CN113337526A - 玉米甲硫氨酸亚砜还原酶基因ZmMSRB3及应用 - Google Patents

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Abstract

玉米甲硫氨酸亚砜还原酶基因ZmMSRB3，及应用于分子生物学和生物技术域,ZmMSRB3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；一种耐冷玉米自交系蛋氨酸亚砜还原酶ZmMSRB3，由ZmMSRB3基因编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；一种植物表达载体，含有耐冷玉米自交系W9816甲硫氨酸亚砜还原酶基因ZmMSRB3；构建了植物表达载体并转化拟南芥，通过冷胁迫后观测转基因拟南芥的表型、萌发率等性状，结果表明耐冷玉米自交系W9816甲硫氨酸亚砜还原酶基因ZmMSRB3可提高拟南芥的耐冷性。

Description

玉米甲硫氨酸亚砜还原酶基因ZmMSRB3及应用
技术领域
本发明属于分子生物学和生物技术领域，具体为玉米甲硫氨酸亚砜还原酶基因ZmMSRB3及应用。
背景技术
作物经常会受到各种各样的非生物胁迫，例如干旱、盐、低温等，严重制约了作物的种植区域，甚至导致产量下降。玉米已被证明是对环境最具适应性的作物之一。但玉米生长发育及产量依旧会受到多种非生物胁迫的影响。其中，东北地区寒冷胁迫是影响玉米产量的主要非生物胁迫之一，当玉米遭受长时间寒冷胁迫时，会导致玉米植株生长发育受到不同程度上的损害、叶片冻伤甚至死亡，影响玉米早期的生长发育从而导致玉米产量下降，因此对玉米抗冷基因的挖掘和研究变得尤为重要，为玉米的分子育种奠定理论基础。
甲硫氨酸亚砜还原酶基因存在于绝大多数生物体中，编码一种甲硫氨酸亚砜还原酶蛋白(methionine sulfoxide reductase)，是已知的最大蛋白家族之一。众所周知，生物体正常有氧代谢以及遭受胁迫危害时，会不可避免的产生ROS，ROS具有高度的反应的活性，能够造成DNA、RNA、氨基酸、蛋白质及脂质等生物大分子的氧化损伤。其中半胱氨酸、甲硫氨酸等含硫氨基酸尤其容易受到ROS的氧化，从而发生结构的改变甚至功能的丧失。尽管生物体经过长期的进化过程形成了酶促和非酶促的ROS清除系统来减少细胞内的ROS积累，但是仍然有许多ROS从清除系统中逃脱，而半胱氨酸和甲硫氨酸由于具有含硫残基，极易受到ROS的氧化，生物体中过多的ROS能够氧化半胱氨酸和甲硫氨酸的含硫残基进而影响蛋白质大分子的结构与功能。甲硫氨酸的氧化产物被称为甲硫氨酸亚砜(MetSO)，由于甲硫氨酸是一个手性分子，具有旋光性，氧化后的硫原子是一个手性原子，存在两种构型，互为同分异构体，分别称为S型甲硫氨酸亚砜(Met-S-SO)和R型甲硫氨酸亚砜(Met-R-SO)。
值得庆幸的是，这些反应均是可逆的，MetSO可在甲硫氨酸亚砜还原酶作用下，由氧化态的甲硫氨酸亚砜还原为Met。MSR不但可将游离型的MetSo还原，还可以将肽型的MetSo还原为Met，从而修复受损的氨基酸或蛋白质，恢复其功能。
尽管目前对MSR的研究越来越多，但是主要集中在动物方面，在植物方面的研究主要体现在拟南芥、水稻和小麦中，对于MSR功能的研究也大都体现在抗盐抗旱等方面。ZmMSRB3基因在玉米中的研究相对较少，且玉米中该基因的耐冷功能研究未见报道，耐冷机制尚未明确。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施方式的一些方面以及简要介绍一些较佳实施方式。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
因此，本发明的目的是(1)提供了一种DNA序列，其是在耐冷玉米自交系W9816中克隆得到的甲硫氨酸亚砜还原酶基因，命名为ZmMSRB3；(2)提供玉米甲硫氨酸亚砜还原酶基因ZmMSRB3在拟南芥抗冷基因工程方面的应用。
为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：
玉米甲硫氨酸亚砜还原酶基因ZmMSRB3及应用，其核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：1所示
SEQ ID NO.1的序列
(i)序列特征：(A)长度：654bp；(B)类型：核苷酸；(C)链性：单链。
