CN103298943A - 产量相关性状增强的植物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明总体上涉及分子生物学领域，涉及增强植物的多种经济学重要的产量相关性状的方法。更具体地，本发明涉及通过调节HAB1（对ABA1超敏感性）多肽或KELP多肽编码核酸在植物中的表达来增强植物的产量相关性状的方法。本发明还涉及具有HAB1多肽或KELP多肽编码核酸的调节表达的植物，所述植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状。本发明还提供可以用于实施本发明方法的迄今未知的HAB1编码核酸、和包含HAB1或KELP编码核酸的构建体。

Description

产量相关性状增强的植物及其制备方法

发明领域

本发明总体上涉及分子生物学领域，并且涉及通过调节植物中HAB1（对ABA1超敏感性）多肽或KELP多肽编码核酸的表达来增强植物中的产量相关性状的方法。本发明还涉及具有HAB1多肽或KELP多肽编码核酸的调节表达的植物，所述植物相对于相应野生型植物或其他对照植物具有增强的产量相关性状。本发明还提供在本发明的方法中有用的构建体。

背景技术

不断增长的世界人口和逐渐减少的农业可用耕地助长了提高农业效率研究之势。传统的作物和园艺学改良方法利用选育技术来鉴定具有期望特性的植物。然而，此类选育技术有若干缺陷，即这些技术一般为劳动密集型的，而且产生的植物通常含有异质的遗传组分，当这些异质的遗传组分从亲本植物传递时不一定总是产生期望的性状。分子生物学的进展已经使人类能够修饰动物和植物的种质。植物遗传工程需要分离和操作遗传物质（一般为DNA或RNA的形式）以及随后将遗传物质引入植物。这类技术有能力输送具多种改良的经济、农业或园艺性状的作物或植物。

具有特别经济意义的一种性状是增加的产量。产量通常定义为作物可测量经济价值的产出。这可以以数量和/或质量的方式进行定义。产量直接取决于若干因素，例如器官的数量和大小、植物构造（例如，分枝的数量）、种子产量、叶子衰老等等。根的发育、营养吸收、胁迫耐受性和早期活力也是决定产量的重要因素。因此优化上述因素也可以促进作物产量的增加。

种子产量是特别重要的性状，这是因为许多植物的种子对于人类和动物营养而言至关重要。诸如玉米、稻、小麦、芸苔（canola）和大豆等作物占人类总卡路里摄取量的一半以上，不论是通过种子本身的直接消耗，还是通过由加工的种子所饲养的肉类产品的消耗。它们也是工业加工所用的糖类、油类和多类代谢物的来源。种子含有胚(新的枝条和根的来源)和胚乳(发芽和幼苗早期生长过程中胚生长的营养源)。种子的发育涉及许多基因，并且需要代谢物自根、叶和茎转移至正在生长的种子。特别是胚乳，同化糖类、油类和蛋白质的代谢前体，将其合成为贮存性高分子，以充盈谷粒。

对于许多作物而言，另一重要的性状是早期活力（early vigour）。改良早期活力是温带和热带稻类栽培种的现代稻类育种项目的重要目标。长根对于水栽稻的恰当土壤锚固至关重要。在直接向涝地里播种稻米的情况下，以及在植物必须迅速穿过水出苗的情况下，较长的枝条与活力有关。在进行条播的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对于优良的出苗至关重要。改造植物早期活力的能力在农业上将具有极其重要的意义。例如，一直以来早期活力弱限制了在欧洲大西洋地区引入基于玉米带种质的玉米(玉蜀黍，Zea mays L.)杂交种。

另一重要的性状在于改良的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是全世界作物损失的主要原因，使大多数主要作物植物平均产量降低50%以上(Wang等,Planta(2003)218:1-14)。非生物胁迫可由干旱、盐度、极端温度、化学毒性及氧化胁迫引起。提高非生物胁迫植物耐受性的能力将对全世界农场主带来重大的经济利益，并将使人们能够在不利条件下、在否则将不可能进行作物栽培的地区进行作物栽培。

因此通过优化上述因素之一可以增加作物产量。

视最终用途而定，可能更优先修饰某些产量性状。例如，对于诸如饲料或木材生产或者生物燃料资源等应用，可能期望植物营养部分的增长，而对于诸如面粉、淀粉或油料生产等应用，可能特别期望种子参数的增长。即便是在种子参数之中，也可能更优先其中的一些，这取决于应用。多种机制可促成增加的种子产量，无论形式是增加的种子大小、还是增加的种子数量。

现已发现，通过在植物中调节HAB1（对ABA1超敏感性）多肽或KELP多肽编码核酸在植物中的表达，可以改良植物的多种产量相关性状。

发明背景

对ABA1超敏感性蛋白（HAB1）

对ABA1超敏感性蛋白（HYPERSENSITIVE TO ABA1，HAB1）是蛋白磷酸酶2C型（PP2C），其作为ABA信号传递的负调节物起关键作用，并且与ABI1、ABI2和At1g17550（HAB2）紧密相关。具体地，HAB1、ABI1、ABI2和PP2CA已被证实影响ABA的种子和营养应答。植物激素脱落酸（ABA）涉及对环境应激的适应和植物发育的调节。ABA与受体PYR1结合，所述受体PYR1又与PP2Cs结合且抑制PP2Cs。在外源ABA的存在下，hab1-1突变体显示对种子萌发的ABA超敏感性抑制。hab1-1种子的该ABA超敏感性表型，与35S:HAB1植物减少的ABA敏感性，一起指示HAB1作为ABA信号传递的负调节物的作用。HAB1是蛋白质复合物的一部分，在该蛋白质复合物中已经鉴定了PYL5和SWI3B。体外实验显示：i）HAB1使OST1去磷酸化且失活，ii）HAB1以及相关的PP2Cs ABI1和ABI2与OST1相互作用。这个结果提供PP2Cs直接牵涉ABA依赖性OST1激活的证据，且提示AMPK/Snf1相关激酶通过抑制调节性PP2Cs的激活机制从植物到人是保守的。

KELP多肽

真核生物中的转录激活依赖于序列特异性转录激活物和通用转录因子之间的相互作用。虽然在激活物和通用因子之间的直接接触已在体外得到证实，但命名为辅激活物的另一类蛋白质看起来是一些基因的转录激活所需的。

植物KELP蛋白质据报道是转录辅激活物。先前由Cormack等人（1998-Plant Journal，14（6），685-692）描述了来自拟南芥（Arabidopsis）的KELP蛋白质，其为发病机制相关基因的推定转录辅激活物。KELP最初通过酵母双杂交系统被显示与另一种转录辅激活物KIWI相互作用（Cormack等人，1998）。该作者在酵母中执行双杂交相互作用筛选研究，其导致来自拟南芥的两种蛋白质的鉴定，所述两种蛋白质均显示与来自广泛范围的生物体的转录辅激活物家族的序列相似性。开发了利用来自维多利亚多管发光水母（Aequora Victoria）的绿色荧光蛋白（GFP）的修饰的酵母双杂交方法，并且用于自拟南芥cDNA文库克隆推定的植物转录辅激活物之一。Cormack等人（1998）报道命名为KIWI和KELP的两种蛋白质可以杂聚和同聚结合，并且其基因已经克隆且在拟南芥基因组上作图。两种蛋白质均被认为在病原体防御和植物发育过程中在基因激活中起作用。Cormack等人（1998）进一步报道拟南芥基因组含有鉴定的KELP基因的一个拷贝，并且将KELP作图到4号染色体。来自拟南芥的KELP蛋白质被认为含有六个潜在的蛋白激酶C（PKC）和四个潜在的酪蛋白激酶II（CK2）磷酸化位点。

Matsushita等人（2001–Mol Cells，12（1）:57-66）描述了编码与拟南芥（A.thaliana）的KELP（AtKELP）高度同源的蛋白质的克隆。该作者使用番茄花叶病毒（ToMV）的重组运动蛋白（MP）作为探针，进行了油菜（Brassica campestris）cDNA文库的far-western筛选。发现命名为MIP102的推定克隆之一是拟南芥转录辅激活物KELP的一种推定直向同源物。该作者给出了MIP102cDNA的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列。

Sasaki等人（2009–Mol.Plant Pathol.10（2）:161-173）检查了KELP瞬时过表达对ToMV感染和MP在病毒的实验宿主本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中的细胞内定位的影响。在共轰击实验中，KELP的过表达抑制病毒的细胞间运动。此外，与ToMV MP共定位的KELP的过表达导致MP的胞间连丝结合的减少。在不存在MP表达的情况下，KELP通过在其N端部分中的定位信号而定位于核和细胞质中。该作者提示，当过表达时，KELP可以充当用于病毒运动的抑制因子。

发明概述

现已令人惊讶地发现，调节如本文定义的HAB1多肽或KELP多肽编码核酸的表达可以使植物具有增强的产量相关性状，特别是增加的产量，并且更特别地当在干旱胁迫条件下生长时，相对于对照植物增加的种子产量。

根据一个实施方案，本发明提供了相对于对照植物改善植物中如本文提供的产量相关性状的方法，其包括调节如本文定义的HAB1多肽或KELP编码核酸在植物中的表达。

本说明书中的节段题目和标题仅为了方便和提及的目的，不应以任何方式影响本说明书的含义或解释。

定义

下述定义将用于整个本说明书。

多肽/蛋白质

术语“多肽”和“蛋白质”在文中互换使用，是指通过肽键连接起来的、任意长度的氨基酸多聚体。

多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列

术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在文中互换使用，是指任何长度的无支链形式的多聚核苷酸，所述核苷酸或者为核糖核苷酸或者为脱氧核糖核苷酸或者为两者的组合。

同源物

蛋白质的“同源物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，其相对于所讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入，并且具有与其源自的未修饰蛋白质相似的生物活性和功能活性。

缺失是指从蛋白质中除去一个或多个氨基酸。

插入是指在蛋白质的预定位置引入一个或多个氨基酸残基。插入可以包括N-末端和/或C-末端融合以及单个或多个氨基酸的序列内插入。一般氨基酸序列内部的插入将小于N-或C-末端的融合，数量级约1到10个残基。N-或C-末端融合蛋白质或肽的实例包括在酵母双杂交系统中应用的转录激活因子的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶标签、蛋白质A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、

表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白质C表位和VSV表位。

取代是指蛋白质中的氨基酸用具有相似性质(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或打破α螺旋结构或β片层结构的倾向性)的其他氨基酸替换。氨基酸取代通常是单个残基的取代，但是视施加于多肽上的功能性限制而定也可以发生成簇取代，并且可以为1到10个氨基酸；插入通常在大约1到10个氨基酸残基数量级。氨基酸取代优选为保守氨基酸取代。保守取代表在本领域众所周知(参见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company(编辑)和下表1)。

表1：保守氨基酸取代的实例

残基	保守取代	残基	保守取代
				Ala	Ser	Leu	Ile;Val
Arg	Lys	Lys	Arg;Gln
				Asn	Gln;His	Met	Leu;Ile
Asp	Glu	Phe	Met;Leu;Tyr
				Gln	Asn	Ser	Thr;Gly
Cys	Ser	Thr	Ser;Val
				Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp;Phe
				His	Asn;Gln	Val	Ile;Leu
Ile	Leu;Val

可通过本领域众所周知的肽合成技术，如固相肽合成法等，或通过重组DNA操作容易地进行氨基酸取代、缺失和/或插入。用于产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的DNA序列操作方法是本领域众所周知的。例如，本领域的技术人员熟知在DNA预定位置进行取代突变的技术，包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB,Cleveland,OH)、QuickChange定点诱变(Stratagene,San Diego,CA)、PCR介导的定点诱变或其他定点诱变方案。

衍生物

“衍生物”包括肽、寡肽、多肽，与天然蛋白质的氨基酸序列如目的蛋白质相比，其可以包括用非天然产生的氨基酸残基进行的氨基酸取代、或者添加非天然产生的氨基酸残基。蛋白质的“衍生物”还包括肽、寡肽、多肽，与天然多肽的氨基酸序列相比，其可以包括天然改变的(糖基化、酰基化、异戊二烯化、磷酸化、豆蔻酰化、硫酸化等)或非天然改变的氨基酸残基。衍生物与其源自的氨基酸序列相比，还可以包括一个或多个非氨基酸替代或添加，例如共价或非共价地结合于氨基酸序列的报告分子或其他配体，如与之结合有利于衍生物检测的报告分子，以及相对于天然蛋白质的氨基酸序列而言非天然产生的氨基酸残基。此外，“衍生物”还包括天然产生形式的蛋白质与标签肽如FLAG、HIS6或硫氧还蛋白的融合物(关于标签肽的综述，请参见Terpe,Appl.Microbiol.Biotechnol.60,523-533,2003)。

直向同源物/旁系同源物

直向同源物和旁系同源物涵盖用于描述基因祖先关系的进化概念。旁系同源物为相同物种内的基因，其源自于祖先基因的复制；而直向同源物为来自不同生物体的基因，其起源于物种形成，并且也源自于共同的祖先基因。

结构域,基序/共有序列/标签序列

术语“结构域”是指在进化相关蛋白质序列的比对中，在特定位置上保守的一组氨基酸。尽管其他位置上的氨基酸可能因同源物不同而改变，但是在特定位置上高度保守的氨基酸则意味着对于蛋白质结构、稳定性或功能而言很可能是必不可少的氨基酸。“结构域”因其在所比对的家族蛋白质同源物序列中高度保守而得以鉴定，能够用作为标识符以确定任何所讨论的多肽是否属于先前鉴定到的多肽家族。

术语“基序”或“共有序列”或“标签序列”（signature）是指进化相关蛋白质序列中短的保守区域。基序常常是高度保守的结构域部分，但也可能仅仅包括部分结构域，或者位于保守结构域之外(若基序的所有氨基酸都落在所定义的结构域之外的话)。

