CN113215180B

CN113215180B - 玉米9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶蛋白基因ZmVP14及应用

Info

Publication number: CN113215180B
Application number: CN202110639544.2A
Authority: CN
Inventors: 原亚萍; 单晓辉; 赵婷玉; 刘宏魁; 苏胜忠; 李世鹏; 李贺
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2021-06-08
Filing date: 2021-06-08
Publication date: 2023-03-28
Anticipated expiration: 2041-06-08
Also published as: CN113215180A

Abstract

玉米9‑顺‑环氧类胡萝卜素双加氧酶蛋白基因ZmVP14及应用属分子生物学和生物技术领域，ZmVP14的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；一种耐冷玉米自交系9‑顺‑环氧类胡萝卜素双加氧酶蛋白，由ZmVP14基因编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；一种植物表达载体，含有耐冷玉米自交系W98169‑顺‑环氧类胡萝卜素双加氧酶蛋白基因ZmVP14；构建了植物表达载体并转化拟南芥，通过低温胁迫后观测转基因拟南芥的表型、根长、萌发率等生命状态，结果显示耐冷玉米自交系W98169‑顺‑环氧类胡萝卜素双加氧酶蛋白基因ZmVP14可提高拟南芥的耐冷性。

Description

玉米9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶蛋白基因ZmVP14及应用

技术领域

本发明属于分子生物学和生物技术领域，具体涉及一种玉米9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶蛋白基因ZmVP14及应用。

背景技术

玉米(Zea mays L.)是中国三大主要粮食作物之一，种植范围遍布全国，主要集中在东北、华北和西南地区。因此，玉米生产在区域农业经济中起着至关重要的作用。在全球变暖的背景下，极端天气和气候极端事件的发生频率和强度在全球范围内呈上升趋势，这对作物单产和全球粮食安全产生了严重影响。如何提高玉米对极端天气的耐受能力以应对人口增长和气候变化，保障粮食安全已迫在眉睫。

玉米vivaparous14(VP14)编码一种9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)，它催化ABA生物合成中的限速步骤,胡萝卜素和类胡萝卜素生物合成途径已在许多植物中被广泛鉴定。

NCED可催化9-顺式黄嘌呤或9-顺式黄嘌呤的11，12碳-碳双键的氧化裂解。C15醛，黄嘌呤毒素被氧化并通过两次后续反应转化为具有生物活性的ABA。包括VP14在内的NCED是决定ABA水平的关键调控因子。类胡萝卜素的酶促裂解是由酶家族催化的，俗称类胡萝卜素裂解加氧酶(CCOs)，或类胡萝卜素裂解双加氧酶(CCD)。专门作用于类胡萝卜素底物的CCD被称为类胡萝卜素裂解加氧酶。植物中CCD的两个功能不同的组又细分为CCD和NCED。

有研究发现，玉米VP14突变体出现穗发芽的表型，且突变体的ABA含量比野生型低70％，表明ABA生物合成存在缺陷，VP14受胁迫和叶片发育的调控和诱导。在拟南芥中，NCED包括五个与ABA生物合成有关的成员。其中，大多数NCED受发育调节，除了AtNCED3负责胁迫诱导下叶片中大部分ABA生物合成。这些实验证明，NCED可以通过被胁迫诱导表达并参与植物抗逆的过程，但玉米VP14基因编码的蛋白是否对植物抵抗冷胁迫产生重要作用，具体如何行使功能，以及是否与其他蛋白共同作用来行使功能的相关研究尚未十分明确。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施方式的一些方面以及简要介绍一些较佳实施方式。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

因此，本发明的目的是提供(1)提供了一种DNA序列，其是在耐冷玉米自交系W9816中克隆得到的编码9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶基因，命名为ZmVP14；(2)提供玉米9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶基因ZmVP14在拟南芥抗冷基因工程方面的应用。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：

玉米9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶蛋白基因ZmVP14及应用，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示

SEQ ID NO.1的序列

(i)序列特征：(A)长度：1815bp；(B)类型：核苷酸；(C)链性：单链。

(ii)分子类型：核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.1

提取课题组自行培育的耐冷玉米自交系W9816三叶期叶片的RNA，反转录成cDNA为模板，以ZmVP14-F/R为特异引物，采用RT-PCR技术对ZmVP14基因进行克隆。将扩增产物进行电泳检测，在1815bp左右处有扩增条带，与预期目的基因大小相一致。将扩增产物的凝胶回收片段连接到pDONR207载体上，转化DH5α大肠杆菌感受态，将阳性的单克隆菌液进行Sanger测序，获得耐冷玉米自交系W9816 9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶基因ZmVP14预期完整的开放阅读框(ORF)全序列。

