CN104046639A - 小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrB3.1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小麦山融3号甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrB3.1。本发明还公开了所述基因TaMsrB3.1在拟南芥和小麦植株中提高其抗盐/耐旱性的应用。实验结果表明，本发明所述转基因植株比非转基因植株的抗盐/耐旱能力得到了很大程度的提高，为通过基因工程手段提高作物抗盐/耐旱性提供了理论依据和实践基础。

Description

小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrB3.1及其应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrB3.1及其应用。

背景技术

干旱和高盐等逆境是限制植物产量的重要因素。因此，鉴定抗逆相关基因用于作物改良是未来抗逆育种的关键策略之一。Msr能被多种非生物胁迫诱导表达，而且MSR可以清除机体内过量的ROS，也可以体外催化因ROS氧化的R和S型MetSO的还原，暗示其在植物胁迫应答中发挥作用。

小麦作为世界上最重要的粮食作物之一，提高小麦产量一直是科研和育种工作者们最为关注的研究课题。然而，近年来农业生态环境不断恶化，许多土地处于干旱、盐渍、沼泽、冷土等逆境中，干旱胁迫与盐胁迫尤其严重影响作物生长发育和产量。因此加强小麦应对各种非生物胁迫的能力是提高小麦产量最为有效的途径之一。本实验室前期将小麦近缘禾草中耐逆性极强的长穗偃麦草的染色质渐渗入小麦济南177的基因组，创制了一批抗逆新种质资源并从中选育出高产/耐盐小麦新品种山融3号(SR3)。前期的盐旱处理SR3幼苗构建的cDNA芯片显示其中的TaMsrB3.1有显著响应。Msr在拟南芥、水稻以及一些其他植物中抗胁迫方面的作用已有初步结果，但在主要粮食作物小麦中该基因的克隆、功能验证尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗盐和抗旱相关基因——小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrB3.1，以及利用该基因在提高植株抗盐/耐旱性中的应用。

本发明的技术方案是：从小麦山融3号(SR3)中分离得到小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrB3.1，在植物真核系统拟南芥中验证其功能，再在转化小麦实验中验证其提高抗盐和抗旱性。

本发明所述的小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrB3.1，其特征在于：所述基因cDNA序列如SEQ ID No.1所示。其中，所述小麦是山融3号小麦。

本发明在小麦中克隆的甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrB3.1与其他物种中的类似基因相比同源性在40～75％之间。对其保守区分析发现，小麦中甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrB3.1推导的氨基酸序列含有两个保守的CxxC，这两个CxxC用于结合Zn²⁺，为酶的热稳定性和催化活性所必须。和其它同类基因相比，也存在保守序列的多态性，比如在除了以上两个功能相关的保守序列外，TaMsrB3.1存在其它位点保守序列的差异，这暗示在小麦中该基因功能上的分化。

本发明所述小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrB3.1在提高植株抗盐/耐旱性中的应用。

实验证实：在逆境处理的条件下，无论是盐还是旱处理，转入本发明所述基因TaMsrB3.1的植株过表达系的根长相比于野生型差异明显，在逆境下生长良好，说明该基因的转化的确增强了植株(小麦)抗盐/旱的能力。

本发明的有益效果：利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了小麦SR3甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrB3.1并进行了功能验证。通过不同诱导子处理显示该基因与抗盐和抗旱密切相关。故对于该基因TaMsrB3.1的研究具有重要理论意义和应用前景。

附图说明

图1：TaMsrA2.1基因的cDNA电泳图，其中：M为DNA Marker，泳道1-3为TaMsrB3.1的cDNA。

图2：转TaMsrB3.1基因的拟南芥转基因植株筛选，绿苗为转基因植株。

图3：甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrB3.1在转基因拟南芥中RealTime-PCR表达分析，Clo-0为野生型拟南芥，OE1和2为不同转基因纯系。