存在用于鉴定结构域的专家数据库，例如SMART(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95,5857-5864;Letunic等(2002)Nucleic AcidsRes30,242-244)、InterPro(Mulder等,(2003)Nucl.Acids.Res.31,315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994),A generalized profile syntax forbiomolecular sequences motifs and its function in automatic sequenceinterpretation.(In)ISMB-94;第二届分子生物学智能系统国际会议记录(Proceedings2nd International Conference on Intelligent Systems forMolecular Biology)Altman R.,Brutlag D.,Karp P.,Lathrop R.,Searls D.编辑,53-61页,AAAI Press,Menlo Park;Hulo等,Nucl.Acids.Res.32:D134-D137,(2004))或者Pfam(Bateman等,Nucleic Acids Research30(1):276-280(2002)。进行蛋白质序列芯片(in silico)分析的一组工具可以从ExPASy蛋白质组学服务器获得(瑞士生物信息学研究所(Swiss Institute ofBioinformatics)(Gasteiger等ExPASy:the proteomics server for in-depthprotein knowledge and analysis.Nucleic Acids Res31:3784-3788(2003))。也可以利用常规技术如通过序列比对鉴定结构域或基序。

为比较而进行序列比对的方法是本领域众所周知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch的算法((1970)J.Mol.Biol.48:443-453)来寻找可以使匹配数最大化且空位数最小化的两序列间的全局比对(即跨越全序列)。BLAST算法(Altschul等(1990)J Mol Biol215:403-10)计算序列同一性百分比，并对两序列之间的相似性进行统计学分析。执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)公开地获得。例如，同源物可以使用ClustalW多重序列比对算法(1.83版)，采用默认的成对比对参数以及百分比的记分方法而容易地鉴定。利用可获自MatGAT软件包(Campanella等BMC Bioinformatics.2003年7月10日4:29.MatGAT:an applicationthat generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences)的方法之一，也可以确定全局相似性和同一性百分比。可以进行微小的人工编辑以优化保守基序之间的比对，这对于所属领域的技术人员而言将是显而易见的。此外，除了利用全长序列进行同源物鉴定以外，还可以利用特定的结构域。可以利用上述程序采用默认参数针对完整核酸或氨基酸序列或者针对选择的结构域或保守基序来确定序列同一性值。对于局部比对，Smith-Waterman算法是特别有用的（Smith TF，Waterman MS（1981）J.Mol.Biol147（1）；195-7）。

交互BLAST

典型地，这涉及以查询序列(例如，利用实施例表A中所列的任一序列)针对任何序列数据库如可公共获得的NCBI数据库进行BLAST的一次BLAST。当从核苷酸序列开始时，通常使用BLASTN或TBLASTX(利用标准默认值)，而当从蛋白质序列开始时，则使用BLASTP或TBLASTN(利用标准默认值)。BLAST结果可以任选地过滤。接着使用过滤的结果或者未过滤的结果中的全长序列针对查询序列来源生物的序列进行反向BLAST(二次BLAST)。然后比较一次和二次BLAST的结果。如果一次BLAST中分值靠前的命中事件来自查询序列源自的相同物种，然后反向BLAST理想地导致查询序列处于最高命中事件之列，则找到了旁系同源物；如果一次BLAST中分值靠前的命中事件不来自查询序列源自的相同物种，且优选地在反向BLAST时导致查询序列处于最高命中事件之列，则找到了直向同源物。

分值靠前的命中事件是E值低的命中事件。E值越低，分值越具有显著性(或者换句话说，偶然发现此命中事件的几率越低)。E值的计算是本领域众所周知的。除了E值之外，还对比较进行同一性百分比记分。同一性百分比是指两比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度上的相同核苷酸(或氨基酸)数。在大家族的情况下可以使用ClustalW，继之以邻接树来辅助相关基因的聚类可视化，和鉴定直向同源物和旁系同源物。

杂交

本文定义的术语“杂交”指其中基本同源互补的核苷酸序列彼此退火的过程。杂交过程能够完全在溶液中发生，即互补的两核酸都处在溶液中。杂交过程也能够这样进行，即互补核酸之一固定于基质上，如磁珠、琼脂糖珠或任何其它树脂上。此外，杂交过程也能够这样进行，即其中互补核酸之一固定在固相支持物如硝酸纤维素或尼龙膜上，或者通过例如照相平板印刷术固定在例如硅质玻璃支持物上(后者称为核酸阵列或微阵列，或称为核酸芯片)。为了使杂交发生，通常使核酸分子热变性或化学变性，以使双链解链成两条单链，和/或除去单链核酸中的发夹结构或其它二级结构。

术语“严格性”是指发生杂交的条件。杂交的严格性受诸如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成等条件的影响。通常，对于特定序列而言，在确定的离子强度和pH值下，低严格条件选择为比热解链温度(T_m)低大约30℃。中等严格条件为温度比T_m低20℃，而高严格条件为温度比T_m低10℃。高严格杂交条件通常用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。不过，由于遗传密码的简并性，核酸可以在序列上有偏差而依然编码基本上相同的多肽。因此有时可能需要中等严格杂交条件来鉴定这样的核酸分子。

T_m是在确定的离子强度和pH值下，50%的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度。T_m取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在较高温度下特异性杂交。在低于T_m值大约16℃到32℃获得最大杂交速率。在杂交溶液中存在一价阳离子会减少两核酸链之间的静电排斥作用，从而促进杂交体形成；当钠浓度高达0.4M时，这一作用可见(对于更高的浓度，此效应可以忽略不计)。每个百分点的甲酰胺可使DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度降低0.6到0.7℃，加入50%甲酰胺能够使杂交在30到45℃完成，尽管这将降低杂交速率。碱基对错配降低杂交速率和双链体的热稳定性。平均而言，对于大的探针，每个百分点碱基错配使T_m值下降约1℃。依赖于杂交体类型，T_m值可以利用下列公式计算：

1)DNA-DNA杂交体(Meinkoth和Wahl,Anal.Biochem.,138:267-284,1984):

Tm=81.5℃＋16.6×log₁₀[Na⁺]^a＋0.41×%[G/C^b]－500×[L^c]^-1－0.61×%甲酰胺

2)DNA-RNA或RNA-RNA杂交体:

Tm=79.8℃＋18.5(log₁₀[Na⁺]^a)＋0.58(%G/C^b)＋11.8(%G/C^b)²-820/L^c

3)寡DNA或寡RNA^d杂交体:

<20个核苷酸:Tm=2(l_n)

20-35个核苷酸:Tm=22＋1.46(l_n)

^a或对于其它一价阳离子，但是仅在0.01-0.4M范围内精确。

^b仅对于在30%到75%范围内的%GC精确。

^cL=双链体的碱基对长度。

^d寡，寡核苷酸；l_n，=引物的有效长度=2×(G/C数)＋(A/T数)。

非特异性结合可以通过许多已知技术中的任一来控制，例如用含蛋白质的溶液封闭膜，在杂交缓冲液中添加异源RNA、DNA和SDS，以及用RNA酶处理。对于非同源探针，可以通过改变如下条件之一来进行系列杂交：(i)逐渐降低退火温度(例如从68℃降至42℃)，或(ii)逐渐降低甲酰胺浓度(例如从50%降至0%)。熟练技术人员知晓可以在杂交过程中改变的多种参数，从而保持或者改变严格条件。

除杂交条件外，杂交特异性通常还是杂交后洗涤的函数。为了除去非特异杂交产生的背景，用稀释的盐溶液洗涤样品。这类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度：盐浓度越低、洗涤温度越高，洗涤的严格性就越高。洗涤条件通常在等于或低于杂交严格性的条件下进行。阳性杂交给出至少为背景两倍的信号。一般按如上来设置适用于核酸杂交试验或基因扩增检测操作的适宜严格条件。也可以选择更高或更低的严格条件。熟练技术人员知晓可以在洗涤过程中改变的多种参数，从而保持或者改变严格条件。

例如，长于50个核苷酸的DNA杂交体的典型的高严格杂交条件包括在1×SSC中于65℃杂交或者在1×SSC和50%甲酰胺中于42℃杂交，接着在0.3×SSC中于65℃洗涤。长于50个核苷酸的DNA杂交体的中等严格杂交条件的实例包括在4×SSC中于50℃杂交或者在6×SSC和50%甲酰胺中于40℃杂交，接着在2×SSC中于50℃洗涤。杂交体的长度是针对杂交核酸预期的长度。当已知序列的核酸进行杂交时，杂交体的长度可以通过比对序列并鉴定本文所述的保守区域进行确定。1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可以另外地包括5×Denhardt’s试剂、0.5-1.0%SDS、100μg/ml片段化的变性鲑精DNA、0.5%焦磷酸钠。

为了定义严格性水平，可以参考Sambrook等(2001)的《分子克隆：实验室手册》，第三版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约，或者Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons,N.Y.(1989及年度更新资料)。

剪接变体

本文所用的术语“剪接变体”包括这样的核酸序列变体，其中选择的内含子和/或外显子已被切除、替换、置换或添加，或者其中内含子已被缩短或增长。这样的变体基本上保持了蛋白质的生物活性；这可以通过选择性地保留蛋白质的功能性区段来实现。这样的剪接变体可以是天然的或人工的。预测和分离这类剪接变体的方法是本领域众所周知的(参见例如Foissac和Schiex(2005)BMC Bioinformatics6:25)。

等位基因变体

等位基因或等位基因变体为处于相同的染色体位置上的给定基因的可选形式。等位基因变体包括单核苷酸多态性(SNP)，以及小的插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。SNP和INDEL在大多数生物体的天然存在的多态性品系中形成最大的一组序列变体。

内源基因

本文述及的“内源”基因不仅指见于植物之中的天然形式的所讨论基因(即未经人为干预)，而且指随后(重新)引入到植物中的分离形式的相同基因(或基本上同源的核酸/基因)(转基因)。例如，含有这样的转基因的转基因植物可以发生转基因表达的大幅下降和/或内源基因表达的大幅下降。分离的基因可以从生物体中分离，或者可以是人工例如通过化学合成制备的。

基因改组/定向进化

基因改组或定向进化为重复DNA改组，继之适当筛选和/或选择，以产生编码具有修饰生物活性的蛋白质的核酸变体或其部分(Castle等(2004)Science304(5674):1151-4;美国专利5,811,238和6,395,547)。

构建体

另外的调控元件可以包括转录和翻译的增强子。本领域技术人员会知道适合用于进行本发明的终止子和增强子的序列。如“定义”部分所说明的那样，也可以向5’非翻译区(UTR)或在编码序列中加入内含子序列，来增加在胞质中累积的成熟信使的量。其他控制序列（除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区域之外）可以是蛋白质和/或RNA稳定元件。这类序列为本领域技术人员公知或者可以容易地获得。

本发明的遗传构建体可以还包括对于在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制起点序列。一个实例是需要将遗传构建体作为附加型遗传元件(如质粒或粘粒分子)在细菌细胞中维持的情况。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。

为检测本发明方法中所用核酸序列的成功转移和/或选择含有这些核酸的转基因植物，有利的是使用标记基因(或报告基因)。因此，遗传构建体可以任选地含有可选择标记基因。可选择标记在本文“定义”部分有更详细的说明。标记基因一旦不再需要，可以从转基因细胞中除去或切除之。进行标记去除的技术在本领域公知，有用的技术在上文“定义”部分有说明。

调控元件/控制序列/启动子

术语“调控元件”、“控制序列”和“启动子”在文中均可互换使用，按广义来理解，指能够实现与之相连的序列表达的调控核酸序列。术语“启动子”通常是指位于基因转录起点上游的核酸控制序列，其参与RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合，由此指导有效连接的核酸进行转录。上述术语包括源自经典真核生物基因组基因的转录调控序列(包括精确转录起始所必需的TATA盒，以及具有或没有CCAAT盒序列)，以及另外的调控元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)，它们通过应答发育刺激和/或外部刺激或以组织特异的方式改变基因表达。所述术语还包括经典原核生物基因的转录调控序列，在此情况下其可以包括-35盒序列和/或-10盒转录调控序列。术语“调控元件”也包括合成的融合分子或衍生物，其赋予、激活或增强细胞、组织或器官中核酸分子的表达。

“植物启动子”包含能够介导编码序列区段在植物细胞中表达的调控元件。从而，植物启动子无需为植物来源的，而是可以来源于病毒或微生物，例如，来源于攻击植物细胞的病毒。“植物启动子”也可以来源于植物细胞，例如，来源于待被欲在本发明方法中表达的以及本文所述的核酸序列转化的植物。这对于其他“植物”调控信号同样适用，例如“植物”终止子的情况。位于可用于本发明方法的核苷酸序列上游的启动子可以通过一个或多个核苷酸取代、插入和/或缺失进行修饰，而不会干扰启动子、开放读框(ORF)或者3’调控区如终止子或远离ORF的其他3’调控区的功能或活性。此外还有可能通过修饰启动子的序列而增强其活性，或者将其完全替换为活性更强的启动子、甚至是来自异源生物体的启动子。为在植物中表达，核酸分子必须如上文所述的那样，有效连接于或者包含适宜的启动子，其中所述启动子将在正确的时间点以所需的空间表达模式表达所述基因。

为鉴定功能上等同的启动子，可以例如通过将启动子与报告基因有效连接、测定所述报告基因在植物多种组织中的表达水平和模式，来分析候选启动子的启动子强度和/或表达模式。众所周知的适宜报告基因包括例如β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶。通过测量β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性可以确定启动子活性。然后可以将该启动子强度和/或表达模式与参照启动子(如本发明方法中所用的启动子)相比较。可选地，可以利用本领域公知的方法，如Northern印迹(RNA分析)结合放射自显影图的光密度测量分析、定量实时PCR或RT-PCR(Heid等,1996Genome Methods6:986-994)，通过定量mRNA水平或者将本发明方法所用核酸的mRNA水平与持家基因如18S rRNA的mRNA水平进行比较，来测定启动子强度。通常，“弱启动子”旨在表示驱动编码序列低水平表达的启动子。“低水平”旨在表示每个细胞大约1/10,000个转录物到大约1/100,000个转录物、到大约1/500,0000个转录物的水平。相反，“强启动子”驱动编码序列高水平表达，或者说以每个细胞大约1/10个转录物到大约1/100个转录物、到大约1/1000个转录物的水平表达。通常，“中等强度启动子”旨在表示驱动编码序列以低于强启动子的水平表达的启动子，特别地该水平在所有情况下均低于在35S CaMV启动子控制下获得的水平。

