CN104178497A

CN104178497A - 源于棉花的myc类转录因子、其编码基因及在调控植物胁迫抗性中的应用

Info

Publication number: CN104178497A
Application number: CN201410390003.0A
Authority: CN
Inventors: 周美亮; 吴燕民; 刘博欣; 孙占敏; 唐益雄
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Jiangsu Zhonghui Zhongtian Technology Development Co ltd
Priority date: 2014-08-08
Filing date: 2014-08-08
Publication date: 2014-12-03
Anticipated expiration: 2034-08-08
Also published as: CN104178497B

Abstract

本发明公开了源于棉花的MYC类转录因子、其编码基因及在调控植物胁迫抗性中的应用。本发明首先公开了从棉花中分离的GhMYC3转录因子编码基因，其多核苷酸序列为SEQ ID No.3所示，其编码的氨基酸序列为SEQ ID No.4所示。本发明还公开了含有所述转录因子编码基因的重组表达载体和重组宿主细胞。转基因功能分析实验证明，在植物中过表达棉花GhMYC3转录因子编码基因能够有效提高植物对包括高盐或干旱等非生物逆境胁迫的抗性。本发明源于棉花的MYC类转录因子及其编码基因在提高植物对逆境胁迫抗性以及培育耐逆境胁迫的转基因植物新品种等方面有重要的应用前景。

Description

源于棉花的MYC类转录因子、其编码基因及在调控植物胁迫抗性中的应用

技术领域

本发明涉及转录因子，尤其涉及源于棉花的MYC类转录因子及其编码基因，还涉及含有棉花MYC类转录因子编码基因的表达载体和宿主细胞，本发明进一步涉及棉花MYC类转录因子及其编码基因在提高植物对逆境胁迫抗性中的应用，属于棉花MYC类转录因子及其应用技术领域。

背景技术

植物中髓细胞组织增生蛋白(Myelocytomatosis proteins，MYCs)即MYC类转录因子，具有多种调节功能，并广泛存在于动植物中。在已经发现的MYC类转录因子中，MYC2是研究最为深入的一个，目前在模式植物拟南芥中发现MYC2转录因子通过形成CO Ⅰ1/JAZs/MYC2复合物发挥调控作用，参与JA、ABA等激素信号转导过程。如拟南芥的AtMYC2转录因子，在逆境下表达增强。在干旱胁迫下，AtMYC2蛋白也作为ABA诱导的转录激活子发挥功能。

干旱和盐渍是诸多非生物逆境中对作物危害最为严重的自然灾害，严重影响作物的产量和种植面积。据不完全统计，全世界的干旱地区占陆地总面积的三分之一，且有逐年增加的趋势。土壤盐碱化和次生盐碱化问题在世界范围内广泛存在，特别是干旱、半干旱地区，问题更为严重。

棉花是最耐盐的农作物之一，其耐盐性因品种、生育阶段、器官以及土壤盐分种类等不同而差异较大。因此，从棉花中克隆MYC类转录因子编码基因并将其应用于提高植物对逆境胁迫的抗性以及培育耐逆境胁迫的转基因植物新品种，对棉花等植物抗逆性能的提高将具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一类与植物抗逆性相关的棉花MYC类转录因子及其编码基因；

本发明的目的之二是提供含有所述MYC类转录因子编码基因的重组表达载体以及含有该重组表达载体的重组宿主细胞；

本发明的目的之三是将所述的棉花MYC类转录因子及其编码基因应用于提高植物对逆境胁迫的抗性以及培育耐逆境胁迫的转基因植物新品种。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明首先从棉花(Gossypium hirsutum L.)分离了GhMYC3转录因子编码基因，其多核苷酸为(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示：

(a)、SEQ ID No.3所示的多核苷酸；或

(b)、编码SEQ ID No.4所示氨基酸的多核苷酸；或

(c)、与SEQ ID No.3的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸所编码蛋白质仍具有GhMYC3转录因子功能；或

(d)、与SEQ ID No.3所示的多核苷酸至少有90％或以上同源性的多核苷酸，优选的，与SEQ ID No.3所示的多核苷酸至少有95％或以上同源性的多核苷酸，最优选的，与SEQ ID No.3所示的多核苷酸至少有98％或以上同源性的多核苷酸；或

(e)、在SEQ ID No.3所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有GhMYC3转录因子的功能或活性。

本发明还公开了由所述转录因子基因编码的GhMYC3转录因子，其氨基酸为(a)或(b)所示：

(a)、SEQ ID No.4所示的氨基酸；

(b)、将SEQ ID No.4所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有GhMYC3转录因子功能或活性的蛋白变体。

