CN102747093A - 一种柑橘CrNCED1基因及其在植物抗非生物胁迫中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种柑橘CrNCED1基因及其在植物抗非生物胁迫中的应用，从抗旱的印度酸橘（Citrusreshni）中分离、克隆得到一个NCED基因，申请人将其命名为CrNCED1，它包含1821bp的开放阅读框，编码606个氨基酸，等电点为6.05，预测的分子量为67.0kDa。本发明将CrNCED1基因转化烟草，获得的转基因植株的抗脱水、抗旱、抗盐和抗氧化胁迫能力均明显增强。本发明为植物抗逆基因工程提供了重要的基因资源，以为实施绿色农业、节水农业提供新的遗传资源。

Description

一种柑橘CrNCED1基因及其在植物抗非生物胁迫中的应用

技术领域

本专利属于植物基因工程领域。具体涉及一种从印度酸橘（Citrus reshni）中分离、克隆得到一个ABA合成关键酶NCED（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶）的编码基因CrNCED1，本发明还涉及一种CrNCED1基因在植物抗非生物胁迫环境中的应用，将该基因导入到烟草中，获得的转基因植株抗旱、抗盐和氧化胁迫能力明显提高。

背景技术

植物经常遭受一系列的环境胁迫，包括干旱、高温、低温、盐碱、淹水等，其中，干旱是影响作物生长发育和产量及限制植物地理分布最为重要的因素之一。在漫长的进化过程中，植物已经形成一套复杂的机制来适应和生存非生物逆境。对植物抗逆性的研究表明，植物对逆境的适应受遗传因素和植物激素两方面因素的控制，这两者可以通过逆境基因表达控制或代谢作用改变细胞膜系统，提高植物的抗逆能力。植物激素可能是抗逆性基因表达的启动物质，逆境胁迫改变了植物体内的激素平衡水平，从而使代谢途径发生变化，使得植物对逆境胁迫的抵抗能力增强（Nan等,2002;Wang等,2008）。

脱落酸（Abscisic acid，ABA）是一种重要的胁迫激素，又称应激激素，它调节植物对逆境胁迫的适应（Meurs等,1992）。ABA不仅可以作为胞间信号转导物质调节整个植株的抗逆反应，同时作为细胞逆境信号物质直接调控多个抗逆基因的表达（Bray，2002;Ishitani等,1997）。在逆境胁迫下，植物体内ABA合成系统启动，合成大量的ABA，促进气孔关闭，抑制气孔开放，减少蒸腾失水；并能通过增加根的透性和水的通导性来促进水分吸收，从而增强植物抵抗逆境胁迫的能力（Ji等,2011;Webb and Hetherington,1997）。

植物体内ABA的积累受到合成途径和降解途径的控制。对ABA合成途径的研究表明NCED（9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶）是ABA合成过程中的关键酶。NCED催化9-顺式紫黄质和9-顺式新黄质发生氧化裂解反应，生成ABA的前体物质黄质醛。NCED是一个多基因家族，不同植物的NCED基因承担着不同的作用，众多的NCED基因家族的成员不但在ABA合成过程中担负着重要的作用，而且在抵抗逆境胁迫维持植物生理形态等方面也发挥着重要的作用（Schwartz等,2003）。

已开展的研究表明，胁迫诱导的NCED基因在逆境应答反应和抗逆中起着重要作用，主要表现在以下几个方面：第一，在玉米（Burbidge等，1997）、番茄（Schwartz等，1997；Thompson等，2000）、豆子（Qin等，1999）、豇豆（Iuchi等，2000）、鳄梨（Chernys等，2000）、拟南芥（Iuchi等，2001；Frey等,2012）、花生（Wan等，2005）、柱花草（Stylosanthes guianensis）（Yang and Guo,2007）等多种植物中，正常生长条件时，NCED基因表达量很低，逆境胁迫下其表达量迅速上升，并且NCED基因的表达早于ABA积累；而一旦胁迫解除，其表达水平和ABA量又迅速回落到基准水平（Schwartz等，2003），表明NCED基因表达的诱导是胁迫下ABA生物合成的主要原因，从另一个方面也说明ABA生物合成是通过NCED基因在转录水平上进行调节（Qin等，1999；Iuchi等，2000）；第二，在烟草和拟南芥上的研究表明，与NCED基因有关的ABA合成突变体或NCED反义基因转化植株中ABA合成受到严重影响，其抗逆性也明显下降（Iuchi等，2000），外源加入ABA则能够提高突变体的抗性；在突变体中超量表达NCED基因后ABA合成得到恢复，抗性随之增强（Wan等，2006），进一步说明逆境下NCED介导的ABA合成是植物抗逆的一个重要因素；第三，超量表达NCED基因的转基因植株中ABA含量增高，转基因植株的抗性显著增强（Iuchi等，2001；Qin等，2002；Aswath等，2005；Thompson等，2007；Zhu等，2007；Hu等,2010）。

