CN105219784A - 一种杂交鹅掌楸LhRGL1基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种杂交鹅掌楸<i>LhRGL1</i>基因及其应用，<i>LhRGL1</i>基因的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示，其表达蛋白的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。本发明通过对杂交鹅掌楸<i>LhRGL1</i>基因的克隆与鉴定，基因的表达分析，验证其功能，发现转<i>LhPIN1</i>基因植株生长发育迟缓，植株矮化，分枝数目增多，可见该基因在植物育种中将有广泛的用途。

Description

一种杂交鹅掌楸LhRGL1基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种杂交鹅掌楸LhRGL1基因及其应用。

背景技术

杂交鹅掌楸是我国著名林木遗传育种家叶培忠教授利用分布在我国的中国鹅掌楸(Liriodendronchinensis（Hemsl.）Sarg.)和和分布在北美的北美鹅掌楸(LiriodendrontulipiferaLinn.)通过人工杂交获得的种间杂交种，其生长速度快，树姿优美，叶形奇特，抗性强，材质纹理细腻，是重要的园林绿化和工业用材树种。杂交鹅掌楸虽然有许多优越性，但杂交制种受到季节和效率的限制，影响了杂交鹅掌楸的推广应用，由于植物体细胞胚具有数量多，一旦形成体细胞胚就能够快速发育成再生植株的特点，以体细胞胚胎发生技术快速繁殖种子来源困难的杂交鹅掌楸，具有重要的理论意义和应用价值。体胚发生技术由于其两极性、繁殖速度快、效率高等特点，已经成为优良林木资源快速无性繁殖的重要手段，并且它能和生物反应器结合实现大规模商业化生产。到目前为止，已经成功利用杂交种体细胞建立了杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生技术和快速成苗体系，开辟了杂交鹅掌楸产业化开发的新途径。体细胞胚发生的本质是细胞分化的问题，而细胞分化的分子基础则是基因差异表达与调控的结果。所以研究这些相关基因可以使我们更好的了解体细胞发生技术的原理。

利用基因工程技术，可以将杂交鹅掌楸生长过程中的相关基因分离出来，挖掘在生长发育过程中发挥重要基因的功能，从而可以更加直接的进行品种改良。研究表明，激素类物质在杂交鹅掌楸的生长中发挥重要作用，包括生长素(Auxin)、细胞分裂素(cytokinin,CTK)、赤霉素(GA)、乙烯(Ethylene,ETH)和脱落酸(Abscisicacid,ABA)等。其中赤霉素GA类对伸长生长有重要作用，可以明显促进细胞的伸长。

DELLA蛋白是一类N端含有17个氨基酸序列，其中前5个氨基酸的缩写为DELLA（Asp-Glu-Leu-Leu-Ala）的蛋白质，在GA信号转导中起到负调控的作用。DELLA作为GA信号转导途径中的关键基因，反馈调节其上游GA生物合成的相关基因，同时控制GA通路中的下游基因。在拟南芥中有5个编码DELLA蛋白的基因，苹果里中有6个，豌豆中有2个，大麦、水稻、玉米和小麦中各有1个，它们的功能既具有保守性，也具有物种内的功能特异性。然而，由于木本植物的研究起步晚，进展慢，杂交鹅掌楸基因组中所编码的DELLA蛋白的基因数目还不清楚，其结构和功能都未知。杂交鹅掌楸的生长发育必然受到受GA的调节，因此研究杂交鹅掌楸的DELLA蛋白基因具有重要意义。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种杂交鹅掌楸LhRGL1基因。本发明的另一目的是提供杂交鹅掌楸PIN基因在杂种鹅掌楸育种中的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种杂交鹅掌楸LhRGL1基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

所述的杂交鹅掌楸LhRGL1基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

所述的杂交鹅掌楸LhRGL1基因在杂交鹅掌楸育种中的应用。

含有所述的杂交鹅掌楸LhRGL1基因的载体。

含有所述的杂交鹅掌楸LhRGL1基因的宿主细胞。

有益效应：与现有技术相比，本发明通过对杂交鹅掌楸LhRGL1基因的克隆与鉴定，基因的表达分析，验证其功能，发现转LhPIN1基因植株生长发育迟缓，植株矮化，分枝数目增多，可见该基因在植物育种中将有广泛的用途。