图4：转基因的拟南芥中甘露醇处理分析，WT为野生型，OE1和OE2为RealTime-PCR分析的过表达系。

图5：转基因的拟南芥中NaCl处理分析，WT为野生型，OE1和OE2为过表达系。

图6：转基因的拟南芥中控水试验的析，WT为野生型，OE1和OE2为过表达系。

图7：转基因小麦PCR筛选电泳结果，1-22为不同转基因植株，PC为阳性对照，NC为阴性对照，M为DNA Marker。

具体实施方式

实施例1、TaMsrB3.1的克隆

1.1提取小麦SR3总RNA

(1)将SR3植物材料放入研钵中，加入液氮将其研磨成粉；

(2)待液氮挥发后，取约100-200mg粉末转入到1.5ml离心管中，加入1ml Trizol提取液，涡旋震荡使样品充分溶入提取液中，室温静置5min；

(3)4℃，12,000rpm，离心10min后，取0.9ml上清液转移到新的1.5ml离心管中，再加入0.2ml氯仿剧烈振荡混匀15sec，室温静置2-5min；

(4)4℃，12,000rpm，离心10min后，取0.4ml上清液转移到新的1.5ml离心管中，加入0.4ml异丙醇后混匀，室温静置15mim；

(5)4℃，12,000rpm，离心10min，弃上清，用1ml75％的乙醇洗涤沉淀两次后，于4℃，8,000rpm，离心5min；

(6)弃上清，开盖于超净工作台中上干燥RNA约2-5min，加入40μl RNase-Free水，在60℃中充分溶解RNA10min；

(7)用紫外分光光度计测RNA样品的OD值和浓度，A₂₆₀/A₂₈₀达到1.7-2.0为佳；琼脂糖凝胶电泳检测的质量。

1.2cDNA第一链的合成

(1)向离心管中依次加入下列物质(40μl反应体系)：

(2)轻轻混匀后，65℃变性5min，立即插到冰上，冰浴至少1min；

(3)向离心管中依次加入下列物质

(4)轻轻混匀后，42℃恒温水浴1h，65℃变性10min，-20℃保存备用。

1.3PCR反应

TaMsrB3-F：(1)-5’GCACGAGCCTGAAAAGGAG3’-(19)

TaMsrB3-R：(801)-5’GCGAGCATCGGTACTTGGG3’-(783)

(1)Trans HiFi Taq高保真酶扩增的反应体系如下(50μl体系)：

扩增条件如下：

反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图1所示。

(2)克隆基因片段的纯化回收(DP209试剂盒)

1)将切下带有目的片段的凝胶放入1.5ml离心管并称凝胶重量，加入3倍体积的溶胶液，60℃溶胶10min，溶胶期间不断的翻转；

2)凝胶完全融化后，全部吸取到回收柱中，放置片刻；

3)室温，12000rpm，离心30Sec，弃溶液；

4)在柱中加入700μl的漂洗液，12000rpm，离心1min，弃漂洗液；

5)在柱中加入500μl的漂洗液，12000rpm，离心1min，弃漂洗液；

6)空柱，12000rpm，离心2min；

7)回收柱开盖晾干1-2min，放入新的干净的1.5ml离心管，加入60℃预热的40μl灭菌水或者EB缓冲液，放置2min；

8)12000rpm离心1min，所得溶液即为回收片段。

1.4连接目的片段与质粒

用上述的回收目的片段与pEasy-T1simple载体，25-30℃连接10-20min。连接体系如下：

pEasy-T1simple  1μl

PCR回收产物   100～200ng

混匀并短暂离心，25-30℃连接10-20min。得到重组质粒pEasy-T1simple，用于后面的反应。

1.5重组体转化

首先用CaCl₂法制备感E.coli DH10B受态细胞。

(1)挑取单菌落接种于5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

(2)按1：100-1：50的比例，取1ml菌液接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养至菌液OD₆₀₀为0.3-0.6。