有效连接

本文所用的术语“有效连接”是指启动子序列和目的基因之间的功能性连接，从而启动子序列能够起始目的基因的转录。

组成型启动子

“组成型启动子”是指在生长和发育的大多数但不必是所有阶段，并且在大多数环境条件下在至少一种细胞、组织或器官中转录激活的启动子。下表2a给出了组成型启动子的实例。

表2a：组成型启动子的实例

遍在启动子

遍在启动子基本上在生物体的所有组织或细胞中都有活性。

发育调控型启动子

发育调控型启动子在某些发育阶段或在经历发育改变的植物部分中有活性。

诱导型启动子

诱导型启动子将响应于化学(有关综述请参见Gatz1997,Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.,48:89-108)、环境或物理刺激而具有诱导的或增加的转录起始；或者可以是“胁迫诱导型”，即在植物接触各种胁迫条件时激活；或者是“病原体诱导型”，即在植物接触各种病原体时激活。

器官特异性/组织特异性启动子

器官特异性或组织特异性的启动子是能够在某些器官或组织，如在叶、根、种子等组织中优先起始转录的启动子。例如，“根特异性启动子”是主要在植物根中转录激活的启动子，基本上排除了在任何其他植物部分的激活，但仍允许在这些其他植物部分中的任何渗漏表达。能够仅在某些细胞中起始转录的启动子在文中称为“细胞特异性”启动子。

根特异性启动子的实例列于下表2b。

表2b：根特异性启动子的实例

种子特异性启动子主要在种子组织中，但不必仅在种子组织中(渗漏表达的情况下)，具有转录活性。种子特异性启动子可以在种子发育和/或萌发期间具有活性。种子特异性启动子可以是胚乳/糊粉层/胚特异性的。种子特异性启动子（胚乳/糊粉层/胚特异性的）的实例列于下表2c至表2f中。种子特异性启动子的更多实例在Qing Qu和Takaiwa(PlantBiotechnol.J.2,113-125,2004)中给出，其公开内容作为参考并入本文，如同充分阐述的那样。

表2c：种子特异性启动子的实例

表2d:胚乳特异性启动子的实例

表2e:胚特异性启动子的实例

基因来源	参考文献
		稻OSH1	Sato等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:8117-8122,1996
KNOX	Postma-Haarsma等,PlantMol.Biol.39:257-71,1999
		PRO0151	WO2004/070039
PRO0175	WO2004/070039
		PRO005	WO2004/070039
PRO0095	WO2004/070039

表2f:糊粉特异性启动子的实例

如文中所定义的绿色组织特异性启动子是主要在绿色组织中，基本上排除在任何其它植物部分中，具有转录活性的启动子，但仍允许在这些其它植物部分中的任何渗漏表达。

可以用来实施本发明方法的绿色组织特异性启动子的实例示于下表2g。

表2g：绿色组织特异性启动子的实例

组织特异性启动子的另一实例是分生组织特异性启动子，其主要在分生组织中，基本上排除在任何其它植物部分中，具有转录活性，但仍允许在这些其它植物部分的任何渗漏表达。可以用来实施本发明方法的绿色分生组织特异性启动子的实例示于下表2h。

表2h：分生组织特异性启动子的实例

终止子

术语“终止子”包括这样的控制序列，其为位于转录单位末端的DNA序列，发送初级转录物进行3’加工和多聚腺苷酸化以及终止转录的信号。终止子可以源自天然基因、多种其它植物基因、或T-DNA。例如，待加入的终止子可以源自胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因、或可选地源自其它植物基因、或次优选地源自任何其它真核基因。

可选择标记(基因)/报告基因

“可选择标记”、“可选择标记基因”或“报告基因”包括赋予细胞表型的任何基因，其中该表型在细胞中的表达有利于鉴定和/或选择经本发明的核酸构建体转染或转化的细胞。这些标记基因通过一系列不同的原理使得能够鉴定核酸分子的成功转移。适宜的标记可以选自赋予抗生素或除草剂抗性、引入新的代谢性状或允许可视选择的标记。可选择标记基因的实例包括赋予抗生素抗性的基因（例如磷酸化新霉素和卡那霉素的nptII，或磷酸化潮霉素的hpt，或赋予抗例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(G418)、壮观霉素或杀稻瘟素抗性的基因）、赋予除草剂抗性的基因（例如提供抗

抗性的bar；提供抗草甘膦抗性的aroA或gox，或赋予抗例如咪唑啉酮、膦丝菌素或磺胺脲抗性的基因）、或者提供代谢性状的基因（如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA，或有关木糖利用的木糖异构酶，或抗营养标记如对2-脱氧葡萄糖的抗性）。可视标记基因的表达导致形成颜色（例如β-葡糖醛酸糖苷酶GUS，或β-半乳糖苷酶及其有色底物，例如X-Gal）、发光（如萤光素/萤光素酶系统）或荧光（绿色荧光蛋白GFP及其衍生物）。这仅仅是一小部分可能标记的名单。技术人员熟悉此类标记。取决于生物体和选择方法，优选不同的标记。

已知对于核酸在植物细胞中的稳定或瞬时整合，取决于所用的表达载体和所用的转染技术，仅少数细胞可以摄入该外来DNA，以及，如果期望的话，整合进其基因组。为鉴定并选择这些整合体，通常将编码可选择标记(例如上文所述的那些)的基因与目的基因一起引入宿主细胞中。这些标记能够在例如突变体中使用，所述突变体中原有的这些基因例如通过常规方法缺失而没有功能。此外，编码可选择标记的核酸分子可与编码本发明多肽的或用于本发明方法的序列包含在同一个载体中，或者在分开的载体中引入宿主细胞。已经稳定转染了所引入的核酸的细胞可以例如通过选择(例如，整合有可选择标记的细胞存活而其它细胞死去)予以鉴定。

由于一旦成功引入了核酸后将不再需要或不期望转基因宿主细胞中存在标记基因，特别是抗生素和除草剂抗性基因，所以根据本发明用于引入核酸的方法最好采用能够除去或切除这些标记基因的技术。一种这样的方法是称为共转化的方法。共转化法采用两个载体同时进行转化，一个载体携带根据本发明的核酸，而第二个携带标记基因。很大比例的转化体接收，或者在植物的情况下含有(高达40%或以上的转化体)，两个载体。对于农杆菌转化，转化体通常只接收载体的一部分，即被T-DNA侧翼包围的序列，其通常是表达盒。随后可通过杂交从转化植物中除去标记基因。在另一种方法中，利用整合在转座子中的标记基因与期望的核酸一起进行转化(称为Ac/Ds技术)。转化体可与转座酶来源杂交，或者用赋予转座酶表达的核酸构建体来瞬时或稳定转化转化体。在有些情况下(约10%)，一旦成功进行了转化，转座子会跳离宿主细胞基因组并丢失。在另外一些情况下，转座子会跳至不同的位置。在这些情况下，必须通过杂交以消除标记基因。在微生物学领域，已经研发了使得可以或便于检测此类事件的技术。另一有利的方法有赖于所谓的重组系统；其优势在于可以免除杂交消除。最著名的这类系统是称为Cre/lox系统的系统。Cre1为重组酶，其切除位于loxP序列之间的序列。如果标记基因整合在loxP序列之间，一旦转化成功后，其会因Cre1重组酶的表达而得以切除。其它重组系统有HIN/HIX、FLP/FRT和REP/STB系统(Tribble等,J.Biol.Chem.,275,2000:22255-22267;Velmurugan等,J.Cell Biol.,149,2000:553-566)。根据本发明的核酸序列可以位点特异性地整合进植物基因组。这些方法自然也可以应用于微生物如酵母、真菌或细菌。

转基因的/转基因/重组

出于本发明的目的，就例如本发明的核酸序列、含有所述核酸序列的表达盒、基因构建体或载体、或用所述核酸序列、表达盒或载体转化的生物体而言，“转基因的”、“转基因”或“重组”是指所有这些构建体通过重组方法产生，其中：

(a)编码可用于本发明方法的蛋白质的核酸序列，或

(b)有效连接于本发明核酸序列的遗传控制序列，例如启动子，或

(c)(a)和(b)

不存在于其天然遗传环境中，或者已通过重组方法修饰，该修饰可以采取的形式为例如一个或多个核苷酸残基的取代、添加、缺失、倒位或插入。天然遗传环境应理解为指在原始植物中天然的基因组或染色体座位或者存在于基因组文库之中。在基因组文库的情况下，优选保持、至少是部分地保持核酸序列的天然遗传环境。该环境至少位于核酸序列的一侧，长度至少为50bp、优选至少500bp、特别优选至少1000bp、最优选至少5000bp。当天然存在的表达盒——例如编码可用于本发明方法的多肽的相应核酸序列与该核酸序列的天然启动子之间的天然组合——经非天然的合成（“人工”）方法例如诱变处理而被修饰时，此表达盒变成转基因表达盒。合适的方法描述在例如，US5,565,350或WO00/15815中。

因此，如上文所述，用于本发明目的的转基因植物应理解为指：在所述植物的基因组中，本发明方法中所用的核酸不存在于所述植物的基因组上，或不源于所述植物的基因组，或存在于所述植物的基因组上但不位于所述植物的基因组中的天然基因座上，其中所述核酸可以进行同源或异源表达。不过，正如所提到的那样，转基因也表示：尽管在植物基因组中根据本发明的或本发明方法中所用的核酸在其天然位置上，但是所述序列已相对于天然序列而被修饰，和/或天然序列的调控序列已被修饰。转基因优选理解为表示：根据本发明的核酸在基因组中非天然的座位上表达，即同源表达，或者优选发生核酸的异源表达。优选的转基因植物在文中述及。

应进一步指出，在本发明的上下文中，术语“分离的核酸”或“分离的多肽”在一些情况下可以分别被视为“重组核酸”或“重组多肽”的同义词，指不位于其天然遗传环境中和/或已通过重组方法修饰的核酸或多肽。

调节

与表达或基因表达相关联时，术语“调节”是指与对照植物相比，所述基因表达的表达水平被改变的过程，所述表达水平可以增加或降低。原始未调节的表达可以是结构RNA（rRNA、tRNA）或随后进行翻译的mRNA的任何类型的表达。出于本发明的目的，原始未调节的表达还可以是不存在任何表达。术语“调节活性”应理解为指，可以导致植物的产量增加和/或生长增加的本发明核酸序列或编码蛋白质的任何表达改变。表达可以从零（不存在或不可测量的表达）增加到一定量，或可以从一定量降低到不可测量的小量或零。

表达

术语“表达”或“基因表达”是指特定基因或特定基因构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”特别地是指基因(一个或多个)或基因构建体至结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA的转录，有或无后者至蛋白质的随后翻译。该过程包括DNA的转录和所获得的mRNA产物的加工。

增加的表达/过表达

如本文所用的术语“增加的表达”或“过表达”表示超出原始野生型表达水平的任何形式的表达。出于本发明的目的，原始野生型表达水平也可以是零，即不存在表达或不可测量的表达。

增加基因或基因产物表达的方法在本领域有充分的文献记载，且包括，例如由适当的启动子驱动的过表达、转录增强子或翻译增强子的使用。可以将用作启动子或增强子元件的分离的核酸引入非异源形式的多核苷酸的适当位置(一般是上游)，从而上调编码目的多肽的核酸序列的表达。例如，可以通过突变、缺失和/或取代，在体内改变内源启动子(见Kmiec,US5,565,350;Zarling等,WO9322443)，或者可以将分离的启动子在相对于本发明基因的适当方向和距离引入植物细胞中，从而控制基因的表达。

如果期望多肽表达，通常期望在多核苷酸编码区的3’末端纳入多聚腺苷酸化区域。多聚腺苷酸化区域可以源自天然基因、多种其它植物基因或T-DNA。例如，待加入的3’末端序列可以源自胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因、或可选地源自其他植物基因、或次优选地源自任何其它真核基因。

也可以在5’非翻译区(UTR)或部分编码序列的编码序列中加入内含子序列，来增加在胞质中累积的成熟信使的量。已显示，在植物和动物表达构建体的转录单位中纳入可剪接内含子，可以在mRNA和蛋白质水平使基因表达增加高达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8:4395-4405;Callis等(1987)Genes Dev.1:1183-1200)。通常内含子放置在转录单位5’末端附近时，增强基因表达的作用最大。玉蜀黍内含子Adh1-S内含子1、2和6，Bronze-1内含子的使用是本领域公知的。一般信息请参见The Maize Handbook,第116章,Freeling和Walbot编辑,Springer,N.Y.(1994)。

降低的表达

本文述及“降低的表达”或者表达“减小或基本上消除”应理解为表示，内源基因表达和/或多肽水平和/或多肽活性相对于对照植物降低。所述减小或基本上消除按照递增的优选顺序为，与对照植物相比，减小至少10%、20%、30%、40%或50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%、96%、97%、98%、99%或更多。

为减小或基本上消除植物中内源基因的表达，需要一段足够长度的、基本上连续核苷酸的核酸序列。为进行基因沉默，这可以少至20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10或更少的核苷酸，可选地，这可以多至完整的基因(包括部分或完整的5’和/或3’UTR)。此基本上连续的核苷酸链可以源自编码目的蛋白质的核酸(靶基因)，或者源自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸。优选地，基本上连续的核苷酸链能够与靶基因(有义链或反义链)形成氢键，更优选地，基本上连续的核苷酸链按照递增的优选顺序与靶基因(有义链或反义链)50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%序列相同。对于本文所讨论的用于减小或基本上消除内源基因表达的各种方法而言，编码(功能性)多肽的核酸序列并非必需的。

减小或基本上消除表达可以利用常规工具和技术来实现。减小或基本上消除内源基因表达的一个优选方法是通过向植物中引入和表达基因构建体，其中，核酸(在此情况中，源自目的基因、或者源自能够编码任一目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸的、一段基本上连续核苷酸的链)以被间隔子(非编码DNA)分隔开的、(部分或完全地)反向重复的形式克隆在该构建体中。

在这样的优选方法中，利用核酸或其部分(在此情况中，源自目的基因、或者源自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸的、一段基本上连续核苷酸的链)的反向重复(优选能够形成发夹结构)，通过RNA介导的沉默，实现减小或基本上消除内源基因的表达。将该反向重复序列克隆进包含控制序列的表达载体中。非编码DNA核酸序列(间隔子，例如基质附着区片段(MAR)、内含子、多接头等)位于形成该反向重复的两个反向核酸之间。该反向重复序列转录后，形成具有（部分或完全）自我互补结构的嵌合RNA。该双链RNA结构称为发夹RNA(hpRNA)。hpRNA被植物加工成可以整合入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中的siRNA。RISC进而切割mRNA转录物，从而显著减少待翻译成多肽的mRNA转录物的数量。关于其它一般细节，参见例如Grierson等(1998)WO98/53083;Waterhouse等(1999)WO99/53050)。

