CN104877987A - 大豆再生相关基因(GmESR1)及其表达分析 - Google Patents

Abstract

大豆再生相关基因（GmESR1）及其表达分析，属于遗传工程技术领域，其特征在于通过对大豆植株进行荧光定量PCR对基因功能进行初步分析，利用对植株喷施细胞分裂素对大豆再生相关基因GmESR1进行克隆，利用农杆菌介导的方法对大豆进行遗传转化，通过过量表达来研究GmESR1基因的功能。同时，根据植株的表型分析和分子检测手段研究该基因与大豆再生之间关系，寻找到并克隆大豆再生相关基因GmESR1（Seq ID No:1）。

Description

大豆再生相关基因(GmESR1)及其表达分析

技术领域

本发明涉及一种大豆再生相关基因（GmESR1）及其表达分析，属于遗传工程技术领域。

背景技术

大豆是我国重要的粮经作物之一，它不仅是重要的食物、家畜饲料和工业原料，而且在医学上也有很大价值。我国是世界上大豆的主要生产国之一（年均总产量1500万吨），同时也是世界上最大的大豆消费国（年均消耗量近8000万吨），国产大豆远不能满足国内消费需求，每年需进口大豆5500多万吨。大豆再生体系建立难、遗传转化效率低严重制约着大豆育种的发展。生物学里的再生是指生物体对失去的结构重新自我修复和替代的过程。植物再生是一个无性繁殖的过程，主要分为以下三个过程：第一个过程为植物体对外源植物激素信号的应答，第二过程为已分化的细胞进行脱分化，第三个过程为静止细胞的再分裂和进入特定组织或器官原基的再生发育路径。总的来说，植物先通过细胞进行脱分化获得了再生能力，随后通过外源激素的刺激来进行细胞增殖及根器官建成能力获得和芽器官发生能力形成，最后摆脱激素依赖进行组织器官再生过程。Haberlandt在1902首次提出了植物体细胞胚的定义，提出每一个植物细胞都能进行不间断的分裂，而后发育成完整植株，说明了植物细胞具有全能性，植物的再生途径广义上可以分为两种，第一种是利用体细胞胚进行发生途径；第二种是利用器官进行发生途径，形成不定根或者不定芽进而诱导芽和根的再生。体细胞在特殊的条件下不经性细胞融合而是经过合子胚相似发育途径，逐渐发育形成崭新个体的形态发生过程被称为植物体细胞胚胎发生。相似合子胚的结构在生物学中被称为胚状体。1958年的Steward和1959年的Reinert首次发现了体细胞胚的发生，随着时代的发展和分子生物学的进步，植物体细胞胚的发生机理逐渐被人们所了解，科学家已经从一百多种植物中分离出体细胞胚，虽然体细胞胚发生在自然界是普遍存在的，但是其分化却极为复杂。植物体细胞胚越来越受到重视，在种质资源的保存、突变体的诱导、基因和细胞工程等方面有很多应用价值。2001年Hiroharu Banno等从拟南芥中利用cDNA文库的方法成功克隆得到ESR1基因，拟南芥ESR1基因是受细胞分裂素诱导密切相关的AP2基因家族的成员，这一类基因的共同特征是有一个AP2结构域，ESR1基因的AP2结构域与已知的EREBPs、AtEBP、AtERFs结构域十分相似，由于这些区域均能编码乙烯应答系统中的GCC box所以这些转录区域被认为是乙烯信号途径中的一部分。大豆的遗传转化效率低、再生体系建立难已严重阻碍大豆分子育种和大豆基因功能的研究。自Hinchee 等（1988）和 McCabe 等（1988）分别用农杆菌介导法和基因枪法转化获得转基因大豆植株以来，虽然又有很多报道但是突破性结果很少，由于大豆的遗传转化效率低下，越来越多的研究者开始把注意力转移到大豆高效再生体系的建立及大豆再生相关基因克隆上来，通过优化再生条件及分析再生基因功能进而解决大豆再生率低这一世界性难题。再生相关基因还能够以一种新型无争议的生物安全标记基因来替代抗生素、除草剂等选择标记，在导入外源目的基因的同时提高受体植物的再生能力，对植物转基因育种效率及转基因新品种的安全性具有重要意义（李文凤，等2010）。因此，如何通过现代分子生物学技术从根本上提高大豆的再生率，找到并克隆出控制大豆再生的基因，解决遗传转化效率低、再生体系建立难成为急需解决的一大难题？所以，通过对大豆植株进行荧光定量PCR对基因功能进行初步分析，利用对植株喷施细胞分裂素对大豆再生相关基因GmESR1进行克隆，利用农杆菌介导的方法对大豆进行遗传转化，通过过量表达来研究GmESR1基因的功能。同时，根据植株的表型分析和分子检测手段研究该基因与大豆再生之间关系，寻找到并克隆大豆再生相关基因GmESR1，发明一种大豆再生相关基因（GmESR1）及其表达分析是必要的。

发明内容

为了克服大豆遗传转化效率低、再生体系建立难的难题，本发明提供了大豆再生相关基因（GmESR1）及其表达分析，该发明通过对大豆植株进行荧光定量PCR对基因功能进行初步分析，利用对植株喷施细胞分裂素对大豆再生相关基因GmESR1进行克隆，利用农杆菌介导的方法对大豆进行遗传转化，通过过量表达来研究GmESR1基因的功能。同时，根据植株的表型分析和分子检测手段研究该基因与大豆再生之间关系，寻找到并克隆大豆再生相关基因GmESR1（Seq ID No:1）。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