附图说明

图1是杂交鹅掌楸的LhRGL1基因的过表达载体图；

图2是LhRGL1基因酶切结果图，其中，M：DL2000Marker；1为LhRGL1与pMD19-TSimple连接后用用BamHI和SacI双酶切；

图3是阳性重组子的筛选图，a1为目的引物PCR结果，条带大小为1610bp，a2为35S引物PCR结果，条带大小为612bp；

图4是转基因阳性植株筛选结果图；

图5是转基因拟南芥植株PCR结果图，图a，目的引物PCR结果；图b，35S引物PCR结果；M：DL2000Marker；CK⁺：以载体质粒DNA为阳性对照；CK^-：野生型DNA为阴性对照；水：空白对照；

图6是转LhRGL1T2代植株与野生型拟南芥植株开花时间比较图，图中WT，野生型拟南芥；1-4，转LhRGL1基因T2代的不同株系；测量12次，误差线表示12个重复的标准误差；**表示差异极显著，*表示差异显著；

图7是转LhRGL1基因的T2代与野生型COL拟南芥图；图中1，2为转LhRGL1的生长40天的T2代拟南芥植株，col为野生型拟南芥；

图8是转LhRGL1基因与野生型拟南芥，图中，LhRGL1为转基因T2代植株，col为野生型拟南芥；

图9是转LhRGL1基因植株与野生型植株分枝数目比较图，**表示差异极显著。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

本实施例所采用的材料是南京林业大学校园内杂交鹅掌楸叶片，采后速冻于液氮中，超低温冰箱（-80℃）保存。

1）杂交鹅掌楸叶片总RNA的提取

按照NORGEN植物总RNA提取试剂盒的说明书进行，具体操作为：在处理过的研钵中加入适量的材料及液氮，充分研磨后，加入600μLLysisSolution；将研钵中裂解后的液体转移至新的离心管中；盖紧管盖后，颠倒混匀数次，在室温下静置2min，使其裂解充分，12000rpm离心2min将上清转移至新的离心管中；加入等体积的70%的乙醇，涡旋混匀；将混合液移至试剂盒内提供的柱子中（下接2mL的收集管），12000rpm离心1min，弃滤液，将柱子放回收集管上；加入400μL的WashSolution，12000rpm离心1min，弃滤液，将柱子放回收集管上；向柱子上加入100μl的DNaseI工作液，14000rpm离心1min，将滤液吸回柱子，在23-30℃的水浴锅或加热器上静置15min；再一次加入400μLWashSolution，14000rpm离心1min，弃滤液；重复步骤（8）；将离心柱放回收集管，14000rpm离心2min，弃收集管；将离心柱放入1.5mL的离心管中，加入50μL的ElutionSolution。200-2000rpm离心2min，14000rpm离心1min；所得的RNA样品，检测其完整性和纯度后，置于-80℃超低温冰箱保存备用。

吸取2μLRNA在1%琼脂糖凝胶电泳上进行检测，结果显示28S和18S条带较为清晰。28S条带亮度约为18S的两倍，RNA质量较好。用Nonodrop2000检测RNA纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀为2.03，OD₂₆₀/OD₂₃₀为2.01，完整性较好，可用于反转录。

2）第一链cDNA的合成

以所得到的杂交鹅掌楸叶片的总RNA为模板，使用TaKaRa反转录试剂盒进行反转录，使用Oligo(dT)作为锚定引物，反转录合成第一链cDNA。具体操作如下：

在离心管中配制按照下列模板RNA/引物的顺序配制混合物，总量为6μL：模板2μL，Oligo(dT)12-18Primer(50μM)3μL，RNase-freeddH₂O1μL。在PCR仪上，70℃保温10min，后迅速将其置于冰上急速冷却2min以上。离心数秒，使得模板RNA/引物的变性溶液聚集于离心管的底部。在上述离心管中配制反转录反应液（10μL）：RNA/引物的变性溶液6μL，5×M-MLVBuffer2μL，dNTPMixture(10mM)0.5μL，RNaseInhibitor(40U/μl)0.25μL，RTaseM-MLV(200U/μl)0.5μL，Nase-freedH₂O0.75μL。PCR仪上，42℃保温1h。PCR仪中，70℃保温15min，然后置于冰上冷却，得到cDNA溶液。

