CN103145816B - 蛋白质激发子Hrip1在提高和改善植物的耐盐和抗旱能力中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种蛋白质激发子Hrip1在提高和改善植物的耐盐和抗旱能力中的应用。Hrip1基因在拟南芥中表达后能够显著提高和改善植物的耐盐和抗旱能力。转基因植株对盐和干旱胁迫的抗性显著增强。本发明对5个T₁代转基因拟南芥株系进行分子检测,证明Hrip1在转基因拟南芥株系中能够正常转录和表达。转基因植株对盐和干旱胁迫的抗性显著增强,75mmol L^-1NaCl和50mmol L^-1甘露醇渗透胁迫2d,转基因植株种子平均相对发芽率是32.1%和77.9%,分别是野生型的3.72倍和5.61倍;150mmol L^-1NaCl和50mmol L^-1甘露醇处理拟南芥幼苗7d后,转基因植株平均相对根长是81.79%和93.25%,分别是野生型的1.53和1.34倍。

Description

蛋白质激发子Hrip1在提高和改善植物的耐盐和抗旱能力中的应用

技术领域

本发明涉及一种蛋白质激发子的应用。 

背景技术

在自然环境中,作物生长发育往往受到干旱、高温、低温等逆境胁迫,影响正常发育而造成减产,提高植物抗逆性是降低逆境伤害的重要途径之一。通过现代生物技术将外源基因导入植物体内,是培育抗逆新品种的有效途径。目前已有许多基因导入植物提高抗逆性的研究报道,这些基因主要包括两类,第一类是功能基因,这些基因可以通过合成相关物质来提高植物在逆境中的抗性,如渗透调节物质合成基因等。渗透调节物质的合成对于维持植物在渗透胁迫环境中的生存至关重要,将P5cs、BADH、SacB等基因转入植物体后脯氨酸,甜菜碱和糖类等含量明显增加,同时转基因作物抗逆性也明显增强;如将PvP5CS1导入拟南芥中,在NaCl和甘露醇渗透胁迫下,转基因植株种子发芽率和幼苗根长均比野生型显著增加^[1]。另一类是调节基因,此类基因在逆境信号转导中发挥作用,迅速传递信息使植物在逆境中做出反应来抵抗恶劣环境,如DREB类转录因子,MYB类转录因子,蛋白激酶类基因等^[2]。Liu等将小麦TaPIMP1基因导入烟草中,干旱胁迫后,转基因植株的存活率相对野生型提高20%-60%^[3]。蛋白激发子能够激发植物防御信号反应,通过信号识别和信号转导,调节植物体内一系列基因的表达,启动植物防卫反应,激活植物的免疫系统,调节植物生长代谢系统,能够提高植物抗病能力,促进植物生长^[4-5]。蛋白激发子不但具有激发植物防卫反应的功能,而且蛋白激发子转入植物后也能够提高植物抗病性。Yang等将激发子蛋白激发子MgSM1转化拟南芥提高对病原真菌和细菌的抗性^[6]。发明人实验室将PemG1基因转入水稻提高对稻瘟病的抗性^[7]。 

Hrip1是发明人从极细链格孢菌(A.tenuissima)中分离到的一种蛋白激发子,前期研究证明,Hrip1蛋白渗入烟草叶片后能够引发烟草叶片的钙离子流入、介质碱化、激活水杨酸途径的蛋白激酶并且提高植物体内相关防卫基因的表达^[8]。本发明将激活蛋白基因Hrip1导入野生型拟南芥中,获得了转基因拟南芥植株,通过研究Hrip1在抗逆过程中的作用,揭示蛋白 激发子在生物胁迫适应性中的反应。 

发明内容

本发明是申请号为：201110149203.3，申请日为：2011-06-03，发明名称为：“提高植物抗性和诱导植物防御反应的蛋白质及其基因、应用”的中国发明专利申请的系列申请，所述专利申请已于2011-11-16公开，公开号102241752A；所述专利申请的说明书和权利要求书全文为本发明所引用。 

在上述专利申请中，发明人公开了一种能够提高植物抗性及诱导植物防御反应的来自于极细链格孢菌（Alternaria tenuissima）JH505菌株的蛋白质及编码该蛋白质的核苷酸序列，其中的蛋白质是一种蛋白质激发子，命名为Hrip1（过敏反应诱导蛋白1，Hypersensitive response inducing protein1）（其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示）；其编码基因为Hrip1基因（其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示）。此专利申请重点研究了Hrip1基因可以诱导植物如烟草的抗性防御反应，如对烟草花叶病毒的抗性能力。 

