CN114807215A

CN114807215A - 一种烟草甲硫氨酸亚砜还原酶基因NtE4在烟草抗逆中的应用

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Publication number: CN114807215A
Application number: CN202210447149.9A
Authority: CN
Inventors: 许力; 许�永; 王明锋; 高茜; 米其利; 蒋佳芮; 刘欣; 杨文武; 向海英; 曾婉俐; 李雪梅; 张建铎
Original assignee: China Tobacco Yunnan Industrial Co Ltd
Current assignee: China Tobacco Yunnan Industrial Co Ltd
Priority date: 2022-04-18
Filing date: 2022-04-18
Publication date: 2022-07-29

Abstract

本发明公开了一种烟草甲硫氨酸亚砜还原酶基因NtE4在烟草抗逆中的应用。烟草甲硫氨酸亚砜还原酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，包括411bp个碱基。本申请利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术敲除NtE4基因获得在抗逆胁迫下长势较弱的基因编辑植株，NtE4基因发生编辑的烟草植株中的甲硫氨酸含量显著低于对照中的烟草植株中的甲硫氨酸含量，这为烟草甲硫氨酸亚砜还原酶研究及烟草抗逆性研究提供遗传材料和理论依据。

Description

一种烟草甲硫氨酸亚砜还原酶基因NtE4在烟草抗逆中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，特别涉及一种烟草甲硫氨酸亚砜还原酶基因NtE4在烟草抗逆中的应用。

背景技术

植物蛋白质中的甲硫氨酸(Met)极易被活性氧氧化为甲硫氨酸亚砜(MetSO)，从而导致相应蛋白质构型和活性的改变，而这种改变可以被甲硫氨酸亚砜还原酶(MSR)家族逆转，即能够将被氧化的甲硫氨酸亚砜还原为甲硫氨酸。植物体内MSR家族可以分为A和B两个亚家族，E4是甲硫氨酸亚砜还原酶A(MSRA)基因的成员。

MSR参与许多植物生长和发育过程的调节，包括开花。并对茉莉酸和乙烯非常敏感，也受赤霉素和生长素的控制。MSR可能介导植物中重要的激素依赖性发育转变和胁迫相关反应。

在拟南芥中，MSRA基因可能还参衰老与衰老过程；E4是一种由乙烯诱导的果实成熟基因，在番茄中该基因参与果实发育与叶片衰老等过程。茄子中甲硫氨酸亚砜还原酶基因SmMsrA研究表明，SmMsrA基因表达量的增加，抗氧化能力增强，清除了果实膨大和低温胁迫产生的活性氧的氧化作用，保护了果实膨大过程中的关键蛋白，使果实得以正常生长和发育，非单性结实品系不能清除低温胁迫产生的活性氧的氧化作用，果实发育受阻。小麦中研究MSR基因当进行胁迫处理时,小麦过表达系的生长状态明显好于野生型。

烟草作为我国重要的经济作物和模式作物，研究烟草甲硫氨酸亚砜还原酶基因响应非生物逆境胁迫的分子机制具有重要意义。在烟草甲硫氨酸亚砜还原酶基因克隆与功能研究方面，有研究者分离获得1个A型MSR基因NtMSRA4，基因的表达水平受到盐、冷、渗透及ABA等非生物胁迫不同程度的影响。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种烟草甲硫氨酸亚砜还原酶基因NtE4在烟草抗逆中的应用，其为研究烟草抗逆能力与基因功能提供遗传材料和理论依据。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种烟草甲硫氨酸亚砜还原酶基因NtE4在烟草抗逆中的应用。

优选地，上述技术方案中，所述抗逆为干旱胁迫和/或盐处理胁迫。

优选地，上述技术方案中，所述烟草甲硫氨酸亚砜还原酶基因核苷酸序列如SEQID NO.1所示，包括411bp个碱基。

优选地，上述技术方案中，所述烟草甲硫氨酸亚砜还原酶基因的编码蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，包括136个氨基酸。

优选地，上述技术方案中，烟草甲硫氨酸亚砜还原酶基因NtE4编辑植株是通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，构建了用于敲除NtE4基因的CRISPR/Cas9编辑载体，经遗传转化后获得了NtE4基因发生编辑的烟草植株。