(ii)分子类型：核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.1
Figure BDA0003106732110000031
提取课题组自行培育的耐冷玉米自交系W9816三叶期叶片的RNA，反转录成cDNA为模板，以ZmMSRB3-FP/RP为特异引物，采用PCR技术对ZmMSRB3基因进行克隆。将扩增产物进行电泳检测，在650bp左右处有扩增条带，与预期目的基因大小相一致。将扩增产物的凝胶回收片段连接到pDONR207载体上，转化DH5α大肠杆菌感受态，将阳性的单克隆菌液进行Sanger测序，获得耐冷玉米自交系W9816甲硫氨酸亚砜还原酶基因ZmMSRB3预期完整的开放阅读框(ORF)全序列。
耐冷玉米自交系W9816甲硫氨酸亚砜还原酶基因ZmMSRB3 ORF全长为654bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，如SEQ ID NO:1所示。
作为本发明所述的玉米甲硫氨酸亚砜还原酶基因ZmMSRB3及应用的一种优选方案，其中：所述的核苷酸序列SEQ ID NO：1编码，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示
SEQ ID NO.2的序列
(i)序列特征：(A)长度：217a.a.；(B)类型：氨基酸；(C)链性：单链。
(ii)分子类型：氨基酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.2
Figure BDA0003106732110000041
耐冷玉米自交系W9816甲硫氨酸亚砜还原酶基因ZmMSRB3由217个氨基酸组成，根据基因结构域组成发现ZmMSRB3属于MSR家族中的可溶性蛋白这一大类，通过蛋白进行系统进化分析，发现它们存在数个分支，表明了它们的功能可能各不相同，而ZmMSRB3与TaMSRB3(小麦)的亲缘关系较近，有研究表明TaMSRB3基因参与了小麦的耐盐耐旱响应，但ZmMSRB3基因参与植物耐冷响应的研究还未见报到。
作为本发明所述的玉米甲硫氨酸亚砜还原酶基因ZmMSRB3及应用的一种优选方案，其中：一种重组植物表达载体，含有玉米甲硫氨酸亚砜还原酶基因ZmMSRB3。
根据ZmMSRB3基因的ORF序列及连接在pDONR207上的阳性菌液测序结果，选择正确序列的菌株进行保存，并且扩摇菌液提取相应的质粒，通过Gateway体系的LR反应将ZmMSRB3基因连接在表达载体pEarlygate101上。
作为本发明所述的玉米甲硫氨酸亚砜还原酶基因ZmMSRB3及应用的一种优选方案，其中：玉米甲硫氨酸亚砜还原酶基因ZmMSRB3在拟南芥抗冷基因工程方面的应用。
利用蘸花法将含有ZmMSRB3基因的植物表达载体导入拟南芥，多代经Basta筛选及分子鉴定，获得T3代拟南芥转基因植株，对纯合的T3代转基因拟南芥植株进行抗逆性分析，结果表明，过表达植株耐冷性显著高于野生型。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：提供了一种耐冷玉米自交系W9816的核苷酸序列及氨基酸序列，构建了植物表达载体并转化拟南芥，通过冷胁迫处理后观测转基因拟南芥的表型、存活率等生命状态，结果显示玉米甲硫氨酸亚砜还原酶基因ZmMSRB3可提高拟南芥的耐冷性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将结合附图和详细实施方式对本发明进行详细说明，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为ZmMSRB3基因与玉米同亚家族其它基因氨基酸的多重序列比较。
图2为玉米ZmMSRB3基因的系统进化树分析示意图。
图3为过表达株系、野生型和突变体4℃时萌发率统计(A：ZmMSRB3过表达、野生型和突变体常温下萌发表型；B：ZmMSRB3过表达、野生型和突变体4℃下萌发表型；C：常温下萌发率统计；D：4℃萌发率统计(值代表三次生物学重复的平均值±标准差，*P＜0.05，**P＜0.01，Bar：1cm))。
图4为三周龄的拟南芥幼苗在-8℃处理5h，野生型和过表达株系的存活率对比(注：A：-8℃处理后表型对比；B：野生型和过表达株系存活率的统计学分析(值代表三次生物学重复的平均值±标准差，*P＜0.05，**P＜0.01))。