本发明的一种大豆再生相关基因（GmESR1）及其表达分析，其特征在于利用同源克隆技术通过对植株喷施细胞分裂素的方法，克隆得到细胞分裂素信号途径中的转录因子GmESR1基因（Seq ID No:1）。具体步骤如下：

（一） GmESR1基因表达模式的研究

1. 大豆的培养及6-BA处理：对大豆GmESR1基因的组织特异性表达进行分析，将品种为东农50的大豆种子种植于人工培养箱中，培养条件为长日照(16h光照/8h黑暗) 、25℃。长出第二片三出复叶时，对植株叶、根、茎进行取材，待开花结荚后对未成熟胚、花、豆荚进行取材，均放入液氮中保存备用。采用实时荧光定量PCR的方法对GmESR1基因的组织特异性表达进行分析，结果表明GmESR1基因在大豆的茎、花和未成熟胚中表达量较高，可推测GmESR1基因在茎的伸长、花的形态建成以及胚再生中均发挥一定作用。对细胞分裂素（6-BA）对大豆GmESR1基因的表达影响进行分析，待大豆植株长出第二片三出复叶时，选取长势相同的植株，对照喷洒水，实验组喷洒100mg/L的6-BA。分别于外源细胞分裂素处理后的0，1，2，4，8，12，24h后取叶片，放入液氮中保存备用。采用实时荧光定量PCR的方法对GmESR1基因受细胞分裂素影响进行分析，结果表明GmESR1基因受细胞分裂素处理1小时内持续上升并且在1小时时表达量达到最高，在处理后4小时后表达量趋于平稳，可推测细胞分裂素对GmESR1基因的影响在1小时内完成的。

2. 植物RNA的提取：按照RNAiso Plus的方法提取大豆叶片总RNA

3. RNA的反转录

4. 实时定量PCR

（二）大豆GmESR1基因的克隆和序列分析

1.CTAB法大量抽提大豆叶片基因组DNA。

2.GmESR1基因引物设计：在Phytozome大豆基因组中调出GmESR1基因序列，应用Primer 5.0软件对其设计引物及其酶切位点分析，在基因上游引物5′端添加Bam HⅠ酶切位点，下游引物5′端添加SacⅠ酶切位点。

3.利用PCR扩增GmESR1基因

4.PCR产物的纯化和胶回收：将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，采用上海华舜生物工程有限公司的胶回收试剂盒回收DNA片段。

5.PCR回收产物的连接：取3μL胶回收产物1.5%琼脂糖凝胶电泳检测定量，将回收的目的片断与pMD19-T Vector连接。

6.大肠杆菌的感受态的制备

7.连接产物的转化

8.目的片段的PCR鉴定：利用SDS小量法提取受细胞分裂素喷施的东农50总DNA。利用设计的特异性引物进行PCR反应，获得片段长度为1164bp。

9.GmESR1基因的全长序列获得和大豆中不同拷贝同源性分析：(1)利用NCBI的在线blast工具检测DNA序列的正确性。(2)利用DNAman软件比对大豆GmESR1基因拷贝间的同源性分析。

（三）大豆GmESR1基因植物表达载体的构建

利用酶切连接方法先将含有EcoR I和Hind III酶切位点的PbI121和pCAMBIA3300构建成中间载体，再通过Sac I和Bam HI酶切将目的片段连接到中间载体上，构建植物过表达载体，最后将选出的阳性克隆送至测序。

（四）农杆菌的制备及其转化

1.转化农杆菌：三亲杂交方法转化根癌农杆菌。

2.农杆菌转化子的鉴定：利用冻融法将质粒pCAMBIA 3300-I121-GmESR1转入农杆菌菌株LBA4404。转化后挑取单菌落摇菌，提取质粒。通过PCR扩增获得条带大小为为1164bp，表明成功将过量表达载体转化到农杆菌LBA4404中，并且构建了含有GmESR1片段的植物表达载体。

3.农杆菌介导大豆子叶节遗传转化：①菌液制备；②大豆无菌苗的培养和子叶节的制备；③侵染和共培养；④恢复培养筛选培养；⑤丛生芽的伸长、生根和移苗。

4. 转基因植株的检测：①转基因大豆DNA提取，SDS小量法提取大豆基因组总DNA。②转基因大豆PCR鉴定，对所提取的植株DNA进行PCR鉴定。③转基因植株表型及其PPT抗性分析：对转基因大豆的表型进行分析，发现GmESR1在大豆中的过量表达会促进大豆幼苗的生长。对过表达大豆T1代检测，以包括35S和NOS的引物为检测引物，T0代转基因大豆经过子叶节法转化后，收获T0代种子，种入土中，待长出第一个三出复叶时SDS小量法提取幼嫩的大豆叶片DNA，以非转基因烟草为阴性对照，水为空白对照，表达载体质粒为阳性对照，进行PCR鉴定，共检测出6株阳性植株。为了筛选出转基因阳性植株，我们对转基因植株和空白对照植株的叶片进行了PPT的浓度递增的实验，分别用浓度150mg/L、200mg/L、250mg/L、300mg/L的PPT对叶片进行涂抹筛选，结果表明转基因阳性植株能抗250 mg/L以下的PPT。