由于ABA是植物逆境信号传递途径中的重要信使，它能够激活在此途径中的一些重要激酶和转录因子，引起下游较多的逆境应答基因表达，类似于一种“集团作战”的方式。超量表达NCED基因与转化某些单一的功能基因（如LEA、脯氨酸合成相关基因等）相比，前者在提高抗旱性上更有优势（Yamaguchi-Shinozaki等，2005）。因此，NCED基因是用于遗传工程提高植物抗旱性的重要基因资源。

发明内容

本发明的一个目的是提供了一种从抗旱的印度酸橘（Citrus reshni）中分离、克隆得到一个NCED基因，申请人将其命名为CrNCED1，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一个目的是提供了一种CrNCED1基因在植物抗非生物胁迫中的应用。通过农杆菌介导的遗传转化方法将该基因转化烟草，鉴定其抗旱功能，为植物抗逆分子设计育种提供新的基因资源，以为实施绿色农业、节水农业提供新的遗传资源。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

申请人利用植物基因克隆技术从印度酸橘中克隆得到一个新基因CrNCED1，其核苷酸序列为序列表SEQ ID NO：1所示，在SEQ ID NO：1所示序列的1-1821bp处为该基因的编码区，它包含1821bp的开放阅读框，编码606个氨基酸；其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示，等电点为6.05，预测的分子量为67.0kDa。

申请人设计了克隆上述基因CrNCED1的cDNA序列的引物对，其核苷酸序列如下所示：

正向引物：5’-TTCGGATCCATGGCGGCAGCAACTAC-3’，即SEQ ID NO.3；

反向引物：5’-TTCGAGCTCTTAGGCCTGCTTGGCCA-3’，即SEQ ID NO.4。

一种CrNCED1基因在植物抗非生物胁迫中的应用，其应用过程是：

将该基因通过农杆菌介导的遗传转化转入烟草，获得转基因植株抗脱水、抗旱、抗盐和抗氧化胁迫。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、利用该基因转化，获得的转基因植株对多种非生物胁迫（脱水、抗旱、盐和氧化胁迫）具有抗性，从而实现一个基因提高多种抗性。

2、该基因的发现为植物抗逆基因工程提供了重要的基因资源，以为实施绿色农业提供新的遗传资源。

附图说明

图1为一种本发明的技术流程示意图。

图2为一种CrNCED1基因在脱水、盐、低温胁迫和ABA处理及恢复后的表达模式示意图。

图2A是印度酸橘在室温下失水0、1、3、6、9、12小时及恢复1、3、6小时后的表达；图2B是印度酸橘在200mM氯化钠、100μM ABA处理和4度处理0、1、3、6、9、12、24、72、120小时及恢复1、3、6、9小时的表达。

图3为一种CrNCED1基因载体构建示意图。

图4为一种CrNCED1基因转化烟草过程示意图。

图4A，转基因烟草再生愈伤；图4B，转基因烟草再生生芽；图4C，转基因烟草植株生根。

图5为一种CrNCED1基因转化烟草再生植株的PCR鉴定示意图。

图5A，CrNCED1转化烟草后得到的T0代植株的PCR鉴定（上图为CrNCED1特异引物扩增图，下图为NPTII基因特异引物扩增图）。图5B，CrNCED1转化烟草后得到的T2代植株PCR鉴定（上图为CrNCED1特异引物扩增图，下图为NPTII基因特异引物扩增图）。

图6为一种阳性转基因植株转基因CrNCED1的表达量分析示意图。

图6A，T0代2个阳性转基因植株中CrNCED1基因RT-PCR分析结果。图6B，T2代阳性转基因植株中CrNCED1基因RT-PCR分析结果。WT为野生型植株，其余编号为转基因植株。β-Actin基因用作内参。