图5为过表达株系、野生型和突变体生理生化指标的测定。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施方式的限制。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步地详细描述。
实施例1
玉米甲硫氨酸亚砜还原酶基因ZmMSRB3的克隆
1.RNA的提取
培养耐冷玉米自交系W9816至三叶期，使用康为世纪的超纯RNA提取试剂盒对叶片的Total RNA进行提取。
(1)取新鲜玉米叶片在液氮中充分研磨，每30-50mg组织加入1ml TRIzonReagent，混匀。
(2)样品中加入TRIzon Reagent后温和上下颠倒几次，使样本充分裂解，室温放置5min，
使蛋白核酸复合物完全分离。
(3)加入200μl氯仿，盖好离心管盖，剧烈振荡15s，室温放置2min。
(4)4℃12,000rpm离心10min，吸取上层水相550μl，将上层水相移到一个新的RNase-Free离心管中。
(5)在水相溶液中加入550μl的70％乙醇(无RNase水配制)，颠倒混匀。
(6)将上一步得到的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱(Spin Columns RM)中。若一次不能加完溶液，可分多次转入，12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(7)向吸附柱中加入700μl Buffer RW1，12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(8)向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(9)重复步骤(8)。
(10)12,000rpm离心2min，倒掉收集管中废液，将吸附柱置于室温数分钟，彻底晾干。
(11)将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位加入30-50μlRNase-Free Water，室温放置1min，12,000rpm离心1min，收集RNA溶液，-80℃保存RNA，防止降解。
2.反转录
使用TaKaRa的PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser对提取的RNA进行反转录。
去gDNA反应体系如下表1：
表1.去gDNA反应体系
试剂 体积
5×gDNA Eraser Buffer 2μl
gDNA Eraser 1μl
Total RNA 1μg
RNase Free Water up to 10μl
将预混液混匀后放入42℃孵育2min，随后4℃，5min。
反转录反应SYBR Green qPCR法，具体反转录反应体系如下表2，
表2.反转录反应体系
试剂 体积
步骤1反应液 10μl
rime Soript RT Enzyme Mix Ⅰ 1μl
RT Primer Mix 1μl
5×Prime Soript Buffer 2 4μl
RNase Free Water 4μl
整个体系放入PCR仪中，程序设置37℃，15min；85℃，5s。
3.ZmMSRB3基因ORF全长的扩增
根据NCBI公布的玉米ZmMSRB3的ORF基因序列，运用生物信息学软件Primer 5.0遵循引物设计原则，设计该基因的Gateway特异性克隆引物，如下所示：
ZmMSRB3-FP-5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGTGCGTCCAGCGTCT-3’
ZmMSRB3-RP-5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTGGCTTCCTCGGGGGACGGATTGA-3’
以反转录得到的cDNA为模板，使用高保真耐热DNA聚合酶PrimeSTAR GXL DNApolymerase克隆ZmMSRB3，反应体系和程序如表3。(若cDNA浓度太低，可适当增加cDNA的用量。若第一次PCR的目的条带过浅，可用其回收产物继续进行同样步骤的PCR)，PCR反应体系如表3：
表3.基因克隆反应体系
组分 体积
5×PrimeSTAR GXL Buffer 10μl
dNTP Mixture 4μl
ZmMSRB3-FP 1μl