耐冷玉米自交系W9816 9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶基因ZmVP14 ORF全长为1815bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，如SEQ ID NO:1所示。

作为本发明所述的玉米9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶蛋白基因ZmVP14及应用的一种优选方案，其中：所述的核苷酸序列SEQ ID NO：1编码，其氨基酸序列如序列表中SEQID NO：2所示

SEQ ID NO.2的序列

(i)序列特征：(A)长度：604aa；(B)类型：氨基酸；(C)链性：单链。

(ii)分子类型：氨基酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.2

耐冷玉米自交系W98169-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶由604个氨基酸组成，为探究ZmVP14与玉米中同家族基因、模式植物拟南芥中NCED酶类及其他部分植物中NCED之间的进化关系，在氨基酸水平上进行了系统进化树分析。结果表明，ZmVP14与高粱中NCED1同源性最高。

作为本发明所述的玉米9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶蛋白基因ZmVP14及应用的一种优选方案，其中：一种重组植物表达载体，含有玉米9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶蛋白基因ZmVP14。

根据ZmVP14基因的ORF序列及入门载体pDONR207的相关信息，设计引物时加入相应交换序列扩增ZmVP14基因。将经测序验证的、准确的ZmVP14基因连接的入门载体用LR酶与pEarleyGate101表达载体重组为ZmVP14基因的植物表达载体。之后将重组载体转化大肠杆菌、提取质粒进行PCR鉴定。

作为本发明所述的玉米9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶蛋白基因ZmVP14及应用的一种优选方案，其中：玉米9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶蛋白基因ZmVP14在拟南芥抗冷基因工程方面的应用。

利用蘸花法将含有ZmVP14基因的植物表达载体导入拟南芥，多代经Basta筛选及分子鉴定，获得T₃代拟南芥转基因植株。对纯合的T₃代转基因拟南芥植株进行抗逆性分析，结果表明，过表达植株耐冷性显著高于野生型。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：提供了一种耐冷玉米自交系W9816的核苷酸序列及氨基酸序列，构建了植物表达载体并转化拟南芥，通过低温胁迫处理后观测转基因拟南芥的表型、存活率等生命状态，结果显示玉米9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶基因ZmVP14可提高拟南芥的耐冷性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将结合附图和详细实施方式对本发明进行详细说明，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为多重序列比对。

图2为玉米ZmVP14基因的系统进化树分析示意图(其中：OsNCED为水稻；AtNCED为拟南芥；SbNCED为高粱；ZmNCED为玉米；GmNCED为大豆)。

图3为-8℃处理条件下拟南芥表型示意图。

图4为-8℃处理条件下拟南芥存活率示意图。

图5为4℃处理条件下拟南芥生理生化指标测定示意图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施方式的限制。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步地详细描述。

实施例1

玉米9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶基因ZmVP14的克隆

1.RNA的提取

培养耐冷玉米自交系W9816至三叶期，使用康为世纪的超纯RNA提取试剂盒(CW0581)对叶片的Total RNA进行提取。

(1)取新鲜玉米叶片在液氮中充分研磨，每30-50mg组织加入1ml TRIzonReagent，混匀。

(2)样品中加入TRIzon Reagent后温和上下颠倒几次，使样本充分裂解。室温放置5min，

使蛋白核酸复合物完全分离。

(3)加入200μl氯仿，盖好离心管盖，剧烈振荡15s，室温放置2min。

(4)4℃12,000rpm离心10min，吸取上层水相550μl，将上层水相移到一个新的RNase-Free离心管中。

(5)在水相溶液中加入550μl的70％乙醇(无RNase水配制)，颠倒混匀。

(6)将上一步得到的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱(Spin Columns RM)中。若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(7)向吸附柱中加入700μl Buffer RW1，12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(8)向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(9)重复步骤(8)。

(10)12,000rpm离心2min，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟，彻底晾干。

(11)将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位加入30-50μlRNase-Free Water，室温放置1min，12,000rpm离心1min，收集RNA溶液，-80℃保存RNA，防止降解。