本发明是在上述申请的基础上，继续研究了Hrip1基因在拟南芥中表达后能够显著提高和改善植物的耐盐和抗旱能力。转基因植株对盐和干旱胁迫的抗性显著增强。 

本发明对5个T₁代转基因拟南芥株系进行分子检测,证明Hrip1在转基因拟南芥株系中能够正常转录和表达。转基因植株对盐和干旱胁迫的抗性显著增强,75mmol L^-1NaCl和50mmol L^-1甘露醇渗透胁迫2d,转基因植株种子平均相对发芽率是32.1%和77.9%,分别是野生型的3.72倍和5.61倍;150mmol L^-1NaCl和50mmol L^-1甘露醇处理拟南芥幼苗7d后,转基因植株平均相对根长是81.79%和93.25%,分别是野生型的1.53和1.34倍。三周龄的转基因植株在250mmol L^-1NaCl胁迫20d,平均存活率为67%,显著高于野生型(42%)(P<0.05);干旱胁迫25d后,复水5d转基因植株平均存活率为72%,而野生型仅为44%。检测结果显示转基因植株叶片的抗氧化酶活性明显高于野生型,用200mmol L^-1NaCl和200mmol L^-1甘露醇处理后24h,POD活性分别比野生型植株提高1.56和1.85倍,CAT活性分别比野生型植株提高1.64和1.86倍。以上结果说明,Hrip1在拟南芥中的表达具有提高植株耐盐抗旱能力的功能。 

附图说明

图1：植物表达载体pCAMBIA1301-CaMV35S-Hrip1-Nos的结构图； 

图2：转Hrip1基因植株的PCR(A)、RT-PCR(B)和Western Blotting(C)分析； 

图3：NaCl和甘露醇胁迫下转Hrip1拟南芥种子和野生型种子发芽试验； 

图4：250mmol L^-1NaCl胁迫处理转基因拟南芥幼苗的生长状况； 

图5：NaCl和甘露醇胁迫下转Hrip1拟南芥和野生型拟南芥植株叶片POD酶活含量，其中标以不同小写字母者在P<0.05水平上差异显著； 

图6：NaCl和甘露醇胁迫下转Hrip1拟南芥和野生型拟南芥植株叶片CAT酶活含量，其中标以不同小写字母者在P<0.05水平上差异显著。 

具体实施方式

为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明： 

1材料与方法 

1.1试验材料 

哥伦比亚生态型（Col-0）野生型拟南芥和农杆菌菌株GV3101由发明人实验室保存，已知。植物表达载体pCAMBIA1301。蛋白激发子Hrip1抗体由华大基因制备。 

1.2表达载体构建 

以引物5′-CATGCCATGGGCATGTACTTCTCGAATATACTCCCGG-3′（如SEQ ID NO:3所示）和5′-GGGTCACCTCAGCACTGAGGCAAGTTACAGACC-3′（如SEQ ID NO:4所示）,以保存的Hrip1基因为模板扩增蛋白激发子Hrip1基因的完整开放阅读框(open reading frame,ORF)序列。选pCAMBIA1301载体序列上的NcoⅠ和BstEⅡ两个酶切位点,将该表达载体的GUS基因替换为Hrip1基因,构建35S::Hrip1植物双元表达载体(图1)。 

1.3转Hrip1基因拟南芥株系的获得及筛选 

采用花序浸染法获得转Hrip1基因拟南芥植株^[9]。 

将T₀代种子表面消毒后均匀铺洒在含有25ug mL^-1潮霉素的1/2MS培养基上,4℃均一化处理3d后,置于22℃光照(光周期为16h光照/8h黑暗)生物培养箱中进行培养。选取培养10-15d生长较快的绿苗移栽到培养土中继续生长以收获种子,筛选三代直到得到纯合的转基因株系。 

1.4转基因拟南芥的分子鉴定 

分别提取转Hrip1拟南芥单株的DNA和RNA,以DNA和cDNA为模板,用引物5′-ATGTACTTCTCGAATATACTCCCGG-3′（如SEQ ID NO:5所示）和5′-TCAGCACTGAGGCAAGTTACAGACC-3′（如SEQ ID NO:6所示）进行PCR扩增,分别以野生型拟南芥(WT)和Hrip1PCR产物(CK)为阴性对照和阳性对照。 

将T4代烟草的叶片加液氮充分研磨后立即转移到磷酸缓冲液(0.025mol L^-1K₂HPO₄,0.025mol L^-1KH₂PO₄,2mmol L^-1EDTA,pH8.0),充分混匀后12000×g,4℃离心10min。将上 清液冰浴1h后12000×g,4℃再离心10min。将提取的蛋白用12%SDS-PAGE胶分离后转移到PVDF膜,使用华大基因公司制备的羊抗兔Hrip1基因的抗体,再参考Kobayashi等^[10]方法进行免疫杂交。 

