CN109266657A - 植物营养贮存蛋白（GmVSPWd）基因 - Google Patents

Abstract

植物营养贮存蛋白(GmVSPWd)基因，属于遗传工程技术领域，其特征在于以大豆东农50子叶节为材料，在细胞分裂素6‑BA诱导下，抑制消减杂交出差异基因，以期获得再生相关基因并进行基因克隆，利用农杆菌介导的方法转化植物，观察转基因植株的变化，通过定量RT‑PCR方法初步分析基因的功能，研究细胞分裂素对再生的影响；从子叶节器官发生途径结合激素对大豆再生途径相关转录因子基因的表达影响入手，分析再生基因在再生体系中的作用，寻找到大豆植物营养贮存蛋白(GmVSPWd)基因(Seq ID No:1)。

Description

植物营养贮存蛋白(GmVSPWd)基因

技术领域

本发明涉及一种植物营养贮存蛋白(GmVSPWd)基因，属于遗传工程技术领域。

背景技术

大豆是我国重要的粮食和油料作物，针对我国目前大豆供给紧张、大多依赖进口的严峻局面，急需加快分子育种研究的步伐，在短期内大幅度提高我国大豆的单产和总产水平。而生物技术是分子育种的主要手段，生物技术在大豆育种中应用的一个关键保障就是高效稳定的再生体系。但是由于大豆再生受基因型影响，只有少数大豆品种的再生体系比较稳定，因此阻碍了生物技术在多数大豆品种中的应用。抑制消减杂交技术(SSH,Suppression Subtractive Hybridization)是分离克隆差异表达基因的一种新方法，由Diatchenko等人于1996年提出的，结合了抑制PCR(Suppression PCR)技术和消减杂交法而建立的。抑制消减杂交技术(SSH)是鉴定、分离细胞组织中的选择性差异表达基因的一种方法。SSH技术已被国内外广泛应用于动物和植物研究领域。大豆组织培养的外植体除了原生质体和单细胞以外，常用的还有胚、子叶、子叶节、真叶及下胚轴等。将这些外植体培养在添加不同种类和浓度的细胞分裂素的培养基上诱导产生不定芽后再生植株，培养基主要是MS或B5基本培养基，常用的植物激素有6-BA、NAA、IBA和IAA等，集中研究基因型、培养基类型、激素浓度及外植体种类等对不定芽形成的影响。由于大豆器官发生的外植体具有来源广、组织培养时间短等特点，因此仅用3个月即可得到再生大豆植株，这样得到的再生植株嵌合体居多，筛选难度很大，使得鉴定、筛选传代和纯化再生大豆植株的工作量大大地加大了。在20世纪80年代，人们发现了一种专门的贮藏蛋白，广泛存在于营养器官中，区别于种子贮藏蛋白，称为植物营养贮存蛋白(vegetative storage proteins,VSP)，这种贮藏蛋白首先是在树木中发现的，是作为植物氮源的贮存形式而被人们认识。大豆的VSP最早是从叶中鉴定出来，也以大豆叶中的营养贮藏蛋白质研究得最为深入。大豆是世界上公认的难转化的作物，大豆的高效遗传转化也一直是植物基因工程领域的难点之一。大豆转基因技术研究的重心是大豆高效再生体系的建立及大豆再生相关基因发生机理和调控因子方面，通过优化再生条件及分析再生基因的功能进而提高大豆的再生能力，为建立高效、稳定的再生体系和遗传转化体系奠定基础。再生相关基因还能够以一种新型无争议的生物安全标记基因来替代抗生素、除草剂等选择标记，在导入外源目的基因的同时提高受体植物的再生能力，对植物转基因育种效率及转基因新品种的安全性具有重要意义。关于植物再生相关基因的克隆在国内外报道甚少，而大豆再生相关基因的克隆更是鲜见报道，因此，如何通过现代分子生物学技术从根本上提高大豆的再生能力，找到控制大豆再生的植物营养贮存蛋白(GmVSPWd)基因等能够发挥关键作用的相关功能基因，解决大豆再生体系建立难、转化难成为急需解决的一大难题？所以以大豆东农50子叶节为材料，在细胞分裂素6-BA诱导下，抑制消减杂交出差异基因，获得再生相关基因并进行基因克隆，利用农杆菌介导的方法转化植物，观察转基因植株的变化，通过定量RT-PCR方法初步分析基因的功能，研究细胞分裂素对再生的影响；从子叶节器官发生途径结合激素对大豆再生途径相关转录因子基因的表达影响入手，分析再生基因在再生体系中的作用，寻找再生基因并对基因进行克隆和改造；从分子水平上分析基因的功能并研究其作用机理，为发掘大豆再生基因，提高大豆的再生和遗传转化效率，发明一种植物营养贮存蛋白(GmVSPWd)基因是必要的。

发明内容

为了通过现代分子生物学技术试图从根本上提高大豆的再生能力，解决大豆再生体系建立难、转化难的难题，本发明提供了植物营养贮存蛋白(GmVSPWd)基因，该发明以大豆东农50子叶节为材料，在细胞分裂素6-BA诱导下，抑制消减杂交出差异基因，以期获得再生相关基因并进行基因克隆，利用农杆菌介导的方法转化植物，观察转基因植株的变化，通过定量RT-PCR方法初步分析基因的功能，研究细胞分裂素对再生的影响；从子叶节器官发生途径结合激素对大豆再生途径相关转录因子基因的表达影响入手，分析再生基因在再生体系中的作用，寻找到大豆植物营养贮存蛋白(GmVSPWd)基因(Seq ID No:1)。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