2.反转录

使用TaKaRa的PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047A)对提取的RNA进行反转录。

去gDNA反应体系如下表1：

表1去gDNA反应体系

试剂	体积
		5×gDNA Eraser Buffer	2μl
gDNA Eraser	1μl
		Total RNA	1μg
RNase Free Water	up to 10μl

将预混液混匀后放入42℃孵育2min，随后4℃，5min。

反转录反应SYBR Green qPCR法，具体反转录反应体系如下表2，

表2反转录反应体系

整个体系放入PCR仪中，程序设置37℃，15min；85℃，5s。

3.ZmVP14基因ORF全长的扩增

根据NCBI公布的玉米ZmVP14的ORF基因序列，运用生物信息学软件Primer5.0遵循引物设计原则，设计该基因的特异性克隆引物，如下所示：

ZmVP14-F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGCAGGGTCTCGCCCCGC-3’

ZmVP14-R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTAAACGTGGAGCTCGGTCAGGCC-3’

以反转录得到的cDNA为模板，使用高保真耐热DNA聚合酶PrimeSTAR GXL DNApolymerase克隆ZmVP14，反应体系和程序如表3。注：若cDNA浓度太低，可适当增加cDNA的用量。若第一次PCR的目的条带过浅，可用其回收产物继续进行同样步骤的PCR，PCR反应体系如表3：

表3 PCR反应体系

组分	体积
		5×PrimeSTAR GXL Buffer	10μl
dNTP Mixture	4μl
		ZmVP14-F	1μl
ZmVP14-R	1μl
		cDNA	2μl
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase	1μl
		灭菌蒸馏水	31μl

PCR反应程序如表4：

表4 PCR反应程序

4.ZmVP14的DNA片段回收

使用生工的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒对ZmVP14目的片段进行回收。

(1)电泳后切取含有ZmVP14目的片段的胶块，称重，置于1.5ml离心管中。根据胶块的重量，每100mg左右的凝胶对应加入300μl BufferB2。

(2)将离心管放入50℃金属浴10min，在此期间可数次颠倒离心管使融化的液体和未融化的胶块混匀，加速溶化。

(3)将所得溶液置于吸附柱中并以8000rpm离心30s。如果溶液的总体积大于750μl，每次加入750μl，多次重复操作。

(4)向吸附柱中加入300μl Buffer B2，转速设定为9000rpm，离心30s，然后倒出废液。

(5)向吸附柱中加入500μl Buffer B2，设置转速为9000rpm，离心时间30s。倒掉废液。再重复一次。

(6)把空的吸附柱和收集管一起放入离心机中，在9000rpm条件下离心60s。取一个新的1.5mL的离心管，将吸附柱放入其中，晾置10min。

(7)在吸附膜中央加入30ul TE buffer或ddH2O，室温静置2min，在9000rpm条件下离心60s。将该步骤中所得到的DNA溶液放在-20℃的冰箱中保存或用于后续试验。

5.ZmVP14连接pDONR207 Vector

使用GatewayTMBP ClonaseTM||Enzymemix将目的片段与pDONR207载体进行连接，获得重组载体用于基因测序。

连接反应体系如下表5：

表5 BP反应体系

/>

6.DH5α大肠杆菌感受态转化及PCR检测

(1)将50μl TOP10大肠杆菌感受态置于冰上融化。

(2)用移液枪吸取连接产物或重组质粒5μl，加到50μl的TOP10大肠杆菌感受态中。

(3)冰浴30min后，42℃热激90s，冰浴5min。随后加入800μl LB液体培养基。

(4)37℃震荡培养1h，8000rpm离心5min。弃掉上清液，在离心管中留有大约50μl培养基。用移液枪吹打混匀后，将其涂布于含有相应抗生素的LB固体培养基上，37℃恒温，倒置培养12-16h。

(5)挑取单菌落于800μl含有相应抗生素的LB液体培养基中，将离心管放入摇床，37℃180rpm，振荡培养10h左右。

(6)使用Ex Taq酶对菌液进行PCR分子检测。对PCR结果为阳性的菌液进行扩摇，并在菌液中加15％甘油，送生工基因公司进行测序，原菌液于-80冰箱保存。

实施例2

玉米基因的生物信息学分析

ZmVP14基因编码一种玉米9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶，其开放阅读框有1815bp的核苷酸，编码604个氨基酸。