图7为一种CrNCED1转基因烟草T2代三个系（C5-6、C7-4和C9-4）与野生型（WT）叶片脱水下的抗性比较和生理指标测定示意图。

图7A是转基因烟草和野生型叶片脱水前（上）和脱水80分钟（下）后的表型。图7B是烟草转基因系和野生型叶片脱水处理下的相对失水率变化。图7C是叶片脱水后的相对电导率检测结果。

图8为一种CrNCED1转基因烟草T2代三个系（C5-6、C7-4和C9-4三个系）和野生型（WT）叶片脱水处理80min后叶片活性氧含量分析示意图。

图8A是采用NBT（氯化硝基四氮唑蓝）染色的结果，显示O₂ ^-含量（染色越深，含量越高）。图8B是采用DAB（二氨基联苯胺）染色的结果，显示H₂O₂含量（染色越深，含量越高）。

图9为一种60天大小的CrNCED1转基因烟草T2代三个系（C5-6、C7-4和C9-4）与野生型（WT）盆栽苗抗旱性比较示意图。

图9A是烟草转基因植株和野生型控水（干旱处理）7天后的表型。图9B是烟草转基因植株和野生型干旱处理7天后叶片含水量的测定结果。图9C是CrNCED1基因转化烟草和野生型干旱处理7天后的相对电导率检测结果。

图10为一种CrNCED1转基因烟草T2代三个系（C5-6、C7-4和C9-4）与野生型（WT）盐（200mM NaCl）处理4天后的表型及生理测定示意图。

图10A是叶圆片盐处理前和处理4天后的表型。图10B是处理4天后相对电导率检测结果。图10C是采用DAB分析处理前（上）和处理后（下）叶圆片中的H₂O₂含量。图10D是处理4天后采用NBT分析处理前（上）和处理后（下）叶圆片中的O₂ ^-含量。

图11为一种CrNCED1转基因烟草T2代两个系（C7-4和C9-4）与野生型（WT）在1%H₂O₂处理4天后表型和叶绿素含量测定示意图。

图11A是叶圆片处理前和1%H₂O₂处理4天后的表型。图11B是H₂O₂处理叶圆片4天后叶绿素含量测定结果。

具体实施方式

以下结合具体实施对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件，具体实施方式中为特别说明的实验方法，均为常规实验方法。

实施例1，CrNCED1基因分离克隆及表达分析

使用Trizol试剂盒抽提印度酸橘叶片RNA（试剂盒购自Invitrogen公司，抽提按照提供的说明书操作），将抽提的1μg总RNA经1U的DNaseI（购自Fermentas公司）室温处理30分钟后，加入1μl EDTA（25mM），于65℃温育10分钟。用MBI反转录试剂盒合成第一链cDNA（货号：K1621，购自Fermentas公司，按照试剂盒说明书操作），所得的第一链cDNA用于扩增CrNCED1基因全长。

根据NCBI中的NCED基因序列（AAR11193、AAR11194、NP_188062、NP_193569、NP_177960），采用同源序列法，先利用多个序列找出高度保守区，再用Premier5.0设计带有BamHI、SacI酶切位点的引物，根据酶切特点加保护碱基。用RT-PCR的方法扩出全长。50μl的反应体系中包括200ng cDNA、1×缓冲液（TransStart FastPfu缓冲液）、10mM dNTP、1U Taq聚合酶（前述缓冲液和聚合酶购自TRANS公司）及1.0μM上述引物。PCR反应在ABI9700（Applied Biosystem）扩增仪上按以下程序完成：94℃5分钟；94℃变性30秒、58℃退火50秒、72℃延伸90秒（共35个循环）；循环完成后72℃延伸15分钟。

PCR扩增获得一条特异带，经1%的琼脂糖凝胶电泳后，用

凝胶回收试剂盒（购自Omega公司，美国）回收特异带（提取步骤参照使用说明）。回收纯化的DNA溶液与pMD18-T载体（购自宝生物工程大连有限公司，即TaKaRa公司）进行连接反应（按说明书操作），连接反应体系中回收产物与pMD18-T载体的摩尔比为3：1，连接反应总体积是10μl，包括5μl的2×缓冲液（购自宝生物工程大连有限公司），1.5μl纯化的PCR产物和0.5μl pMD18-T载体。16℃连接过夜。取10μl连接产物，热激法转化大肠杆菌DH5α，在含有100mg/L氨苄青霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取克隆送上海联合基因公司测序。测序结果表明，该基因长1821bp。通过测序、比对确定为NCED基因（命名为CrNCED1），编码由606个氨基酸组成的多肽，其分子量为67kDa，等电点为6.05。BLASTX分析发现CrNCED1与其它植物的NCED基因有很高的同源性。