本发明的有益效果为：大豆再生相关基因（GmESR1）及其表达分析发现：本研究利用同源克隆技术通过对植株喷施细胞分裂素的方法，克隆得到细胞分裂素信号途径中的转录因子GmESR1基因，该基因全长1164bp，能编码387个氨基酸。构建了植物表达中间载体pCAMBIAI121-3300和植物表达载体pCAMBIAI121 -3300 -GmESR1，通过酶切和PCR相结合的方法对结果进行验证。通过农杆菌介导分别利用子叶节法对大豆进行遗传转化，并且通过PPT筛选和PCR鉴定的方法对过表达植株进行鉴定。采用实时荧光定量PCR的方法对GmESR1基因的组织特异性表达和细胞分裂素对GmESR1基因的影响进行分析，结果表明GmESR1基因在大豆的茎、花和未成熟胚中表达量较高，GmESR1基因受细胞分裂素处理1小时内持续上升并且在1小时时表达量达到最高，在处理后4小时后表达量趋于平稳。对过表达的植株进行表型分析，分析表明GmESR1基因促进了大豆幼苗的生长。

附图说明    

下面结合附图对本发明进一步说明。

图1为大豆再生相关基因（GmESR1）及其表达分析的大豆GmESR1基因的组织表达图。

图2为大豆再生相关基因（GmESR1）及其表达分析的BA处理后大豆GmESR1基因的表达图。

图3为大豆再生相关基因（GmESR1）及其表达分析的PCR克隆出大豆GmESR1基因的凝胶电泳图。

图4为大豆再生相关基因（GmESR1）及其表达分析的大豆GmESR1基因的比对图。

图5为大豆再生相关基因（GmESR1）及其表达分析的GmESR1基因植物表达中间载体构建过程图。

图6为大豆再生相关基因（GmESR1）及其表达分析的GmESR1基因植物表达载体构建过程图。

图7为大豆再生相关基因（GmESR1）及其表达分析的PBI121质粒EcoR I和Hind III双酶切目标产物图。

图8为大豆再生相关基因（GmESR1）及其表达分析的pCAMBIA 3300质粒EcoR I和Hind III双酶切目标产物图。

图9为大豆再生相关基因（GmESR1）及其表达分析的pMD19-GmESR1质粒Sac I和Bam HI双酶切目标产物图。

图10为大豆再生相关基因（GmESR1）及其表达分析的M: DL5000分子量标准；泳道1-6：重组质粒转农杆菌的PCR产物图。

图11为大豆再生相关基因（GmESR1）及其表达分析的通过子叶节介导的大豆遗传转化图。图中 (A)萌发的大豆幼苗(B) 共培养中的子叶节(C) 芽诱导培养基上的外植体(D) 芽诱导培养基上的外植体的伸长(E)根的伸长。

图12为大豆再生相关基因（GmESR1）及其表达分析的转GmESR1基因大豆的PCR鉴定图。图中M:DL2000分子量标准；1-22待检测转基因植株；23：非转基因烟草的阴性对照；24：水的空白对照；25：为表达载体质粒的阳性对照。

图13为大豆再生相关基因（GmESR1）及其表达分析的转基因大豆幼苗表型分析图。图中1转基因植株，2对照植株。

图14为大豆再生相关基因（GmESR1）及其表达分析的转基因大豆种子萌发表型分析图。图中1-2对照植株 3-4转基因植株。

图15为大豆再生相关基因（GmESR1）及其表达分析的基因（GmESR1）的核苷酸序列图。

具体实施方式

在本说明书的上下文中，除非特别指明否则本说明书所用的任何术语具有本领域技术人员在本领域中通常理解的含义，而未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例一

一．    实验材料和试剂

1.植物材料：大豆(Glycine max (L.) Merrill.)品种为再生率较高的东农50，培养在25℃光照培养箱，250μmol m^-2s^-1白光，长日照(LD)（16h/8h光/暗）。

2.菌种及载体：大肠杆菌E.coli DH_5α菌株；章鱼碱型(Oct)农杆菌（Agrobacterium tumefacieus）LBA4404；pCAMBIA3300，pBI21；pmd19-T载体购自TaKaRa公司由本实验室保存。

3.主要试剂：RNAiso Plus试剂购自Takara公司；核酸分子量标准DL2000购自Takara公司；DNA凝胶回收试剂盒购自Omega公司；限制性内切酶、DNA连接酶购自Fermantas公司；pMD19-T载体购自Takara公司；LA PCR in vitro Cloning Kit 购自Takara公司；其它各种生化试剂均为国产分析纯；引物合成自华大基因，测序由华大基因组（BGI）完成。

4.抗生素：

表1 实验所用抗生素

抗生素名称	储存液浓度	溶剂	使用浓度
				Ampicillin（Amp）	100 mg/mL	H2O	100 mg/L
Kanamycin（Kan）	50 mg/mL	H2O	50 mg/L
				Rifampicin（Rif）	100 mg/mL	DMSO	100 mg/L