本发明的植物营养贮存蛋白(GmVSPWd)基因，其特征在于采用抑制消减杂交法获得GmVSPWd基因(Seq ID No:1)。具体步骤如下：①抑制消减杂交法：首先，获得大豆子叶节并用6-BA处理；接着，用RNAiso Plus的方法提取大豆子叶节的总RNA，采用SMART(Switching Mechanism At 5 end of the RNA Transcript)技术合成cDNA，纯化双链cDNA，纯化RsaI酶切及其产物，接头连接，杂交，分析消减杂交后两次PCR扩增的结果，纯化PCR产物，构建抑制消减杂交文库，最后，克隆GmVSPWd基因(Seq ID No:1)并对其序列分析。②GmVSPWd基因的生物信息学分析。③GmVSPWd基因的植物表达载体构建。④中间载体的构建。⑤GmVSPWd植物表达载体转化农杆菌：利用冻融法将物表达载体质粒转入农杆菌菌株。转化后挑取单菌落摇菌，提取质粒。通过PCR扩增获得条带大小为1129bp，表明成功将表达载体转化到农杆菌中。I.农杆菌的制备及转化：i.农杆菌感受态的制备；ii.农杆菌转化子的鉴定。⑥子叶节法转化大豆：将目的基因GmVSPWd基因转入植物体中。II.子叶节法转化大豆：i.转化中用到的培养基；ii.大豆种子灭菌剂子叶节外植体的获得：①侵染与共培养；②丛生芽的诱导及筛选；③抗性芽的伸长和生根；④抗性植株的驯化。⑦转基因植株的检测：I.转基因大豆DNA的提取：SDS小量法提取植物总DNA；II.转基因植株的PCR鉴定；III.过表达大豆的检测。⑧GmVSPWd基因的组织特异性表达：结果表明GmVSPWd基因在子叶中表达量最高，其次是茎、根，可推测该基因在子叶再生，茎的伸长中发挥一定的作用。

本发明的有益效果为：植物营养贮存蛋白(GmVSPWd)基因发现：.①利用抑制消减杂交的方法，以大豆DN50的子叶节为材料，以细胞分裂素6-BA作为诱导条件，构建了大豆再生相关基因的cDNA消减文库。②克隆获得GmVSPWd基因，GmVSPWd基因(Seq ID No:1)834bp的CDS区共编码278个氨基酸序列，其分子量为32.0471kDa，理论等电点PI为6.75。③利用农杆菌的介导，采用子叶节法将GmVSPWd基因的植物表达载体进行大豆的遗传转化。④Real-time RT-PCR分析表明，GmVSPWd在大豆根、真叶、三出复叶、茎、花芽、中均有表达，但表达具有组织特异性，对大豆子叶再生和茎伸长表现最明显。⑤Real-time RT-PCR分析表明，GmVSPWd的表达受6-BA的调控诱导，在受6-BA处理后1-9h表达量平稳，9h时开始升高，12h达到最高值后又逐渐下降，基因可能在细胞分裂素途径下游起作用。

附图说明

下面结合附图对本发明进一步说明。

图1为植物营养贮存蛋白(GmVSPWd)基因的核苷酸序列(Seq ID No:1)图。

图2为植物营养贮存蛋白(GmVSPWd)基因的不同浓度的6-BA对GmVSPWd大豆的影响图

图3为植物营养贮存蛋白(GmVSPWd)基因的6-BA处理后大豆GmVSPWd基因的表达图。

图4为植物营养贮存蛋白(GmVSPWd)基因的组织表达图。

图5为植物营养贮存蛋白(GmVSPWd)基因的大豆遗传转化图。图中A:大豆东农50种子；B:萌发6d的大豆幼苗；C:共培养中的子叶节；D:芽诱导；E:外植体的伸长；F和G:根的生长。

具体实施方式

在本说明书的上下文中，除非特别指明否则本说明书所用的任何术语具有本领域技术人员在本领域中通常理解的含义，而未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例一

一.实验材料和试剂

1.植物材料-大豆品种：再生率高的东农50，来自武小霞实验室。

2.菌种及载体：大肠杆菌E.coli DH5α；农杆菌(Agrobacterium tumefacieus)LBA4404；载体pCAMBIA3300，pBI121；pMD18-T载体购自TaKaRa公司。

二.主要实验试剂

CLONTECH SMARTer^TM PCR cDNA Synthesis Kit和CLONTECH PCR-Select^TM cDNASubtraction Kit购买自CLONTECH公司；RNAiso Plus、pMD18-T、LA Taq DNA 聚合酶DL2000、DL8000、DL15000购买自TaKaRa公司；限制性内切酶EcoRI、HindIII、SacI、SmaI购买自Fermantas公司；SYBY Green I荧光定量试剂盒购买自大连宝生物公司；引物合成和测序由北京华大基因完成。

三.实验方法

(一)抑制消减杂交法

1.大豆子叶节的获得及6-BA处理

选取当年收获的表面光滑无病、健康饱满的东农50种子，利用氯气消毒法灭菌：将种子放在培养皿中，称量96mL的次氯酸钠放于广口瓶中，将其与放种子的培养皿平稳的放在通风橱内密闭的容器内，称取4mL的浓盐酸倒入盛有次氯酸钠的广口瓶中，迅速密封容器，灭菌12-16h后，将种子接种于MS(MS粉末4.43g，蔗糖20g，琼脂0.8％，pH＝5.8)培养基上，在24℃，长日照(16h光照/8h黑暗)条件下培养6d，在超净台中取出无菌苗，剥去种皮，切掉大部分下胚轴，只留下靠近子叶的3-5mm下胚轴，将2片子叶从下胚轴中线处切开，除去顶芽和腋芽，在近生长点出划伤口，得到子叶节外植体。将一部分子叶节外植体接种到添加6-BA的液体培养基(4.43MS+2mg L^-1 6-BA，2％蔗糖，pH＝5.8)中振荡培养，以处理1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h取样作为SSH tester；另一部分子叶节外植体接种在不添加6-BA的液体培养基(4.43MS+2mg L^-1 6-BA，2％蔗糖，pH＝5.8)中，同样以处理1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h取样作为SSH Driver，每个时间点取三份材料备用，液氮速冻，-80℃保存。