为分析CrNCED1基因是否响应非生物胁迫和外源ABA，采用半定量PCR分析该基因在高盐、干旱、低温和ABA处理下的表达。结果表明，干旱（见图2A）、盐和外源ABA（见图2B）处理均能诱导CrNCED1基因的表达，表明它是一个逆境应答基因，但低温对CrNCED1基因的表达量影响不大。

实施例2，植物转化超表达载体构建

根据pBI121载体的多克隆位点和CrNCED1基因的编码区序列上的酶切位点，选择BamHI和SalI作为内切酶。首先将以CrNCED1基因的克隆子为模板进行PCR扩增，再通过TA克隆连接到pMD18-T载体上，从而构建一个重组载体pMD18-T-CrNCED1。双酶切体系总体积为40μl，其中含有pMD18-T-CrNCED1质粒8μl、10×M缓冲液（购自Takana）4μl、BamHI及SalI各2μl、双蒸水24μl。在37℃酶切3-4h后纯化回收。pBI121载体的双酶切体系同上。连接反应体系中CrNCED1基因与载体pBI121分别为6μl和2μl，反应总体积为10μl，10×T4连接缓冲液1μl，T4连接酶1μl，16℃连接14-16小时。连接产物转化大肠杆菌菌株DH5α，在含有100mg/L卡那霉素的LB固体平板中筛选，挑单克隆PCR检测呈阳性后抽提质粒进行酶切，测序确定读码框没有突变后，即pBI121-CrNCED1重组载体构建成功。将重组载体CrNCED1转到农杆菌EHA105中并保存菌株。构建完成的载体图见图3。

实施例3，烟草遗传转化

1、实验材料准备

取烟草种子，在超净工作台上先用75%的酒精浸泡灭菌30秒，弃去酒精无菌水洗涤1次，再用2%的次氯酸钠浸泡灭菌8-12min，用灭菌的接种针播种于MS培养基上，置于培养室。

2、农杆菌菌液的制备

农杆菌在含有卡那霉素50mg/L的固体LB培养基上划线，28℃暗培养两天；

挑取单菌落接种在新的加有卡那霉素的LB平板上，28℃暗培养2-3天；

用手术刀刮下已长好的农杆菌，接种在不加抗生素的液MS培养基中，同时加20mg/L(100uM)AS，28℃200r/min振荡培养2h（同时在这段时间准备切烟草叶片）；

用分光光度计测量菌液的OD₆₀₀值，用MS液体培养基调整OD₆₀₀值到0.4-0.55进行侵染。

3、外植体准备

取烟草叶片，于超净工作台上切掉叶片大的叶脉和叶片边缘，然后将叶片切成约0.5×0.5cm大小，切好的叶片暂时放于灭菌的空三角瓶中（加少量水保湿），待农杆菌菌液制备完成后用于转化。

4、侵染与共培养

将切好的外植体浸泡在已制备好的农杆菌菌液里，侵染8-10min，中间摇动几次。侵染完后用无菌吸水纸吸干外植体表面菌液，再接种到共培养培养基上21-23℃暗处共培养3天。

5、筛选培养与再生

共培养3天后，将共培养的叶片用500mg/L头孢霉素洗一次，无菌水洗3-5次，再用无菌吸水纸吸干表面的农杆菌，转到加有卡那霉素100mg/L及头孢霉素400mg/L的筛选培养基上，25℃光照条件下培养。在筛选培养基上长出抗性芽，当抗性芽长至2-3cm左右时，切下并转入加100mgL卡那霉素（或不加）和400mgL头孢霉素生根培养基诱导生根，烟草转化过程见图4。