二．    实验方法

（一） GmESR1基因表达模式的研究

1. 大豆的培养及6-BA处理：对大豆GmESR1基因的组织特异性表达进行分析，将品种为东农50的大豆种子种植于人工培养箱中，培养条件为长日照(16h光照/8h黑暗) 、25℃。长出第二片三出复叶时，对植株叶、根、茎进行取材，待开花结荚后对未成熟胚、花、豆荚进行取材，均放入液氮中保存备用。采用实时荧光定量PCR的方法对GmESR1基因的组织特异性表达进行分析，结果表明GmESR1基因在大豆的茎、花和未成熟胚中表达量较高，可推测GmESR1基因在茎的伸长、花的形态建成以及胚再生中均发挥一定作用。对细胞分裂素（6-BA）对大豆GmESR1基因的表达影响进行分析，待大豆植株长出第二片三出复叶时，选取长势相同的植株，对照喷洒水，实验组喷洒100mg/L的6-BA。分别于外源细胞分裂素处理后的0，1，2，4，8，12，24h后取叶片，放入液氮中保存备用。采用实时荧光定量PCR的方法对GmESR1基因受细胞分裂素影响进行分析，结果表明GmESR1基因受细胞分裂素处理1小时内持续上升并且在1小时时表达量达到最高，在处理后4小时后表达量趋于平稳，可推测细胞分裂素对GmESR1基因的影响在1小时内完成的。

2. 植物RNA的提取：按照RNAiso Plus的方法提取大豆叶片总RNA：(1)将超低温冻结的大豆组织称量后迅速移至用液氮预冷的研钵内，用研杵快速研磨组织，并在其间不断加入液氮，直至研成粉末状，用药匙放入2mL的离心管中；(2)加入1mL RNAiso Plus提取液，室温静置5min，120000g，4℃离心5min；(3)取匀浆裂解液加入0.2mL氯仿，盖紧离心管盖，剧烈振荡15s，待充分乳化，室温静置5min，4℃，12000g离心15min；(4)此时离心管内部液分层，取上清液移至新离心管中，加入等体积的异丙醇混匀，室温静置10min，4℃，12000g离心10min可见白色或者褐色沉淀；(5)弃掉上清液，加入1mL 75%乙醇溶液，轻轻吹打 RNA沉淀，4℃，12000g离心1min；(6)弃掉上清液，在无菌操作台中吹风干燥RNA沉淀大约15min，加入50μL RNase-free水溶解沉淀，待 RNA充分溶解后，-80℃保存；(7)琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。

3. RNA的反转录：按以下组分（表2）配制反转录反应液。在PCR仪上进行变性、退火反应：65℃，5min，然后置于冰上急冷。在上述PCR管中配制下列反转录反应溶液（表3）。在PCR仪上按照下列条件进行反转录反应：30℃,10 min；42℃，30—60 min；95℃，5 min。

表2 cDNA第一链合成反转录反应液

试剂	用量
		Total  RNA	0.2—2 μg
Oligo dT(50μM)	1μL
		dNTP Mixture(10mM each)	1μL
RNase Free ddH2O	up to 10μL

表3 cDNA合成反应体系

试剂	用量
		上述变性、退火后反应液	10μL
5×PrimeScript Buffer	4μL
		PrimeScript RTase(200U/μL)	1μL
RNase Inhibitor(40 U/μL)	0.5μL
		RNase Free ddH2O	4.5μL
Total	20μL

4.实时定量PCR：(1) 利用Primer5软件对GmESR1基因进行的实时定量引物设计,内参基因选择actin 4引物设计如(表4)。(2) 按照以下成分对实时定量反应液进行配制：SYBR Real time Master 10μL； 第一链cDNA1μL，PCR上游引物和下游引物1μL，水8μL。进行实时定量PCR反应。(3) 利用Opticon Monitor 3.1软件对数据进行分析，计算出GmESR1的相对表达量。

表4 cDNA扩增所用引物

引物名称	引物序列
		RTGmESR1F:	5'CTTCCACTCAGAACTTCCACGAC3' Seq ID No:2
RTGmESR1R:	5'TAACAGACAAAGAGCCTCCACAA3' Seq ID No:3
		Actin4F:	5'GTGTCAGCCATACTGTCCCCATTT3' Seq ID No:4
Actin4R:	5'GTTTCAAGCTCTTGCTCGTAATCA3' Seq ID No:5

（二）大豆GmESR1基因的克隆和序列分析

1.CTAB法大量抽提大豆叶片基因组DNA：(1)对播种后三周左右的东农50进行6-BA喷施，6-BA浓度为100mg·L^-1。对植株不同部位进行取材；(2)将CTAB溶液放入65℃水浴锅中预热，同时将50mL离心管置于离心机中预冷，将样品在液氮中迅速研磨成粉末放入50mL的离心管中；(3)加入10mL预热的CTAB Buffer，每5min轻轻震荡几次，同时加入疏基乙醇至终浓度1% (v/v)；(4)加入等体积的氯仿：异戊醇24:1(v/v)，室温下混匀，保证样品与溶液充分混合；15-20℃，4000rpm离心30min；(5)取上清液移至另一离心管中，重复步骤4，直到上清液澄清，取上清液；(6)加入等体积的异丙醇，轻轻摇晃混匀直到出现白色絮状DNA沉淀，用枪头挑出白色团状DNA并转移至1.5mL离心管中，4000rpm离心10min，倒掉残余液体；(7)用事先预冷好的70%乙醇溶液洗涤2次，12000rpm，10min倒掉残余液体，室温干燥；(8)用TE溶解已经干燥的DNA。

2. GmESR1基因引物设计：在Phytozome大豆基因组中调出GmESR1基因序列，应用Primer 5.0软件对其设计引物及其酶切位点分析，在基因上游引物5′端添加Bam HⅠ酶切位点，下游引物5′端添加SacⅠ酶切位点。引物序列设计如下：