本发明所述的蛋白变体可由遗传多态性或人为操作产生，这些操作方法通常为本领域所了解。例如，可通过DNA的突变来制备GhMYC3转录因子的氨基酸序列变体或片段，其中用于诱变或改变多核苷酸的方法为本领域所习知。其中，保守的取代是将一种氨基酸残基替换成具有相似性质的另一种氨基酸。本发明所述的GhMYC3转录因子及其编码基因包括天然存在的序列和变体两种形式。“变体”意指基本相似的序列，对于多核苷酸，变体包含天然多核苷酸中一个或多个位点处一个或多个核苷酸的缺失、插入或/和替换。对于多核苷酸，保守的变体包括由于遗传密码的简并性而不改变编码的氨基酸序列的那些变体。诸如此类天然存在的变体可通过现有的分子生物学技术来鉴定。变体多核苷酸还包括合成来源的多核苷酸，例如采用定点诱变所得到的仍编码SEQ ID No.4所示的氨基酸的多核苷酸变体，或者是通过重组的方法(例如DNA改组)。本领域技术人员可通过以下分子生物技术手段来筛选或评价变体多核苷酸所编码蛋白的功能或活性：DNA结合活性、蛋白之间的相互作用，瞬时研究中基因表达的激活情况或转基因植物中表达的效应等。

本发明还公开了含有所述GhMYC3转录因子编码基因的重组表达载体；所述的重组表达载体是重组植物表达载体。

本发明还公开了含有所述的重组表达载体的重组宿主细胞。

将所述棉花GhMYC3转录因子编码基因可操作的与表达调控元件相连接，得到可以在植物中表达该编码基因的重组植物表达载体；该重组植物表达载体可以由5′端非编码区，SEQ ID No.3所示的核苷酸和3′非编码区组成；其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的Ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。

另外，本领域技术人员可以将SEQ ID No.3所示的核苷酸进行优化以增强在植物中的表达效率。例如，可采用目标植物的偏爱密码子进行优化来合成多核苷酸以增强在目标植物中的表达效率。

所述重组植物表达载体还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因用于选择经转化的细胞或组织。标记基因包括：编码抗生素抗性的基因以及赋予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白等。

本发明还涉及将所述的棉花GhMYC3转录因子编码基因引入到植物中以提高植物对逆境胁迫的抗性。

本发明进一步公开了所述的棉花GhMYC3转录因子编码基因在提高植物对逆境胁迫抗性中的应用，包括以下步骤：(1)构建含有所述棉花GhMYC3转录因子编码基因的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到植物或植物细胞中；(3)培育筛选得到对逆境胁迫抗性提高的转基因植物新品种。

本发明进一步公开了一种培育耐逆境胁迫的转基因植物新品种的方法，包括以下步骤：(1)构建含有所述棉花GhMYC3转录因子编码基因的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到植物或植物细胞中；(3)培育筛选得到对逆境胁迫抗性提高的转基因植物新品种。

其中，所述的逆境胁迫包括高盐或干旱等非生物胁迫。

转化方案以及将所述多核苷酸或多肽引入植物的方案可视用于转化的植物(单子叶植物或双子叶植物)或植物细胞的类型而变化。将所述多核苷酸或多肽引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移以及高速弹道轰击等。在特定的实施方案中，可利用多种瞬时转化法将本发明的GhMYC3转录因子基因提供给植物。在其它实施方案中，本发明的GhMYC3转录因子基因可通过将植物与病毒或病毒核酸接触来引入到植物中，通常，这样的方法涉及将本发明的GhMYC3转录因子基因构建体引入病毒DNA或RNA分子中。

利用常规方法可使已转化的细胞再生稳定转化植株(McCormick et al.Plant CellReports.1986.5:81-84)。本发明可用于转化任何植物种类，包括但不限于：单子叶植物或双子叶植物。更优选的，所述的目标植物包括农作物、蔬菜或观赏植物、果树等，例如，可以是玉米、水稻、高粱、小麦、大豆、马铃薯、大麦、番茄、菜豆、花生或甘蔗等。

为了分析本发明从棉花(Gossypium hirsutum L.)分离的GhMYC3转录因子的功能，本发明用Gateway方法构建含有GhMYC3基因(核苷酸为SEQ ID No.3所示)的植物表达载体，花序浸染法转化拟南芥，获得T 1代种子；通过拟南芥种子抗性筛选及PCR鉴定，获得转基因拟南芥。同时分别构建含有GhMYC1(核苷酸为SEQ IDNo.1所示)、GhMYC2(核苷酸为SEQ ID No.2所示)和GhMYC4(核苷酸为SEQ IDNo.5所示)基因的植物表达载体，转化拟南芥，获得转基因拟南芥。