(3)将菌液冰浴10min，4℃4000rpm离心10min，收集菌体。

(4)沉淀加10ml预冷的0.1M CaCl₂悬浮后，冰浴30min。

(5)4℃4000rpm离心10min。沉淀重悬浮于1ml预冷的0.1M CaCl₂，混匀并冰水浴中保存，备用或加入15％的甘油置于-70℃中保存。

热击法转化E.coli DH10B

(1)在无菌条件下吸取100μl感受态细胞，加入1.5ml预冷的无菌Eppendorf管中，加入10μl连接产物(1.4中的重组质粒)，轻轻混匀，立即置于冰上30min。

(2)在42℃恒温水浴中热激90sec。

(3)冰浴3-5min。

(4)加入800μl不含抗生素的LB液体培养基，混匀，37℃振荡培养45-60min。

(5)短暂离心收集菌体，用150μl LB液体培养基重悬菌体，转至含抗生素Amp、X-gal、IPTG的LB固体平板上，用无菌涂布棒涂布。

(6)将平板于37℃正向放置15-30min至液体被吸收，倒置平板，于37℃培养12-16h，观察平板会有蓝白斑。白斑用于后面的质粒提取。

1.6阳性重组子的鉴定

首先利用碱裂解法提取含有重组子的大肠杆菌质粒

(1)挑取白色单菌落，接入含抗生素Amp(50mg/L)的3ml LB液体培养基中，同时也要保存所挑取的白色单菌落于含抗生素Amp的固体LB平板中，37℃震荡培养12-16h；

(2)12000rpm离心30sec，收集培养物中的菌体，尽量弃尽上清；

(3)加入100μl冰预冷的溶液I，在涡旋器上使菌体充分重悬；

(4)加入200μl溶液II，立即将离心管缓缓颠倒数次，冰浴5-10min；

(5)加入150μl冰预冷的溶液Ⅲ，缓缓颠倒离心管数次直至白色沉淀充分形成，冰浴5-10min；

(6)12000rpm离心3min，取上清转入另一微量离心管中，加入2倍体积95％乙醇，混匀后，室温静置3min；12000rpm离心3min，使质粒DNA沉淀；

(7)弃尽上清，取200μl TE溶液溶解沉淀；

(8)加入等体积冰预冷的5mol/L LiCl溶液，冰浴5min，沉淀大量的RNA；

(9)12000rpm，离心3min；

(10)转移上清到另一离心管中，加入2倍体积的95％乙醇，混匀后于室温静置3min，12000rpm离心3min使质粒沉淀；

(11)弃上清后用1ml70％乙醇洗涤沉淀，弃尽液体；

(12)室温干燥后，取20μl含RNaseA(20μg/ml)的TE溶液溶解沉淀，37℃水浴30～60min消化RNA。

(13)为减少损失，可先用TE将总体积补充至200μl，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇，充分振荡5-10min，12000rpm离心5min；

(14)取上清，加入等体积的氯仿-异戊醇，重复以上操作；

(15)取上清，加入1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH5.3)和2倍体积的无水乙醇,混匀后-20℃放置15min,12000rpm离心3min使质粒沉淀；

(16)弃上清用1ml70％乙醇洗涤沉淀，弃液体,用40μl TE或无菌水溶解沉淀。质粒用于后面的反应。

提出质粒后进行酶切验证，酶切反应体系如下表所示：

重组质粒           16μl

EcoRI限制性内切酶  2μl

10×Buffer         2μl

将上述反应体系混匀并5000rpm离心1min，37℃水浴反应过夜，然后进行1％的TAE琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7DNA测序和基因命名

挑取含有重组质粒的阳性单菌落用含有Amp(50mg/L)的液体LB摇过夜，然后送上海博亚生物技术有限公司测序，得到测序结果：全长基因cDNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。