本发明的方法的实施不依赖于向植物中引入和表达其中以反向重复形式克隆了核酸分子的基因构建体，而是可以使用几种公知的“基因沉默”法中的任一个或多个来实现相同的效应。

用于减小内源基因表达的一个这样的方法是RNA介导的基因表达的沉默(下调)。在该情况下沉默在植物中由双链RNA序列(dsRNA)触发，所述双链RNA序列基本上与靶内源基因相似。该dsRNA被植物进一步加工成称为短干扰RNA(siRNA)的大约20至大约26个核苷酸。siRNA整合入RNA诱导的沉默复合物(RISC)，该复合物切割内源靶基因的mRNA转录物，从而实质性减少待翻译成多肽的mRNA转录物的数量。优选，双链RNA序列相应于靶基因。

RNA沉默法的另一实例包括以有义取向，向植物中引入核酸序列或其部分(在这种情况下，源自目的基因、或者源自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸的、一段基本上连续核苷酸的链)。“有义取向”是指与其mRNA转录物同源的DNA序列。从而至少一个拷贝的核酸序列被引入植物。该额外的核酸序列将减小内源基因的表达，从而产生称为共抑制的现象。如果将几个额外拷贝的核酸序列引入植物，则基因表达的减小将更明显，因为在高转录水平与共抑制的触发之间存在正相关。

RNA沉默法的另一实例包括使用反义核酸序列。“反义”核酸序列包含这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列与编码蛋白质的“有义”核酸序列互补，即与双链cDNA分子的编码链互补或与mRNA转录物序列互补。反义核酸序列优选与待沉默的内源基因互补。互补性可位于基因的“编码区”和/或“非编码区”中。术语“编码区”是指包含将翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列的区域。术语“非编码区”是指连接在编码区侧翼的5'和3'序列，其可被转录但不被翻译成氨基酸(也称为5'和3'非翻译区)。

可根据沃尔森和克里克碱基配对法则设计反义核酸序列。反义核酸序列可与整个核酸序列（在这种情况下，源自目的基因、或者源自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸的、一段基本上连续核苷酸的链）互补，但也可以是仅对核酸序列的部分(包括mRNA5’和3’UTR)反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸序列可与围绕编码多肽的mRNA转录物的翻译起始位点的区域互补。适宜的反义寡核苷酸序列的长度在本领域内是已知的并且可以开始于长大约50、45、40、35、30、25、20、15或10个核苷酸或更少。可使用本领域内已知的方法，使用化学合成和酶促连接反应，构建根据本发明的反义核酸序列。例如，反义核酸序列（例如，反义寡核苷酸序列）可使用天然存在的核苷酸或各种修饰核苷酸来化学合成，所述修饰核苷酸经设计用以增加分子的生物学稳定性或增加反义与有义核酸序列之间形成的双链体的物理稳定性，例如可使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于产生反义核酸序列的修饰核苷酸的实例在本领域是公知的。已知的核苷酸修饰包括甲基化、环化和“加帽”和用类似物例如肌苷对一个或多个天然存在的核苷酸的取代。核苷酸的其它修饰在本领域是公知的。

可使用已将核酸序列以反义取向（即，从插入的核酸转录的RNA针对目的靶核酸是反义取向）亚克隆入其中的表达载体，生物学地产生反义核酸序列。优选，植物中，通过稳定地整合的包含启动子、有效连接的反义寡核苷酸和终止子的核酸构建体，产生反义核酸序列。

用于在本发明的方法中进行沉默的核酸分子（无论引入植物的还是原位产生的）与编码多肽的mRNA转录物和/或基因组DNA杂交或结合，从而例如通过抑制转录和/或翻译来抑制蛋白质的表达。杂交可通过常规核苷酸互补性以形成稳定的双链体或者，例如在结合DNA双链体的反义核酸序列的情况下，通过双螺旋的大沟中的特定相互作用而产生。可通过转化或在特定组织位置直接注射，将反义核酸序列引入植物。可选地，可修饰反义核酸序列以靶向选择的细胞，然后全身性施用。例如，为了进行全身性施用，可以修饰反义核酸序列，以便其特异性结合选择的细胞表面上表达的受体或抗原（例如，通过将反义核酸序列连接到结合细胞表面受体或抗原的肽或抗体）。还可使用本文中描述的载体将反义核酸序列递送至细胞。

根据另一个方面，反义核酸序列是α-异头物核酸序列。α-异头物核酸序列与互补RNA形成特定的双链杂交体，其中与常见的b单元（b-units）不同，链走向彼此平行(Gaultier等(1987)Nucl Ac Res15:6625-6641)。反义核酸序列还可包含2'-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)NuclAc Res15,6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等(1987)FEBSLett.215,327-330)。

还可使用核酶减少或基本上消除内源基因的表达。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，该分子能够切割与其具有互补区的单链核酸序列例如mRNA。因此，核酶(例如，锤头核酶(Haselhoff和Gerlach(1988)Nature334,585-591)中描述的)可用于催化切割编码多肽的mRNA转录物，从而显著减少待翻译成多肽的mRNA的数量。可设计具有对于核酸序列的特异性的核酶(参见例如:Cech等美国专利号4,987,071;和Cech等美国专利号5,116,742)。可选择地，可以使用相应于核酸序列的mRNA转录物，从RNA分子库中选择具有特定核糖核酸酶活性的催化性RNA(Bartel和Szostak(1993)Science261,1411-1418)。核酶用于在植物中进行基因沉默的用途在本领域是已知的(例如,Atkins等(1994)WO94/00012;Lenne等(1995)WO95/03404;Lutziger等(2000)WO00/00619;Prinsen等(1997)WO97/13865和Scott等(1997)WO97/38116)。

基因沉默还可以通过插入诱变(例如，T-DNA插入或转座子插入)或通过Angell和Baulcombe((1999)Plant J20(3):357-62)、(AmpliconVIGS WO98/36083)或Baulcombe(WO99/15682)等所述的策略来实现。

如果在内源基因上存在突变和/或在随后引入植物的分离基因/核酸上存在突变，那么基因沉默也可发生。减少或基本上消除可通过非功能性多肽引起。例如，多肽可能结合多种相互作用的蛋白质；因此，可以通过一个或多个突变和/或截短，提供仍然能够结合相互作用的蛋白质（例如受体蛋白）但不能展示其正常功能（例如信号转导配体）的多肽。

进行基因沉默的另一个方法是通过用与基因的调控区（例如启动子和/或增强子）互补的核酸序列来打靶以形成三螺旋结构，所述结构阻止基因在靶细胞中的转录。参见Helene,C.,Anticancer Drug Res.6,569-84,1991;Helene等,Ann.N.Y.Acad.Sci.660,27-361992;和Maher,L.J.Bioassays14,807-15,1992。

其它方法，例如应用针对内源多肽的抗体在植物原位(in planta)抑制其功能、或干扰多肽所参与的信号传递通路，对于技术人员是公知的。特别地，可预期人造分子可用于抑制靶多肽的生物功能，或用于干扰其中靶多肽参与的信号转导途径。

可选择地，可设置筛选程序以鉴定植物群体中基因的天然变体，该变体编码具有减少的活性的多肽。这样的天然变体也可用于例如进行同源重组。

人工和/或天然微小RNA(miRNA)可以用来敲除基因表达和/或mRNA翻译。内源miRNA为单链小RNA，一般长度19-24个核苷酸。它们主要用于调控基因表达和/或mRNA翻译。大多数植物microRNA(miRNA)具有与其靶序列完全或几乎完全的互补性。然而，存在具有达到5个错配的天然靶。miRNA利用Dicer家族的双链特异性RNA酶从具有特征性折回结构的更长的非编码RNA加工而来。一旦加工后，它们通过结合RNA诱导的沉默复合物(RISC)的主要成分Argonaute蛋白，而掺入到RNA诱导沉默复合物中。miRNA充当RISC的特异性组件，因为它们与细胞质中的靶核酸（大多数为mRNA）碱基配对。随后的调控事件包括靶mRNA切割和破坏和/或翻译抑制。因此，miRNA过表达的效应常反映为靶基因的降低的mRNA水平。

人工微小RNA(amiRNA)一般长度21个核苷酸，可以特异地遗传改造以负调控单个或多个目的基因的基因表达。植物微小RNA靶标选择的决定因素在本领域公知。已经定义了靶标识别的经验参数，并且可用来辅助设计特异性amiRNA(Schwab等,(2005)Dev Cell8:517-527,2005)。设计和生成amiRNA及其前体的便利工具也是公众可获得的(Schwab等,(2006)Plant Cell18(5):1121-1133,2006)。

为优化性能，用来减小植物中内源基因表达的基因沉默技术需要应用来自单子叶植物的核酸序列转化单子叶植物，而使用来自双子叶植物的核酸序列转化双子叶植物。优选，将来自任何给定植物物种的核酸序列引入到相同物种中。例如，来自稻的核酸序列转化到稻植物中。然而，待引入的核酸序列来源于与其待引入的植物相同的植物物种并非是绝对必需的。内源靶基因与待引入的核酸之间基本上同源就足够了。

上文描述了减小或基本上消除植物中内源基因表达的多种方法的实例。本领域技术人员将能够容易地调整上述沉默方法，以便例如通过应用适当的启动子而实现内源基因在整株植物或其部分中的表达减小。

转化

本文述及的术语“引入”或“转化”包括将外源多核苷酸转移进宿主细胞，不考虑转移所用的方法。能够随后通过器官发生或者胚胎发生进行克隆增殖的植物组织都可以使用本发明的遗传构建体转化，并从其再生整个植物。具体的组织选择将因可用于和最适于待转化的具体物种的克隆增殖系统而变。示例性的组织靶标包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、雌配子、愈伤组织、既有的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)，以及诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。可以将多核苷酸瞬时地或稳定地引入宿主细胞，并且可以，例如作为质粒以非整合的状态维持。可选地，其可以整合进入宿主基因组。得到的转化植物细胞可以接着以本领域技术人员已知的方式再生为转化的植物。

外来基因转移进入植物基因组中称为转化。植物物种的转化目前是一种相当常规的技术。有利地，可以使用若干转化方法的任一种向适当的祖先细胞引入目的基因。可以利用公开的转化方法以及由植物组织或植物细胞再生植物的方法来进行瞬时或稳定转化。转化方法包括应用脂质体、电穿孔、增加游离DNA摄取的化学物质、直接向植物注射DNA、粒子枪轰击、用病毒或花粉转化和微粒轰击。方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens,F.A.等,(1882)Nature296,72-74;Negrutiu I.等,(1987)Plant Mol.Biol.8:363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等,(1985)Bio/Technol3,1099-1102)；植物材料的显微注射(Crossway A.等,(1986)Mol.Gen Genet202:179-185)；DNA或RNA包被的粒子轰击(Klein T.M.等,(1987)Nature327:70)；用(非整合型)病毒感染，等等。优选通过农杆菌介导的转化，产生转基因植物，包括转基因作物植物。有利的转化法是植物原位转化。为此，可以例如使农杆菌作用于植物种子，或用农杆菌接种植物分生组织。已经证明，根据本发明尤为有利的是使转化的农杆菌悬液作用于完整植株或至少花原基。随后培养植物，直至获得所处理植物的种子(Clough和Bent,Plant J.(1998)16,735–743)。农杆菌介导的稻转化方法包括公知的稻转化方法，例如在任一如下文献中描述的那些：欧洲专利申请EP1198985A1，Aldemita和Hodges(Planta,199:612-617,1996);Chan等(Plant Mol.Biol.22(3)491-506,1993),Hiei等(Plant J.6(2):271-282,1994)，其公开内容并入本文作为参考，如同充分阐述的那样。至于玉米转化，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol.14(6):745-50,1996)或Frame等(Plant Physiol.129(1):13-22,2002)中所述，其公开内容并入本文作为参考，如同充分阐述的那样。作为举例说明，所述方法还由B.Jenes等,Techniques for GeneTransfer,在Transgenic Plants,卷1,Engineering and Utilization,编辑S.D.Kung和R.Wu,Academic Press(1993)128-143以及Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中进一步描述。优选将待表达的核酸或构建体克隆到载体中，所述载体适用于转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，例如pBin19(Bevan等,Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。然后以已知的方式利用由这样的载体转化的农杆菌来转化植物，例如模式植物，像拟南芥属植物(拟南芥(Arabidopsis thaliana)在本发明范围内不视为作物植物)；或者作物植物，例如烟草植物，例如通过将擦伤的叶子或切碎的叶子浸在农杆菌溶液中，然后在合适的培养基中培养之。通过根癌农杆菌的植物转化由例如，和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16,9877中描述，或者尤其可以参见F.F.White,Vectors for Gene Transfer in Higher Plants在Transgenic Plants,卷1,Engineering and Utilization,编辑S.D.Kung和R.Wu,Academic Press,1993,第15-38页。

除了转化体细胞（其之后不得不再生为完整植株），还可以转化植物分生组织的细胞，特别是可以发育成配子的那些细胞。在这种情况下，转化的配子循着天然植物的发育而产生转基因植物。因此，例如，用农杆菌处理拟南芥的种子，并从发育中的植物获得种子，其中一定比例的植物被转化因而是转基因的[Feldman,KA和Marks MD(1987).MolGen Genet208:1-9;Feldmann K(1992).在C Koncz,N-H Chua和J Shell编辑Methods in Arabidopsis Research.Word Scientific,Singapore,第274-289页]。可选的方法基于花序的反复去除以及莲座中心切割部位与转化农杆菌一起进行的孵育，由此在随后的时间点同样能够获得转化的种子(Chang(1994).Plant J.5:551-558;Katavic(1994).Mol Gen Genet,245:363-370)。然而，特别有效的方法是改良的真空浸润法，如“浸花法”(floral dip)。对于拟南芥的真空浸润，减压下用农杆菌悬液处理完整植株[Bechthold,N(1993).C R Acad Sci Paris Life Sci,316:1194-1199]，而对于“浸花法”，将发育中的花组织与表面活性剂处理的农杆菌悬液短暂孵育[Clough,SJ和Bent,AF(1998).The Plant J.16,735-743]。在两种情况下均收获一定比例的转基因种子，且可通过在上述选择性条件下培养而将这些种子与非转基因种子区分开来。另外，质体的稳定转化是有利的，因为质体在多数作物中为母系遗传，从而降低或消除了转基因通过花粉流失的风险。叶绿体基因组的转化通常通过Klaus等,2004[NatureBiotechnology22(2),225-229]系统展示的方法实现。简言之，将待转化的序列与可选择的标记基因一起克隆到同源于叶绿体基因组的侧翼序列之间。这些同源侧翼序列指导转基因位点特异性整合到质体基因组中。质体转化已在许多不同的植物物种中描述，且综述由Bock(2001)Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology.J Mol Biol.2001年9月21日;312(3):425-38或Maliga,P(2003)Progress towardscommercialization of plastid transformation technology.Trends Biotechnol.21,20-28给出。最近报道了其它生物技术进步，无标记的质体转化体，这可通过瞬时共整合的标记基因产生(Klaus等,2004,NatureBiotechnology22(2),225-229)。