2.大豆子叶节RNA的提取

准备工作：配制0.1％DEPC水；将研钵、镊子、药匙等用锡纸包裹，放入干热灭菌箱中，180℃干热灭菌过夜；用0.1％DEPC水配制TAE电泳液。用RNAiso Plus的方法提取大豆子叶节的总RNA：(1)用液氮取出-80℃保存的子叶节，置于装有液氮的研钵中，液氮中研成粉末，研磨中不断加入液氮，转移至1.5mL离心管中；(2)加入1mL RNAiso Plus提取液，振荡混匀，于室温下静置5min，4℃，12000rpm，离心5min；(3)取上清液转入新1.5mL离心管中，转移至0.2mL氯仿，剧烈振荡15s混匀，室温静置5min，4℃，12000rpm，离心15min；(4)取上清液转入新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇混匀，室温静置10min，4℃，12000rpm，离心10min可见白色沉淀；(5)弃上清液，加入1mL 75％乙醇溶液，吹打洗涤RNA沉淀，4℃，12000rpm，离心5min；(6)弃上清液，在超净台中干燥RNA沉淀大约15min，加入50μL DEPC水溶解沉淀，待RNA充分溶解后，-80℃保存；(7)用2％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。其结果为：对实验组和对照组1-10h的大豆子叶节进行总RNA的提取，经过2％琼脂糖凝胶电泳检测，28S、18S和5S三条带条带清晰RNA。

3.cDNA的合成

(1)第一链cDNA的合成

1)在一小离心管中加入以下成分：

RNA 3.5μL

3’SMART CDS Primer IIA 1μL

2)上下吹吸混匀，微离，PCR仪上72℃温育3min，42℃温育2min；

3)向步骤1的离心管中加入以下成分：

4)涡旋混匀，快速离心，在控温摇床上42℃温育90min；

5)PCR仪上70℃温育10min以终止反应；

6)加入40μL TE buffer，稀释第一链反应产物；

7)-20℃保存。

(2)LD PCR扩增cDNA

1)取1μL稀释的cDNA于标记的0.5mL离心管中，加入9μL无RNA水，终体积至10μL，取1.5μL于另一PCR管，标记；

2)按次序加入以下样品，制备PCR Master混合物：

3)混匀，微离，将Master混合物分装9个小管，各10μL，按1-9顺序编号；

4)立即进行PCR：

5)在15个循环时取出管样品，放4℃保存，并将选择管分别在18、21、24、27、30、33、36、39个循环时各取出一管：

6)分别取出5μL进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，确定最佳循环数。

其结果为：SMART(Switching Mechanism At 5 end of the RNA Transcript)技术是利用真核mRNA特有的“帽子结构”而扩增得到全长的cDNA，并经过PCR方法得到处于对数期扩增阶段的扩增情况最佳的双链cDNA，既不因循环次数过少而丧失过多的低拷贝数基因，又不会因循环次数太多而产生非特异性的产物。选取能够代表原有样品中的mRNA的丰度的cDNA样品。实验中Tester在第30个循环时显示扩增效率降低，故采用27个循环进行cDNA扩增；而Driver在第27个循环时显示低扩增效率，所以采用了24个循环进行cDNA扩增。

4.双链cDNA纯化：(1)在PCR产物中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，彻底涡旋混匀，室温，14000rpm，离心10min；(2)转移上清液于新离心管中，加入700μL正丁醇，彻底涡旋混匀，室温，14000rpm，离心1min；(3)重复步骤2，使液体终体积达到40-70μL；(4)上下颠倒CHROMA SPIN+TE-1000柱几次充分重悬胶基质，移去柱子上盖，再移去柱子下盖，将柱子放于1.5mL离心管中，待柱子中的液体流尽后加入1.5mL 1×TNE缓冲液，当液体再重力作用下流尽后，弃去收集的缓冲液进行纯化(柱子胶质高度约再0.75mL)；(5)小心缓慢的将样品滴在胶平面中心，避免样品顺壁流下；(6)加入25μL 1×TNE缓冲液使液体完全流出；(7)加150μL 1×TNE缓冲液使液体完全流出；(8)转移柱子至一新1.5mL离心管中，加入320μL 1×TNE缓冲液，收集流出液为纯化的dscDNA，取10μL于新离心管中标记为“样品B”用于琼脂糖凝胶电泳检测；(9)加75μL 1×TNE缓冲液，收集流出液于另一离心管中，取出7μL于新离心管中，标记为“样品C”，用于1％琼脂糖凝胶电泳检测收集结果。

5.RsaI酶切及其产物的纯化：(1)从纯化的dscDNA样品中取出10μL标记为“样品D”，用于电泳分析dscDNA片段大小；(2)再纯化的dscDNA中加入36μL 10×RsaI缓冲液和1.5μL RsaI，涡旋混匀，快速离心，在(恒温培养箱)37℃中温育3h；(3)取10μL酶切后产物和“样品D”进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否成功；(4)取10μL酶切产物标记为“样品E”，-20℃保存用于比较分析纯化的酶切产物结果；(5)加入等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，涡旋混匀，室温，14000rpm离心10min；(6)转移上清液至新离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1),涡旋混匀，室温，14000rpm离心10min；(7)转移上清液至新离心管中，加入适量4M NH₄OAC和2.5倍体积的95％乙醇，室温14000rpm离心20min；(8)弃上清，用200μL 80％乙醇洗涤沉淀，室温，14000rpm离心5min；(9)弃上清，空气中干燥5-10min，溶解沉淀于5.5μL无RNA水，-20℃保存。