3）目的基因引物的设计及克隆

根据现有的杂交鹅掌楸转录组测序数据，利用其它物种的DELLA相关基因序列进行Blast同源比对。利用Oligo7.0，Prime5.0设计相应引物，引物序列为：

scf7180-F：5'-ATCTGCACATCCAAACACACCATTC-3'，

scf7180-R：5'-ACAGCTTATTCTATTGTATCCCGAG-3'。

以cDNA第一链为模板，利用超保真的PhusionDNA聚合酶进行杂交鹅掌楸基因的克隆。PCR扩增体系（50μL）为：25μL2×PhusionMasterMix，2μLForwardPrimer，2μLReversePrimer，3μLTemplateDNA，18μLNuclease-freeWater。PCR程序为：98℃5min；98℃30s，57℃30s，72℃1min40s，35cycles；72℃7min；4℃forever。

PCR反应完成后，取少量PCR产物（4μL左右）进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳后切割目的片段，凝胶回收纯化PCR目的扩增产物。采用AXYGEN公司的DNA凝胶回收试剂盒，进行目的片段纯化回收，具体操作为：在紫外灯下找到含有目的条带片段的琼脂凝胶，用刀片切下后用纸巾吸干表面液体，将其切碎后置于1.5mL离心管中。称量凝胶重量，将该重量作为一个凝胶体积(如100mg=100μL)。向离心管中加入3个凝胶体积的BufferDE-A，混匀后置于75℃加热仪上加热，每2-3min间断混合一次，直至凝胶完全融化(时间大约为6-8min)。向离心管中加0.5个BufferDE-A体积的BufferDE-B，混合均匀；将混合液转移到DNA制备管(置于2mL离心管)中，12000×g离心lmin，弃滤液。将制备管放回2mL离心管，加500μlBufferW1，12000×g离心30s，弃滤液。将制备管放回2mL离心管，加700μLBufferW2，12000×g离心30s，弃滤液。以同样方法再用700μLBufferW2洗涤一次，12000×g离心lmin。将制备管放回2mL离心管中，12000×g离心lmin。将制备管置于干净的1.5mL离心管中，在制备膜中央加25-30μLEluent去离子水，室温下，静置lmin。12000×g离心lmin，洗脱DNA。取2μL回收纯化后的产物，使用1%琼脂糖进行凝胶电泳检测。

4）目的片段与载体连接

克隆载体为TaKaRa公司的pMD19-TVector（D102A），进行连接反应，连接体系（10μL）：5μLSolutionI，1μLpMD19-TVector，4μLPCR纯化产物（50ng）。轻轻吸打混匀后，使用离心机低速离心，水浴锅中16℃连接过夜。

5）大肠杆菌超级感受态细胞的制备

取置于-80℃超低温冰箱中保存的JM109菌株，用接种环取少量，在不含抗生素的LB培养基上进行划线，37℃培养箱内倒置培养12-16h。参考分子克隆实验指南，采用Inoue方法制备大肠杆菌JM109超级感受态细胞，保存于-80℃，备用。

6）连接产物的转化

从超低温冰箱中取出感受态细胞JM109菌株，置于冰上融化。吸取5μL的过夜连接产物加入到100μL感受态细胞中；将离心管置于冰上冰浴30min；42℃水浴锅中水浴，热激90s，期间不要摇动；后立即置于冰上冰浴2min；在超净台中加入800μL无抗生素的液体培养基，37℃、180rpm摇1h复苏；4000rpm离心3min，吸去800μL上清；将沉淀的菌体重悬，涂于LB平板（Amp的浓度为100mg/L），37℃培养过夜。

7）重组质粒的筛选及验证

挑取在含有抗生素（Amp）的LB固体培养基上过夜生长的单菌落，接种到含有同样抗生素的750μL的LB液体培养基中。250rpm，37℃过夜培养。

PCR扩增体系为：2μL10×PCRBuffer，1.2μLMgCl₂（25mM），0.4μLdNTP（10mM），1μLM13-F/R，2μL菌液，0.2μLrTaq，ddH₂O补充到20μL。

PCR程序为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min40s，36cycles；72℃7min；4℃forever。