遗传修饰的植物细胞能够通过技术人员熟悉的所有方法再生。合适的方法可见于上述S.D.Kung和R.Wu、Potrykus或者

和Willmitzer的出版物。

通常在转化以后，选出存在一个或多个标记的植物细胞或细胞群，所述标记由与目的基因共转移的植物可表达基因编码，接着使转化的材料再生成整个植物。为选择转化的植物，通常将在转化中获得的植物材料置于选择性条件下，从而可将转化的植物与未转化的植物区分开来。例如，可以种植以上述方式获得的种子，并在最初的生长期之后，通过喷雾对其进行合适的选择。另一可能性方案是在使用合适的选择剂的琼脂板上生长种子（酌情在灭菌后），从而仅转化的种子能够长成植物。可选地，针对可选择标记例如上文所述标记的存在，筛选转化的植物。

DNA转移和再生之后，还可例如用Southern分析(DNA印迹)，评价推定转化的植物，评价目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造。可选的或额外地，可用Northern和/或Western分析(蛋白质印迹)监测新引入的DNA的表达水平，这两种技术都是本领域普通技术人员所公知的。

产生的转化植物可以通过多种方式繁殖，如通过克隆繁殖或经典的育种技术。例如，第一代(或T1)转化的植物可自交，选择纯合的第二代(或T2)转化体，而T2植物可进一步通过经典育种技术繁殖。产生的转化生物体可以呈多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆的转化体(例如所有细胞已转化而含有表达盒)；转化的和非转化的组织的嫁接体(例如在植物中，转化的砧木嫁接到非转化的接穗上)。

T-DNA激活标签

T-DNA激活标签（Hayashi等Science（1992）1350-1353）包括将通常含有启动子（也可以是翻译增强子或内含子）的T-DNA插入在目的基因的基因组区或基因编码区上游或下游10kb处，从而在构型上使启动子能够指导靶向基因的表达。通常天然启动子对靶向基因表达的调控被破坏，基因由新引入的启动子控制。启动子一般包含于T-DNA中。可以例如，通过农杆菌感染将此T-DNA随机插入植物基因组中，并导致插入T-DNA附近的基因的表达被修饰。得到的转基因植物将由于紧靠引入的启动子的基因的修饰表达而表现出显性表型。

TILLING

术语“TILLING”为“靶向诱导的基因组局部损伤”(Targeted InducedLocal Lesions In Genomes)的缩写，是一种用于生成和/或鉴定编码具有修饰的表达和/或活性的蛋白质的核酸的诱变技术。TILLING还允许选择携带此类突变变体的植物。这些突变变体可以在强度、位置或时间(例如，如果突变影响启动子的话)上呈现出修饰的表达。这些突变变体可以比其天然形式基因呈现更高的活性。TILLING将高密度诱变和高通量筛选方法结合在一起。TILLING一般遵循的步骤有：(a)EMS诱变(Redei GP和Koncz C,(1992)In Methods in Arabidopsis Research,Koncz C,Chua NH,Schell J编辑,新加坡,World Scientific Publishing Co,第16-82页;Feldmann等,(1994)In Meyerowitz EM,Somerville CR编辑,Arabidopsis.冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约,第137-172页;Lightner J和Caspar T,(1998)In J Martinez-Zapater,J Salinas编辑,Methods on MolecularBiology,82卷Humana Press,Totowa,NJ,第91-104页)；(b)DNA制备和个体合并；(c)目的区域的PCR扩增；(d)变性和退火以形成杂双链体；(e)DHPLC，其中合并物中存在的杂双链体在色谱图上检测为额外的峰；(f)突变个体的鉴定；和(g)突变PCR产物的测序。TILLING的方法是本领域公知的(McCallum等(2002)Nat Biotechnol18:455-457,由Stemple综述(2004)Nat Rev Genet5(2):145-50)。

同源重组

同源重组允许向基因组中的规定选定位置引入所选的核酸。同源重组是生物科学中常规用于低等生物体如酵母或剑叶藓（physcomitrella）的标准技术。在植物中进行同源重组的方法已经不仅在模式植物中描述(Offringa等(1990)EMBO J.9(10):3077-84)，而且也在作物植物，如稻中描述(Terada等(2002)Nat Biotech20(10):1030-4;Iida和Terada(2004)Curr Opin Biotechnol15(2):132-8)，并且存在无论靶生物种类的通常可应用的方法(Miller等,Nature Biotechnol.25,778-785,2007)。

产量相关性状

产量相关性状是与植物产量相关的性状或特性。产量相关性状可以包含下述非限制性特性列表中的一项或多项：早期开花时间、产量、生物量、种子产量、早期活力、绿度指数、增加的生长速率、改善的农艺性状，例如增加的耐淹性（这在稻中导致增加的产量）、改善的水利用效率（WUE）、改善的氮利用效率（NUE）等。

产量

术语“产量”通常表示具有经济价值的可测量产出，其典型地与规定的作物、面积和/或时期相关。各植物部分基于其数量、大小和/或重量对产量直接做出贡献，或者说真正的产量是每平方米作物的年产量，用总产量（包括收获的产量和估定的产量）除以种植的平方米来确定。

术语植物的“产量”和“植物产量”可互换使用，并且意指该植物的营养性生物量（如根和/或枝条生物量）、繁殖器官、和/或繁殖体（如种子）。

玉米的花是单性的；雄花序（雄穗）源于茎端，并且雌花序（雌穗）起于腋芽顶端。雌花序在中心轴（穗轴）的表面上产生成对的小穗状花序。雌小穗状花序各自包围两朵能育的小花，其中之一在受精后通常成熟为玉米粒。因此，玉米的产量增加可以表现为如下一个或多个方面：每平方米建植的植物数的增加、每株植物的雌穗数的增加、行数、行粒数、粒重、千粒重、雌穗长度/直径的增加、种子饱满率（其为饱满小花（即含有种子的小花）数除以小花总数并乘以100）的增加，等等。

稻植物中的花序被称为圆锥花序。圆锥花序具有小穗状花序，其为圆锥花序的基本单位，并且由花梗和小花组成。小花长在花梗上且包括由两个保护性颖片覆盖的花朵：较大的颖片（外稃）和较短的颖片（内稃）。因此，以稻为例，产量增加可以表现为如下一个或多个方面的增加：每平方米的植物数、每株植物的圆锥花序数、圆锥花序长度、每个圆锥花序的小穗状花序数、每个圆锥花序的花朵（或小花）数、种子饱满率（其为饱满小花（即含有种子的小花）数除以小花总数并乘以100）的增加；千粒重的增加，等等。

早期开花时间

如本文使用的具有“早期开花时间”的植物是比对照植物更早开始开花的植物。因此，这个术语指显示出较早的起始开花的植物。植物的开花时间可以通过计数在播种和第一个花序出现之间的天数（“到开花的时间”）进行评估。植物的“开花时间”可以例如使用如WO2007/093444中所述的方法进行测定。

早期活力

“早期活力”是指活跃健康充分均衡的生长（特别是在植物生长的早期阶段），其可以因植物健康(fitness)增强引起，例如，由于植物更好地适应其环境(即，优化能源资源的利用以及在枝条和根之间的分配)引起。具有早期活力的植物也显示出增加的幼苗存活和更佳的作物齐苗，这往往产生高均匀度的田地(作物以齐整的方式生长，即大多数植物基本上同时达到各发育阶段)，以及往往是更优更高的产量。因此，早期活力可以通过测量多种因素来确定，如千粒重、萌发率、出苗率、幼苗生长、幼苗高度、根长度、根和枝条生物量，等等。

增加的生长速率

增加的生长速率可以特异于植物的一个或多个部分(包括种子)，或者可以基本上遍及整株植物。具有增加生长速率的植物可以具有更短的生命周期。植物的生命周期可以理解为指，从成熟干种子生长至植物已经产生类似于起始材料的成熟干种子的阶段所需的时间。此生命周期可以受到诸如萌发速度、早期活力、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度等因素的影响。生长速率的增加可以发生在植物生命周期的一个或多个阶段，或者发生在基本上整个植物生命周期的过程中。在植物生命周期的早期阶段，生长速率的增加可以反映出增强的活力。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，使植物能够比原可能的情况更晚播种和/或更快收获(类似的效果可以通过较早的开花时间获得)。如果生长速率充分增加，可以允许再次播种同种植物物种的种子(例如完全在一个常规的生长期内，播种和收获稻类植物、接着再次播种和收获稻类植物)。与此类似，如果生长速率充分地增加，可以允许再播种不同植物物种的种子(例如播种和收获玉米植物，随后，例如，播种和任选的收获大豆、马铃薯或任何其它适宜的植物)。在一些作物植物的情况下也可能从同一砧木收获增加的次数。改变植物的收获周期可以导致每平方米年生物量产量的增加(这是由于(比方说在一年中)任何特定植物可以生长和收获的次数增加)。与野生型对应物相比，生长速率的增加还允许在更广阔的地域栽培转基因植物，这是因为种植作物的地域限制常由种植时(早季)或收获时(晚季)不利的环境条件所决定。如果缩短收获周期，就可以避免这类不利条件。可以通过自生长曲线获得多种参数，确定生长速率，这类参数可以是：T-Mid(植物达到其最大大小的50%所需的时间)和T-90(植物达到其最大大小的90%所需的时间)等等。

胁迫抗性

与对照植物相比，产量和/或生长速率的增加可以发生在植物处于非胁迫条件下时、或发生在植物暴露于不同的胁迫下时。植物通常通过更缓慢地生长来对暴露于胁迫作出反应。在重度的胁迫条件下，植物甚至可能完全停止生长。另一方面，轻度的胁迫在此处定义为植物暴露于该胁迫后、不导致植物停止生长和丧失重新生长的能力的任何胁迫。在本发明的意义上，轻度胁迫导致受胁迫的植物与在非胁迫条件下的对照植物相比，生长减少不足40%、35%、30%或25%，更优选不足20%或15%。由于农业实践（灌溉、施肥、农药处理）的进步，在栽培的作物植物中通常不会遇到重度胁迫。因此，由轻度胁迫诱导的减弱的生长通常是农业上不期望的特征。“轻度胁迫”可以是植物接触到的日常生物和/或非生物（环境）胁迫。非生物胁迫可以由干旱或过多的水、缺氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、冷或冰冻温度引起。

生物胁迫典型地是由病原体例如细菌、病毒、真菌、线虫和昆虫引起的胁迫。

“非生物胁迫”可以是由水胁迫（例如由于干旱）、盐胁迫或冰冻结胁迫引起的渗透胁迫。非生物胁迫还可以是氧化胁迫或冷胁迫。“冰冻胁迫”意指由于冰冻温度引起的胁迫，所谓冰冻温度是指可用水分子在该温度冻结并转变为冰。“冷胁迫”也称为“寒冷胁迫”，意指低温，例如低于10℃、或优选低于5℃，但不使水分子冻结的温度。如Wang等人（Planta（2003）218:1-14）所报道的，非生物胁迫引起一系列的形态学、生理学、生物化学和分子变化，对植物生长和生产力造成不利影响。已知干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫相互关联，并可以通过相似的机制诱发生长和细胞损害。Rabbani等人（Plant Physiol（2003）133:1755-1767）描述了干旱胁迫和高盐度胁迫之间存在着的一种特别高程度的“串话（cross-talk）”。例如，干旱和/或盐度主要表现为渗透胁迫，导致破坏细胞中的稳态和离子分布。氧化胁迫通常与高温或低温、盐度或干旱胁迫相伴，可以引起功能及结构蛋白质的变性。所以，这些多种多样的环境胁迫常激活相似的细胞信号传递路径和细胞应答，如应激蛋白的产生、抗氧化剂的上调、相容性溶质的累积以及生长停滞。如本文所用的术语“非胁迫”条件为那些允许植物最佳生长的环境条件。本领域技术人员知晓给定区域的正常土壤条件和气候条件。具有最佳生长条件（在非胁迫条件下生长）的植物一般产量按照递增的优先顺序是此类植物在给定环境中的平均产量的至少97%、95%、92%、90%、87%、85%、83%、80%、77%或75%。平均产量可以基于收获和/或季节进行计算。本领域技术人员知晓作物的平均产量产出。

特别地，可以在非胁迫条件下实施本发明的方法。在一个实例中，可以在非胁迫条件例如轻度干旱下实施本发明的方法，以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。

在另一个实施方案中，可以在胁迫条件下实施本发明的方法。

在一个实例中，可以在胁迫条件例如干旱下实施本发明的方法，以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。

在另一个实例中，可以在胁迫条件例如养分缺乏下实施本发明的方法，以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。

养分缺乏可以因诸如氮、磷酸及其它含磷化合物、钾、钙、镁、锰、铁和硼等养分的缺乏所致。

在另外一个实例中，可以在胁迫条件例如盐胁迫下实施本发明的方法，以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。术语盐胁迫不局限于氯化钠(NaCl)，而可以是如下之任一种或多种：NaCl、KCl、LiCl、MgCl₂、CaCl₂等等。

在另外一个实例中，可以在胁迫条件例如冷胁迫或冰冻结胁迫下实施本发明的方法，以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。

增加/提高/增强

术语“增加”、“提高”或“增强”可互换，且在本申请意义上表示与文中所定义的对照植物相比，产量和/或生长多出至少3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%，优选至少15%或20%，更优选25%、30%、35%或40%。