1.5转基因拟南芥幼苗抗旱性和耐盐性测定 

将5个转基因株系拟南芥T₄代纯合种子和野生型拟南芥种子点播在含有75mmol L^-1NaCl和50mmol L^-1甘露醇的1/2×MS固体培养基上,以不含渗透剂的1/2×MS固体培养基上培养的种子为对照(CK),测定种子发芽率和幼苗根长。发芽率测定试验每株系处理60粒种子,重复三次。根长试验每株系处理30株幼苗根长,重复三次。操作方法参照Dai等^[11]。种子相对发芽率(%)=(胁迫条件下发芽率/对照发芽率)×100%,相对根长(%)=(胁迫条件下的根长/对照条件下根长)×100%。 

1.6转基因拟南芥成株抗旱性和耐盐性测定 

将在1/2×MS培养基上培养7d的转基因植株(L1、L2、L3、L4和L5)以及野生型幼苗到装有定量营养土的营养钵中(9.5cm x9.5cm),每钵移植4株苗,培养3周后,分组进行胁迫处理,每株系处理3钵,重复3次。耐盐实验采用250mmol L^-1NaCl水溶液从培养托盘底部浸透营养土,每托盘使用1L NaCl水溶液,温室中继续培养至第20d,统计幼苗存活率;抗旱实验在停止浇水培养25d模拟干旱胁迫(温室控制相对湿度75%),然后复水继续培养5d,统计植株存活率。 

1.7转基因拟南芥相关防御酶活力测定 

取干旱和盐胁迫处理24h长势一致的拟南芥植株,在植株相同部位取10片叶片,分别测定正常条件(CK)和胁迫条件下(200mmol L^-1NaCl和200mmol L^-1Mannitol)不同转基因植株和野生型植株叶片过氧化物酶(Peroxidase,POD)和过氧化氢酶(Catalase,CAT)酶活性。POD活性采用愈创木酚法测定,CAT活性采用紫外分光光度法测定,方法参照刘颖超^[12]的方法。 

1.8数据统计分析 

采用SAS(Version9.1)软件对数据进行统计分析。 

2结果与分析 

2.1转Hrip1基因拟南芥的获得及分子检测 

将构建好的植物表达载体转化拟南芥后收获T₀代种子,用含有25μg mL^–1潮霉素1/2MS培养基筛选,共获得5个阳性T₀代转Hrip1拟南芥单株。对获得的5个阳性T₀代株系进行Hrip1基因的DNA和转录水平检测。(图2-A)结果显示5个转基因株系(L1、L2、L3、L4、L5)有目标基因的扩增片段,RT-PCR结果显示Hrip1基因在5个植株中均正常转录表达(图2-B),Western blotting分析,在供试5个转基因株系中均检测到抗原和抗体特异的17.56kD 杂交带,而在野生型(Wt)中没有检测到杂交信号,表明Hrip1已整合到拟南芥基因组并正确表达(图2-C)。 

2.2转Hrip1基因拟南芥种子在胁迫条件下的相对发芽率 

转Hrip1基因的拟南芥种子对干旱和盐胁迫耐性显著提高。结果显示(图3,表1),在75mmol L^-1NaCl和50mmol L^-1甘露醇胁迫下,所测试的5个转基因株系种子相对发芽率均显著高于野生型(P<0.005),平均值分别为32.1%和77.9%,是野生型的3.72倍和5.61倍,表明Hrip1基因的转入显著改善了拟南芥种子对干旱和盐的耐渗透能力。 

表1NaCl和甘露醇胁迫下转Hrip1拟南芥种子和野生型种子相对发芽率 

标以不同小写字母者在P<0.05水平上差异显著。 

2.3转Hrip1基因拟南芥在胁迫条件下幼苗的相对根长 

在盐和干旱胁迫下,转基因拟南芥比野生型根长显著延长。图4显示不同胁迫条件下转基因幼苗和野生型幼苗的相对根长。在胁迫条件下拟南芥植株根长均显著低于非胁迫条件下的根长,说明胁迫抑制了拟南芥幼苗根系的生长。150mmol L^-1NaCl以及75mmolL^-1甘露醇胁迫下,5个转基因植株的相对根长平均值分别是81.79%和93.25%,为野生型植株的1.53和1.34倍,说明导入蛋白激发子Hrip1基因在盐和干旱胁迫条件下具有显著提高拟南芥根的生长速度的作用。 

表2NaCl及甘露醇胁迫下转Hrip1拟南芥和野生型幼苗的相对根长 

标以不同字母者在P<0.05水平上差异显著。 

2.4转Hrip1基因拟南芥成株抗盐耐旱性 

250mmol L^-1NaCl处理土壤第10d观察,野生型幼苗叶片和转基因幼苗叶片均开始变黄,说明NaCl已经对植株生长产生毒害(图4);胁迫第20d观察,大部分野生型植株死亡,而转基因植株死亡少,平均存活率为67%,不同株系之间植株存活率差异不显著(P<0.05),但均显著高于野生型植株存活率42%(表3)。 