对转基因拟南芥进行抗旱耐盐分析。表型分析结果表明，转GhMYC3基因的拟南芥抗旱效果明显，植株生长旺盛，没有明显的叶片发黑现象。生理指标分析表明，NaCl处理后，转GhMYC3基因的拟南芥叶绿素含量与NK基本持平，属正常水平，说明转GhMYC3基因植株的光合作用正常；干旱处理后，转GhMYC3基因的拟南芥丙二醇含量较低，在0.013μmol/g附近，证明抗旱效果明显；转GhMYC3基因1号植株的可溶性糖含量为0.112mmol/g，显著高于对照，说明转GhMYC3基因植株通过升高可溶性糖含量来提高其抗旱水平，转GhMYC3基因的拟南芥抗旱效果明显。

总之，转化实验证明，在植物中过表达棉花GhMYC3转录因子编码基因能够有效提高植物对高盐或干旱逆境胁迫的抗性。因此，本发明克隆的棉花GhMYC3转录因子编码基因在提高植物对逆境胁迫抗性及培育耐逆境胁迫的转基因植物新品种中有着重要的应用前景。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“转录因子”意指能够与真核生物基因启动子区域中顺式作用元件特异性结合，从而激活或抑制下游基因在特定时间和空间转录与表达的一类DNA结合蛋白。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。

述语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍)。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen,Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(Tm)约5-10℃。Tm为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在Tm下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。

术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。

术语“转化”意指将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。

术语“表达”意指内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。

术语“编码序列”意指转录成RNA的核酸序列。

术语“重组植物表达载体”意指一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：T-DNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性DNA序列等。

附图说明

图1为从棉花基因组及cDNA中克隆GhMYC1和GhMYC2电泳图；其中，M为DNA Marker；1、2为棉花基因组对MYC1全长引物的PCR结果；3为棉花cDNA对MYC1全长引物的PCR结果；4、5为棉花基因组对MYC2全长引物的PCR结果；6为棉花cDNA对MYC2全长引物的PCR结果；

图2为从棉花基因组及cDNA中克隆GhMYC3和GhMYC4电泳图；其中，1、2为棉花cDNA对MYC3全长引物的PCR结果；3为棉花基因组对MYC3全长引物的PCR结果；4、5、6为棉花基因组对MYC4全长引物的PCR结果；7、8、9为棉花cDNA对MYC4全长引物的PCR结果；

图3为GhMYC1的阳性菌落检测图；其中，M为DNA Marker；11、13为11和13号菌落；+为阳性对照；-为空白对照；

图4为GhMYC2的阳性菌落检测图；

图5为GhMYC3的阳性菌落检测图；

图6为GhMYC4的阳性菌落检测图；

图7为Gateway方法构建含有GhMYC1、GhMYC2、GhMYC3或GhMYC4基因的植物表达载体的流程图；

图8为GhMYC1、GhMYC2、GhMYC3和GhMYC4基因的入门克隆转化大肠杆菌菌株DH5α的菌液PCR检测图；其中，M为DNA Marker；1-3为GhMYC1的入门克隆转化大肠杆菌DH5α的3号菌落的PCR检测结果；2-3和2-4为GhMYC2的入门克隆转化大肠杆菌DH5α的3号和4号菌落的PCR检测结果；3-2、3-3和3-4为GhMYC3的入门克隆转化大肠杆菌DH5α的2号、3号和4号菌落的PCR检测结果；4-1、4-2、4-3、4-4和4-5为GhMYC4的入门克隆转化大肠杆菌DH5α的1号、2号、3号、4号和5号菌落的PCR检测结果；+为阳性对照；

图9为GhMYC1、GhMYC2、GhMYC3和GhMYC4基因的植物表达载体转化大肠杆菌菌株DH5α的菌液PCR检测图；其中，M为DNA Marker；1-1、1-2和1-3为GhMYC1的植物表达载体转化大肠杆菌DH5α的1号、2号和3号菌落的PCR检测结果；2-1、2-1、2-3和2-4为GhMYC2的植物表达载体转化大肠杆菌DH5α的1号、2号、3号和4号菌落的PCR检测结果；3-1、3-2和3-3为GhMYC3的植物表达载体转化大肠杆菌DH5α的1号、2号和3号菌落的PCR检测结果；4-1、4-2、4-3和4-4为GhMYC4的植物表达载体转化大肠杆菌DH5α的1号、2号、3号和4号菌落的PCR检测结果；+为阳性对照；-为空白对照；