表5 DNA扩增所用引物

引物名称	引物序列
		GmESR1F：	5' TGGATCCCTTCAGAAAGTATCACTAC 3' Seq ID No:6
GmESR1R：	5' AGAGCTCTAATTGAAAGGCCAGAC 3' Seq ID No:7

3.利用PCR扩增GmESR1基因：将PCR管置于冰上，依次加入下列反应成分：

表6 PCR反应体系

试剂	用量
		Total DNA	1μL
10×LA butter	5μL
		dNTP Mixture	8μL
GmDELLA-F	1μL
		GmDELLA-R	1μL
Takara LA Taq	0.5μL
		Sterilized,distilled water	33.5μL
Final volume	50μL

按如下程序进行扩增（变性、退火、延伸35个循环），取5μL 扩增产物进行电泳。

表7 PCR反应程序

程序	温度和时间
		预变性	94℃, 5min
变性	94℃, 0.5min
		退火	55-60℃, 0.5min
延伸	72℃,1.5min
		终延伸	72℃, 10min
保存	10℃

4. PCR产物的纯化和胶回收

将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，采用上海华舜生物工程有限公司的胶回收试剂盒回收DNA片段。具体操作如下：(1)将PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳，EB染色。用解剖刀，在紫外灯下迅速将目的DNA片段切下，使琼脂糖胶块尽可能小，转入干净的1.5ml离心管中；(2)按每100mg琼脂糖加入300μL S1液的比例加入S1液，放置在50℃水浴10min,使琼脂糖块完全溶化，颠倒混匀数次；(3)将溶化的Agarose液移入吸附柱，离心30s。倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中；(4)在吸附柱中加入500μL W1液，离心15s。将管中的液体倒掉，吸附柱放放回到管中；(5)在吸附柱中加入500μL W2液，静止1min后，离心15s。将管中的液体倒掉，吸附柱放回到管中；(6)离心1min；(7)将吸附柱取出，放入新EP管中，在吸附膜中央加入30μL T1液，静止1min后，离心1min。将含有回收DNA的离心管贮存于-20℃。

5. PCR回收产物的连接

取3μL胶回收产物1.5%琼脂糖凝胶电泳检测定量，将回收的目的片断与pMD19-T Vector连接，反应体系如表8所示，将上述反应体系16°反应30分钟。

表8 GmESR1基因与19-T载体的连接体系

试剂	用量
		Solution I	5μL
目的片段产物（100ng/μL）	1μL
		pMD19-T载体（50ng/μL）	1μL
去离子水	3μL
		总体积	10μL

6. 大肠杆菌的感受态的制备：(1) 将E.coli DH5α划线接种于LB平板上，37℃倒置培养12-16h；(2) 挑取2mm单菌落接种于5ml LB液体培养基中，37℃、 220rpm 振荡培养8h，取出1ml加入到100ml LB液体培养基中，37℃、 220rpm 振荡培养2h后，每隔20min左右使用紫外分光光度计检测OD600值，至光密度OD600值界于0.35～0.40之间时收获细菌培养物；(3) 立即将培养物转入预冷的无菌的离心管中，每管50mL，冰上放置10min后转入4℃，4000rpm离心10min；(4) 倒掉上清，每管加入10mL冰预冷的0.1M MgCl2，4℃下吹吸重悬菌体，4000rpm离心10min；(5) 倒掉上清，使残余液体流尽，每管加入10mL冰预冷的0.1M CaCl2，轻柔吹吸重悬菌体；在冰上放置30min后转入4℃，4000rpm离心10min；(6) 倒掉上清，每管加入2mL溶液（1.65mL 0.1M CaCl2，0.35mL 80%甘油），轻柔吹吸重悬菌体，每管200μL分装，置于4℃冰箱12～24h后用于转化，其它感受态细胞-80℃保存。

7. 连接产物的转化：(1) 取2μL PCR连接产物至一离心管中，置于冰上，小心向其中加入100μL感受态细胞，轻弹管底混匀，冰浴30min；(2) 42℃水浴热激30s，立即置于冰上2min；(3) 向离心管中加入200μL LB培养基，37℃，100rpm振荡培养1.5h，置于冰上；(4) 分别取菌液涂布于含有30μL Kan (50mg/mL)的LB平板(90mm)上，37℃正放1h待菌液完全被平板吸收后倒置过夜培养16h；(5) 挑取白色单菌落，接种于5mL含有5μL Kan (50mg/mL)的LB液体培养基，37℃，220rpm振荡培养16h；(6) 培养基明显变浑浊后，取0.5mL菌液加入0.5mL无菌30%甘油至终浓度为15%，-80℃保存菌种。

8. 目的片段的PCR鉴定：(1)PCR反应体系的制备，将PCR管置于冰上，依次加入下列反应成分（表9）；(2)PCR按照如（表10）反应程序；(3)每个反应取出8μL进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；(4)对鉴定出的阳性克隆，取0.5mL菌液加入0.5mL无菌30%甘油至终浓度为15%，-80℃保存菌种，并送交测序公司测序。利用SDS小量法提取受细胞分裂素喷施的东农50总DNA。利用设计的特异性引物进行PCR反应，获得片段长度为1164bp （Seq ID No:1）。