如图1、图2所示，在氨基酸水平上进行了多重序列比对与系统进化树分析，结果表明ZmVP14与高粱中NCED1同源性最高。

实施例3

ZmVP14植物表达载体的构建

1.根据入门载体pDONR207序列，引物设计时加入相应置换序列。

2.把经过高保真酶扩增出的基因，通过回收、转化、PCR鉴定、测序等一系列步骤，确定表达基因的正确性，有完整的开放阅读框、无错配、无移码。

3.把测序正确的基因利用Gateway技术连接到植物表达载体pEarleyGate101上。

提取测序正确的连接目的基因的入门载体质粒，利用GatewayTMLR ClonaseTM||Enzyme mix将目的基因置换到植物表达载体上，反应体系如表6：

表6 LR反应体系

试剂	用量
		表达载体	2μl
Pdonr207-VP14	2.5μl
		LR Enzyme	0.5μl

连接仪中22℃过夜反应，用于大肠杆菌转化。

实施例4

转ZmVP14基因拟南芥的获得及分子检测

利用蘸花法对基因进行拟南芥转化，具体如下：

1.将开花的拟南芥倒置使花蕾朝下，侵入农杆菌菌液中2min。

2.将转化后的拟南芥植株平放，盖好保鲜膜，低光强度下生长24h后置于正常光照条件下培养生长，一周后同上再侵染一次。

3.转化后植株可正常地开花生长，待角果完全枯黄、欲开裂时，即可收获种子。

4.收获的部分T0代种子经Basta筛选，PCR鉴定，获得T1代转基因植株，经过两次加代，获得T3代拟南芥植株，可用于后续的表型筛选。

实施例5

T₃代转ZmVP14基因拟南芥的低温处理与存活率统计

将突变体、野生型和转基因植株的拟南芥种子撒播于营养土中，生长25天后转移至-8℃处理2小时，在常温下恢复培养3天，观察拟南芥的存活情况如图3、图4所示，结果表明，低温下转基因拟南芥植株(OE3和OE4)存活率显著高于野生型(WT)和突变体(nced9)，说明过表达ZmVP14能提高拟南芥的耐冷性。

实施例6

T₃代转ZmVP14基因拟南芥的生理生化分析

将培养至4周龄的拟南芥各株系4℃处理48h，之后分别进行，PRO含量和SOD活力的测定。结果显示如图5所示。

实验结果表明，低温处理后，野生型、转基因植株和突变体的PRO的含量、POD的活力均有所上升，说明各株系均发生了胁迫响应。冷处理之后，转基因拟南芥的脯氨酸含量较对照而言显著提高，说明其耐冷性更强。转基因拟南芥植株SOD活力提高，显著高于正常生长状态的SOD活力。

总之，与野生型相比，转基因拟南芥植株在冷处理之后抗氧化能力更高，PRO含量、SOD活力显著提高，表明本发明的转基因拟南芥植株的耐冷性相对较高，过表达ZmVP14基因可以提高拟南芥的耐冷性。

根据上述技术，本发明从玉米自交系W9816中得到一个9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶基因ZmVP14。通过农杆菌介导的转化方法，将ZmVP14植物表达载体成功转化拟南芥，获得了纯合的T₃代转基因拟南芥植株。结果显示，在低温胁迫下，转基因拟南芥存活率显著高于野生型和突变体，经低温胁迫处理后，转基因拟南芥的抗氧化能力，PRO含量、SOD活力较野生型对照均显著提高。上述结果均说明玉米自交系W98169-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶基因ZmVP14能提高拟南芥的耐冷性。

虽然在上文中已经参考实施方式对本发明进行了描述，然而在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件。尤其是，只要不存在结构冲突，本发明所披露的实施方式中的各项特征均可通过任意方式相互结合起来使用，在本说明书中未对这些组合的情况进行穷举性的描述仅仅是出于省略篇幅和节约资源的考虑。因此，本发明并不局限于文中公开的特定实施方式，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。