图10为GhMYC1、GhMYC2、GhMYC3和GhMYC4基因的植物表达载体转化农杆菌GV3101的菌液PCR检测图；其中，M为DNA Marker；1-1、1-2、1-4和1-5为GhMYC1的植物表达载体转化农杆菌GV3101的1号、2号、4号和5号菌落的PCR检测结果；2-1、2-3、2-4和2-5为GhMYC2的植物表达载体转化农杆菌GV3101的1号、3号、4号和5号菌落的PCR检测结果；3-1、3-2、3-3和3-4为GhMYC3的植物表达载体转化农杆菌GV3101的1号、2号、3号和4号菌落的PCR检测结果；4-2和4-5为GhMYC4的植物表达载体转化农杆菌GV3101的2号和5号菌落的PCR检测结果；+为阳性对照；

图11转基因拟南芥的PCR鉴定图；其中，M为DNA Marker；1-1—1-6为转GhMYC1基因的6株拟南芥的检测结果；3-1—3-2为转GhMYC3基因的2株拟南芥的检测结果；4-1—4-12为转GhMYC4基因的12株拟南芥的检测结果；

图12为200mmol/L NaCl处理后的转基因拟南芥总叶绿素含量的柱状图；其中NK为对照未转基因植株；GhMYC1-1和GhMYC1-2为转GhMYC1基因的拟南芥植株1号和2号；GhMYC2-1和GhMYC2-2为转GhMYC2基因的拟南芥植株1号和2号；GhMYC3-1和GhMYC3-2为转GhMYC3基因的拟南芥植株1号和2号；GhMYC4-1和GhMYC4-2为转GhMYC4基因的拟南芥植株1号和2号；

图13为干旱处理后的转基因拟南芥总叶绿素含量的柱状图；其中NK为对照未转基因植株；GhMYC1-1和GhMYC1-2为转GhMYC1基因的拟南芥植株1号和2号；GhMYC3-1和GhMYC3-2为转GhMYC3基因的拟南芥植株1号和2号；GhMYC4-1和GhMYC4-2为转GhMYC4基因的拟南芥植株1号和2号；

图14为干旱处理后的转基因拟南芥的丙二醇含量柱状图；其中NK为对照未转基因植株；GhMYC1-1和GhMYC1-2为转GhMYC1基因的拟南芥植株1号和2号；GhMYC2-1和GhMYC2-2为转GhMYC2基因的拟南芥植株1号和2号；GhMYC3-1和GhMYC3-2为转GhMYC3基因的拟南芥植株1号和2号；GhMYC4-1和GhMYC4-2为转GhMYC4基因的拟南芥植株1号和2号；

图15为200mmol/L NaCl处理后的转基因拟南芥的可溶性糖含量的柱状图；其中NK为对照未转基因植株；GhMYC1-1和GhMYC1-2为转GhMYC1基因的拟南芥植株1号和2号；GhMYC2-1和GhMYC2-2为转GhMYC2基因的拟南芥植株1号和2号；GhMYC3-1和GhMYC3-2为转GhMYC3基因的拟南芥植株1号和2号；GhMYC4-1和GhMYC4-2为转GhMYC4基因的拟南芥植株1号和2号；

图16为干旱处理后的转基因拟南芥的可溶性糖含量柱状图；其中NK为对照未转基因植株；GhMYC1-1和GhMYC1-2为转GhMYC1基因的拟南芥植株1号和2号；GhMYC2-1和GhMYC2-2为转GhMYC2基因的拟南芥植株1号和2号；GhMYC3-1和GhMYC3-2为转GhMYC3基因的拟南芥植株1号和2号；GhMYC4-1和GhMYC4-2为转GhMYC4基因的拟南芥植株1号和2号。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

1、实验材料

棉花银棉品种的叶片，银棉品种购买于北京市中蔬大森林花卉市场；拟南芥种子为哥伦比亚型，本发明人实验室保存；pMD-19T克隆载体、Taq酶购于全式金公司；大肠杆菌DH5α与高纯质粒小量制备试剂盒均购自北京百泰克生物技术有限公司；农杆菌菌株GV3101为本发明人实验室保存；

pDONR^TM207载体购自英伟捷达公司；表达载体pH7WG2D购自VIB(比利时)公司；Gateway克隆的BP反应试剂盒和LR反应试剂盒购自英伟捷达公司；DNA胶回收试剂盒购自塔克拉公司；Trizol试剂购自天根科技有限公司；cDNA反转录试剂盒购自Fermentas公司；引物合成和测序由北京奥科鼎盛生物技术有限公司完成。