阳性转化菌的菌液PCR鉴定

试剂	用量
		大肠杆菌菌液	1μL
10×PCR缓冲液	2.5μL
		MgCl2（25mM）	2.0μL
dNTP Mix（10mM）	0.5μL
		上游引物(10μM)	0.5μL
下游引物(10μM)	0.5μL
		Taq DNA聚合酶(5U/μL)	0.3μL
无菌水	19.7μL

表10 PCR反应程序

程序	温度和时间
		预变性	94℃, 5min
变性	94℃, 0.5min
		退火	59℃, 0.5min
延伸	72℃,1.5min
		终延伸	72℃, 10min
保存	10℃

9. GmESR1基因的全长序列获得和大豆中不同拷贝同源性分析：(1)利用NCBI的在线blast工具检测DNA序列的正确性；(2)利用DNAman软件比对大豆GmESR1基因拷贝间的同源性分析。利用DNA man软件对测序结果进行分析，结果表明GmESR1基因的测序结果与在Phytozome上的序列相似度为100％，可以用来接下来的载体构建和功能验证。

（三）大豆GmESR1基因植物表达载体的构建

利用酶切连接方法先将含有EcoR I和Hind III酶切位点的PbI121和pCAMBIA3300构建成中间载体，再通过Sac I和Bam HI酶切将目的片段连接到中间载体上，构建植物过表达载体。由于在单独的PbI121和pCAMBIA3300上均找不到合适的酶切位点，所以通过先构建中间载体pCAMBIAI121-3300然后再用GmESR1基因代替中间载体的GUS来构建最终的植物过表达载体。

1. 中间载体的构建：利用酶切连接方法先将含有EcoR I和Hind III酶切位点的PbI121和pCAMBIA3300构建成中间载体。

2. GmESR1植物表达载体的构建：通过Sac I和Bam HI酶切将目的片段连接到中间载体上，构建植物过表达载体。

3. PbI121、pMD19T- GmESR1和pCAMBIA3300质粒的提取：(1) 从冰箱中取含PbI121、pMD19T- GmESR1和pCAMBIA3300质粒的大肠杆菌菌种，分别划线于含Kan和Amp抗性的LB固体培养基上培养，直至出现单菌落。挑取培养基上的白色单菌落，接种于5mL含适当抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；(2) 取1.5mL菌液于离心管中，13000rpm离心30s，弃上清，富集菌体1-3次。(3) 将细菌沉淀重悬250μL冰预冷的溶液Solution I中，剧烈涡旋振荡混匀；(4) 加入250μL Solution II，上下快速颠倒5次，以混合内容物，切勿振荡，冰上放置5min；(5) 加入350μL冰预冷的溶液III，反复颠倒数次，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，冰上放置3～5min；(6) 4℃，13000rpm离心10min；(7) 将上清转移到吸附柱中，13000rpm离心30s，弃废液；(8) 向吸附柱加入700μL Washing Buffer，13000rpm离心30s，弃废液；(9) 向吸附柱加入500μL Washing Buffer，13000rpm离心30s，弃废液；(10) 13000rpm 离心2min，室温静置2min;(11) 加入50μL Elution Buffer，室温静置1min，13000rpm离心1min，收集洗脱液，即为提取的质粒。-20℃保存。

4. 质粒的限制性内切酶酶切

表11 质粒的酶切反应体系

试剂	用量
		pCAMBIA3300和PbI121质粒	10μL
10×buffer	2μL
		EcoR I	1μL
Hind III	1μL
		ddH2O	6μL

于金属浴中37℃12h。

表12 质粒的酶切反应体系

试剂	用量
		pCAMBIAI121-3300和pMD19T- GmESR1质粒	4μL
10×buffer	2μL
		Sac I	0.5μL
Bam HI	0.25μL
		ddH2O	18.25μL

于金属浴中37℃过夜。

5. GmESR1基因片段和pCAMBIAI121-3300载体酶切片段的回收：胶回收PBI121长度为3032bp片段、pCAMBIA 3300长度为8377bp和GmESR1基因长度为1200bp左右片段。

6. GmESR1基因片段和pCAMBIAI121-3300载体酶切回收片段的连接

表13 GmESR1基因与pCAMBIAI121-3300载体的连接

试剂	用量
		T4 DNA Ligase Buffer	1μL
GmESR1基因片段	3μL
		pCAMBIAI121-3300载体酶切回收片段	3μL
T4 DNA Ligase	1μL
		ddH2O	2μL
总体积	10μL

7. 重组产物的转化、筛选、检测以及菌液PCR鉴定，最后将选出的阳性克隆送至测序。

（四）农杆菌的制备及其转化

1. 转化农杆菌：三亲杂交方法转化根癌农杆菌的方法：(1) 将农杆菌LBA4404放入含相应抗生素(链霉素Str，利福平Rif)的YEP液体培养基里28℃培养1-2天。将pRK2013放入含有卡那霉素Kan抗生素的LB液体培养基里37℃过夜培养。将含重组质粒pCAMBIAI121-3300-GmESR1的大肠杆菌放入含卡那霉素kan的抗生素的LB液体培养基里37℃过夜培养；(2) 当三种菌液达到OD值为0.6时，分别将其从摇床中取出。各取1000μL加入到离心管中，12 000rpm离心5min，弃上清液。分别加入1000μL相应的不含抗生素的YEP液体培养基重悬，12 000rpm再离心5min，弃上清液。然后再加入1000μL相应的不含抗生素的液体培养基重悬；(3) 分别取三种菌液100μL混合于一个EP管中。梯度体积（10ul、20ul、30ul）将混合液滴于不含抗生素的LB固体培养基上，28℃过夜培养；(4) 用接菌环在LB固体培养基上沾取少量的菌落，用划线的方式接种于含抗生素（Rif，Str，Kan）的LB固体培养基上，28℃培养1-2天。