经过NCBI blast分析，初步确定为甲硫氨酸亚砜还原酶基因，命名TaMsrB3.1。

实施例2、在拟南芥中对TaMsrB3.1进行功能验证

2.1植物过表达载体的构建

(1)设计引物：pSTART载体是常用的过表达双元载体，设计添加有合适酶切位点(正向引物添加Xba I，反向引物添加Sac I)的引物：

TaMsrB3.1-F-PSTART：GCTCTAGAGCACGAGCCTGAAAAGGAG

                         Xba I

TaMsrB3.1-R-PSTART：TCGAGCTCGCGAGCATCGGTACTTGGG

                         Sac I

(2)PCR反应：Trans HiFi Taq高保真酶PCR扩增目的基因，反应体系和条件同1.3(1)；电泳回收目的片段的方法同1.3(2)。

(3)3连入pEasy-T1载体后转化大肠杆菌，阳性重组子鉴定并提取质粒。连接方法同1.4，转化方法同1.5，阳性重组子鉴定和质粒提取方法同1.6；

(4)克隆质粒和pSTART空载体质粒用相应合适的内切酶进行酶切(引物上引入的)，电泳后回收载体线性片段和目的片段；酶切方法同1.6，片段的回收同1.3(2)。

(5)使用T4DNA ligase把目的基因连入切好的pSTART空载体；连接方法同1.4。

(6)连接产物热激法转化E.Coli DH10B感受态细胞；感受态的制备和转化方法同1.5。

(7)阳性重组子的酶切验证方法同1.6。

2.2植物表达载体转化农杆菌

2.2.1农杆菌感受态的制备(无菌操作)

(1)取农杆菌GV3101接种于10ml YEP液体培养基中，28℃摇床过夜；

(2)按1︰50接种于50ml YEP液体培养基中，28℃振荡培养3-4小时，至OD₆₀₀值为0.4-0.6；

(3)4℃，4200rpm，离心10min，收集菌体；

(4)弃上清，加入10ml预冷的0.15M的NaCl悬浮菌体；

(5)重复步骤3；

(6)弃上清，加入2ml预冷的20mM的CaCl₂悬浮菌体，分装于1.5ml离心管中，现用或加入终体积7％DMSO经液氮速冻后-80℃保存备用。

2.2.2农杆菌的转化(无菌操作)

(1)将10μl植物表达载体质粒DNA加入50μl的感受态细胞中，轻弹离心管混匀，冰浴30min；

(2)液氮速冻1min；然后37℃水浴5min，立即冰浴2-3min；

(3)加入1ml YEP培养基，28℃培养2-4h；

(4)室温，4000rpm，离心3min，收集菌体；

(5)将菌涂布于含有相应抗生素的YEP培养平板上，28℃倒置培养48h。

2.2.3转化农杆菌的PCR验证

对阳性农杆菌菌落进一步鉴定，所用方法为菌落PCR技术，反应体系如下(20μl体系)：

PCR扩增条件如下：

反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。

2.3花侵染法转化拟南芥

(1)将适量待灭菌的拟南芥(Col-0野生型)种子放入1.5ml离心管中，加入1ml75％的乙醇(含有0.03％体积比的TritonX-100)震荡消毒1min，再用70％的乙醇震荡消毒1min(两次)，最后用吸头将种子吸到无菌滤纸上吹干，然后用无菌的牙签将其点入1/2MS培养基中。

(2)生长至抽苔1cm时，将顶端减掉以诱导侧生花序的生成；

(3)在转化前一天，取1ml活化过的含有表达载体质粒的农杆菌GV3101加到含相应抗生素及50μg/ml利福平的40ml YEP培养基中，28℃震荡培养至OD₆₀₀约为1.0-1.2；