吸取10μL的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。验证后，将条带大小正确的菌液样品委托上海英骏公司测序，测序引物为通用引物M13F/R。测序结果在NCBI上进行比对分析。

根据对测序结果的分析，最终确定克隆得到1个杂交鹅掌楸DELLA基因，命名为LhRGL1基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，LhRGL1基因，片段长度为1610bp，含有ATG起始密码子和TAA终止密码子，其中ORF全长为1572bp，编码524个氨基酸的蛋白质，该蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

实施例2

研究结果表明LhRGL1和LhRGL2在杂交鹅掌楸中各个组织器官中均发挥重要作用。但是两个基因在茎中的表达量最高，说明茎的生长发育中GA信号途径活跃，DELLA蛋白在茎的伸长生长中起着重要的调控作用。

本实施例所用的植物材料为拟南芥(Arabidopsisthaliana)Col（Columbia）野生型种子，由德国ThomasLaux教授惠赠。

本实施例所用的大肠杆菌菌株为E.coliJM109；农杆菌菌株为GV3101和EHA105，分别用于转化拟南芥；试验中所用植物表达载体为pBI121。所有菌株购自相关生物公司。

1）LhRGL1基因的pBI121载体的构建

将实施例1获得的LhRGL1基因的ORF全长序列与植物表达载体pBI121进行连接，构建的载体如图1。

2）质粒的提取：采用碱裂解法中量提取质粒。所用试剂为：SolutionI：50mM葡萄糖，25mMTris-Cl，10mMEDTA，pH8.0，高压灭菌15min，4℃保存。SolutionII：10NNaOH2mL，0.1%SDS10mL，88mLH₂O，配制成100mL，现用现配。SolutionIII：5mol/L醋酸钾60mL，醋酸11.5mL，ddH₂O28.5mL，配制成100mL，4℃保存，用前冰浴（K⁺为3mol/L，AC为5mol/L）。

质粒提取的步骤为：取过夜培养的10mL菌液，12000rpm、2min离心，收集菌体；倒掉上清液，尽可能去掉培养基；将菌体重悬于400μLSolutionI中，剧烈震荡，尽可能打散；加800μLSolutionII，快速颠倒离心管（2mL大小的离心管），将混合后的内容物置于冰上；加入600μLSolutionIII，轻轻反复颠倒数次，使细菌裂解物分散后置于冰上3-5min；4℃，14000rpm离心5min，取2×850μL上清到两只洁净离心管中；加入等体积酚氯仿（可用氯仿代替），剧烈震荡混合水相和有机相，14000rpm离心2min，取上层水相到另外一只干净的离心管中(大约800μL)；室温下加等体积氯仿：异丙醇，剧烈震荡混合均匀，室温放置2min；在室温下最大转速14000rmp离心5min，收集沉淀；小心去除上清，将离心管倒置于纸上，流干液体，尽量除去管壁上液体；加入1mL70%乙醇，颠倒混匀数次，使沉淀在乙醇中漂浮，室温下14000rmp离心2min；去除酒精，开口使液体完全挥发；用30μL含有RnaseA(20μg/μL)的水进行溶解，4℃保存。

3）特异酶切位点的添加

以目的基因与克隆载体pMD19-T所构建的阳性重组质粒为模板，通过PCR方法在目的基因的两侧添加特异性酶切位点。杂交鹅掌楸LhRGL1基因两侧添加BamHI和SacI酶切位点。PCR反应体系、程序及所使用引物如下：

PCR反应体系（20μL）：2μL10×PCRBuffer，1.2μLMgCl2（25mM），0.4μLdNTP（10mM），1μLForwardPrimer，1μLRorwardPrimer，1μL质粒DNA，0.2μLrTaq，13.2μLddH₂O。

PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，55-59℃30s，72℃1min40s，36cycles；72℃7min；4℃forever。

所使用的引物序列：

LhRGL1-F+BamHI：5'-GCATCCATCTGCACATCCAAACACACCATTC-3'，

LhRGL1-R+SacI：5'-GAGCTCACAGCTTATTCTATTGTATCCCGAG-3'。

将得到的PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离，使用AxyPrepDNAGelExtractionKit试剂盒进行回收纯化，将回收后的产物与pMD19-TSimple连接，构建含有目的基因的中间载体。