成株幼苗干旱胁迫25d,无论是转基因植株还是野生型植株均出现萎蔫枯死症状,复水培养2d后。转基因植株的存活率分别为72%(L1)、72%(L2)、71%(L3)、71%(L4)和72%(L5),平均存活率为72%,显著高于野生型44%(Wt)(P<0.05)(表3),说明导入蛋白激发子Hrip1基因的植株提高了拟南芥的耐旱能力。 

表3盐胁迫和干旱后拟南芥幼苗的存活率 

标以不同字母者在P<0.05水平上差异显著。 

2.5盐、干旱胁迫条件下转基因植株叶片POD酶和CAT酶活力 

不同转基因植株和野生型植株叶片抗氧化酶的活力测定结果显示,无论是正常生长条件下还是胁迫条件(200mmol L^-1NaCl和200mmol L^-1Mannitol)下,转基因植株叶片POD、CAT酶活都显著高于野生型植株(P<0.05)(图5、6)。在正常和两种胁迫条件下(200mmol L^-1NaCl和200mmol L^-1Mannitol),转基因植株叶片POD酶活平均值分别是野生型的2.04倍、1.56倍和 1.85倍,CAT酶活平均值分别是野生型的1.76、1.64、1.86倍。说明Hrip1基因的转入,明显提高了拟南芥植株叶片POD和CAT酶活。 

叶片POD酶活性测定显示(图5),在200mmol L^-1NaCl胁迫下,不同转基因株系的POD酶活性有差异,转基因植株L1(38.84)和L3(37.84)叶片POD酶活性最高,显著高于L4(29.79)和L5(30.57)。200mmol L^-1甘露醇胁迫下,不同转基因株系之间叶片POD酶活之间差异不显著,但均显著大于野生型。叶片CAT酶活性测定显示(图6),200mmol L^-1NaCl和200mmolL^-1甘露醇胁迫下,转基因植株叶片CAT酶活平均值分别为10.12和13.66,都显著高于野生型拟南芥植株的CAT酶活。 

3结论 

在75mmol L^-1NaCl和50mmol L^-1甘露醇胁迫下,转Hrip1基因植株种子发芽率和幼苗根长明显高于野生型植株,成株对盐和干旱胁迫的耐性也显著增强,说明蛋白激发子Hrip1基因转入可以明显改善拟南芥的抗盐、抗旱能力。 

干旱胁迫、盐胁迫是影响作物生长发育的主要逆境因子,逆境胁迫使细胞内活性氧自由基增加,导致细胞遭受氧化危害。POD和CAT等抗氧化酶是细胞抵御活性氧伤害的保护酶系统的主要组成部分,在清除自由基和阻止自由基形成方面起重要作用。KONG等^[16]发现转激酶基因ZmMKK4拟南芥在4℃以及200mmol L^-1NaCL胁迫后,其POD以及CAT酶活均高于野生型。Ali等^[17]发现转入海藻糖基因玉米干旱胁迫后,POD、CAT酶活相对野生型显著提高。Zhang等^[18]将调节基因SgNCED1导入烟草后,逆境胁迫条件下,显著提高了转基因烟草的抗氧化酶POD、CAT酶活。本研究显示,200mmol L-¹NaCl和200mmol L^-1甘露醇分别处理24h后,拟南芥幼苗叶片中过氧化物酶（POD）活性分别是野生型植株的1.56和1.85倍;CAT活性分别是野生型植株的1.64和1.86倍。说明Hrip1基因的转入明显提高了拟南芥株系抗氧化酶POD和CAT酶的活性,从而使植株对盐分、干旱胁迫表现了一定抗性。 

Hrip1基因能够在转基因拟南芥中表达。导入Hrip1的转基因拟南芥种子相对发芽率有很大提高,并且能够促进幼苗生根速度;成株受胁迫后,转基因拟南芥植株存活率显著高于野生型,而且叶片的POD、CAT酶活性增加,这些结果均表明,导入Hrip1基因可以提高拟南芥对盐和干旱耐受能力。拟南芥具有植株小、世代短，结实多、基因组小、自花授粉和基因高度纯合等优点，是研究植物遗传、细胞、发育、分子生物学的模式植物，其研究结果可适用于多数植物和农作物。由此可见Hrip1有望成为未来抗旱耐盐植物选育的可利用资源之一。 

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Claims (1)

1.蛋白质激发子Hrip1在提高和改善拟南芥的耐盐和抗旱能力中的应用，所述蛋白质激发子Hrip1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。