序列表

<110>吉林大学

<120>玉米9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶蛋白基因ZmVP14及应用

<160>2

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>815

<212>DNA/RNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

atgcagggtc tcgccccgcc cacctctgtt tccatacacc ggcacctgcc ggcccggtcc 60

agggcccggg cctccaattc cgtcaggttc tcgccgcgcg ccgtcagctc cgtgccgccc 120

gccgagtgcc tccaagcgcc gttccacaag cccgtcgccg acctgccggc gccgtccagg 180

aagcccgccg ccattgccgt cccagggcac tccgcggcgc cgaggaaagc ggacggcggc 240

aagaagcagc tcaacttgtt ccagcgcgcc gcggcggccg cgctcgacgc gttcgaggaa 300

gggttcgtgg ccaacgtcct ggagcggccc cacgggctgc ccagcacggc cgacccggcc 360

gtgcagatcg ccggcaactt cgcgcccgtc ggggagagcc cgcccgtgca cgagctcccc 420

gtctccggcc gcatcccgcc cttcatcgac ggggtctacg cgcgcaacgg cgccaacccc 480

tgcttcgacc ccgtcgccgg gcaccacctc ttcgacggcg acggcatggt gcacgcgctg 540

cggatacgca acggcgccgc cgagtcctac gcctgccgct tcacggagac cgcgcgcctg 600

cgccaggagc gcgcgatcgg ccgccccgtc ttccccaagg ccattggcga gctgcacggg 660

cactccggga tcgcgcgcct cgccctgttc tacgcgcgcg ccgcgtgcgg cctcgtggac 720

ccctcggccg gcaccggcgt ggccaacgcc ggcctcgtct acttcaacgg ccgcctgctc 780

gccatgtccg aggacgacct cccctaccac gtccgcgtgg cggacgacgg cgacctcgag 840

accgtcggcc gctacgactt cgacgggcag ctcggctgcg ccatgatcgc gcaccccaag 900

ctggacccgg ccaccgggga gctccacgcg ctcagctacg acgtcatcaa gaggccgtac 960

ctcaagtact tctacttcag gcccgacggc accaagtccg acgacgtgga gatcccgctg 1020

gagcagccta cgatgatcca cgacttcgcc atcaccgaga acttcgtggt tgtgcccgac 1080

caccaggtgg tgttcaagct ccaggagatg ctgcgcggcg ggtcgcccgt ggtgctggac 1140

aaggagaaga cgtcgcggtt cggcgtgctc cccaagcacg ccgcggacgc gtcggagatg 1200

gcgtgggtgg acgtgccgga ctgcttctgc ttccacctgt ggaacgcgtg ggaggacgag 1260

gcgacgggcg aggtggtggt gatcggctcc tgcatgaccc ccgccgactc catcttcaac 1320

gagtccgacg agcgcctgga gagcgtgctg acggagatcc gcctggacgc gcgcacgggc 1380

cggtccacgc gccgcgccgt cctgccgccg tcgcagcagg tgaacctgga ggtgggcatg 1440

gtgaaccgca acctgctggg ccgcgagacc cggtacgcgt acctcgcggt ggcggagccg 1500

tggcccaagg tgtcgggctt cgccaaggtg gacctgtcca cgggcgagct caccaagttc 1560

gagtacggcg agggccggtt cggcggcgag ccatgcttcg tgcccatgga cccggccgcg 1620

gcccacccgc gcggcgagga cgacgggtac gtgctcacct tcgtccacga cgagcgcgcc 1680

ggcacgtcgg agctacttgt ggtcaatgcc gccgacatgc ggctggaggc cacggtccag 1740

ctgccgtccc gcgtgccctt cggcttccac ggcaccttca tcacgggcca ggagctcgag 1800

gcccaggcgg cctga 1815

<210>2

<211>604

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

Met Gln Gly Leu Ala Pro Pro Thr Ser Val Ser Ile His Arg His Leu

1 5 10 15

Pro Ala Arg Ser Arg Ala Arg Ala Ser Asn Ser Val Arg Phe Ser Pro

20 25 30

Arg Ala Val Ser Ser Val Pro Pro Ala Glu Cys Leu Gln Ala Pro Phe

35 40 45

His Lys Pro Val Ala Asp Leu Pro Ala Pro Ser Arg Lys Pro Ala Ala

50 55 60