6.接头连接

(1)用5μL无RNA水稀释1μL RsaI酶切产物，混匀。

(2)制备Master混合物：无RNA水(3μL)；5×连接缓冲液(2μL)；T4DNA连接酶(1μL)。

(3)按次序加入以下试剂，上下吹吸彻底混匀：

(4)另取一管混合2μL Tester 1-1和2μL Tester 1-2。

(5)16℃温育过夜。

7.杂交

(1)第一次杂交

1)将4×杂交缓冲液置于室温至少15-20min，确认使用前没有沉淀必要使，37℃加热10min；

2)按次序加入以下试剂，上下吹吸，彻底混匀：

3)在每一管中加一滴石蜡，快速离心，PCR仪上98℃温育5min，PCR仪上68℃温育8-9h，立即进行第二次杂交。

(2)第二次杂交

1)在一离心管中加入以下试剂混匀：Driver cDNA(1μL)；4×杂交缓冲(1μL)；无RNA水(2μL)。

2)取以上混合物1μL放于另一离心管中，并覆盖一滴石蜡，PCR仪上98℃温育5min，即为变性Driver。

3)从PCR仪上取下新鲜变性的Driver，按照下面程序同时混合Driver、杂交样本1和杂交样本2：①将移液器调至15μL；②轻柔的将枪头伸至杂交样本2和石蜡交界面处；③仔细吸取整个样本，不用担心少量石蜡也被吸入；④从管中移走枪头吸进少量空气在样本液滴下面产生小的空气隔离段；⑤重复②-④吸取新鲜热变性的Driver；⑥将整个混合物加入到杂交样本1的管中；⑦上下吹吸混匀。

4)快速离心，PCR仪上68℃温育过夜，向管中加入200μL稀释缓冲液并吹打混匀，PCR仪上68℃温育7min，-20℃保存。

RsaI酶是一种四碱基内切酶，约256bp，有一个酶切点，能将双链cDNA酶切成较小的cDNA片段，小片段可以降低杂交过程中形成的复杂二级机构对杂交的阻碍作用，这既提高不同基因的检出率，又防止了长cDNA片段对消减杂交的干扰。

8.消减杂交后两次PCR扩增的结果分析

(1)第一次PCR反应扩增：1)制备PCR模板，取1μL稀释的杂交样品cDNA和1μL未消减tester对照放于离心管中；2)按次序加入以下试剂制备PCR Master混合物：无菌水(19.5μL)；10×PCR缓冲液(2.5μL)；dNTP Mix(0.5μL)；PCR Primer I(1.0μL)；LA酶(0.5μL)；总体积(24μL)。3)涡旋混匀并快速离心，向每个样品中加入24μL PCR Master；4)每管中各加一滴石蜡，快速离心；5)在PCR仪上75℃温育5min延伸接头；6)立即开始PCR：94℃(25s)；94℃(10s)；68℃(30s)；72℃(1.5min)；2-33个循环；在24、27、30、33个循环时各取出一管；7)每个样品各取5μL进行2.0％琼脂糖凝胶电泳分析结果，-20℃保存。

(2)第二次PCR反应扩增：1)取初次PCR循环较好产物取3μL用27μL无菌水稀释，取出1μL加入标记好的离心管中；2)按次序加入以下试剂制备PCR Master混合物：无RNA水(18.5μL)；10×PCR buffer(2.5μL)；Nested PCR Primer 1(1.0μL)；Nested PCR Primer2R(1.0μL)；dNTP Mix(0.5μL)；LA酶(0.5μL)；总体积(24μL)。3)向步骤1标记好的每个离心管中加入24μL Master混合物，每个样品做2管。4)每管中加一滴石蜡，快速离心，立即开始PCR循环：94℃(10s)；68℃(30s)；72℃(1.5min)；1-18个循环；分别在12、15、18个循环时取出一管；5)每个样品取5μL进行2.0％琼脂糖凝胶电泳分析结果，-20℃保存。

9.PCR产物纯化：(1)按次序加入以下试剂制备PCR Master混合物：无RNA水(18.5μL)；10×PCR buffer(2.5μL)；Nested PCR Primer 1(1.0μL)；Nested PCR Primer 2R(1.0μL)；dNTP Mix(0.5μL)；LA酶(0.5μL)；总体积(24μL)。(2)取第二次PCR循环数较好的扩增产物tester15μL加入PCR Master混合物，混匀，分装到10个离心管，按t1-t10标记。(3)按步骤1-2将第二次PCR扩增Driver分装。(4)快速离心，立即开始PCR：94℃(10s)；68℃(30s)；72℃(1.5min)；1-15个循环。(5)PCR结束，将10个管混合，取5μL进行2％琼脂糖凝胶电泳。(6)加入1/10体积的3M NaAC(pH＝5.2),涡旋混匀。(7)加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)抽提，涡旋混匀，室温，14000rpm离心10min。(8)取上清，加2.5倍体积无水乙醇涡旋混合均匀后室温下静置30min，14000rpm，离心10min。(9)弃上清，加适量80％乙醇洗涤沉淀，14000rpm，离心5min。(10)弃上清，空气干燥沉淀，加20μL无RNA水溶解沉淀。(11)取3μL样品进行2.0％琼脂糖凝胶电泳，-20℃保存。