种子产量

增加的种子产量可表现为如下一个或多个方面：

（a）种子生物量（种子总重量）的增加，这可以是以单粒种子和/或每植株和/或每平方米为基础的增加；

（b）每植株的花数的增加；

（c）增加的种子数；

（d）增加的种子饱满率（其表达为饱满小花数与小花总数的比率）的增加；

（e）增加的收获指数，其表达为可收获部分如种子的产量除以地上植物部分的生物量的比率；和

（f）增加的千粒重（TKW），这通过计数种子数和它们的总重量外推得到。TKW增加可来自于种子大小和/或种子重量的增加，并且也可来自胚和/或胚乳大小的增加。

术语“饱满小花”和“饱满种子”可视为同义词。

种子产量的增加也可表现为种子大小和/或种子体积的增加。此外，种子产量的增加自身也可表现为种子面积和/或种子长度和/或种子宽度和/或种子周长的增加。

绿度指数

如本文所用的“绿度指数”根据植物的数字图像计算。对于图像中属于植物目标的每一个像素，计算绿值相对于红值之比(在RGB模型中用于色度编码)。绿度指数表达为绿红比超过给定阈值的像素百分比。在正常生长条件下、在盐胁迫生长条件下、在养分可利用度下降的生长条件下，在开花前的末次成像中测量植物绿度指数。相反，在干旱胁迫生长条件下，在干旱后的首次成像中测量植物绿度指数。

生物量

如本文中所用，术语“生物量”意指植物的总重量。在生物量的定义范围内，可以区分植物的一个或多个部分的生物量，其可以包括以下之任一或多个：

-地上部分，例如但不限于枝条生物量、种子生物量、叶生物量等；

-地上可收获部分，例如但不限于枝条生物量、种子生物量、叶生物量等；

-地下部分，例如但不限于，块茎、球茎、根生物量等；

-地下可收获部分，例如但不限于，块茎、球茎、根生物量等；

-营养体生物量，例如根生物量、枝条生物量等；

-生殖器官；和

-繁殖体，例如种子。

标记辅助育种

这类育种程序有时需要使用例如EMS诱变，通过植物诱变处理引入等位基因变异；可选的，此类程序可以起始于一系列无意产生的所谓“天然”起源的等位基因变体。然后通过例如PCR进行等位基因变体的鉴定。随后是选择步骤，用以选择所讨论序列的较好等位基因变体，该变体提供增加的产量。一般通过监测含有所讨论序列的不同等位基因变体的植物的生长行为来进行选择。可以在温室或田地中监测生长行为。更多任选的步骤包括使经鉴定含有较好等位基因变体的植物与另一植物杂交。例如，可使用这种方法产生感兴趣表型特征的组合。

在（遗传作图）中用作探针

利用编码目的蛋白质的核酸进行基因的遗传和物理作图仅需要长度至少15个核苷酸的核酸序列。此类核酸可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。可以用编码目的蛋白质的核酸探测限制酶切消化的植物基因组DNA的Southern印迹(Sambrook J,Fritsch EF和Maniatis T(1989)《分子克隆：实验室手册》)。随后使用计算机程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics1:174-181)对产生的带型进行遗传分析，以构建遗传图谱。另外，可以使用所述核酸探测含有一组如下个体的限制性内切酶处理的基因组DNA的Southern印迹，所述该组个体为规定的遗传杂交的亲本和子代。记录DNA多态性的分离，并用于计算编码目的蛋白质的核酸在先前用此群体所获得的遗传图谱中的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32:314-331)。

有关在遗传作图中使用的植物基因衍生探针的产生和使用，描述于Bernatzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter4:37-41中。众多出版物中描述过用上述方法或其变通形式对特定cDNA克隆进行的遗传作图。例如，可以使用F2杂交群体、回交群体、随机交配群体、近等基因系和其它个体组作图。这类方法是本领域技术人员公知的。

核酸探针也可以用来进行物理作图(即在物理图谱上安置序列；参见Hoheisel等In:Non-mammalian Genomic Analysis:A Practical Guide,Academic press1996，第319-346页，及其中引用的参考文献)。

在另一个实施方案中，核酸探针可用于直接荧光原位杂交(FISH)作图(Trask(1991)Trends Genet.7:149-154)。尽管目前FISH作图的方法倾向使用大的克隆(几个kb到几百个kb；参见Laan等(1995)Genome Res.5:13-20)，但是灵敏性的提高可以允许在FISH作图中应用较短的探针。

用于遗传和物理作图的多种基于核酸扩增的方法可以使用所述核酸序列进行。实例包括等位基因特异性扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med11:95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS;Sheffield等(1993)Genomics16:325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等(1988)Science241:1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18:3671)、放射杂交作图(Walter等(1997)Nat.Genet.7:22-28)和Happy作图(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17:6795-6807)。为实施这些方法，使用核酸的序列设计和产生用于扩增反应或引物延伸反应的引物对。这类引物的设计是本领域技术人员公知的。在采用基于PCR的遗传作图的方法中，可能需要鉴定作图杂交的亲本之间在相应于本发明核酸序列的区域中的DNA序列差异。然而，这对作图方法通常不是必要的。

植物

本文所用术语“植物”涵盖整株植物、植物的祖先和后代以及植物部分，包括种子、枝条、茎、叶、根（包括块茎）、花以及组织和器官，其中上述每一种都含有目的基因/核酸。术语“植物”也涵盖植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样其中上述每一种都含有目的基因/核酸。

尤其适用于本发明方法中的植物包括属于超家族植物界(Viridiplantae)的所有植物，特别是单子叶和双子叶植物，包括饲料或草料豆科植物、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木，选自：槭树属(Acerspp.)、狲猴桃属(Actinidia spp.)、秋葵属(Abelmoschus spp.)、剑麻(Agavesisalana)、冰草属(Agropyron spp.)、匍匐剪股颍(Agrostis stolonifera)、葱属(Allium spp.)、苋属(Amaranthus spp.)、固沙草(Ammophilaarenaria)、菠萝(Ananas comosus)、番荔枝属(Annona spp.)、旱芹(Apium graveolens)、落花生属(Arachis spp)、波罗蜜属(Artocarpusspp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麦属(Avena spp.)(例如燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、Avena fatua var.sativa、杂种燕麦(Avena hybrida))、阳桃(Averrhoacarambola)、箣竹属(Bambusa sp.)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属(Brassica spp.)(例如欧洲油菜(Brassica napus)、芜菁亚种(Brassica rapa ssp.)[卡诺拉油菜(canola)、油籽油菜(oilseed rape)、芜菁油菜(turnip rape)])、Cadabafarinosa、大叶茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、大麻(Cannabis sativa)、辣椒属(Capsicum spp.)、Carex elata、番木瓜(Caricapapaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、山核桃属(Carya spp.)、红花(Carthamus tinctorius)、栗属(Castanea spp.)、吉贝(Ceibapentandra)、苦苣(Cichorium endivia)、樟属(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑桔属(Citrus spp.)、椰子属(Cocos spp.)、咖啡属(Coffea spp.)、芋(Colocasia esculenta)、可乐属(Cola spp.)、黄麻属(Corchorus sp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属(Corylus spp.)、山楂属(Crataegus spp.)、番红花(Crocus sativus)、南瓜属(Cucurbita spp.)、香瓜属(Cucumis spp.)、菜蓟属(Cynara spp.)、野胡萝卜(Daucus carota)、山蚂蝗属(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属(Dioscorea spp.)、柿树属(Diospyros spp.)、稗属(Echinochloa spp.)、油棕属(Elaeis)(例如油棕(Eiaeis guineensis)、美洲油棕(Elaeis oleifera))、龙爪稷(Eleusine coracana)、埃塞俄比亚画眉草(Eragrostis tef)、蔗茅属(Erianthus sp.)、枇杷(Eriobotrya japonica)、桉属(Eucalyptus sp.)、红仔果(Eugenia unifora)、荞麦属(Fagopyrum spp.)、山毛榉属(Fagus spp.)、苇状羊茅(Festuca arundinacea)、无花果(Ficus carica)、金桔属(Fortunella spp.)、草莓属(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属(Glycine spp.)(例如大豆(Glycine max)、黄豆(Soja hispida)或Sojamax)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、向日葵属(Helianthus spp.)(例如向日葵(Helianthus annuus))、萱草(Hemerocallis fulva)、木槿属(Hibiscusspp.)、大麦属(Hordeum spp.)(例如大麦(Hordeum vulgare))、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属(Lathyrus spp.)、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linum usitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffaacutangula)、羽扇豆属(Lupinus spp.)、Luzula sylvatica、蕃茄属(Lycopersicon spp.)(例如西红柿(Lycopersicon esculentum)、蕃茄(Lycopersicon lycopersicum)、梨形蕃茄(Lycopersicon pyriforme))、硬皮豆属(Macrotyloma spp.)、苹果属(Malus spp.)、凹缘金虎尾(Malpighiaemarginata)、曼密苹果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、木薯属(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、紫苜蓿(Medicagosativa)、草木樨属(Melilotus spp.)、薄荷属(Mentha spp.)、芒(Miscanthussinensis)、苦瓜属(Momordica spp)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属(Musaspp.)、烟草属(Nicotiana spp.)、木犀榄属(Olea spp.)、仙人掌属(Opuntiaspp.)、鸟足豆属(Ornithopus spp.)、稻属(Oryza spp.)、(例如稻(Oryzasativa)、阔叶稻(Oryza latifolia)、稷(Panicum miliaceum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinacasativa)、狼尾草属(Pennisetum sp.)、鳄梨属(Persea spp.)、欧芹(Petroselinum crispum)、虉草(Phalaris arundinacea)、菜豆属(Phaseolusspp.)、梯牧草(Phleum pratense)、刺葵属(Phoenix spp.)、南方芦苇(Phragmites australis)、酸浆属(Physalis spp.)、松属(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属(Pisum spp.)、早熟禾属(Poa spp.)、杨属(Populus spp.)、牧豆树属(Prosopis spp.)、李属(Prunus spp.)、番石榴属(Psidium spp.)、石榴(Punica granatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属(Quercus spp.)、萝卜(Rapbanus sativus)、波叶大黄(Rheumrhabarbarum)、茶藨子属(Ribes spp.)、蓖麻(Ricinus communis)、悬钩子属(Rubus spp.)、甘蔗属(Saccharum spp.)、柳属(Salix sp.)、接骨木属(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、胡麻属(Sesamum spp.)、白芥属(Sinapis sp.)、茄属(Solanum spp.)(例如马铃薯(Solanum tuberosum)、红茄(Solanum integrifolium)或蕃茄(Solanum lycopersicum))、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属(Spinacia spp.)、蒲桃属(Syzygium spp.)、万寿菊属(Tagetes spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobromacacao)、车轴草属(Trifolium spp.)、鸭茅状摩擦禾(Tripsacumdactyloides)、Triticosecale rimpaui、小麦属(Triticum spp.)(例如普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticumturgidum)、Triticum hybernum、Triticum macha、普通小麦(Triticumsativum)、一粒小麦(Triticum monococcum)或普通小麦(Triticumvulgare))、小金莲花(Tropaeolum minus)、金莲花(Tropaeolum majus)、越桔属(Vaccinium spp.)、野豌豆属(Vicia spp.)、豇豆属(Vigna spp.)、香堇(Viola odorata)、葡萄属(Vitis spp.)、玉蜀黍(Zea mays)、沼生菰(Zizania palustris)、枣属(Ziziphus spp.)等等。

对照植物

选择合适的对照植物是实验设置的常规部分，并且可以包括相应的野生型植物或不含目的基因的相应植物。对照植物通常与待评估植物为相同的植物物种，或者甚至为同一品种。对照植物还可以是待评估植物的无效合子（nullizygote）。无效合子是由于分离而丢掉转基因的个体。如本文所用的“对照植物”不仅指完整植物，而且指植物部分，包括种子和种子部分。

发明详述

现已令人惊讶地发现，调节植物中HAB1多肽或KELP多肽编码核酸的表达，可以使这些植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状。

根据第一个实施方案，本发明提供了相对于对照植物增强植物中的产量相关性状的方法，其包括调节植物中HAB1多肽或KELP多肽编码核酸的表达，且任选选择产量相关性状增强的植物。根据另一个实施方案，本发明提供了相对于对照植物产生产量相关性状增强的植物的方法，其中所述方法包括调节所述植物中HAB1多肽或KELP多肽编码核酸的表达，任选选择产量相关性状增强的植物的步骤。

用于调节（优选增加）HAB1多肽或KELP多肽编码核酸表达的一种优选方法是在植物中表达HAB1多肽或KELP多肽编码核酸。

下文中对“用于本发明方法的蛋白质”的任何提及，均旨在指如本文中定义的HAB1多肽或KELP多肽。下文中对“用于本发明方法的核酸”的任何提及，均旨在指能够编码该HAB1多肽或KELP多肽的核酸。待引入植物中（并因此可以用于实施本发明方法）的核酸是编码现将进行描述的此类蛋白质的任何核酸，在下文中也称为“HAB1核酸”或“HAB1基因”或者“KELP核酸”或“KELP基因”。

如本文定义的“HAB1多肽”指包含PP2C结构域（PFAM PF00481）的任何磷酸酶。优选地，用于本发明方法的HAB1多肽包含下述基序中的一个或两个：

基序1（SEQ ID NO:55）：

PLWG[FLS][TEV]SICG[RK]RPEMED[DA][YV][AV][ATV]VPRF[LF][KDQ][ILV]P[ILS][KW]M[VL][AT][GD][DN][RAH]

基序2（SEQ ID NO:56）：

[LM][DS][PRA][SAM][SL]F[RH]L[TP][AS]H[FL]F[AG]VYDGH[DG]G[AVS]Q

另外地或备选地，HAB1多肽包含下述标签序列中的一个或多个：

标签1:NCGDSR（SEQ ID NO:57）

标签2:SRSIGD（SEQ ID NO:58）

标签3:LASDG（SEQ ID NO:59）

如本文使用的术语“HAB1”或“HAB1多肽”还意欲包括在以下定义的“HAB1多肽”的同源物。

基序1和2使用MEME算法(Bailey和Elkan,第二届分子生物学智能系统国际会议记录(Proceedings of the Second International Conferenceon Intelligent Systems for Molecular Biology),第28-36页,AAAI Press,Menlo Park,California,1994.)推导出来。在MEME基序中的每个位置上，显示在查询组序列中以高于0.2的频率存在的残基。方括号中的残基代表可选残基。