优选地，上述技术方案中，所述NtE4基因发生编辑的烟草植株的创制方法具体包括：

(1)选择NtE4基因中较特异的23nt核苷酸序列为CRISPR/Cas9的引导序列，并将该序列片段与CRISPR/Cas9载体进行连接、转化和PCR扩增检测，获得PCR阳性克隆，得到CRISPR/Cas9-NtE4编辑载体；

(2)利用所构建的CRISPR/Cas9-NtE4编辑载体质粒，进行遗传转化，以敲除植物体内的烟草甲硫氨酸亚砜还原酶相关基因NtE4，获得NtE4基因编辑植株。

优选地，上述技术方案中，步骤(1)中NtE4基因中较特异的23nt核苷酸序列如SEQID No.5所示。

优选地，上述技术方案中，NtE4基因发生编辑的烟草植株中的甲硫氨酸含量显著低于对照中的烟草植株中的甲硫氨酸含量。

本发明上述技术方案，具有如下有益效果：

本发明通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，构建了用于敲除NtE4基因的CRISPR/Cas9编辑载体，经遗传转化后获得了NtE4基因发生编辑的红花大金元植株。本发明通过在种子萌发苗期进行不同程度干旱胁迫与盐胁迫处理，发现NtE4基因编辑植株的生长(地上部分、根长)均明显弱于对照(未转化)植株；正常条件下，成熟期进行NtE4基因编辑植株与对照(未转化)植株叶片采样，进行甲硫氨酸含量测定，NtE4基因编辑植株中甲硫氨酸含量显著低于对照(未转化)中的。

综上所述，利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术敲除NtE4基因获得在抗逆胁迫下长势较弱的基因编辑植株，这为烟草甲硫氨酸亚砜还原酶研究及烟草抗逆性研究提供遗传材料和理论依据。

附图说明

被结合在说明书中并构成说明书的一部分的附图示出了本发明的实施例，并且连同其说明一起用于解释本发明的原理。

图1A为对照(未转化)植株和基因编辑植株萌发期在不同浓度干旱胁迫处理条件下对比图的培养皿分布示意图。

图1B为对照(未转化)植株和基因编辑植株萌发期在不同浓度干旱胁迫处理条件下对比图的干旱胁迫对照图。

图2为对照(未转化)植株和基因编辑植株萌发期在不同浓度盐胁迫处理条件下对比图。

图3为对照(未转化)植株和基因编辑植株在成熟期正常条件下，进行植株叶片甲硫氨酸含量测定。

具体实施方式

现在将参照附图来详细描述本发明的各种示例性实施例。应注意到：除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。

以下实施例中所有使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

实施例1

本实施例主要就烟草甲硫氨酸亚砜还原酶相关基因NtE4的获得过程，简要介绍如下。

以栽培种烟草红花大金元叶片为样品，利用RNA提取试剂盒提取烟草叶片总RNA，反转录为cDNA备用：

按照植物RNA提取试剂盒说明书提取烟草总RNA。

1μg从叶片中提取总RNA用于反转录，转录体系如下：

Total RNA 1μg；

Oligo(dT)(10μM) 1.5μL；

ddH₂O up to 15μL；

将上述体系混匀后置于PCR中，70℃保温5min，去除后立即置于冰上5min，之后向体系中加入以下试剂：

上述体系放入PCR仪中，42℃65min，65℃10min，4℃保温，之后置于-20℃冰箱中保存使用。

通过同源比对的方法，参考拟南芥基因的序列及已知烟草部分基因序列，设计扩增引物序列如下：

F：5’-CATGTCCACGACCCAAATTAC-3’(SEQ ID No.3)；

R：5’-TCAACCGTAGCACCTTATTGGG-3’(SEQ ID No.4)；

以上述所制备cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增：

扩增体系(50μL)：

混匀离心后进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃ 10sec，52℃ 30sec，72℃2.5min，共30个循环；72℃ 10min；12℃ Hold。