在杂交液中进行第一次杂交，杂交结束后会形成四种杂交产物：a是均一化了的差异表达的单链Tester cDNA；b是自身退火的Tester cDNA双链；c异源退火的是Tester和Driver cDNA；d是Driver cDNA。将两份第一次杂交样品进行混合，再加入新鲜热变性Driver cDNA在缓冲液中进行第二次杂交，进一步除去共有序列，由第一次杂交时在退火中形成的均一化了的连接不同接头的差异表达的单链Tester cDNA特殊类型的分子e，第二次杂交补平接头末端。加入adapter 1和adapter 2R的部分特异序列进行PCR扩增，第一次PCR扩增时a和d没有引物结合位点故不能进行扩增；b两端连有相同的接头，接头上有反向重复序列抑制PCR也不能进行扩增；而c是单接头，只能进行线性扩增；只有两端连接有不同接头的双链DNA分子e才可进行扩增，扩增产物即为目的片段。第二次PCR扩增使接头内侧的引物选择性扩增目的片段，经过了两次杂交和两次Nested PCR，目的片段即被消减并富集，得到了长度大约在200bp-1400bp的均匀的弥散状片段，平均大小约在400-700bp左右。

10.抑制消减杂交文库的构建

I.PCR产物连接T载体：(1)在离心管中加入以下试剂：纯化PCR产物(4μL)；PMD 18-T vector1(1μL)；Solution I(5μL)。(2)16℃连接2h。

II.连接产物的转化：(1)取5μL连接产物于1.5mL离心管中，放置于冰上，向其中加入50μL大肠杆菌感受态，轻弹混匀，冰浴30min；(2)将混合物于42℃水浴热激90s后立即置于冰上，期间不要摇动；(3)向混合物离心管中加入200μL LB固体培养基，37℃，220rpm振荡培养45min，取出后放置于冰上；(4)将菌液分别涂布在含有50μL IPTG、25μL X-Gal、50μLAMP，37℃倒置过夜培养16h；(5)将平皿置于4℃保存2h，使其充分显色；(6)挑取单菌落，接种于5mL含有5μL AMP的LB液体培养基，37℃，220rpm振荡培养过夜；(7)培养基明显变浑浊后，取0.5mL菌液于0.5mL无菌的30％甘油中保存菌种，标记，-80℃保存菌种。

III.PCR鉴定插入的目的片段：(1)按次序加入以下试剂制备Master混合物：无RNA水(18.7μL)；10×PCR buffer(2.5μL)；Nested PCR Primer 1(0.5μL)；Nested PCR Primer2R(0.5μL)；dNTP Mix(0.5μL)；LA酶(0.3μL)；总体积(23μL)。(2)微离，开始PCR扩增：94℃(5min)；94℃(30s)；68℃(30s)；72℃(2min)；2-33个循环；延伸，72℃(5min)。(3)PCR结束后，进行1.0％琼脂糖凝胶电泳。将鉴定为阳性克隆的菌液按1：1加30％甘油，于-80℃中保存菌种。经SSH消减并富集得到的cDNA片段，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选蓝白班，随机挑取1028个克隆，PCR检测表明大多数插入片段长度约在100-750bp之间。

IV.ESTs测序：随机挑取1028个克隆送至北京华大基因进行测序，序列经过去载体、宿主序列重复序列后进行拼接，其中高质量的EST 532个，占总数的51.8％，将所得到的EST片段利用NCBI和PHYTOZOME的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)比对进行序列相似性分析。

V.文库中ESTs实时荧光定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)

将测序获得的EST片段序列在PHYTOZOME上比对得到基因全长，利用Primer5软件在CDS区上设计引物，以GenBank上登陆的大豆看家基因actin4(作为内参)分别设计引物。按照SYBR(R)Ex Script ^TM RT-PCR Kit的程序进行荧光定量PCR反应。东农50种子接种于MS培养基上，在24℃，长日照(16h光照/8h黑暗)条件下培养6d，切取子叶节，分别在加6-BA和不添加6-BA的液体MS培养基上震荡培养，按1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、24h、48h进行取样，RNAiso Plus法提取RNA，反转录成cDNA，-80℃保存。RT-PCR反应混合体系：每个样品进行3次重复，cDNA第一链(1.6μL)；上、下游引物各(1.6μL)；SYBR qPCR Mix(10μL)；去离子水(6.8μL)；总体积(20μL)。PCR反应条件：95℃预变性(30s)；40个循环：95℃变性(5s)；60℃复性(20s)；72℃延伸(20s)。利用Opticon Monitor 3.1软件对数据进行分析，计算基因的相对表达量。EST测序与同源性检索结果：随机获得的1028个克隆，其中高质量的EST 532个，占总数的51.8％。将测序结果到GenBank进行BLASTn和BLASTx比对，基因功能涉及信号转导，葡萄糖、蛋白质大分子生物合成代谢，光、叶形态发生；细胞凋亡、细胞自身防御、细胞壁分化；各种激素及细胞分裂素介导的信号通路。

VI.文库中ESTs实时荧光定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)

从荧光定量数据中可以得到以下结论：酸性磷酸酶基因在6-BA处理的前4h表达量平稳，4h至7h表达量不断升高，在7h时达到最高表达量，此后开始降低，12h后逐渐趋于平稳，表明基因在6-BA处理后受到抑制作用，属于负调控基因。GmVSPWb基因在受6-BA处理后1-2h表达量平稳，2h时开始升高，9h达到最高值后又逐渐下降，基因可能在细胞分裂素途径下游起作用。16S ribosomal基因在受细胞分裂素处理后1-10h趋于平稳，在11h是表达量达到最高，可以初步确定该基因可能在细胞分裂素途径下游。胆色素原脱氨酶基因在处理后第5h时表达量突然升高并到达峰值，后又趋于平衡，基因可能作用在细胞分裂素途径上游。

11.GmVSPWd基因的克隆及序列分析

I.GmVSPWd基因引物设计：从文库中挑选基因进行克隆，在Phytozome大豆基因组中调出GmVSPWd基因的序列，根据其CDS区序列应用Primer 5.0软件对其设计引物并添加酶切位点，在基因上游引物5’端添加SacI酶切位点，下游引物5’端添加SmaI酶切位点。引物序列设计如下：