实施例1棉花MYC类转录因子编码基因的克隆

1、实验方法

1.1电子克隆得到MYC类转录因子

根据同源基因中存在保守相似序列的特性，用拟南芥MYC类转录因子基因的序列为信息探针，对NCBI中EST数据库棉花(Gossypium hirsutum)进行Tblastx同源性检索，利用DNAStar软件将检索到的来自于棉花的EST序列拼接获得连接体；然后用此连接体再次进行Tblastx的同源检索与拼接，重复以上过程直至无重叠的EST序列，最终获得陆地棉4个GhMYC基因的cDNA序列片段。

1.2RT-PCR方法获得目的基因

依据电子克隆获得的全长4个GhMYC基因的cDNA序列设计RT－PCR引物(表1)。

表1 GhMYC克隆全长引物

利用Trizol－异丙醇法提取银棉总RNA，按照试剂盒的说明进行操作。提取棉花总RNA后，以其为模板，Oligo-dT(5pmol/μL)为引物1μL，混匀后65℃孵育5min，放于冰上，加入5×Reaction Buffer 4μL、RNasin Inhibitor 1μL、M-MLVRT 1μL及dNTPMix 2μL，并温和混匀后瞬离，42℃孵育60min，70℃5min终止反应，即反转录合成cDNA第一链，-20℃保存备用。

将反转录产物初步检测后，取1μL作为模板按下列体系和条件进行PCR扩增。

RT－PCR反应体系为：总体系为20μL，其中含有10×Buffer为2μL，2mmol/LdNTP为1μL，稀释为10μmol/L的引物各1μL，Taq酶0.5U(一般20μL的反应体系加1μL)，加ddH₂O至20μL。

RT－PCR的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火45s，72℃延伸60s，并循环29次；72℃延伸10min。

扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，将预期大小的片段回收并克隆入pMD-19T克隆载体，然后转化大肠杆菌菌株DH5α。挑取阳性菌进行菌液PCR并进行测序。

另外，利用CTAB法提取棉花基因组DNA，利用表1的引物从棉花基因组DNA克隆出4个GhMYC转录因子基因。

2、实验结果

根据电子克隆的棉花四个GhMYC DNA序列设计引物，通过RT-PCR反应分别从cDNA或基因组DNA克隆出四个GhMYC转录因子基因(图1、图2)，获得的4个MYC类转录因子基因分别命名：GhMYC1、GhMYC2、GhMYC3和GhMYC4，其核苷酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.5所示。其中，GhMYC3基因的推导的氨基酸序列为SEQ ID No.4所示。从图1、图2发现GhMYC转录因子的四个基因在银棉基因组中不含内含子。

将克隆的GhMYC1、GhMYC2、GhMYC3和GhMYC4基因的PCR产物分别与pMD-19T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，进行阳性菌液PCR检验。

对转GhMYC1基因的DH5α抗性菌进行PCR菌落检测，发现11和13号菌落为阳性(图3)。

对转GhMYC2基因的DH5α抗性菌进行PCR菌落检测，发现3号菌落为阳性(图4)。

对转GhMYC3基因的DH5α抗性菌进行PCR菌落检测，发现2号、3号等18个菌落为阳性(图5)。

对转GhMYC4基因的DH5α抗性菌进行PCR阳性菌落检测，发现9号、14号菌落为阳性(图6)。

实施例2含有MYC类转录因子编码基因的植物表达载体构建及转化拟南芥

1、实验方法

1.1Gateway方法构建植物表达载体

根据Gateway克隆技术的引物序列设计要求及实施例1克隆的GhMYC1、GhMYC2、GhMYC3和GhMYC4基因序列设计Gateway反应引物(表2)。

表2 Gateway引物设计

采用DNA聚合酶，用表2的上下游引物进行PCR反应，总体系为20μL，其中含有实施例1制备的分别连接GhMYC1、GhMYC2、GhMYC3和GhMYC4基因的pMD-19T克隆载体质粒1μL，10×Buffer为2μL，2mmol/L dNTP为1μL，稀释为10μmol/L的引物各1μL，Taq酶0.5U(一般20μL的反应体系加1μL)，加ddH₂O至20μL。在GhMYC1、GhMYC2、GhMYC3和GhMYC4全长基因的上下游加入attB序列。反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，退火45s，75℃延伸1min，共30个循环；75℃延伸10min，4℃终止反应。用琼脂糖凝胶电泳检测反应产物，并纯化回收。