对扩增产物进行提纯后测序，获得烟草甲硫氨酸亚砜还原酶相关基因NtE4序列，其碱基序列如SEQ ID No.1所示，共包括411bp个碱基。对该基因序列进行翻译后，其所编码蛋白序列如SEQ ID No.2所示，共包括136个氨基酸，进一步对比分析表明，该蛋白含有同源性很高的序列，高度保守。

实施例2

利用实施例1中所获得烟草甲硫氨酸亚砜还原酶相关基因NtE4，本发明进一步构建了CRISPR/Cas9载体，以及利用叶盘法转化获得基因编辑植株。

选择NtE4基因中较特异的23nt核苷酸序列(SEQ ID No.5)为CRISPR/Cas9的引导序列，并将该序列片段与CRISPR/Cas9载体(由西南大学提供)进行连接，获得转化的克隆子，进行PCR扩增检测，后将PCR阳性克隆送测序公司进行测序确认，最后得到CRISPR/Cas9-NtE4编辑载体。

利用上一步所构建的CRISPR/Cas9-NtE4编辑载体质粒，以红花大金元为例，进行遗传转化试验，以敲除植物体内的烟草甲硫氨酸亚砜还原酶相关基因NtE4，相关实验过程简要介绍如下。

将烟草种子点种于培养皿中，待长到4片子叶(15-20d)，便可将其移入培养瓶中(含80mL MS液体培养基)，每瓶2株，于25±1℃、光照强度30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16h/d条件继续培养40d，备用。

取出-80℃保存的LBA4404电转化感受态农杆菌细胞，置于冰上冻融。待感受态刚刚解冻时，加入含有编辑NtE4基因的2μL质粒，轻轻弹混匀，置于冰上。转化培养获得转化成功的农杆菌。

在超净工作台中制作烟草叶盘成边长为1cm的方形叶盘，用MS液体制备含有CRISPR/Cas9-NtE4编辑载体的农杆菌菌落成悬浮菌液(OD600＝0.6-0.8)。利用悬浮农杆菌菌液浸泡侵染烟草叶盘10min。之后将叶盘置于含2.0mg/LNAA+0.5mg/L6-BA的MS固体培养基上，28℃，黑暗，共培养3d。之后进行继代培养，放置于含2.0mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA+250mg/L Cb+50mg/L Kan的MS固体培养基上，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m²·s)，25℃黑暗培养8h/d，培养45-60d。获得分化芽及转化植株生根培养。将获得的经LBA4404农杆菌介导转化NtE4基因的再生植株，后进行转化植株叶片取样，送华大基因进行分子检测，确定获得NtE4基因编辑植株。

实施例3

利用实施例2中分子检测确定为NtE4基因敲除植株，进行收种获得基因编辑素材。随后进行种子干旱胁迫、盐胁迫处理，选择NtER4基因编辑烟草种子与对照(未转化)种子，选取饱满无明显缺陷的种子进行表面消毒，之后分别点种于MS培养基中进行培养；培养条件为：在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16h/d的条件下，水平放置进行培养，并进行观察。

干旱胁迫(3％PEG-6000、5％PEG-6000)处理培养基和MS培养基的制备。

盐胁迫(100mmol/L、150mmol/L NaCl)处理培养基和MS培养基的制备。

待烟草种子生长约3-4d，待种子露白时选取同一时期种子(10-20颗)小心移至于步骤(2)中干旱胁迫(3％PEG-6000、5％PEG-6000)处理培养基及盐胁迫(100mmol/L、150mmol/L NaCl)处理培养基；培养条件为：在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16h/d的条件下培养12-25d，垂直放置进行培养，并进行观察。放置MS培养基上露白的原因，以防止由于种子活力不同，发芽时间不一致。垂直放置培养，保证幼苗垂直向下，以便根长测量。