表1 GmVSPWd基因扩增所用引物

II.RNA的反转录：(1)东农50大豆种子培养在萌发培养基上培养5d，取其子叶节提取RNA。(2)把RNA在65℃条件下热变性5min后，立即置于冰上冷却。(3)反应液的配制：Nuclease-free water(5.5μL)；5×RT buffer(2μL)；RT-Enzyme Mix(0.5μL)；Primer Mix(0.5μL)；热变性RNA(1.5μL)；总体积(10μL)。(4)逆转录反应：在37℃条件下，进行15min的逆转录反应；在98℃条件下，进行5min的酶失活反应。反应结束后，4℃或者-20℃条件下保存。

III.PCR扩增GmVSPWd基因：(1)依次加入以下试剂混合PCR反应体系：cDNA(1μL)；10×LA buffer(2μL)；dNTP Mix(0.3μL)；GmVSPWd-F(1μL)；GmVSPWd-R(1μL)；Takara LATaq(0.3μL)；ddH₂O(14.4μL)；Total volume(20μL)。(2)按如下程序进行PCR反应：预变性(94℃,5min)；变性(94℃,0.5min)；退火(58℃,0.5min)；延伸(72℃,1.5min)；35个循环；终延伸(72℃,10min)；保存(4℃)。(3)取5μL PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

IV.PCR产物胶回收：(1)在紫外灯下迅速切下目的条带于干净的1.5mL离心管中；(2)加入200μL Bing Buffer，57℃水浴7min，待琼脂糖完全溶化，颠倒混匀数次；(3)把溶液转移入吸附柱中，10000rpm离心1min，倒掉收集管的废体；(4)加入300μL Bing Buffer，10000rpm离心1min，倒掉收集管的废体；(5)加入700μL Bing Buffer，10000rpm离心1min，倒掉收集管的废体；(6)加入500μL Bing Buffer，10000rpm离心1min，倒掉收集管的废体；空离10000rpm离心2min，开盖在空气中放置3min，使酒精挥发；(7)将吸附柱取出，放入新的1.5mL离心管中，在吸附膜的中央加入30μL Elution Buffer，静止2min后，10000rpm离心2min，回收产物-20℃保存。

V.PCR产物连接T载体：(1)将回收的目的片断与pMD18-T载体连接，反应体系如下：Solution I(5μL)；胶回收产物(1μL)；pMD18-T载体(1μL)。(2)混合均匀16℃连接2h。

VI.连接产物转化大肠杆菌：(1)取50μL感受态细胞置于冰上，加入5μL连接产物，混匀，冰浴30min；(2)冰浴后42℃水浴热激30s后快速放置于冰上2-3min；(3)向混合物中加入200μL LB液体培养基，37℃，220rpm振荡培养1.5h；(4)将菌液涂布在含有Kana(50mg/mL)的LB平板上，37℃下倒置过夜培养16h；(5)挑取白色单菌落，接种于5mL含有5μL Kan(50mg/mL)的LB液体培养基，37℃，220rpm振荡培养12-16h；(6)取0.5mL菌液加入0.5mL无菌30％甘油，-80℃保存菌种。

VII.菌液PCR鉴定：(1)在冰上加入以下试剂，混合PCR反应体系：大肠杆菌菌液(1μL)；10×PCR Buffer(2μL)；Taq DNA聚合酶(0.3μL)；dNTP Mix(0.3μL)；上游引物(1μL)；下游引物(1μL)；ddH₂O(14.4μL)；Total volume(20μL)。(2)按以下步骤进行PCR反应：预变性(94℃,5min)；变性(94℃,30s)；退火(58℃,30s)；延伸(72℃,30s)；38个循环：终延伸(72℃,10min)；保存(4℃)。(3)取出5μL PCR产物，用1％琼脂糖凝胶电泳检测。(4)鉴定出的阳性克隆，与无菌30％甘油按1：1比例-80℃保存菌种，取700μL送至测序公司测序，得到GmVSPWd基因的序列为(Seq ID No:1)。

(二)GmVSPWd基因的生物信息学分析

将GmVSPWd基因的CDS区用DNAMan软件预测序列的氨基酸序列，通过NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的Protein Conservation Domain程序对GmVSPWd全长cDNA序列编码的氨基酸数目、组成进行结构分析，再利用(http://web.expasy.org/compute)网站分析蛋白质相对分子质量(Mr)、理论等电点，最后用Protscale(http://www.expasy.ch/tools/protscale.html/)工具对GmVSPWd编码的蛋白质产物的疏水性和亲水性等参数进行分析。

GmVSPWd基因的834bp的CDS区共编码278个氨基酸序列，其分子量为32.0471kDa，理论等电点PI为6.75，基因编码产物属于HAD superfamily,subfamily IIIB(Acidphosphatase)，这个家族包括酸性磷酸酯酶和部分营养贮藏蛋白质。

氨基酸序列的疏水性/亲水性分析的结果为：多肽链第96、216位的缬氨酸(Val)、甘氨酸(Gly)具有最低的分值-2.517，第11、12位的丙氨酸Alanine(Ala)具有最高的分值3.415。参考ProtScale软件，氨基酸分值越低亲水性越强和分值越高疏水性越强的规律，可以看出，在缬氨酸、甘氨酸亲水性最强，第丙氨酸疏水性最强，而就整体来看，亲水性氨基酸均匀分布在整个肽链中，多于疏水性氨基酸。