BP反应：BP反应的目的是将扩增得到的含有attB接头的PCR产物克隆到含有attP的供体载体pDONR^TM207上，以产生入门克隆。根据invitrogen公司的GatewayBP Clonase Ⅱ enzyme mix试剂盒中BP反应体系，包括PCR产物15-150ng、pDONR^TM207载体1μL(150ng/μL)，补充TE缓冲液(pH8.0)至8μL，快速漩涡震荡酶体系混合液两次，加1×BP ClonaseTM酶混合物2μL。反应体系置25℃温育60min后加入2μL蛋白酶K液，37℃温育10min，以终止BP反应。得到入门克隆pDONR^TM207-GhMYC1、pDONR^TM207-GhMYC2、pDONR^TM207-GhMYC3和pDONR^TM207-GhMYC4。

BP反应产物的转化及阳性克隆的鉴定：将通过BP反应得到的入门克隆pDONR^TM207-GhMYC1、pDONR^TM207-GhMYC2、pDONR^TM207-GhMYC3和pDONR^TM207-GhMYC4转化大肠杆菌菌株DH5α，并涂布到壮观霉素LB抗性平板上，挑取抗性菌落，进行PCR检测，检测为阳性的菌落提取质粒，即得到入门克隆载体。

LR反应：LR反应的目的是将已经重组入入门载体pDONR^TM207-GhMYC1、pDONR^TM207-GhMYC2、pDONR^TM207-GhMYC3和pDONR^TM207-GhMYC4的目标基因GhMYC1、GhMYC2、GhMYC3和GhMYC4再克隆到表达载体pH7WG2D中。LR反应体系中包括入门克隆质粒15-150ng，pH7WG2D载体1μL(150ng/μL)，补充TE缓冲液(pH8.0)至8μL，快速漩涡震荡酶体系混合液两次，加1×LR ClonaseTM酶混合物2μL。反应体系置25℃温育60min后加入2μL蛋白酶K溶液，37℃温育10min以终止LR反应，得到最终的表达载体pH7WG2D-GhMYC1、pH7WG2D-GhMYC2、pH7WG2D-GhMYC3和pH7WG2D-GhMYC4(构建流程图见图7)。

LR反应产物的转化及阳性克隆的鉴定：将LR反应产物的表达载体pH7WG2D-GhMYC1、pH7WG2D-GhMYC2、pH7WG2D-GhMYC3和pH7WG2D-GhMYC4转化大肠杆菌菌株DH5α，并涂布到卡那霉素LB抗性平板上，挑取阳性菌落，进行PCR检测，以确定阳性克隆。

1.2花序浸染法转化拟南芥

1.2.1拟南芥的培养与处理

将置于4℃冰箱中春化了两三天的拟南芥种子种在生长盆里，浇水并盖膜以保持水分。在拟南芥初次开花时，为促进侧枝更多花枝的增生，将主茎顶端的花蕾剪掉。适合转化植株的花卉是并没有成熟，也没有产生已受精的角果(大约生长时间为30天左右)。

在用花序侵染法转拟南芥之前，剪去已经长成的角果，以免降低阳性率。侵染前一晚浇水，保持土壤湿度，侵染过程中土不易掉出。

1.2.2花序浸染法转化拟南芥

将Gateway方法构建的植物表达载体pH7WG2D-GhMYC1、pH7WG2D-GhMYC2、pH7WG2D-GhMYC3和pH7WG2D-GhMYC4分别转化农杆菌GV3101，挑取阳性菌落进行PCR检测。将阳性菌株分别接种到250ml三角瓶(按1：1000的比例添加到装有200ml的YEB液体培养基中，添加抗生素卡那霉素和利福平)，大量摇菌1天直到OD值为1.2。5000rpm离心富集农杆菌，然后用5﹪的蔗糖+1/2MS大量悬浮(蔗糖溶液中加入0.1％的表面活性剂SilwetL-77)，直至OD值约为0.8。将拟南芥的花序浸入菌液中侵染1分钟；侵染后的拟南芥用黑色塑料袋或者薄膜覆盖，暗培养24小时。在第一次侵染后7天进行第二次侵染，侵染方法同第一次。待拟南芥植株长大成熟，角果自然开裂后收获种子，即为T1代种子。