常用培养基配方：

LB固体培养基：蛋白胨10g/l+酵母提取物5g/l+NaCl10g/l+琼脂15g/l

烟草共培养及筛选培养基：MS+6-BA2.25mg/l+NAA0.3mgl+琼脂7.5g/l+蔗糖30g/l（pH为5.8）

烟草生根培养基：MS++NAA0.3mg/l+琼脂7.5g/l+蔗糖30g/l（pH为5.8）

实施例4，转化植株分子及生理鉴定

1、烟草叶片DNA提取

取适量的叶片放入1.5mL离心管中，加液氮，充分研磨；然后加入700μl65℃预热的十六烷基三乙基溴化铵（简称CTAB）DNA提取缓冲液（配方：100mM Tris-HCl，pH8.0，1.5M NaCl，50mM EDTA，pH8.0，1%聚乙烯吡咯烷酮，2%（体积）CTAB），65℃温浴60-90分钟（温浴过程中每15分钟取出离心管上下轻轻颠倒混匀）；10000×g离心10分钟；取上清，加600μl氯仿，颠倒混匀静置3分钟；10000×g离心15分钟；取上清450μl，加入900μl预冷无水乙醇，34μl5M NaCl，混匀后，冰冻30分钟，10000×g离心10分钟；弃上清后，用lml75%的乙醇，洗涤3次后，加适量双蒸水溶解。

2、阳性转基因植株PCR检测

采用NPTII引物和CrNCED1基因特异性引物进行PCR扩增。引物序列、反应程序及体系分别见表1、表2。采用NPTII引物和CrNCED1基因特异性引物对烟草再生植株进行PCR鉴定，对T0代的21个转基因株系的鉴定结果显示一共有17个阳性株系（图5A）。对T0代转基因烟草进行繁殖，得到T2代转基因烟草。NPTII引物和CrNCED1基因特异性引物鉴定结果显示，T2代工得到了8个纯合阳性转基因株系（图5B）。

表1、引物序列信息

表2、PCR反应程序

表3、PCR反应体系

成分	用量(μl)
		模板	1
10×PCR缓冲液	2
		dNTP Mix（2.0mmol/L）	2
MgCl2（25mmol/L）	1.2
		35S启动子引物（10μmol/L）	0.3
CrNCED1反向引物（10μmol/L)	0.3
		Taq DNA聚合酶（5U/μL）	0.2
无核酶水	13

实施例5，半定量RT-PCR检测CrNCED1基因的超表达

本研究采用半定量RT-PCR分析转基因烟草植株中外源基因CrNCED1的表达量，转基因株系叶片RNA提取使用Trizol试剂盒，其步骤如下：

1、研钵预冷。研钵用0.5M NaOH浸泡10min，再用灭菌DEPC洗3-4次，加液氮预冷（铝箔放冰上预冷冷藏叶片）；

2、称重0.1g叶片于1.5ml离心管，液氮研磨后，加1ml Trizol混匀（裂解cell并保护RNA）；

3、4℃10000-12000g，离心15min，取上清，加200μL氯仿，用力摇15s孵育2min，4℃10000-12000g，离心15min；

4、取上清，加500μL异丙醇，孵育10min。4℃12000g，离心10min。配75%的酒精；

5、弃上清，加1ml75%的酒精(用灭菌DEPC水配)轻摇。4℃7200g，5min离心；

6、弃上清，风干，沉淀用30-50μL DEPC水溶解，-80℃保存；

7、取1-2μL检测RNA的浓度和质量，将RNA反转录成cDNA其方法同实施例1。

半定量所用引物为CrNCED1基因特异引物：正向引物5’-AAGCCCACCGAAATCACTTG-3’；反向引物5’-CCAATGCGTTTTCGACTGC-3’，反应程序为94℃时3分钟，94℃变性30秒，61℃退火30秒，72℃延伸45秒，28个循环；循环完成后72℃延伸5分钟。

用烟草的actin基因做为内参基因，烟草actin正向引物5'-CCGACCGTATGAGCAAGGAAA-3'，反向引物5'-TTCCTGTGGACAATGGATGGA-3’。对烟草T0代2个转基因系和T2代6个转基因系的表达水平进行分析，结果表明，在转基因植株中中，外源CrNCED1基因表达水平明显增强(图6B)，选取5-6、7-4和9-4三个转化系用于抗性评价。