(三)GmVSPWd基因的植物表达载体构建

用双酶切的方法将载体PbI121和pCAMBIA3300在EcoRI和HindIII酶切位点切开构建中间表达载体pCAMBIA3300-121，再经过SacI和SmaI将中间载体与目的基因连接构建植物表达载体。①pCAMBIA3300、PbI121和pMD18T-GmVSPWd质粒的提取：(1)pCAMBIA3300和PbI121的保存菌种接种在Kan抗性的LB培养基中，28℃，100rpm振荡培养24-36h；(2)pMD18T-GmVSPWd的保存菌种接种在Amp抗性的LB培养基中，37℃，220rpm振荡培养12h；(3)取2mL灭菌离心管，加满菌液，12000rpm，离心1min，弃上清；(重复这一步骤，收集足够菌液)；(4)用250μL溶液P1重悬菌体沉淀；(5)加250μL溶液P2，温和颠倒4-7次，室温放置4min；(6)加350μL溶液P3，温和颠倒4-7次，充分混匀，有白色絮状沉淀出现，冰上加入静置3-5min，12000rpm，室温，离心10min,小心取上清；(7)将上一步上清液加入吸附柱AC中(要小心的滴加在滤膜上)，12000rpm，室温，离心10min，倒掉收集管中的废液；(8)加入700μL漂洗液Washing Buffer，12000rpm，室温，离心1min，弃废液；(9)加入500μL漂洗液WashingBuffer，12000rpm，室温，离心1min，弃废液；(10)将吸附柱AC放回空收集管中，12000rpm，室温，离心2min；(11)取出吸附柱AC放入一管干净的离心管中，加100μL洗脱缓冲液ElutionBuffer(EB事先在65-70℃水浴中加热效果更好)，室温放置2min，12000rpm，离心1min；(12)将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1min；(13)取出5μL进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，-20℃保存。②质粒的限制性内切酶酶切：(1)混合一下酶切体系：SacI(2μL)；SmaI(1μL)；10×Buffer Tango(1μL)；质粒(4μL)；ddH₂O(2μL)；Total volume(10μL)。(2)金属浴37℃酶切12h。(3)1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。(4)酶切产物胶回收。③GmVSPWd基因片段和pCAMBIA3300-121载体酶切回收片段的连接：(1)连接反应体系：T4DNA Ligase Buffer(2μL)；T4DNA Ligase(1μL)；GmVSPWd酶切后胶回收产物(3μL)；pCAMBIA3300-121酶切后胶回收产物(1μL)；ddH₂O(3μL)；Total volume(10μL)。(2)混合均匀，金属浴22℃温育5h，16℃连接过夜。④目的片段的扩增：用Trizol试剂法提取大豆东农50总RNA。利用设计的特异性引物进行PCR反应，得到1129bp的扩增片段。

(四)中间载体的构建

将PbI121和pCAMBIA3300空质粒载体用EcoR I和Hind III双酶切，其中载体PBI121回收带有CaMV35S启动子，nos终止子的GUS启动原件，长度为3032bp；载体pCAMBIA3300回收带有bar基因选择标记的片段，长度为8377bp，后将这两个片段连接重组获得中间载体pCAMBIA3300-121，长度为11409bp。

(五)GmVSPWd植物表达载体转化农杆菌

利用冻融法将物表达载体质粒转入农杆菌菌株。转化后挑取单菌落摇菌，提取质粒。通过PCR扩增获得条带大小为1129bp，表明成功将表达载体转化到农杆菌中。

1.农杆菌感受态的制备：(1)CaCl₂法制备根癌农杆菌感受态细胞：1)从含有抗生素Rif和Str的YEP培养基上挑取新鲜的DHA105单菌落接种到新的Rif和Str抗性的YEP培养基上，28℃，220rpm振荡培养过夜24-36h；2)取过夜活化的对数生长期的菌液，接种于YEP培养基中，继续培养至OD₆₀₀＝0.4-0.6左右；3)将菌液转入冰预冷的无菌离心管中，冰浴30min，4℃，4000rpm离心10min；4)弃上清，用10mL冰预冷的0.05M CaCl₂重悬菌体，冰浴30min，4℃，4000rpm离心10min；5)弃上清，用2mL冰预冷的0.05M CaCl₂重悬菌体；6)将制备好的感受态细胞4℃保存，24-48h转化率最高，100μL分装，30％无菌甘油，-80℃保存。(2)目的基因转化农杆菌感受态细胞：1)取100μL农杆菌感受态细胞置于冰上，加入2μL质粒轻弹管底部混匀，冰浴30min；2)冰浴后液氮速冻2min，迅速置于37℃水浴中热激5min，再迅速冰浴5min；3)加入500μL YEP液体培养基，28℃，100rpm振荡培养3-5h复苏菌体；4)将菌液涂布在含有Rif、Str和Kan的YEP固体培养基上，28℃，倒置培养24-36h。

2.农杆菌转化子的鉴定：挑取YEP固体培养基上的白色单菌落接种在含有Rif、Str和Kan的YEP液体培养基中，28℃，100rpm振荡培养24-36h，菌液用PCR方法和酶切鉴定，获得的阳性克隆与30％无菌甘油按1：1比例混合，-80℃保存。通过农杆菌介导，利用子叶节法对大豆进行遗传转化，将目的基因GmVSPWd基因转入植物体中。