2. 农杆菌转化子的鉴定：挑取白色单菌落在含有适当抗生素的YEP液体培养基（Rif，Str，Kan）中培养，PCR鉴定阳性克隆。得到的农杆菌转化子即可用于植物的转化。利用冻融法将质粒pCAMBIA 3300-I121-GmESR1转入农杆菌菌株LBA4404。转化后挑取单菌落摇菌，提取质粒。通过PCR扩增获得条带大小为为1164bp，表明成功将过量表达载体转化到农杆菌LBA4404中，并且构建了含有GmESR1片段的植物表达载体。

3.农杆菌介导大豆子叶节遗传转化：① 菌液制备：(1) 从-80℃水箱取出含有重组质粒的农杆菌菌种，用接菌环划线于YEP平板(Rif R，Str R，KanR)，28℃培养。挑取单菌落，接种于5mL YEP(50mg/L Str，25mg/L Rif和50mg/L Kan)液体培养基中，28℃，220rpm振荡培养过夜。取2mL培养物，加入到50mL YEP液体培养基(50mg/L Str，25mg/L Rif和50mg/L Kan)中，28℃培养至OD600为0.6～0.8。(2) 菌体于5000 rpm，离心10 min后重悬于感染液（液体CCM培养基）中，OD600调整至0.6。②大豆无菌苗的培养和子叶节的制备：(1)大豆种子的灭菌和萌发：取表面光滑无病斑的大豆成熟种子，放入NaClO／HCl（24：1），HCl稍过量的滤器中灭菌8h。将氯气灭菌后的小粒豆种脐向下接种至萌发培养基（GM），光照25℃、16h光照/8h黑暗条件下培养4-6天。(2)子叶节外植体的制备：选择无污染、健壮的幼苗,去掉种皮，保留3－5mm下胚轴区域,沿2片子叶中间纵切子叶节，将2片子叶分开,切去主芽，保留完整的子叶，在子叶的叶腋处划10刀左右以制造伤口，切好的外植体放入在角瓶中，备用。每个无菌苗可产生2个用于转化的子叶节外植体。③ 侵染和共培养：将制备好的子叶节外植体放入重悬后的侵染液中28℃，100rpm摇晃30分钟。倒掉菌液,将外植体放入上下均铺有无菌滤纸的大培养皿内，吸掉多余的菌液。然后将大豆子叶节外植体放入有滤纸的培养基（CCM）上。共培养培养基与农杆菌重悬培养基相同，加0.8%琼脂固化。培养物在24-25℃、无光条件下共培养3天。④恢复培养筛选培养：共培养3天后把外植体取出，放入没有菌的去离子水中清洗数次，再转移到无菌的（SIM）中洗数次，然后倾斜着插入固体培养基（SIM）中。在恢复培养基中培养7天，转入含有7mg/L PPT的固体筛选（SIM⁺）培养基中培养。⑤ 丛生芽的伸长、生根和移苗：将外植体转入固体芽伸长培养基（SEM）中。7-10天继代一次，直到苗长到4-6cm时，将其转入生根培养基（RM）中培养，直到根足够健壮时，将其转移至液体1/2MS中，敞口练苗5-7天后，移栽到混有蛭石的土中培养（刚培养的3天用保鲜膜遮盖保湿，弱光下培养）。

4. 转基因植株的检测：① 转基因大豆DNA提取：SDS小量法提取大豆基因组总DNA，具体步骤为：(1) 用组织研磨器在2mL EP管中研磨1-2片大小适当的植物叶片，迅速加入800μL EB缓冲液，100μL10%的SDS，震荡10s后，65℃温浴30min其间颠倒两次，再加入150μL 醋酸钾涡旋6s，置于冰上放置30min；(2) 加入800μL酚/氯仿 (1：1)，颠倒不少于15次， 12000rpm，4℃离心5min；(3) 重复上述步骤后，静止于-20℃中30分钟；(4) 取上清液，加入等体积的冷异丙醇，颠倒不少于15次， 12000rpm，4℃离心1min；(5) 弃掉乙醇，用70%乙醇吹打2次后，12000rpm，4℃离心1min；(6) 弃上清液，室温干燥后加入50μL无菌去离子水溶解，-20℃短期保存或者-80℃长期保存。② 转基因大豆PCR鉴定：对所提取的植株DNA进行PCR鉴定，所需引物、PCR体系以及PCR程序如（表14，表15和表16）。③ 转基因植株表型及其PPT抗性分析：对转基因大豆的表型进行分析，发现GmESR1在大豆中的过量表达会促进大豆幼苗的生长。对过表达大豆T1代检测，以包括35S和NOS的引物为检测引物，T0代转基因大豆经过子叶节法转化后，收获T0代种子，种入土中，待长出第一个三出复叶时SDS小量法提取幼嫩的大豆叶片DNA，以非转基因烟草为阴性对照，水为空白对照，表达载体质粒为阳性对照，进行PCR鉴定，共检测出6株阳性植株。为了筛选出转基因阳性植株，我们对转基因植株和空白对照植株的叶片进行了PPT的浓度递增的实验，分别用浓度150mg/L、200 mg/L 、250 mg/L、 300 mg/L的PPT对叶片进行涂抹筛选，结果表明转基因阳性植株能抗250 mg/L以下的PPT。