1.2.3拟南芥种子的抗性筛选

将T1代种子均匀播种在含50mg/L潮霉素或100mg/L卡那青霉素的抗性平板(1/4MS培养基)上，置4℃冰箱冷处理72h后，移至25℃，16h光照培养箱中发芽，定期观察并调查种子发芽和幼苗生长情况。生长7-10天左右，长出两片真叶的幼苗为抗性幼苗，将抗性幼苗移栽到营养土中。待长成熟时，提取转基因植株的基因组进行PCR鉴定。

2、实验结果

2.1植物表达载体构建

入门克隆pDONR^TM207-GhMYC1、pDONR^TM207-GhMYC2、pDONR^TM207-GhMYC3和pDONR^TM207-GhMYC4转化大肠杆菌菌株DH5α的菌液PCR检测结果见图8。

植物表达载体pH7WG2D-GhMYC1、pH7WG2D-GhMYC2、pH7WG2D-GhMYC3和pH7WG2D-GhMYC4转化大肠杆菌菌株DH5α的菌液PCR检测结果见图9。说明GhMYC1、GhMYC2、GhMYC3和GhMYC4基因的植物表达载体构建成功。

2.2植物表达载体转化拟南芥

扩增含有植物表达载体pH7WG2D-GhMYC1、pH7WG2D-GhMYC2、pH7WG2D-GhMYC3和pH7WG2D-GhMYC4的阳性DH5α菌落并提取质粒，转化进农杆菌GV3101中(图10)。

通过花序浸染法转化拟南芥，分别获得转GhMYC1、GhMYC2、GhMYC3和GhMYC4基因的拟南芥T1代种子。

2.3拟南芥的抗性筛选

提取阳性幼苗基因组进行PCR鉴定(图11)。结果说明，成功获得分别转GhMYC1、GhMYC2、GhMYC3和GhMYC4基因的拟南芥。

实施例3转棉花MYC类转录因子编码基因拟南芥的抗旱耐盐分析

1、实验方法

1.1转基因阳性株的胁迫处理

1.1.1盐胁迫处理

用实施例2获得的盆栽4周左右的转基因拟南芥植株作为研究对象浇淋200mmol/L的NaCl，盐处理10d时取样检测，以野生型拟南芥作对照。观察盐胁迫对转基因拟南芥表型的影响。

1.1.2干旱胁迫处理

用实施例2获得的盆栽4周左右的转基因拟南芥植株作为研究对象进行干旱胁迫处理，10天内不浇水，干旱处理10d时取样检测，以野生型拟南芥作对照。观察干旱胁迫对转基因拟南芥表型的影响。

1.2生理指标检测

1.2.1叶绿素含量的测定

取胁迫处理后的拟南芥鲜叶擦净，剪碎(去掉中脉)，混匀，称取剪碎鲜样0.05g放入研钵中，加半匙的石英砂和一匙的碳酸钙粉及95％的乙醇2-3ml，研磨成匀浆，再加95％乙醇4ml继续研磨至组织发白，在暗处静止3-5分钟，接着用滤纸过滤入10ml容量瓶中，然后用95％乙醇滴洗研钵、研棒及滤纸，直至无绿色为止，最后定容至刻度，摇匀，得到叶绿素提取液；用分光光度计分别测定646nm及663nm波长下的吸光度(A)值。

1.2.2丙二醇(MDA)及可溶性糖的测定

称取胁迫处理的拟南芥植株0.1g，剪碎，用液氮研磨成粉末状；加入1.1ml的5％TCA，漩涡震荡2min，13000r/min离心10min，上清液为样品提取液。吸取离心的上清液1ml，加入1.1ml的0.6％TBA溶液，摇匀。将试管放入沸水中自试管内溶液中出现小气泡开始计时煮沸10min，取出试管并冷却，13000r/min离心10min，取上清液2ml。以0.6％TBA溶液为空白，测定532nm、600nm、450nm处的吸光度值(A)。

2、实验结果

2.1盐胁迫对转基因拟南芥表型的影响

结果表明，转GhMYC3基因的拟南芥在NaCl浇淋10天后，无叶片发黄现象，开花与结实情况都好于NK对照组，对照组拟南芥叶片出现了叶片发黄、萎蔫和枯死的现象，茎部发黑，花朵与结实都较转基因组差；转GhMYC2基因的拟南芥出现了部分叶片枯死的现象，而对照组叶片生长较小，也存在部分叶片枯死的现象。