实施例6，转基因植株的抗旱性评价

为评价CrNCED1是否能使转基因植株抗旱性增强，首先将烟草转基因系（5-6、7-4和9-4）及野生型进行叶片脱水处理。转基因系和野生型处理前在表型上没有任何差异（图7A左）。脱水80分钟后可以明显看到转基因烟草叶片的萎焉程度要比对照野生型低（图7A右）。对叶片相对失水率的统计结果显示，脱水80分钟后3个烟草转基因系的失水率分别是15.5%、24%和29.6%，显著低于野生型的失水率，野生型烟草的失水率达到了42.4%（图7B）。为了比较烟草叶片细胞膜在脱水处理下的伤害程度，对脱水处理后的烟草叶片进行相对电导率测定。相对电导率测定结果显示，脱水处理之后转基因系的相对电导率明显比野生型低（图7C），表明转基因烟草细胞膜受损程度更轻。利用DAB和NBT染色对脱水处理后烟草叶片中的H₂O₂和O^2-积累水平进行分析，发现脱水后转基因植株的叶片染色明显轻于野生型（图8A，B），表明，在脱水处理后转基因材料中积累的ROS比野生型少。

为了进一步比较CrNCED1转基因植株的抗旱性，将60天大小的烟草苗（野生型和转基因）干旱处理7天，干旱处理7天后可以明显看到转基因烟草的萎焉程度较低（图9A）。对干旱处理后的烟草叶片含水量的检测结果显示，转基因烟草的含水量显著高于野生型。干旱处理后的相对电导率测定结果显示，转基因系的相对电导率明显比野生型低（图9B）。转基因植株的电导率低于野生型，表明其膜受损程度更轻（图9C）。转基因烟草的抗旱能力较强。

实施例7，转基因烟草盐胁迫处理下的抗性分析

为了评价转基因烟草在盐胁迫下的抗性，用盐溶液处理烟草叶片（野生型和转基因）。处理4天后发现转基因烟草叶片的坏死较少（图10A）。烟草叶片盐处理后的相对电导率检测结果显示，转基因烟草的相对电导率明显低于对照野生型（图10B）。利用DAB和NBT染色对盐处理后烟草叶片中的H₂O₂（图10C）和O^2-（图10D）积累水平进行分析，发现脱水后转基因植株的叶片染色明显轻于野生型。这些结果说明在在盐胁迫下转基因烟草具有更强的抗性。

实施例8，转基因烟草抗氧化胁迫分析

逆境下ROS积累是造成细胞膜结构损坏和叶绿素降解的重要原因，为了评估在胁迫下转基因烟草叶绿素的稳定情况，利用H₂O₂模拟氧化胁迫处理烟草叶片（野生型和转基因）。处理4天后发现转基因烟草脱绿较少（图11A），进一步对其叶绿素含量进行测定结果显示转基因烟草叶片的叶绿素含量明显高于野生型（图11B）。说明转基因烟草抗氧化胁迫能力增强。

  SEQUENCE LISTING

 

<110>  华中农业大学

 

<120>  一种柑橘CrNCED1基因及其在植物抗非生物胁迫中的应用

 

<130>  一种柑橘CrNCED1基因及其在植物抗非生物胁迫中的应用

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  1821

<212>  DNA

<213>  Citrus reshni

 

<400>  1

atggcggcag caactactac ttcttcactc atagacttgg gctcttgtaa agattcttgt     60

 

tcttctccgt ctttttcttc ttcaagagca agaattgctt ttagtttaaa aaagcccacc    120

 

gaaatcactt gctctcttca aacaccttcc attcctcatt tccccaagca gtccccaaaa    180

 

taccctccat cacctgcagc ttcccctcct ccatcttctc ctcctcttac aactaagcag    240

 

caacccaagg aaaatgacaa tttcgcccct tcaaaatgga acttcttaca aaaaacagca    300

 

gctttagcct tggacgcagt cgaaaacgca ttggtttctc aagagcgtca gcatcctttc    360

 

cccaaaacag ccgaccccac cgtccaaatc gccggaaact tctctccggt gcccgaaaaa    420

 

cccgtctgcc agaaccttcc cactaccgga aaggtccccg actgcattca aggcgtctac    480

 

gtcagaaacg gagccaaccc acttcacgaa ccggtcgccg gccaccattt cttcgacgga    540

 

gacggcatgg ttcatgcagt ccaattcaac aaaggctctg tcagctattc ttgtcgtttc    600

 

actgaaacaa accgttttgt tcaagaacgt agcttaggcc gccccgtaat ccccaaagcc    660

 

attggcgagc ttcacggcca cacgggtatc gcaagattgc ttctattcta cagcagagcg    720

 

ctcttcggtc tcgttgaccc cagccacggc actggcgttg ccaacgccgg ccttgtttac    780

 

ttcaacaacc gtttgttggc catgtctgaa gatgacttgc cttatcacgt gcgcgtcact    840

 