ZmMSRB3-RP 1μl
cDNA 2μl
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1μl
灭菌蒸馏水 31μl
PCR反应程序如表4：
表4.基因克隆反应程序
Figure BDA0003106732110000081
4.ZmMSRB3的DNA片段回收
使用生工的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒对ZmMSRB3目的片段进行回收。
(1)电泳后切取含有ZmMSRB3目的片段的胶块，称重，置于1.5ml离心管中。根据胶块的重量，每100mg左右的凝胶对应加入300μl Buffer B2。
(2)将离心管放入50℃金属浴10min，在此期间可数次颠倒离心管使融化的液体和未融化的胶块混匀，加速溶化。
(3)将所得溶液置于吸附柱中并以8000rpm离心30s。如果溶液的总体积大于750μl，每次加入750μl，多次重复操作。
(4)向吸附柱中加入300μl Buffer B2，转速设定为9000rpm，离心30s，然后倒出废液。
(5)向吸附柱中加入500μl Wash Buffer，设置转速为9000rpm，离心时间30s，倒掉废液，再重复一次。
(6)把空的吸附柱和收集管一起放入离心机中，在9000rpm条件下离心60s，取一个新的1.5mL的离心管，将吸附柱放入其中，晾置10min。
(7)在吸附膜中央加入30ul TE buffer或ddH2O，室温静置2min，在9000rpm条件下离心60s，将该步骤中所得到的DNA溶液放在-20℃的冰箱中保存或用于后续试验。
5.ZmMSRB3连接pDONR207 Vector
使用invitrogen的Gateway BP clonase将目的片段与pDONR207载体进行连接，获得重组载体用于基因测序如表5：
表5.BP反应体系
组分 体积
pDONR207 Vector 1μl
ZmMSRB3 DNA 3.5μl
BP酶 0.5μl
反应程序：25℃反应3h。
6.DH5α大肠杆菌感受态转化及PCR检测
(1)将50μl DH5α大肠杆菌感受态置于冰上融化。
(2)用移液枪吸取连接产物或重组质粒5μl，加到50μl的DH5α大肠杆菌感受态中。
(3)冰浴30min后，42℃热激90s，冰浴5min。随后加入800μl LB液体培养基。
(4)37℃震荡培养1h，8000rpm离心3min。弃掉上清液，在离心管中留有大约50μl培养基。用移液枪吹打混匀后，将其涂布于含有Gen抗生素的LB固体培养基上，37℃恒温，倒置培养12-16h。
(5)挑取单菌落于800μl含有相应抗生素的LB液体培养基中，将离心管放入摇床，37℃180rpm，振荡培养6h左右。
(6)使用Ex Taq酶对菌液进行PCR分子检测。对PCR结果为阳性的菌液送生工基因公司进行测序，原菌液于-80℃冰箱保存。
实施例2
玉米基因的生物信息学分析
ZmMSRB3基因编码一种玉米甲硫氨酸亚砜还原酶B3，其开放阅读框有654bp的核苷酸，编码217个氨基酸，利用Clustal对同亚家族的MSR基因进行多重序列比对，如图1所示。结果表明：在MSRB亚家族中，不同基因含有相同的保守位点，如均含有产于氧化还原的半胱氨酸残基。
通过蛋白进行系统进化分析，发现它们存在数个分支，如图2所示。结果表明：它们的功能可能各不相同，而ZmMSRB3与小麦和水稻的MSR基因的亲缘关系较近，而小麦和水稻中的MSR基因有相关报道和抗盐旱等非生物胁迫有关，这说明ZmMSRB3很可能对盐旱等非生物胁迫密切相关，但ZmMSRB3基因参与植物耐冷响应的研究还未见报到。
实施例3
ZmMSRB3基因植物表达载体的构建
1.根据测序结果正确的菌液进行扩摇，提取质粒。
2.扩摇表达载体的菌液，提取pEarlygate101空载体的质粒。
3.根据Gateway反应体系，将重组质粒和空的表达载体做LR反应。
4.转化大肠杆菌感受态及提取质粒进行鉴定，连接体系如表6所示。
表6.LR反应体系
组分 体积
ZmMSRB3基因质粒 2.5μl
Pearlygate101载体 1.5μl
水 0.5μl
LR酶 0.5μl
反应程序：25℃反应3h。
实施例4
转ZmMSRB3基因拟南芥的获得及分子检测
利用蘸花法对基因进行拟南芥转化，具体如下：
1.将开花的拟南芥倒置使花蕾朝下，侵入农杆菌菌液中2min左右。