(4)室温，4200rpm,离心10min，收集菌体，用浸染液(5％蔗糖，0.05％Silwet L-77)重悬菌体，使OD₆₀₀约为0.8；

(5)用移液器将农杆菌滴到花序上进行浸染，待所有花序都被侵染后，将拟南芥放入真空干燥器中抽真空1min；

(6)用保鲜袋覆盖花序，至于20-22℃避光培养一天剪开顶部露出花序，再培养一天后揭去保鲜袋，培养至种子成熟。

2.4转基因纯系的获得

对收获的T0代种子进行表面消毒，然后后均匀涂布于1/2MS平板上(含相应的抗生素卡那霉素)。春化处理3天后移入人工气候室生长。萌发约10天，子叶深绿色的植株为转基因植株，而子叶发浅绿甚至黄化的植株为非转基因植株(如图2所示)。将转基因植株转入土中生长直至收获得到T1代转基因种子，T1代植株单株收种子，每株收取的种子继续筛选，将后代分离比为3∶1(阳性∶阴性)的阳性植株移栽后生长至收获T2代转基因种子，单株收种后，每株收取的种子经筛选可以得到纯系T2代转基因种子。

2.5转基因植株的RT-PCR检测

(1)植株总RNA的提取和cDNA第一链的合成方法参照1.1和1.2.

(2)TaMsrB3.1基因RT引物序列：

TaMsrB3.1-RT-F：5’GCACCGAGTATCCTGGAACA3’

TaMsrB3.1-RT-R：5’TTAGCAGCGAGCATCGGTAC3’

将逆转录得到的cDNA进行适当稀释并作为模板进行PCR反应，用单拷贝基因TaActin作为内参，先对其进行扩增，在200μl离心管中加入反应体系：

混匀体系并离心，放入PCR仪中进行PCR反应。

PCR反应程序：

之后利用琼脂糖电泳分析PCR结果，检测结果如图(3)所示，表明成功获得了转基因株系。

2.6不同浓度盐和甘露醇处理拟南芥

(1)将灭菌后的野生型拟南芥(WT)及转TaMsrB3.1过表达系(OE)的种子分别点到1/2MS固体培养基上，4℃下无光培养3-4d，后转移至到光照培养箱22℃竖直培养3d；

(2)制备加有不同浓度的NaCl(0,80mM,100mM,120mM)、甘露醇(0,200mM,300mM)的1/2MS固体培养基；

(3)将根长0.8～1cm且生长一致的幼苗移入各种1/2MS固体培养基中竖直培养，要求每个培养皿中包括对照野生型和两个独立的过表达系幼苗，培养10d后拍照并统计根长。实验重复3次。

结果表明，过表达系和野生型相比，在300mM甘露醇(图4)和80mM NaCl下(图5)显著增强了对盐和胁迫渗透(甘露醇模拟)的抗性。

2.7控水实验

将过表达系和野生型对照种子点到土中，待长到5-7叶(大约五到六周)时，控水3周，之后再复水3d。照相统计植株存活率(存活率＝复水后叶片反绿的植株数/总植株数，实验重复3次。

当结束控水并复水一段时间后，过表达系恢复了正常的生长状态，野生型仍然处于枯死状态。结果显示了TaMSRB3.1的过表达使拟南芥对干旱的耐受性增强(见图6)。

实施例3、在小麦济南17中过表达甲硫氨酸亚砜还原酶TaMsrB3.1

3.1种子灭菌

取济南17种子，在超净工作台上以75％乙醇浸泡1min，无菌水洗3～4次，接着用0.1％的升汞浸泡10min，无菌水洗3～4次。

3.2春化处理

灭菌后的种子置于含有适量无菌水的100mL无菌三角瓶中，在28℃100rpm摇床过夜，将露白的种子置于培养皿底用超纯水饱和的滤纸上；之后放入4℃冰箱暗培养四周，待胚芽鞘长到1～3cm即可切苗侵染。