ccatccggcg agcttaaaac agtcggccgt ttcgacttca gcggccagct caagtccacg    900

 

atgatagctc atccgaaagt tgatcccgtg acgggtgatt tgtttgctct gagttatgac    960

 

gttgtcaaga agccttacct gaagtacttt cagttttcgc cccaagggat caagtctccg   1020

 

gacgttgaga ttccccttga ggagcctaca atgatgcatg atttcgcaat cactgagaac   1080

 

tttgttgtgg tgcctgacca gcaagtggtg ttcaagttga aagagatgat ccaaggtggc   1140

 

tcccctgtga tttatgacaa gaacaaggtg tcaagatttg ggattttgga caagaatgcc   1200

 

accgatgctt ccaaaatgaa gtggattgac gcccctgatt gcttctgttt ccatctttgg   1260

 

aatgcttggg aagagcctga gagggatgaa gttgttgtaa ttgggtcctg tatgactcct   1320

 

gccgactcca ttttcaacga atgtgatgag agtctgaaga gtgttttgtc cgaaattaga   1380

 

ctcaatctaa ggaccggcga gtccactcgc cgccccataa tctccgagga tgagcaagtg   1440

 

aacttggaag ccggaatggt gaacagaaac ttgctcggaa gaaagacccg tttcgcgtac   1500

 

ttagccctcg ccgagccgtg gcctaaagtt tcaggttttg ccaaagttga tctcttaacc   1560

 

ggacaagtaa acaagtttac ttatggaggt caaaggtacg gtggcgagcc tttgttcttt   1620

 

ccgagagacc ccaattcgga gaatgaggat gatggctaca ctctcgcttt tgtacatgat   1680

 

gaagaggagt ggaaatcaga gctgcaaatt gttaacgcaa tgactctgga gcttgaagct   1740

 

acagttaagc ttccatctcg agttccttat ggcttccacg ggacgttcat aagcgcgaaa   1800

 

gatttggcca agcaggccta a                                             1821

 

 

<210>  2

<211>  606

<212>  PRT

<213>  Citrus reshni

 

<400>  2

 

Met Ala Ala Ala Thr Thr Thr Ser Ser Leu Ile Asp Leu Gly Ser Cys

1               5                   10                  15     

 

 

Lys Asp Ser Cys Ser Ser Pro Ser Phe Ser Ser Ser Arg Ala Arg Ile

            20                  25                  30         

 

 

Ala Phe Ser Leu Lys Lys Pro Thr Glu Ile Thr Cys Ser Leu Gln Thr

        35                  40                  45             

 

 

Pro Ser Ile Pro His Phe Pro Lys Gln Ser Pro Lys Tyr Pro Pro Ser

    50                  55                  60                 

 

 

Pro Ala Ala Ser Pro Pro Pro Ser Ser Pro Pro Leu Thr Thr Lys Gln

65                  70                  75                  80 

 

 

Gln Pro Lys Glu Asn Asp Asn Phe Ala Pro Ser Lys Trp Asn Phe Leu

                85                  90                  95     

 

 

Gln Lys Thr Ala Ala Leu Ala Leu Asp Ala Val Glu Asn Ala Leu Val

            100                 105                 110        

 

 

Ser Gln Glu Arg Gln His Pro Phe Pro Lys Thr Ala Asp Pro Thr Val

        115                 120                 125            

 

 

Gln Ile Ala Gly Asn Phe Ser Pro Val Pro Glu Lys Pro Val Cys Gln

    130                 135                 140                

 

 

Asn Leu Pro Thr Thr Gly Lys Val Pro Asp Cys Ile Gln Gly Val Tyr

145                 150                 155                 160

 

 

Val Arg Asn Gly Ala Asn Pro Leu His Glu Pro Val Ala Gly His His

                165                 170                 175    

 

 

Phe Phe Asp Gly Asp Gly Met Val His Ala Val Gln Phe Asn Lys Gly

            180                 185                 190        

 

 

Ser Val Ser Tyr Ser Cys Arg Phe Thr Glu Thr Asn Arg Phe Val Gln

        195                 200                 205            

 

 

Glu Arg Ser Leu Gly Arg Pro Val Ile Pro Lys Ala Ile Gly Glu Leu

    210                 215                 220                

 

 

His Gly His Thr Gly Ile Ala Arg Leu Leu Leu Phe Tyr Ser Arg Ala

225                 230                 235                 240

 