Ile Ala Val Pro Gly His Ser Ala Ala Pro Arg Lys Ala Asp Gly Gly

65 70 75 80

Lys Lys Gln Leu Asn Leu Phe Gln Arg Ala Ala Ala Ala Ala Leu Asp

85 90 95

Ala Phe Glu Glu Gly Phe Val Ala Asn Val Leu Glu Arg Pro His Gly

100 105 110

Leu Pro Ser Thr Ala Asp Pro Ala Val Gln Ile Ala Gly Asn Phe Ala

115 120 125

Pro Val Gly Glu Ser Pro Pro Val His Glu Leu Pro Val Ser Gly Arg

130 135 140

Ile Pro Pro Phe Ile Asp Gly Val Tyr Ala Arg Asn Gly Ala Asn Pro

145 150 155 160

Cys Phe Asp Pro Val Ala Gly His His Leu Phe Asp Gly Asp Gly Met

165 170 175

Val His Ala Leu Arg Ile Arg Asn Gly Ala Ala Glu Ser Tyr Ala Cys

180 185 190

Arg Phe Thr Glu Thr Ala Arg Leu Arg Gln Glu Arg Ala Ile Gly Arg

195 200 205

Pro Val Phe Pro Lys Ala Ile Gly Glu Leu His Gly His Ser Gly Ile

210 215 220

Ala Arg Leu Ala Leu Phe Tyr Ala Arg Ala Ala Cys Gly Leu Val Asp

225 230 235 240

Pro Ser Ala Gly Thr Gly Val Ala Asn Ala Gly Leu Val Tyr Phe Asn

245 250 255

Gly Arg Leu Leu Ala Met Ser Glu Asp Asp Leu Pro Tyr His Val Arg

260 265 270

Val Ala Asp Asp Gly Asp Leu Glu Thr Val Gly Arg Tyr Asp Phe Asp

275 280 285

Gly Gln Leu Gly Cys Ala Met Ile Ala His Pro Lys Leu Asp Pro Ala

290 295 300

Thr Gly Glu Leu His Ala Leu Ser Tyr Asp Val Ile Lys Arg Pro Tyr

305 310 315 320

Leu Lys Tyr Phe Tyr Phe Arg Pro Asp Gly Thr Lys Ser Asp Asp Val

325 330 335

Glu Ile Pro Leu Glu Gln Pro Thr Met Ile His Asp Phe Ala Ile Thr

340 345 350

Glu Asn Phe Val Val Val Pro Asp His Gln Val Val Phe Lys Leu Gln

355 360 365

Glu Met Leu Arg Gly Gly Ser Pro Val Val Leu Asp Lys Glu Lys Thr

370 375 380

Ser Arg Phe Gly Val Leu Pro Lys His Ala Ala Asp Ala Ser Glu Met

385 390 395 400

Ala Trp Val Asp Val Pro Asp Cys Phe Cys Phe His Leu Trp Asn Ala

405 410 415

Trp Glu Asp Glu Ala Thr Gly Glu Val Val Val Ile Gly Ser Cys Met

420 425 430

Thr Pro Ala Asp Ser Ile Phe Asn Glu Ser Asp Glu Arg Leu Glu Ser

435 440 445

Val Leu Thr Glu Ile Arg Leu Asp Ala Arg Thr Gly Arg Ser Thr Arg

450 455 460

Arg Ala Val Leu Pro Pro Ser Gln Gln Val Asn Leu Glu Val Gly Met

465 470 475 480

Val Asn Arg Asn Leu Leu Gly Arg Glu Thr Arg Tyr Ala Tyr Leu Ala

485 490 495

Val Ala Glu Pro Trp Pro Lys Val Ser Gly Phe Ala Lys Val Asp Leu

500 505 510

Ser Thr Gly Glu Leu Thr Lys Phe Glu Tyr Gly Glu Gly Arg Phe Gly

515 520 525

Gly Glu Pro Cys Phe Val Pro Met Asp Pro Ala Ala Ala His Pro Arg

530 535 540

Gly Glu Asp Asp Gly Tyr Val Leu Thr Phe Val His Asp Glu Arg Ala

545 550 555 560

Gly Thr Ser Glu Leu Leu Val Val Asn Ala Ala Asp Met Arg Leu Glu

565 570 575

Ala Thr Val Gln Leu Pro Ser Arg Val Pro Phe Gly Phe His Gly Thr

580 585 590

Phe Ile Thr Gly Gln Glu Leu Glu Ala Gln Ala Ala

595 600

Claims

1.玉米9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶蛋白基因ZmVP14在拟南芥抗冷基因工程方面的应用，其特征在于：所述ZmVP14核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。