4）双酶切反应

使用相应的内切酶进行酶切反应，得到含有粘性末端并覆盖整个ORF的LhRGL1基因片段。同时用同样的酶，处理空的pBI121表达载体。LhRGL1酶切反应体系：2μL10×Kbuffer，0.5μLBamHI，0.5μLSacI，1μg回收产物/pBI121空载体质粒，ddH₂O补充到20μL。37℃水浴，酶切4-6h。加入10×LoadingBuffer缓冲液终止酶切反应。酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行分离检测，使用AxyPrepDNAGelExtractionKit(AXYGEN)的试剂盒进行回收并纯化酶切产物，将其溶于20μL的ddH₂O中。酶切结果如图2所示，其中，M：DL2000Marker；1：LhRGL1，与pMD19-TSimple连接后用用BamHI和SacI双酶切。

5）连接反应

琼脂糖凝胶电泳检测酶切后所回收到的目的基因和载体pBI121，根据所检测出的纯度和浓度，按连接体系加入各试剂，16℃过夜连接。其中，目的片段分子数：载体分子数=3:1-5:1，连接反应体系为：2μLT4DNAligasebuffer(10×)，2μL经过酶切的表达载体，10μL目的片段，1μLT4DNAligase，ddH₂O补充至20μL。

6）连接产物转入大肠杆菌

将目的片段与载体pBI121连接后的产物转入大肠杆菌JM109超感细胞中，方法同实施例1。

7）重组子的鉴定

挑取平板上的单菌落接种到含有抗生素（卡那霉素）的LB液体培养基中，37℃、250rpm震荡培养过夜。使用目的基因全长引物进行菌液PCR，以筛选阳性克隆。筛选后的阳性克隆送上海英骏公司测序。同时使用AxyPrepPlasmidMiniprepKit(AXYGEN)提取质粒并进行酶切验证，判断酶切后片段大小是否一致。结果如图3所示，a1为目的引物PCR结果，条带大小为1610bp，a2为35S引物PCR结果，条带大小为612bp。

8）农杆菌感受态细胞的制备与转化

本实施例利用农杆菌GV3101来制备农杆菌感受态，进行拟南芥的侵染实验；农杆菌感受态制备过程为：挑取已经活化好的农杆菌单菌落，接种于5mL液体LB培养基中，28℃、250rpm摇菌培养20-24h；吸取2mL菌液，接种到含有50mL液体LB培养基的三角瓶中，28℃、250rpm摇菌至OD₆₀₀值为0.8左右；将扩大繁殖后的菌液置于冰上冰浴30min，4℃、5000rpm离心5min，弃上清；加入10mL经预冷的0.1mo1/LCaCl₂溶液，充分悬浮沉淀的菌体；4℃，5000rpm离心5min，弃去上清；加入1mL预冷的20mmo1/LCaCl₂溶液充分悬浮菌体，即得到所要制备的GV3101感受态细胞，用离心管将其分装成100μL/管，迅速加入20%的无菌甘油，-80℃放置保存。

重组子的农杆菌转化：冰浴，使农杆菌感受态细胞融化，将1-5μl经回收纯化后的质粒加入到200μl的农杆菌感受态中，轻轻混匀，冰浴30min；使用液氮速冻lmin，37℃水浴锅中热击1-5min，迅速置于冰上1-2min；加入800μl不含任何抗生素的LB培养基，28℃，100rpm复苏2-4h；4000rpm离心3min，吸掉部分培养基；使用移液枪充分混匀剩余的菌液，后涂抹于添加50mg/L卡那霉素和50mg/L链霉素（EHA105）或100mg/L的庆大霉素（GV3101）的固体LB培基上；28℃倒置培养30-48h。

农杆菌重组子的鉴定：从平板培养基上挑取长出的单菌落，接种于含有相应抗生素的液体培养基中；28℃，220rpm培养过夜；使用35S-F分别搭配如下引物进行菌液PCR，引物序列为：

35S-F：5'-TGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTG-3'，

35S-SCF7180-R：5'-TGAGACGGTGGTGATTGGTG-3'。

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定是否含有目的片段；鉴定出的阳性克隆，扩大培养后，采用碱裂解法提取质粒，进行双酶切验证；鉴定后的阳性克隆加入适量无菌甘油，于-80℃保存备用。