 

Leu Phe Gly Leu Val Asp Pro Ser His Gly Thr Gly Val Ala Asn Ala

                245                 250                 255    

 

 

Gly Leu Val Tyr Phe Asn Asn Arg Leu Leu Ala Met Ser Glu Asp Asp

            260                 265                 270        

 

 

Leu Pro Tyr His Val Arg Val Thr Pro Ser Gly Glu Leu Lys Thr Val

        275                 280                 285            

 

 

Gly Arg Phe Asp Phe Ser Gly Gln Leu Lys Ser Thr Met Ile Ala His

    290                 295                 300                

 

 

Pro Lys Val Asp Pro Val Thr Gly Asp Leu Phe Ala Leu Ser Tyr Asp

305                 310                 315                 320

 

 

Val Val Lys Lys Pro Tyr Leu Lys Tyr Phe Gln Phe Ser Pro Gln Gly

                325                 330                 335    

 

 

Ile Lys Ser Pro Asp Val Glu Ile Pro Leu Glu Glu Pro Thr Met Met

            340                 345                 350        

 

 

His Asp Phe Ala Ile Thr Glu Asn Phe Val Val Val Pro Asp Gln Gln

        355                 360                 365            

 

 

Val Val Phe Lys Leu Lys Glu Met Ile Gln Gly Gly Ser Pro Val Ile

    370                 375                 380                 

 

 

Tyr Asp Lys Asn Lys Val Ser Arg Phe Gly Ile Leu Asp Lys Asn Ala

385                 390                 395                 400

 

 

Thr Asp Ala Ser Lys Met Lys Trp Ile Asp Ala Pro Asp Cys Phe Cys

                405                 410                 415    

 

 

Phe His Leu Trp Asn Ala Trp Glu Glu Pro Glu Arg Asp Glu Val Val

            420                 425                 430        

 

 

Val Ile Gly Ser Cys Met Thr Pro Ala Asp Ser Ile Phe Asn Glu Cys

        435                 440                 445            

 

 

Asp Glu Ser Leu Lys Ser Val Leu Ser Glu Ile Arg Leu Asn Leu Arg

    450                 455                 460                

 

 

Thr Gly Glu Ser Thr Arg Arg Pro Ile Ile Ser Glu Asp Glu Gln Val

465                 470                 475                 480

 

 

Asn Leu Glu Ala Gly Met Val Asn Arg Asn Leu Leu Gly Arg Lys Thr

                485                 490                 495    

 

 

Arg Phe Ala Tyr Leu Ala Leu Ala Glu Pro Trp Pro Lys Val Ser Gly

            500                 505                 510        

 

 

Phe Ala Lys Val Asp Leu Leu Thr Gly Gln Val Asn Lys Phe Thr Tyr

        515                 520                 525            

 

 

Gly Gly Gln Arg Tyr Gly Gly Glu Pro Leu Phe Phe Pro Arg Asp Pro

    530                 535                 540                

 

 

Asn Ser Glu Asn Glu Asp Asp Gly Tyr Thr Leu Ala Phe Val His Asp

545                 550                 555                 560

 

 

Glu Glu Glu Trp Lys Ser Glu Leu Gln Ile Val Asn Ala Met Thr Leu

                565                 570                 575    

 

 

Glu Leu Glu Ala Thr Val Lys Leu Pro Ser Arg Val Pro Tyr Gly Phe

            580                 585                 590        

 

 

His Gly Thr Phe Ile Ser Ala Lys Asp Leu Ala Lys Gln Ala

        595                 600                 605    

 

 

<210>  3

<211>  26

<212>  DNA

<213>  Citrus reshni

 

<400>  3

ttcggatcca tggcggcagc aactac                                          26

 

 

<210>  4

<211>  26

<212>  DNA

<213>  Citrus reshni

 

<400>  4

ttcgagctct taggcctgct tggcca                                          26

Claims (3)

1.一种分离的基因，其特征在于：基因CrNCED1，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的一种分离的基因，其特征在于，所述基因的正向引物为：5’- TTCGGATCCATGGCGGCAGCAACTAC -3’，即SEQ ID NO.3；反向引物为：5’- TTCGAGCTCTTAGGCCTGCTTGGCCA -3’，即SEQ ID NO.4。

3.权利要求1所述的基因在植物抗非生物胁迫中的应用。

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