2.2干旱对转基因拟南芥表型的影响

结果表明，在干旱处理10天后，转GhMYC2基因的植株相对于对照组有明显的植株枯死现象，叶片整个干枯但有少量的开花结子；分别转GhMYC1和GhMYC4基因的拟南芥植株生长正常但叶片小，植株生长较高，有一定的抗旱效果；转GhMYC3基因的拟南芥抗旱效果明显，没有明显的叶片发黑的现象，植株生长旺盛，但生长相对矮小。相对于转基因植株，NK植株叶片有发黑现象，植株生长较高。

2.3生理指标检测

2.3.1总叶绿素含量的测定

对NaCl处理、干旱处理的拟南芥进行了光合作用指标叶绿素含量的测定，结果见图12和图13。

由图12可以看出，在10天200mmol/L的NaCl处理后，分别转GhMYC1、GhMYC3和GhMYC4基因的拟南芥叶绿素含量与NK基本持平，在1mg/g-1.4mg/g之间波动，属正常水平，说明在200mmol/L NaCl处理10天后植株的光合作用正常，叶绿素含量基本保持一致。而转GhMYC2基因的植株的总叶绿素含量明显较其他值低，说明植株生长状况不理想。

由图13可以看出，干旱处理10天后，NK对照组的叶绿素总含量明显较转基因植株的值升高；转GhMYC2基因的拟南芥叶片死亡，故无叶绿素含量数据。可能是由于干旱处理后，对照组NK拟南芥大量失水使叶片重量减轻，故叶绿素含量升高。分别转GhMYC1、GhMYC3和GhMYC4基因的拟南芥叶绿素水平正常，说明转基因植株的光合作用正常。

2.3.2丙二醇含量的测定

对NaCl处理、干旱处理的拟南芥进行丙二醇含量的测定，结果见图14。

图14可以看出，干旱处理10天后的NK对照组较转基因植株，在丙二醇含量上有增长，说明干旱对NK植株的影响较大。分别转GhMYC1、GhMYC3和GhMYC4基因的拟南芥丙二醇含量最低，在0.013μmol/g附近，证明抗旱效果明显；转GhMYC2基因的拟南芥丙二醇含量最高，为0.020μmol/g，说明抗旱效果较其他略弱。

2.3.3可溶性糖含量的测定

对NaCl处理、干旱处理的拟南芥进行可溶性糖含量的测定，结果见图15和图16。

从图15可以看出，200mmol/L NaCl处理的对照组和转基因组拟南芥，可溶性糖含量变化不大，转基因组的可溶性糖含量基本较对照组的值低。可能是因为在NaCl处理下，转基因拟南芥的可溶性糖含量对调节植物抗逆性状的影响不大。转GhMYC3基因的2号植株的可溶性糖含量最高，超过了NK水平；其余转基因拟南芥的可溶性糖含量都较NK值低；转GhMYC4基因的2号拟南芥植株可溶性糖含量最低，为0.077mmol/g。

从图16可以看出，干旱处理10天后，分别转GhMYC1、GhMYC2、GhMYC3和GhMYC4基因的拟南芥可溶性糖平均含量高于NK对照组(0.07mmol/g)，说明转基因植株通过升高可溶性糖含量来提高其抗旱水平。但除了转GhMYC3基因的1号植株的可溶性糖平均含量为0.112mmol/g外，其余转基因植株可溶性糖含量与NK对照组比较都不显著。

Claims

1.从棉花(Gossypium hirsutum L.)分离的GhMYC3转录因子编码基因，其特征在于，其多核苷酸为(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示：

(a)、SEQ ID No.3所示的多核苷酸；或

(b)、编码SEQ ID No.4所示氨基酸的多核苷酸；或

2.权利要求1所述编码基因编码的GhMYC3转录因子，其特征在于，其氨基酸为(a)或(b)所示：

(a)、SEQ ID No.4所示的氨基酸；

3.含有权利要求1所述的编码基因的重组表达载体。

4.按照权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是重组植物表达载体。

5.含有权利要求3或4所述的重组表达载体的重组宿主细胞。

6.权利要求1所述的编码基因在提高植物对逆境胁迫抗性中的应用。

7.按照权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建含有权利要求1所述的编码基因的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到植物或植物细胞中；(3)培育筛选得到对逆境胁迫抗性提高的转基因植物新品种。

8.一种培育耐逆境胁迫的转基因植物新品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建含有权利要求1所述的编码基因的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到植物或植物细胞中；(3)培育筛选得到对逆境胁迫抗性提高的转基因植物新品种。

9.权利要求2所述的GhMYC3转录因子在提高植物对逆境胁迫抗性中的应用。

10.按照权利要求6、7或9所述的应用，其特征在于：所述的逆境胁迫包括高盐或干旱。