表14 DNA扩增所用引物

引物名称	引物序列
		GmESR1F:	5' TGGATCCCTTCAGAAAGTATCACTAC 3' Seq ID No:6
GmESR1R:	5' AGAGCTCTAATTGAAAGGCCAGAC 3' Seq ID No:7
		35s：	5'AGGAAGGTGGCTCCTACAAATG 3' Seq ID No:8
nos:	5'AATGTATAATTGCGGGACTCTAATC 3' Seq ID No:9

表15阳性转化植株PCR鉴定

试剂	用量
		植株DNA	1μL
10×PCR缓冲液	2.5μL
		MgCl2（25mM）	2.0μL
dNTP Mix（10mM）	0.5μL
		上游引物(10μM)	0.5μL
下游引物(10μM)	0.5μL
		Taq DNA聚合酶(5U/μL)	0.3μL
无菌水	19.7μL

表16 PCR反应程序

程序	温度和时间
		预变性	94℃, 5min
变性	94℃, 0.5min
		退火	59℃, 0.5min
延伸	72℃,1.5min
		终延伸	72℃, 10min
保存	10℃

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书其等效物界定。

<110> 东北农业大学

<120>大豆再生相关基因（GmESR1）及其表达分析

<160>9

<210>1

<211>1164

<212>DNA   

<213>人工序列

<400>1

ATGAGGCGTC TCAACGGGGT AGCTCCGATT ATCGGACCCG ACTCGAAAGG CGACGGTGGA       60

CTCATCGCCA ATAACCCGAA ACGGACCTCG GCCGTGAACA AGAGGGCTTT AAGAGAAGAC       120

GGCGGCGGTG GTGGCGGCGG CGGAGCGATG AGGTACCGCG GCGTGAGGCG CAGGCCGTGG       180

GGGCGTTACG CGGCGGAGAT AAGGGACCCT CAATCGAAGG AGCGGCGATG GCTGGGAACC       240

TTCGACACGG CGGAGGAAGC CGCTTGCGCC TACGACTGCG CTGCTAGAGC CATGAGGGGT       300

CTCAAAGCTC GCACCAACTT CGTTTACCCA ACTTCTCCGC AACCTTCTTC CGCCACCACC       360

GAACACTTGT TCCCTAACTT CAACAACAAC AACAACTTTC ACAAACACTC ACTCTTCAAT       420

CACCACCGTA ACCGCCACAT AACCGGTTCC AACACTTGTT TTGACCACCC TCACTCCGTT       480

GACTTTTCAG CCCCTCGAAA CCCTTCTTCT CTCAACATGC TTCTCTTTCG TGACCTTATT       540

CACTCTAACC CTTCTTTGCT TTCTTCTTCT TCCACTCAGA ACTTCCACGA CCAGTTTTAC       600

AACAAGAGTA CTTCTACTTT TTCATCGTTA CCTGTTTCTC CTTCTCTTGC TCCCCCTAGT       660

TATTCGATGA ATAATTCTTG TGGAGGCTCT TTGTCTGTTA AGATGAACAC GTTTCCCACT       720

TGTGGAACTA ATTTTGCTGA AAAAGGTGAT GATGGTGATG GTTTTTTCTC TCGTGAGTCT       780

TCGGATTCGG GGTTGTTGGA GGAGATAGTT AACAAGTTCT TGCCTAGAAC GAAGCCTAGT       840

AAATGCGAGA CTACTTTTGC AAATCCTCAG GAGGAGTCGC TTCTTCTCCC TCCGCTTGTT       900

TCTGAATCAA CGCTTGTTTC CACCGGGCAA CAATACTATG ATGATGACAT GAAAAAAGGG       960

TTTCCAAAGA ACGAGGGTCT AGGTGTTTTT TATTCTGATC AAGGTTTTCC CATGCAGCAA       1020

TTCGACACCC CTAATGGGTT TAATAGCATG GCTATGGAGA ATGATCAAAA CATTATTAAT       1080

AATGCAGAGA ACTGTGTCAT TGAAGATGTT TTTCAGTACC AAGAGCTTCT TAATGCTTTC       1140

GCAATCAGAA TGCAAAATGC TTAA                                              1164

<210>2

<211>23

<212> DNA

<213>人工序列

<400>2

CTTCCACTCA GAACTTCCAC GAC                                              23

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

TAACAGACAA AGAGCCTCCA CAA                                              23

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

GTGTCAGCCA TACTGTCCCC ATTT                                           24

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

GTTTCAAGCT CTTGCTCGTA ATCA                                           24

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

TGGATCCCTT CAGAAAGTAT CACTAC                                         26

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

AGAGCTCTAA TTGAAAGGCC AGAC                                           24

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

AGGAAGGTGG CTCCTACAAA TG                                            22

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

AATGTATAAT TGCGGGACTC TAATC                                         25

 

Claims (1)

1. 大豆再生相关基因（GmESR1）及其表达分析，其特征在于利用同源克隆技术通过对植株喷施细胞分裂素的方法，克隆得到细胞分裂素信号途径中的转录因子GmESR1基因（Seq ID No:1），该基因全长1164bp。