9）农杆菌介导的拟南芥的转化

采用花序侵染法将目的基因转入拟南芥中，具体操作方法为：拟南芥(col野生型)保持健康生长状态至开花；活化携带有目的基因的农杆菌EHA105菌株。挑取单菌落，接种于5mL含有卡那霉素和链霉素的LB培养基上，28℃、250rpm摇菌至菌液刚刚变浑浊，约8-10h；吸取1mL菌液，接种到三角瓶中(50mL)摇菌24h，至OD值约为0.8左右；将菌液5000rpm在室温下离心5min，去除上清后收集菌体，用5%蔗糖溶液悬浮；浸泡前，加入SilwetL-77，浓度为0.05%(500μl/L)，晃出泡沫；将拟南芥的地上部分在农杆菌悬浮溶液中浸泡15-30s，期间轻轻晃动；将浸过的拟南芥平躺在托盘中，用保鲜膜覆盖，锡箔纸密封避光，4℃，放置24h；揭开锡箔纸，正长条件下培养，当种子成熟时停止浇水。

5%蔗糖溶液重悬液各成分如下：MS培养基，添加蔗糖50g/L，MES0.5g/L，Silwet-77500ul/L。（注意：配制后pH调制5.8，菌液离心重悬后再加入SilwetL-77；重悬液和菌液的换算关系为：重悬液用量：菌液OD*菌液体积=0.8*重悬液）。

10）转基因植株的筛选

收集的T1代转基因拟南芥的种子，用酒精和升汞进行灭菌，步骤为：取适量获得的转基因种子放置于1.5mL离心管中，用75%酒精浸泡30s；0.1%升汞灭菌2min30s；无菌水冲洗3-4次，第一次冲洗后更换经高压灭菌的新离心管；用0.1%琼脂糖溶液悬浮。

将灭菌后的转基因拟南芥种子播种于含有抗生素（卡那霉素50mg/L和头孢霉素100mg/L）的1/2MS固体培养基上。22℃，光照培养。大约一周后将培养基上可以正常生长的拟南芥移植与土中，继续生长，结果如图4所示。

11）转基因植株的检测

取适量拟南芥和转基因植株的幼嫩叶片，采用CTAB法提取DNA，具体操作步骤为：将适量叶片置于灭菌处理后的2mL离心管中，加入700μl的CTAB溶液，用球磨仪彻底研磨，65℃静置10min；加入等体积的氯仿：异戊醇，数次颠倒使其混合均匀，14000rpm离心10min；将上清移至新的无菌离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀数次，室温静置2min，14000rpm离心10min，倒掉上清；加入70%的无水乙醇，使用移液枪吹打洗涤两次，14000rpm离心1min，弃去上清；吹干表面液体，加入20μlddH₂O溶解。取上述提取的转基因和野生型拟南芥的DNA，分别用LhRGL1基因的特异性引物和35S引物进行PCR检测。

杂交鹅掌楸LhRGL1基因转化拟南芥后，转基因植株的检测使用两对引物，只有两对引物都能扩增出特异性条带才确定植株为转基因植株。共获得12棵拟南芥转LhRGL1基因植株系。以重组质粒为阳性对照，以野生型为阴性对照，以水为空白对照，PCR结果如图5所示，图a，目的引物PCR结果；图b，35S引物PCR结果。M：DL2000Marker；CK⁺：以载体质粒DNA为阳性对照；CK^-：野生型DNA为阴性对照；水：空白对照。

12）表型观察

不同代转基因植株的获得：收获的转基因T1代种子经灭菌，筛选培养后，再移植于营养土中，22℃，16h光照/8h黑暗培养；经检测后保留初步确认的转基因植株，待成熟后收获T1代种子，进行编号，得到T2代；同T1代一样，将T2代种子经灭菌后涂布于含抗生素的筛选培养基上，置于22℃，连续光照；10天左右，对不同编号的T2代种子进行存活率统计，选取存活比例为75%的植株移植与营养土中按照22℃，16h光照/8h黑暗培养，并取叶片进行阳性检测；阳性T2代植株继续进行编号，收集种子，得到T3代种子；将种子灭菌后，用筛选培养基筛选，置于光下连续光照培养；10天左右，观察不同编号的T3代植株，全部存活并且没有出现分离的为T3代纯合植株。