观察记录萌发状态、根长及根的状态、叶片大小及叶色等，初步确定烟草种子在萌发期的抗逆性。

同一培养皿中干旱处理包括(对照)及基因编辑材料种子(结果如图1A和图1B所示)。

同一培养皿中盐处理包括(对照)及基因编辑材料种子(结果如图2所示)。

实施例4

种植编辑植株与对照植株，成熟期进行新鲜烟叶取样，进行甲硫氨酸检测，对新鲜烟叶中游离氨基酸进行测定，编辑素材中甲硫氨酸含量显著低于对照素材(结果如图3所示)。

虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。

序列表

<110> 云南中烟工业有限责任公司

<120> 一种烟草甲硫氨酸亚砜还原酶基因NtE4在烟草抗逆中的应用

<130> WPC221146

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 408

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

catgtccacg acccaaatta caagctcgtt tgctccggta ccaccgacca tgcagaggtg 60

attcggatcc agtttgaccc gaatgtctgc ccatatacca atctgctttc tctcttttgg 120

agtcgtcatg atcccaccac tctaaatcgc cagggtaacg atgtggggaa tcagtaccgc 180

tcaggaatat actactataa cgatgctcag gctcaactag caagggaatc attggaagct 240

aagcagaagg aatttacgga taagaagatt gtcacagaaa ttcttcctgc aaagagattt 300

tatagagctg aagagtatca ccaacaatat ttagaaaagg gtggtggcag aggtgccaag 360

cagtcagctg caaagggctg caatgaccca ataaggtgct acggttga 408

<210> 2

<211> 135

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

His Val His Asp Pro Asn Tyr Lys Leu Val Cys Ser Gly Thr Thr Asp

1 5 10 15

His Ala Glu Val Ile Arg Ile Gln Phe Asp Pro Asn Val Cys Pro Tyr

20 25 30

Thr Asn Leu Leu Ser Leu Phe Trp Ser Arg His Asp Pro Thr Thr Leu

35 40 45

Asn Arg Gln Gly Asn Asp Val Gly Asn Gln Tyr Arg Ser Gly Ile Tyr

50 55 60

Tyr Tyr Asn Asp Ala Gln Ala Gln Leu Ala Arg Glu Ser Leu Glu Ala

65 70 75 80

Lys Gln Lys Glu Phe Thr Asp Lys Lys Ile Val Thr Glu Ile Leu Pro

85 90 95

Ala Lys Arg Phe Tyr Arg Ala Glu Glu Tyr His Gln Gln Tyr Leu Glu

100 105 110

Lys Gly Gly Gly Arg Gly Ala Lys Gln Ser Ala Ala Lys Gly Cys Asn

115 120 125

Asp Pro Ile Arg Cys Tyr Gly

130 135

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catgtccacg acccaaatta c 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaaccgtag caccttattg gg 22

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccgaccatgc agaggtgatt cgg 23

Claims

1.一种烟草甲硫氨酸亚砜还原酶基因NtE4在烟草抗逆中的应用。

2.根据权利要求1所述的烟草甲硫氨酸亚砜还原酶基因NtE4在烟草抗逆中的应用，其特征在于，所述抗逆为干旱胁迫和/或盐处理胁迫。

3.根据权利要求1所述的烟草甲硫氨酸亚砜还原酶基因NtE4在烟草抗逆中的应用，其特征在于，所述烟草甲硫氨酸亚砜还原酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，包括411bp个碱基。

4.根据权利要求1所述的烟草甲硫氨酸亚砜还原酶基因NtE4在烟草抗逆中的应用，其特征在于，所述烟草甲硫氨酸亚砜还原酶基因的编码蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，包括136个氨基酸。

5.根据权利要求1所述的烟草甲硫氨酸亚砜还原酶基因NtE4在烟草抗逆中的应用，其特征在于，烟草甲硫氨酸亚砜还原酶基因NtE4编辑植株通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，构建用于敲除NtE4基因的CRISPR/Cas9编辑载体，经遗传转化后获得了NtE4基因发生编辑的烟草植株。

6.根据权利要求5所述的烟草甲硫氨酸亚砜还原酶基因NtE4在烟草抗逆中的应用，其特征在于，所述NtE4基因发生编辑的烟草植株的创制方法包括：

7.根据权利要求6所述的烟草甲硫氨酸亚砜还原酶基因E4在烟草抗逆中的应用，其特征在于，步骤(1)中NtE4基因中较特异的23nt核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

8.根据权利要求6所述的烟草甲硫氨酸亚砜还原酶基因E4在烟草抗逆中的应用，其特征在于，NtE4基因发生编辑的烟草植株中的甲硫氨酸含量显著低于对照中的烟草植株中的甲硫氨酸含量。