另外地或备选地，HAB1蛋白质的同源物按照递增的优选顺序与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的全序列同一性，前提是所述同源蛋白质包含任何一个或多个上文所列的保守基序。可以使用全局比对算法，例如程序GAP(GCG WisconsinPackage,Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选利用缺省参数和优选利用成熟蛋白质的序列（即，不考虑分泌信号或转运肽），确定全序列同一性。与全序列同一性相比，当只考虑保守结构域或基序时，序列同一性通常更高。优选地，HAB1多肽中的基序按照递增的优选次序与SEQ ID NO:55至SEQ ID NO:56所示的基序（基序1和2）中的任一或多个具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。

换言之，在另一个实施方案中，提供方法，其中所述HAB1多肽包含这样的保守结构域（或基序），所述保守结构域（或基序）与SEQ IDNO:2中从氨基酸134开始至氨基酸439的保守结构域具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。

如本文定义的KELP多肽属于转录辅激活物组。转录辅激活物是协调来自激活物蛋白（激活物蛋白与称为增强子的基因结合，这帮助确定哪些基因被打开和加速转录）和阻遏蛋白（阻遏蛋白与称为沉默子的基因结合，这干扰激活物蛋白和减慢转录）的信号的衔接分子。转录辅激活物是一种将信息传达给基础因子的衔接分子，随后基础因子“告知”RNA聚合酶在何处和何时开始转录。转录辅激活物激活自RNA聚合酶II启动子的转录。

已进一步描述植物KELP蛋白质涉及病原体防御过程中的基因激活。例如，Matsushita等人（2001）报道，番茄花叶病毒（ToMV）的运动蛋白（MP）可以与衍生自不同植物物种的KELP蛋白质结合。来自ToMV MP羧基末端的至少31个氨基酸看起来对于与KELP的相互作用是非必需的。衍生自十字花科烟草花叶病毒CTMV-W和黄瓜花叶病毒的其他MPs也显示出相当的结合能力。因此，这些作者提出，这些运动蛋白共同地可以与KELP相互作用，可能调节宿主基因表达。

更特别地，在优选实施方案中，根据本发明的“KELP多肽”包含下述基序中的一个或多个：

(i)基序3：CRLSDKRRVT[ILV]Q[DE]F[RK]GK[TS]LVSIRE[YF](SEQ ID NO:137),

（ii)基序4：YKKDGKELP[ST][SA]KGISLT[EDA]EQWS[TA][FL][KR](SEQ ID NO138),

(iii)基序5：AS[EK][KR]L[GA][LI]DLSE[PSK][ES][YRH]K[AK]FVR[HQS]VV[EN][SK]F(SEQ ID NO:139).

在另一个优选实施方案中，根据本发明的“KELP多肽”进一步包含下述基序中的一个或多个：

(i)基序6：DD[DE]GDLIICRLSDKR[RK]VT[IL]Q(SEQ ID NO:140);

(ii)基序7：GKELP[ST]SKGISLT[ED]EQWS[TA][FL](SEQ ID NO:141);

(iii)基序8：[LI]DLS[EKQ][PSK][EKS][YFH]KA[FY]V[RK][HSQ]VV[NE][AKST]FL(SEQ ID NO:142).

更优选地，KELP多肽按照递增的优选顺序包含选自基序3至8的至少2、至少3、至少4、至少5或所有6个基序。基序3至8使用MEME算法(Bailey和Elkan,第二届分子生物学智能系统国际会议记录(Proceedings of the Second International Conference on IntelligentSystems for Molecular Biology),第28-36页,AAAI Press,Menlo Park,California,1994.)推导出来。在MEME基序中的每个位置上，显示在查询组序列中以高于0.2的频率存在的残基。方括号中的残基代表可选残基。

如本文使用的术语“KELP”或“KELP多肽”还意欲包括如在下定义的“KELP多肽”的同源物。

KELP蛋白质的同源物按照递增的优选顺序与SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列具有至少25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的全序列同一性。可以使用全局比对算法，例如程序GAP(GCG Wisconsin Package,Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选利用缺省参数和优选利用成熟蛋白质的序列（即，不考虑分泌信号或转运肽），确定全序列同一性。与全序列同一性相比，当只考虑保守结构域或基序时，序列同一性通常更高。优选地，KELP多肽中的基序按照递增的优选次序与SEQ IDNO:137至SEQ ID NO:142所示的基序（基序3和8）中的任一或多个具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。

在另一个实施方案中，本文定义的“KELP多肽”指包含DEK_C结构域（PF02229）和/或PC4结构域（PF08766）的任何多肽。

在另一个实施方案中，所述KELP多肽包含与选自下组的一个或多个保守结构域具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的保守结构域：

（i）具有SEQ ID NO:65的坐标108至172的氨基酸的保守结构域；

（ii）具有SEQ ID NO:65的坐标108至176的氨基酸的保守结构域；

（iii）具有SEQ ID NO:65的坐标93至169的氨基酸的保守结构域；和

（iv）具有SEQ ID NO:65的坐标16至71的氨基酸的保守结构域。

术语“结构域”、“标签”和“基序”在本文“定义”部分进行了定义。

优选地，多肽序列，当用于构建系统发生树，例如图3中描述的系统发生树（Saez等人，Plant J.37，354-369，2004）时，与包含SEQ IDNO:2所示蛋白质的拟南芥直向同源物的HAB1多肽组（特别是图3中的组#5）而非与任何其它组聚类。

此外，HAB1多肽（至少在其天然形式中）一般具有磷酸酶活性。用于测量PP2C磷酸酶活性的工具和技术是本领域熟知的（参见例如Vlad等人Plant Cell21，3170-3184，2009）。进一步的细节在实施例6中提供。

此外，HAB1多肽，当根据如实施例7和8中所列的本发明方法在稻中表达时，导致植物具有增加的产量相关性状，特别是增加的种子饱满率。

本发明以编码SEQ ID NO:2的多肽序列的SEQ ID NO:1所示核酸序列转化植物来进行举例说明。然而，本发明的实施并不局限于这些序列；本发明的方法可以有利地利用本文所定义的任何HAB1编码核酸或HAB1多肽来实施。

编码HAB1多肽的核酸的实例在本文实施例部分表A1中给出。这些核酸可用于实施本发明的方法。实施例部分表A1所给出的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示的HAB1多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，其中术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文所定义。其它的直向同源物和旁系同源物可以通过进行如定义部分所述的所谓交互BLAST搜索，容易地鉴定；在查询序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的情况下，二次BLAST(back-BLAST)将针对稻序列进行。

本发明还提供了可以用于相对于对照植物在植物中赋予增强的产量相关性状的迄今为止的HAB1编码核酸和HAB1多肽。

根据本发明的进一步实施方案，因此提供了选自下述的分离的核酸分子：

（i）SEQ ID NO:13和19所示核酸；

（ii）SEQ ID NO:13和19所示核酸的互补物；

（iii）编码HAB1多肽的核酸，所述HAB1多肽按照递增的优选顺序与SEQ ID NO:14和20所示氨基酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，并且另外或可选地包含按照递增的优选顺序与SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56中给出的基序之任何一个或多个具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的一个或多个基序，并且进一步优选地相对于对照植物赋予增强的产量相关性状；

（iv）在高严格杂交条件下与（i）至（iii）的核酸分子杂交且优选地相对于对照植物赋予增强的产量相关性状的核酸分子。

根据本发明的进一步实施方案，还提供了选自下述的分离的多肽：

（i）SEQ ID NO:14和20所示氨基酸序列；

（ii）氨基酸序列，其按照递增的优选顺序与SEQ ID NO:14和20所示氨基酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，并且另外或可选地包含按照递增的优选顺序与SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56中给出的基序之任何一个或多个具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的一个或多个基序，并且进一步优选地相对于对照植物赋予增强的产量相关性状；

（iii）上文（i）或（ii）中给出的任何氨基酸序列的衍生物。

优选地，所述多肽序列，当用于构建系统发生树，例如图8中描述的系统发生树时，与图8上指出的包含SEQ ID NO:65所示氨基酸序列的KELP多肽组I而非与任何其它组聚类。

此外，KELP多肽（至少在其天然形式中）一般具有作为转录辅激活物的功能。还已报道，这些多肽在酵母双杂交筛选中与其他类别的多肽相互作用（参见例如Cormack等人，1998）。此外，KELP多肽，当根据如实施例7和8中所列的本发明方法在转基因植物如稻中表达时，导致植物相对于对照植物具有增加的产量相关性状，特别是增加的种子产量。

本发明以编码SEQ ID NO:65的多肽序列的SEQ ID NO:64所示核酸序列转化植物来进行举例说明。然而，本发明的实施并不局限于这些序列；本发明的方法可以有利地利用本文所定义的任何KELP编码核酸或KELP多肽来实施。

编码KELP多肽的核酸的实例在本文实施例部分表A2中给出。这些核酸可用于实施本发明的方法。下表A2所给出的氨基酸序列包括SEQID NO:65所示的KELP多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，其中术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文所定义。其它的直向同源物和旁系同源物可以通过进行如定义部分所述的所谓交互BLAST搜索，容易地鉴定；在查询序列为SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:65的情况下，二次BLAST(back-BLAST)将针对拟南芥序列进行。

核酸变体也可用于实施本发明的方法。这类变体的实例包括编码实施例部分表A1或表A2中给出的任一氨基酸序列的同源物和衍生物的核酸，其中“同源物”和“衍生物”如本文所定义。同样可用于本发明方法的有，编码实施例部分表A1或表A2所给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物的核酸。可用于本发明方法的同源物和衍生物与其源自的未修饰蛋白质具有基本上相同的生物活性和功能活性。可以用于实施本发明方法的其它变体为密码子使用经优化或miRNA靶位点被移去的变体。

可用于实施本发明方法的其它核酸变体包括编码HAB1多肽的核酸的部分，与编码HAB1多肽或KELP多肽的核酸杂交的核酸，编码HAB1多肽或KELP多肽的核酸的剪接变体，编码HAB1多肽或KELP多肽的核酸的等位基因变体，以及通过基因改组获得的编码HAB1多肽或KELP多肽的核酸的变体。术语杂交序列、剪接变体、等位基因变体和基因改组如本文所述。

编码HAB1多肽或KELP多肽的核酸无需是全长核酸，因为本发明方法的实施不依赖于全长核酸序列的使用。根据本发明，提供了增强植物产量相关性状的方法，包括在植物中引入和表达实施例部分的表A1或表A2中所示任一核酸序列的部分、或者编码实施例部分的表A1或表A2中所示任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的部分。

例如，可以通过对核酸进行一个或多个缺失来制备所述核酸的“部分”。“部分”可以以分离的形式使用，或者可将其与其他编码（或非编码）序列融合，以便例如，产生组合了若干活性的蛋白质。当与其他编码序列融合时，经翻译后所产生的多肽可能比针对该蛋白质部分所预测到的要大。

关于HAB1多肽，可用于本发明方法的部分编码如本文所定义的HAB1多肽，并与实施例部分的表A1所示氨基酸序列具有基本上相同的生物活性。优选地，该部分是实施例部分的表A1所示任一核酸的部分，或是编码实施例部分的表A1所示任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的部分。优选地，该部分长至少500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600个连续核苷酸，所述连续核苷酸来自实施例部分的表A1所示任一核酸序列或者编码实施例部分的表A1所示任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。

最优选“部分”是SEQ ID NO:1的核酸的部分。优选“部分”编码氨基酸序列的片段，当将其用于构建系统发生树例如图3中描述的系统发生树（Saez等人，2004）时，其与包含SEQ ID NO:2所示蛋白质的拟南芥直向同源物的HAB1多肽组（特别是图3中的组#5）而非与任何其它组聚类、和/或包含基序1和2之一或两者、和/或具有PP2C磷酸酶活性、和/或与SEQ ID NO:2具有至少36%序列同一性。

关于KELP多肽，可用于本发明方法的部分编码如本文所定义的KELP多肽，并与实施例部分的表A2所示氨基酸序列具有基本上相同的生物活性。优选地，该部分是实施例部分的表A2所示任一核酸的部分，或是编码实施例部分的表A2所示任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的部分。优选地，该部分长至少350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800个连续核苷酸，所述连续核苷酸来自实施例部分的表A2所示任一核酸序列或者编码实施例部分的表A2所示任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。

最优选地，该部分是核酸SEQ ID NO:64的部分。

优选地，该部分编码具有下述特征中的一个或多个的氨基酸序列的片段：

-当用于构建系统发生树例如图8中描述的系统发生树时，与图8上指出的包含SEQ ID NO:65所示氨基酸序列的KELP多肽组I而非任何其它组聚类。

-包含如上所示的基序3至8中的任何一个或多个，

-是转录辅激活物；

-与SEQ ID NO:65具有至少25%序列同一性。

可以用于本发明方法的另一核酸变体是这样的核酸，所述核酸能够在降低的严紧条件下，优选在严紧条件下与编码本文中定义的HAB1多肽或KELP多肽的核酸、或者与本文中定义的“部分”杂交。

根据本发明，提供了在植物中增强产量相关性状，优选地增加种子产量的方法，包括向植物中引入和表达能够与实施例部分表A1或表A2中给出的任一核酸杂交的核酸，或包括向植物中引入和表达能够与编码实施例部分表A1或表A2中给出的任何核酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸杂交的核酸。

用于本发明方法的杂交序列编码本文中定义的HAB1多肽或KELP多肽，所述多肽与实施例部分表A1或表A2所给出的氨基酸序列具有基本上相同的生物活性。优选，杂交序列能够与实施例部分表A1或表A2所给出的任一核酸的互补序列杂交，或与这些序列之任一的部分杂交，其中“部分”如上文所定义，或者所述杂交序列能够与编码实施例部分表A1或表A2所给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的互补序列杂交。最优选，所述杂交序列能够与SEQ ID NO:1或SEQID NO:64所示的核酸的互补序列或与其部分杂交。

优选，所述杂交序列编码具有这样的氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列，当全长用于构建系统发生树例如图3中描述的系统发生树（Saez等人，2004）时，与包含SEQ ID NO:2所示蛋白质的拟南芥直向同源物的HAB1多肽组（特别是图3中的组#5）而非与任何其它组聚类、和/或包含基序1和2之一或两者、和/或具有PP2C磷酸酶活性、和/或与SEQID NO:2具有至少36%序列同一性。