将过表达的杂交鹅掌楸LhRGL1基因的35S:LhDELLA转入模式植物拟南芥中，观察T2代转基因拟南芥的表型。

对得到的转基因株系分批次进行观察。

选取其中表型明显的4个转基因株系，共60棵转基因的植株和15棵野生型植株进行开花时间统计，并进行数据分析。在生长后期，对转LhRGL1基因植株的高度和分枝数目进行观察。分别统计转基因植株和拟南芥野生型植株的莲座叶侧枝数与茎生叶侧枝数。

对4个转基因株系60棵转LhRGL1基因的植株，发现转基因T2代植株的开花时间比野生型植株晚（图6），生长发育阶段也滞后于野生型（图7）。转基因植株开花时间比野生型晚3-6d左右。从图7可知，同样生长周期为40天的拟南芥，转基因植株的发育阶段要晚于野生型。

观察生长后期的转基因植株，发现转LhRGL1基因的植株的高度较野生型矮，同时分枝数目较野生型多（图8）。对转LhRGL1基因的T2代植株进行莲座叶侧枝数与茎生叶侧枝数目的统计。从图9中可以发现，转基因植株的茎生叶分枝数要比野生型拟南芥多，且差异明显（P=0.0005<0.05）；转基因植株的主枝不明显。推测出现该表型的原因是杂交鹅掌楸LhRGL1基因转化拟南芥后在其中过量表达，抑制了植株的顶端优势从而促进分枝的生长。

本实施例将过表达的杂交鹅掌楸LhRGL1基因的35S:LhDELLA转入模式植物拟南芥和烟草中，进行表型观察和分析。从结果可以看出，过表达35S:LhRGL1的拟南芥T2代植株出现生长发育迟缓，植株矮化，分枝数目增多的表型。

SEQUENCELISTING

<110>南京林业大学

<120>一种杂交鹅掌楸LhRGL1基因及其应用

<130>100

<160>8

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>1610

<212>DNA

<213>杂交鹅掌楸

<400>1

atctgcacatccaaacacaccattcccgaaatgggaccatacgacacggccatctccccc60

accaccaccaactcctcaccatgcggcccatccaagctctcggagatcgacggcctcctc120

gcaggggcgggctaccacatccggtcgtcggatctacgccacgtggctcagaggctggag180

catctggagtcagcgatggtcaaccaagctcccgagaacatctccaacctagccacagag240

gccgtacactacaacccctccgacctcgcgtcctgggtcgagtccatgctctccgagttc300

caccaatcaccaccgtctcagctcctccccaccttctcggacccacagaacccctcctcg360

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cgcctcctcctgacacgcgtcaacaccggatgcggcatcggcaaggtcgcgagctacttc600