3.3表达载体的构建和转化农杆菌

利用pSTART构建载体，方法同2.1，只是用ubiquitin启动子替换了35S启动子。转化农杆菌及阳性菌的鉴定同2.2。

3.4转化小麦

(1)含有植物表达载体的农杆菌活化：切苗前3～4天活化菌种(培养基：10mL YEP+5μL Kan+50μL利福平)：第一次活化用20mL培养基+50～100μL菌液→保菌(浓白)；第二次活化在切苗前一天晚上，用100mL三角瓶将第一次活化后菌液450μL+40～60mL培养基过夜摇至OD略大于1.0。

(2)取1ml活化至OD_6oo达1.0的农杆菌菌液,10000rpm离心30s,弃上清后加入乙酰丁香酮使其终浓度达到200μM,加入无菌水10ml,置于冰上备用。

(3)切苗和农杆菌转化:首先将胚芽鞘长至1～3cm的幼苗从根部开始下刀,斜切暴露幼苗茎端生长点；接着用微量注射器吸取4μL菌液,滴于暴露的生长点；将处理后的幼苗置于己灭菌的培养皿中,室温培养至小麦健壮后移栽于土壤中；在植株开花前将每株麦穗进行套袋隔离。

3.5转基因小麦阳性株系的确定

(1)基因组DNA的提取：T₁～T₂代转化小麦长至3～4叶时,剪取3-5cm叶片,CTAB法提取小麦叶片基因组DNA：具体是剪碎叶片后用液氮研磨，将粉末转移至1.5ml离心管中，然后加入700μl预热至65℃的CTAB提取缓冲液(含0.1％的疏基乙醇)混匀后置于65℃水浴保温2h，不时颠倒混匀。之后加入等体积的酚∶氛仿∶异戊醇(25∶24∶1)，4℃下10000g离心10min。将液相转移至一干净离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，4℃下10000g离心10min。将上清转移至一干净离心管中，加入两倍体积无水乙醇，温和混匀，-20℃放置30min沉淀DNA。4℃下10000g离心10min，弃去液体，并用70％乙醇洗涤两次，室温干燥DNA后，加入100μl RNA酶液，37℃水浴30min。加入200μl无水乙醇，温和混匀，-20℃放置30min沉淀DNA。4℃10000rpm离心10min，弃去液体，并用70％乙醇洗涤两次，室温干燥DNA后，加入40μl无菌水溶解DNA，4℃保存待用。

(2)PCR法检测阳性转基因植株，釆用GUS引物进行筛选:

GUSr:GACAGCAGCAGTTTCATCAATC

GUSf:ATCCCACTATCCTTCGCAAG

反应体系如下(20μl体系)：

扩增条件如下：

反应结束后，反应液于1％TAE琼脂糖凝胶电泳检测(图7)，依据电泳结果进行了相关遗传分析，获得了阳性小麦纯系。

3.6转基因小麦的耐盐/抗旱性分析

小麦材料(对照JN17，两个不同的转基因纯系)于1/2Hoagland液体培养基,22℃长日照(光照16h/黑暗18h)条件下培养，待材料生长到两叶一心时选择生长一致的进行逆境处理：NaCl的浓度分别为0,100mM，150mM；PEG(模拟抗旱)的浓度分别为0,10％(v/v)，15％。处理2周后统计根长,三次重复。结果如表1，可以看出在没有逆境处理的条件下，对照和两个过表达系根长没有显著差异，而在逆境处理的条件下，无论是盐还是旱处理，过表达系的根长相比于野生型差异明显，在逆境下生长良好，说明该基因的转化的确增强了小麦抗盐/旱的能力。

表1转基因小麦逆境处理下根长分析

1/2Hogland液体培养基配方：

Claims (4)

1.一种小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrB3.1，其特征在于：所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.如权利要求1所述小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrB3.1，其特征在于：所述小麦是山融3号小麦。

3.权利要求1所述小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrB3.1在提高植株抗盐/耐旱性中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述植株是小麦或拟南芥。