2.将转化后的拟南芥植株平放，盖好保鲜膜，低光强度下生长24h后置于正常光照条件下培养生长，一周后同上再侵染一次。
3.转化后植株可正常地开花生长，待角果完全枯黄、欲开裂时，即可收获种子。
4.收获的部分T0代种子经Basta筛选和PCR鉴定，获得T1代转基因植株，经过两次加代，获得T3代拟南芥植株，用于后续的表型筛选。
实施例5
T3代转ZmMSRB3基因拟南芥的冷胁迫处理与长势测定
将野生型、转基因和突变体植株的拟南芥种子用百分之一的次氯酸钠消毒后点种于同一1/2MS固体培养基上，四度黑暗春化三天，待春化结束后，分别将其置于常温和四度下培养，待种子开始萌发后统计其萌发数量和速度，实验重复三次，如图3所示。结果表明：在常温条件下，野生型、突变体和转基因三种株系的萌发率基本相同无显著差异(图3A和C)，而在4℃条件下，转基因株系的萌发速度显著快于野生型和突变体，同时野生型植株的萌发速度显著快于突变体(图3B和D)，说明ZmMSRB3可以提高拟南芥种子在低温条件下的萌发率，提高了种子萌发时期的冷耐受力。
将三周龄的野生型和转基因拟南芥分别置于常温和4℃进行-8℃处理5h，之后都置于常温下进行恢复培养，3-5天后进行拍照，进行存活率统计，如图4所示。结果表明-8℃冷冻处理后过表达株系的存活率高于野生型存活率，且存在显著性差异，说明ZmMSRB3的过表达可以显著提高拟南芥的抗冻能力。
实施例6
T3代转ZmMSRB3基因拟南芥的生理生化分析
使用植物丙二醛(MDA)测定试剂盒(微管法)进行测定MDA含量，详细步骤见其使用说明书；用过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒(可见光法)进行测定CAT含量，详细步骤见其使用说明书；用脯氨酸(Pro)测定试剂盒(比色法)进行测定脯氨酸含量，详细步骤见其使用说明书；用总超氧化物歧化酶(T-SOD)测定试剂盒(羟胺法)进行测定SOD活力值，详细步骤见其使用说明书。
将培养至三周龄的拟南芥各株系置于4℃处理36h，分别进行各生理生化指标的测定，相关实验步骤参见其说明书，如图5所示。
常温下ZmMSRB3过表达植株、野生型及突变体的MDA含量无显著差异，4℃时ZmMSRB3过表达植株MDA含量显著低于野生型，且突变体MDA含量显著高于野生型(图5A)，这表明ZmMSRB3可以减少冷胁迫对细胞的氧化损伤；SOD活力变化表明，ZmMSRB3过表达植株在常温下和野生型没有明显差异，但突变体SOD活力显著低于野生型，4℃下过表达植株活力值显著高于野生型，突变体SOD活力值仍显著低于野生型(图5B)，表明ZmMSRB3过表达在4℃下能显著提高SOD活力；在常温下ZmMSRB3部分过表达植株和部分突变体的PRO较野生型植株存在显著差异，4℃下ZmMSRB3所有过表达株系PRO含量均显著高于野生型，且突变体PRO含量显著低于野生型(图5C)，表明在冷胁迫下，ZmMSRB3过表达提高了拟南芥脯氨酸含量；常温和4℃下ZmMSRB3过表达株系CAT活力值均高于野生型(图5D)，表明ZmMSRB3可以提高拟南芥中CAT的活性。
虽然在上文中已经参考实施方式对本发明进行了描述，然而在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件。尤其是，只要不存在结构冲突，本发明所披露的实施方式中的各项特征均可通过任意方式相互结合起来使用，在本说明书中未对这些组合的情况进行穷举性的描述仅仅是出于省略篇幅和节约资源的考虑。因此，本发明并不局限于文中公开的特定实施方式，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。

Claims (4)

1.玉米甲硫氨酸亚砜还原酶基因ZmMSRB3，其特征在于：其核苷酸序列如序列表中SEQID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的玉米甲硫氨酸亚砜还原酶ZmMSRB3，其特征在于：所述的核苷酸序列SEQ ID NO：1编码，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。
3.一种重组植物表达载体，其特征在于：含有如权利要求1所述的玉米甲硫氨酸亚砜还原酶基因ZmMSRB3。
4.如权利要求1所述的玉米甲硫氨酸亚砜还原酶基因ZmMSRB3在拟南芥耐冷基因工程方面的应用。
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