atagacgcgctaagccggcggctcttctcaccggcccaggccgggccggattgctccggt660

tcggcccttgagaacgagatcctctaccaccacttctacgaggcttgcccctacctcaaa720

ttcgcccacttcaccgccaatcaagccatcctcgaggcgttccacggccacgattgcgtc780

cacgtcatcgacttcaacctgatgcacggcctgcaatggcccgccctgatccaggccctc840

gcgctccgcccgggcggcccgccgttgctccgcctgaccggcatcggtccaccatccccg900

gacggccgcgactccctccgcgaaatcggcctccggctggccgagttggctcggtccgtc960

cgcgtccggtttaccttccgcggcgtcgcagcgtcccggctcgacgacgtcaagccgggg1020

atgctccaggtgggccctagggaagccgtggctgtcaattcggtaatgcagctccaccgg1080

ctgcttggatcggaccagaaccgtggccccgcaccgatcgactcagtactcgggtggata1140

cacgggctgaacccgaagatcgtgaccgttgtcgagcaggaagcagatcacaacggtccg1200

aaattcgtggaccggttcactgagtcgctctactactactcaaccatgttcgactcgctc1260

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<210>2

<211>524

<212>PRT

<213>杂交鹅掌楸

<400>2

MetGlyProTyrAspThrAlaIleSerProThrThrThrAsnSerSer

151015

ProCysGlyProSerLysLeuSerGluIleAspGlyLeuLeuAlaGly

202530

AlaGlyTyrHisIleArgSerSerAspLeuArgHisValAlaGlnArg

354045

LeuGluHisLeuGluSerAlaMetValAsnGlnAlaProGluAsnIle

505560

SerAsnLeuAlaThrGluAlaValHisTyrAsnProSerAspLeuAla

65707580

SerTrpValGluSerMetLeuSerGluPheHisGlnSerProProSer

859095

GlnLeuLeuProThrPheSerAspProGlnAsnProSerSerMetHis

100105110

AspThrTrpGlnProAspThrCysThrAspProLeuGlnGlnGlnGln

115120125

LeuThrValMetAlaAlaLeuGluGluGluAspSerGlyIleArgLeu

130135140

ValHisLeuLeuMetThrCysAlaGluSerMetGlnArgGlyGluIle

145150155160

AlaLeuAlaGlySerLeuIleAspGluMetArgLeuLeuLeuThrArg

165170175

ValAsnThrGlyCysGlyIleGlyLysValAlaSerTyrPheIleAsp

180185190

AlaLeuSerArgArgLeuPheSerProAlaGlnAlaGlyProAspCys

195200205

SerGlySerAlaLeuGluAsnGluIleLeuTyrHisHisPheTyrGlu

210215220

AlaCysProTyrLeuLysPheAlaHisPheThrAlaAsnGlnAlaIle

225230235240

LeuGluAlaPheHisGlyHisAspCysValHisValIleAspPheAsn

245250255

LeuMetHisGlyLeuGlnTrpProAlaLeuIleGlnAlaLeuAlaLeu

260265270

ArgProGlyGlyProProLeuLeuArgLeuThrGlyIleGlyProPro

275280285

SerProAspGlyArgAspSerLeuArgGluIleGlyLeuArgLeuAla

290295300

GluLeuAlaArgSerValArgValArgPheThrPheArgGlyValAla

305310315320

AlaSerArgLeuAspAspValLysProGlyMetLeuGlnValGlyPro

325330335

ArgGluAlaValAlaValAsnSerValMetGlnLeuHisArgLeuLeu

340345350

GlySerAspGlnAsnArgGlyProAlaProIleAspSerValLeuGly

355360365

TrpIleHisGlyLeuAsnProLysIleValThrValValGluGlnGlu

370375380

AlaAspHisAsnGlyProLysPheValAspArgPheThrGluSerLeu

385390395400

TyrTyrTyrSerThrMetPheAspSerLeuGluAlaCysAlaLeuGln

405410415

ProGluLysAlaValAlaGluMetTyrIleGlnLysGluIleCysAsn

420425430

IleLeuCysCysGluGlyAlaAlaArgValGluArgHisGluProLeu

435440445

AlaLysTrpArgAlaArgMetValArgAlaGlyPheLysProLeuHis

450455460

LeuGlySerAsnAlaPheLysGlnAlaSerMetLeuLeuThrLeuPhe

465470475480

SerAlaGlnGlyTyrCysValGluGluAsnGlyGlyCysLeuThrLeu

485490495

GlyTrpHisSerArgProLeuIleAlaAlaSerAlaTrpGlnAlaAla

500505510

GluProGlnAlaGlnProAlaArgAspThrIleGlu

515520

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>scf7180-F

<400>3

atctgcacatccaaacacaccattc25

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>scf7180-R

<400>4

acagcttattctattgtatcccgag25

<210>5

<211>31

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>LhRGL1-F+BamHI

<400>5

gcatccatctgcacatccaaacacaccattc31

<210>6

<211>31

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>LhRGL1-R+SacI

<400>6

gagctcacagcttattctattgtatcccgag31

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>35S-F

<400>7

tgaagatagtggaaaaggaaggtg24

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>35S-SCF7180-R

<400>8

tgagacggtggtgattggtg20

Claims (5)

1.一种杂交鹅掌楸LhRGL1基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

2.权利要求1所述的杂交鹅掌楸LhRGL1基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

3.权利要求1所述的杂交鹅掌楸LhRGL1基因在杂交鹅掌楸育种中的应用。

4.含有权利要求1所述的杂交鹅掌楸LhRGL1基因的载体。

5.含有权利要求1所述的杂交鹅掌楸LhRGL1基因的宿主细胞。