(六)子叶节法转化大豆

1.转化中用到的培养基：(1)1L萌发培养基(GM)：3.21g B5粉末，2％蔗糖，1mg/L6-BA，0.7％琼脂，pH＝5.8；(2)1L共培养培养基(CCM)：0.321g B5粉末，3％蔗糖，3.9g Mes，1.67mg/L 6-BA，40mg/L AS，0.25mg/L GA3，0.154g/L DTT，1g/L L-cysteine，0.248g/LNaS2O3，0.5％琼脂，pH＝5.4；(3)1L芽诱导培养基(SIM)：3.21g B5粉末，3％蔗糖，0.59gMes，1.67mg/L 6-BA，250mg/mL cef，0.7％琼脂，pH＝5.6；(4)1L筛选培养基(SIM⁺)：3.21gB₅粉末，3％蔗糖，0.59g Mes，1.67mg/L 6-BA，500mg/mL cef，5mg/L PPT，0.75％琼脂，pH＝5.6；(5)1L芽伸长培养基(SEM)：4.43g MS，3％蔗糖，0.59g Mes，0.5mg/L GA₃，0.1mg/LIAA，1mg/L ZR，50mg/L L-Asp，250mg/mL cef，0.8％琼脂，pH＝5.6；(6)1L生根培养基(RM)：1.605g B₅粉末，2％蔗糖，0.59g Mes，1mg/L IAB，0.7％琼脂pH＝5.6。

2.大豆种子灭菌剂子叶节外植体的获得：①侵染与共培养：富集的农杆菌菌体用CCM培养基重悬，在子叶节生长点附近轻划伤口，与农杆菌重悬液混合在一起，置于摇床上，28℃，150rpm振荡培养30min；将子叶节外植体取出，用无菌吸水纸吸干菌液，倒扣在铺有一层无菌滤纸的CCM固体培养基上，暗培养3d。②丛生芽的诱导及筛选：将共培养后的子叶节用无菌水清洗两次，然后再用加有除菌剂的SIM液体培养基清洗两次，用无菌吸水纸吸干子叶节表面的水分，接种在添加除菌剂的SIM固体培养基上，进行恢复培养。在芽诱导培养基上培养7d后，将其转入含有PPT浓度为5mg·L-1的筛选培养基中进行筛选7d。培养条件为：温度24±1℃；光周期为16h/8h。③抗性芽的伸长和生根：将筛选7d后的外植体转入芽伸长培养基中，转入时切掉子叶以及下胚轴基部的老化组织，每7d继代一次。当芽伸长至3-4cm时，将其贴着根部切下，转入生根培养基中进行生根培养。④抗性植株的驯化：待外植体在伸长培养基中的根足够发达后，打开瓶口培养3-5d，待无菌苗适应有菌的外界环境后，将植株取出洗净培养基，转至蛭石中避光保湿培养，然后逐渐降低湿度、增强光照培养。待小植株缓苗成活后转移到正常土壤中栽培，保持温、湿度和正常光照至结荚成熟。

(七)转基因植株的检测

1.转基因大豆DNA的提取：SDS小量法提取植物总DNA。(1)去适量植物叶片于1.5mL的离心管中，用研磨器研碎叶片至粉末，加入400μL EB缓冲液，80μL 10％的SDS溶液，混匀，65℃水浴30min，每隔10min颠倒一次；(2)水浴后加入200μL 5M KAC溶液，颠倒数次混匀，冰浴30min；(3)冰浴后加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)溶液，颠倒混匀，室温静置5min，12000rpm，离心15min；(4)取上清，加入与上清液等体积的氯仿：异戊醇(24:1)溶液，室温静置5min，12000rpm，离心10min；(5)取上清，加入1mL预冷的异丙醇溶液，颠倒不少于15次，出现絮状沉淀，-20℃静置0.5-1h，12000rpm，离心10min；(6)弃上清，加1mL 70％乙醇溶液吹打洗涤，12000rpm，离心5min；(7)弃上清，室温干燥后，50μL无菌去离子水溶解；(8)取出5μL用1％琼脂糖凝胶电泳检测，-20℃保存。

2.转基因植株的PCR鉴定

(1)取转基因植株叶片提取DNA，进行PCR检测，所需要的引物如下：

表2转基因植株检测扩增所用引物

(2)PCR体系：植株DNA(1μL)；10×PCR缓冲液(2μL)；dNTP Mix(10mM)(0.3μL)；上游引物(10μM)(1μL)；下游引物(10μM)(1μL)；Taq DNA聚合酶(5U/μL)(0.3μL)；ddH₂O(14.4μL)。(3)PCR程序：预变性(94℃,5min)；变性(94℃,0.5min)；退火(58℃,0.5min)；延伸(72℃,1.5min)；终延伸(72℃,10min)；38个循环；保存(4℃)。

3.过表达大豆的检测

通过子叶节法得到的转基因大豆T₀种子，播种在蛭石里，每株进行编号，待长出第一个三出复叶时，取叶片为材料，用SDS小量法提取幼嫩的大豆叶片DNA，以Bar基因引物、包括35S和NOS的引物为检测引物，以非转基因烟草为阴性对照，表达载体质粒为阳性对照，水为空白对照，进行PCR鉴定，共检测出8株阳性植株。

(八)GmVSPWd基因的组织特异性表达

将大豆东农50种子培养于蛭石中，长日照(16h光照/8h黑暗)条件下培养，待第一个三出复叶完全展开后(约10天)，对大豆根、茎、真叶、子叶和第一个三出复叶进行取材；待开花后取花芽、花组织取材；在结荚后，对幼胚和豆荚进行取材，对大豆各组织部分提取RNA，反转录cDNA用于荧光定量PCR，-80℃保存。为了了解GmVSPWd基因在不同组织器官中的表达模式差异。用GmACTIN4管家基因作为内参基因，Real-time RT-PCR分析GmVSPWd基因在大豆不同组织中mRNA转录物的丰度变化。结果表明GmVSPWd基因在子叶中表达量最高，其次是茎、根，可推测该基因在子叶再生，茎的伸长中发挥一定的作用。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书其等效物界定。

核苷酸和/或氨基酸序列表

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 大豆植物营养贮存蛋白（GmVSPWd）基因

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 834

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

Claims (1)

1.植物营养贮存蛋白(GmVSPWd)基因，其特征在于采用抑制消减杂交法获得GmVSPWd基因(Seq ID No:1)。