优选杂交序列编码具有下述特征中的一个或多个的氨基酸序列的片段：

-当用于构建系统发生树例如图8中描述的系统发生树时，与图8上指出的包含SEQ ID NO:65所示氨基酸序列的KELP多肽组I而非任何其它组聚类。

-包含如上所示的基序3至8中的任何一个或多个，

-是转录辅激活物；

-与SEQ ID NO:65具有至少25%序列同一性。

可以用于本发明方法的另一核酸变体是编码上文中定义的HAB1多肽或KELP多肽的剪接变体，剪接变体如本文中定义。

根据本发明，提供了增强植物产量相关性状的方法，包括在植物中引入和表达实施例部分表A所给出的任一核酸序列的剪接变体、或编码实施例部分表A所给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的剪接变体。

优选剪接变体是如SEQ ID NO:1所示的核酸的剪接变体、或编码SEQ ID NO:2的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选，由所述剪接变体编码的氨基酸序列，当用于构建系统发生树例如图3中描述的系统发生树（Saez等人，2004）时，与包含SEQ ID NO:2所示蛋白质的拟南芥直向同源物的HAB1多肽组（特别是图3中的组#5）而非与任何其它组聚类、和/或包含基序1和2之一或两者、和/或具有PP2C磷酸酶活性、和/或与SEQ ID NO:2具有至少36%序列同一性。

优选剪接变体是如SEQ ID NO:64所示的核酸的剪接变体、或编码SEQ ID NO:65的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选，由所述剪接变体编码的氨基酸序列具有下述特征中的一个或多个：

-当用于构建系统发生树例如图8中描述的系统发生树时，与图8上指出的包含SEQ ID NO:65所示氨基酸序列的KELP多肽组I而非任何其它组聚类。

-包含如上所示的基序3至8中的任何一个或多个，

-是转录辅激活物；

-与SEQ ID NO:65具有至少25%序列同一性。

可用于本发明方法的另一核酸变体为编码前文所定义的HAB1多肽或KELP多肽的核酸的等位基因变体，等位基因变体如本文所定义。

根据本发明，提供了增强植物产量相关性状的方法，包括在植物中引入和表达实施例部分表A所给出的任一核酸的等位基因变体，或包括在植物中引入和表达编码实施例部分表A所给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的等位基因变体。

由可用于本发明方法的等位基因变体编码的多肽与SEQ ID NO:2的HAB1多肽及实施例部分表A1中描述的任何氨基酸序列具有基本上相同的生物活性。等位基因变体天然存在，并且对这些天然等位基因的应用包含于本发明的方法中。优选，等位基因变体为SEQ ID NO:1的等位基因变体，或编码SEQ ID NO:2的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位基因变体。优选，由等位基因变体编码的氨基酸序列，当用于构建系统发生树例如图3中描述的系统发生树（Saez等人，2004）时，与包含SEQ ID NO:2所示蛋白质的拟南芥直向同源物的HAB1多肽组（特别是图3中的组#5）而非与任何其它组聚类、和/或包含基序1和2之一或两者、和/或具有PP2C磷酸酶活性、和/或与SEQ ID NO:2具有至少36%序列同一性。

由可用于本发明方法的等位基因变体编码的多肽与SEQ ID NO:65的KELP多肽及实施例部分表A2中描述的任何氨基酸序列具有基本上相同的生物活性。等位基因变体天然存在，并且对这些天然等位基因的应用包含于本发明的方法中。优选，等位基因变体为SEQ ID NO:65的等位基因变体，或编码SEQ ID NO:65的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位基因变体。优选，由等位基因变体编码的氨基酸序列具有下述特征中的一个或多个：

-当用于构建系统发生树例如图8中描述的系统发生树时，与图8上指出的包含SEQ ID NO:65所示氨基酸序列的KELP多肽组I而非任何其它组聚类；

-包含如上所示的基序3至8中的任何一个或多个，

-是转录辅激活物；

-与SEQ ID NO:65具有至少25%序列同一性。

基因改组或定向进化也可用于产生编码上文所定义的HAB1多肽或KELP多肽的核酸的变体；术语“基因改组”如本文所定义。

根据本发明，提供了用于在植物中增强产量相关性状的方法，包括向植物中引入和表达实施例部分表A所给出的任一核酸序列的变体，或包括向植物中引入和表达编码实施例部分表A所给出的任何氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的变体，其中所述变体核酸通过基因改组获得。

优选，由通过基因改组获得的变体核酸编码的氨基酸序列，当用于构建系统发生树例如图3中描述的系统发生树（Saez等人，2004）时，与包含SEQ ID NO:2所示蛋白质的拟南芥直向同源物的HAB1多肽组（特别是图3中的组#5）而非与任何其它组聚类、和/或包含基序1和2之一或两者、和/或具有PP2C磷酸酶活性、和/或与SEQ ID NO:2具有至少36%序列同一性。

优选，由通过基因改组获得的变体核酸编码的氨基酸序列具有下述特征中的一个或多个：

-当用于构建系统发生树例如图8中描述的系统发生树时，与图8上指出的包含SEQ ID NO:65所示氨基酸序列的KELP多肽组I而非任何其它组聚类；

-包含如上所示的基序3至8中的任何一个或多个，

-是转录辅激活物；

-与SEQ ID NO:65具有至少25%序列同一性。

此外，还可利用定点诱变获得核酸变体。若干方法可用来实现定点诱变，最常见的是基于PCR的方法(Current Protocols in MolecularBiology.Wiley编辑)。

HAB1多肽或KELP多肽编码核酸可以来自任何天然或人工的来源。可以通过有意的人为操作在组成和/或基因组环境上修饰核酸，使之不同于天然形式。优选地，HAB1多肽或KELP多肽编码核酸来自植物，还优选来自单子叶或双子叶植物，还优选来自十字花科（Brassicaceae），更优选来自禾本科（Poaceae）或拟南芥属(Arabidopsis)，最优选地，核酸来自稻(Oryza sativa)或拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

实施本发明的方法产生具有增强的产量相关性状的植物。特别地，实施本发明的方法产生相对于对照植物具有增加的产量的植物，尤其是具有增加的种子产量。术语“产量”和“种子产量”在本文“定义”部分有更详细的说明。

本文所述及的增强的产量相关性状应理解为表示植物早期活力和/或一个或多个部分的生物量（重量）的增加，所述部分可以包括（i）地上部分且优选地上可收获部分，和/或（ii）地下部分且优选可收获地下部分。特别地，这样的可收获部分为种子，并且实施本发明的方法使得植物相对于对照植物的种子产量具有增加的种子产量。

本发明提供了相对于对照植物增加植物的产量相关性状、优选增加产量、特别是种子产量的方法，所述方法包括调节本文所定义的HAB1多肽或KELP多肽编码核酸在植物中的表达。

根据本发明一个优选特征，实施本发明的方法产生相对于对照植物具有增加的生长速率的植物。因此，本发明提供了增加植物生长速率的方法，所述方法包括调节本文所定义的HAB1多肽或KELP多肽编码核酸在植物中的表达。

实施本发明方法，可以产生在非胁迫条件下或在干旱条件下生长时相对于在相当条件下生长的对照植物具有增加的产量的植物。因此，根据本发明，提供了用于在非胁迫条件下或在干旱条件下生长的植物中增加产量的方法，所述方法包括调节编码HAB1多肽的核酸在植物中的表达。

实施本发明方法，可以产生在营养缺乏条件，特别是在缺氮条件下生长时相对于在相当条件下生长的对照植物具有增加的产量的植物。因此，根据本发明，提供了用于在营养缺乏条件下生长的植物中增加产量的方法，所述方法包括调节编码HAB1多肽的核酸在植物中的表达。

实施本发明方法，可以产生在盐胁迫条件下生长时相对于在相当条件下生长的对照植物具有增加的产量的植物。因此，根据本发明，提供了用于在盐胁迫条件下生长的植物中增加产量的方法，所述方法包括调节编码HAB1多肽的核酸在植物中的表达。

本发明的方法可以在非胁迫条件下或在如上定义的胁迫条件下实施。

在优选实施方案中，本发明的方法在胁迫条件下实施。实施本发明方法，可以产生在干旱条件下生长时相对于在相当条件下生长的对照植物具有本文所述增加的产量相关性状的植物。因此，根据本发明，提供了用于在胁迫条件下，尤其是在干旱条件下生长的植物中增加产量相关性状的方法，所述方法包括调节编码本文定义的KELP多肽的核酸在植物中的表达。

在另一实例中，实施本发明方法，可以产生在营养缺乏条件，特别是在缺氮条件下生长时相对于在相当条件下生长的对照植物具有增加的产量相关性状的植物。因此，根据本发明，提供了用于在营养缺乏条件下生长的植物中增加产量相关性状的方法，所述方法包括调节编码KELP多肽的核酸在植物中的表达。在再一实例中，实施本发明方法，可以产生在盐胁迫条件下生长时相对于在相当条件下生长的对照植物具有增加的产量相关性状的植物。因此，根据本发明，提供了用于在盐胁迫条件下生长的植物中增加产量相关性状的方法，所述方法包括调节编码KELP多肽的核酸在植物中的表达。

本发明还提供遗传构建体和载体，以利于编码HAB1多肽或KELP多肽的核酸在植物中的引入和/或表达。可以将基因构建体插入适于转化进入植物并适于在转化的细胞中表达目的基因的载体（可商购获得）中。本发明还提供了如本文所定义的基因构建体在本发明方法中的用途。

更特别地，本发明提供这样的构建体，其含有：

(a)编码如上文所定义的HAB1多肽或KELP多肽的核酸；

(b)一个或多个能够驱动(a)中核酸序列表达的控制序列；和任选

(c)转录终止序列。

优选地，编码HAB1多肽或KELP多肽的核酸如以上所定义。术语“控制序列”和“终止序列”如本文所定义。

此外，本发明提供转化了上述构建体的植物。特别是，本发明提供转化了上述构建体的植物，所述植物具有如本文所述增加的产量相关性状。

可以使用含有任何上述核酸的载体转化植物。技术人员充分知晓载体中必须存在的遗传元件，以便成功进行转化、选择和繁殖含目的序列的宿主细胞。目的序列将有效连接于一个或多个控制序列(至少连接于启动子)。

有利地，可以使用任何类型的启动子，无论是天然的或合成的，来驱动核酸序列的表达，但优选启动子是植物来源的。组成型启动子在本发明方法中特别有用。优选组成型启动子是中等强度的遍在组成型启动子。有关各种启动子类型的定义，参见本文中“定义”部分。

应当清楚，本发明的实施并不局限于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:64所示的HAB1多肽或KELP多肽编码核酸，而且本发明的实施也不局限于由组成型启动子驱动的HAB1多肽或KELP多肽编码核酸的表达。

组成型启动子优选为中等强度启动子。更优选地，它是植物衍生的启动子例如GOS2启动子，或具有基本上相同强度且具有基本上相同的表达模式的启动子（功能等价的启动子），更优选地，启动子是来自稻的GOS2启动子。还优选组成型启动子为基本上类似于SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:136的核酸序列，最优选组成型启动子如SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:136所示。有关组成型启动子的更多实例，敬请参见本文“定义”部分。

任选的，可以在引入植物内的构建体中使用一个或多个终止子序列。优选地，构建体包括包含有效连接至编码HAB1多肽或KELP多肽的核酸的稻GOS2启动子的表达盒，所述稻GOS2启动子基本上类似于SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:136。更优选地，构建体包含与HAB1编码序列的3'末端连接的玉米醇溶蛋白终止子（t-玉米醇溶蛋白）。最优选地，表达盒包含SEQ ID NO:63（pGOS2::HAB1::t-玉米醇溶蛋白序列）或SEQ ID NO:143（pGOS2::KELP::终止子）所示序列。此外，编码可选择标记的一种或多种序列可以存在于引入植物内的构建体上。

根据本发明优选特征，受调节的表达是增加的表达。增加核酸或基因或基因产物表达的方法在本领域有充分的记录，并且实例在定义部分提供。

如上文所述，调节HAB1多肽或KELP多肽编码核酸表达的一个优选方法是，在植物中引入和表达HAB1多肽或KELP多肽编码核酸；然而，实施所述方法的效果，即增强产量相关性状，也可以利用其他众所周知的技术实现，包括但不限于：T-DNA激活标签、TILLING、同源重组。这些技术的说明在“定义”部分提供。

本发明还提供了产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的转基因植物的方法，包括在植物中引入和表达编码如前文所定义的HAB1多肽或KELP多肽的任何核酸。

更具体地，本发明提供了产生具有增强的产量相关性状、特别是增加的种子产量的转基因植物的方法，所述方法包括：

（i）向植物或植物细胞中引入和表达HAB1多肽或KELP多肽编码核酸或者包含HAB1多肽或KELP多肽编码核酸的遗传构建体；和

（ii）在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。

在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞可以包括或不包括再生和/或生长至成熟。

（i）中的核酸可以是任何能够编码如本文所述的HAB1多肽或KELP多肽的核酸。

在另一个实施方案中，本发明提供了可由根据本发明的方法获得的植物、其植物部分（包括种子）、或植物细胞，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含编码如本文定义的KELP多肽的重组核酸。

可以将核酸直接引入植物细胞或植物本身（包括引入组织、器官或植物的任何其它部分）。根据本发明优选的方面，优选通过转化将核酸引入植物。术语“转化”在本文“定义”部分有更详细的说明。

本发明显然延及由本文所述方法产生的任何植物细胞或植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本发明包括可由根据本发明的方法获得的植物或其部分（包括种子）。所述植物或其部分含有编码如上文所定义的HAB1多肽或KELP多肽的核酸转基因。本发明还延及由任何上述方法产生的原代转化或转染的细胞、组织、器官或整个植物的后代，唯一的要求是所述后代呈现出与在本发明方法中的亲本相同的基因型和/或表型特征。

本发明也包括含有分离的编码上文所定义的HAB1多肽或KELP多肽的核酸的宿主细胞。根据本发明优选的宿主细胞是植物细胞。对于用于本发明方法的核酸或载体、表达盒或构建体或载体，其宿主植物原则上有利地为能够合成可用于本发明方法的多肽的所有植物。

在另一个实施方案中，本发明提供了可由如本文描述的方法获得的植物、其植物部分（包括种子）、或植物细胞，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含编码如本文定义的KELP多肽的重组核酸，所述重组核酸已稳定整合到所述植物的基因组中。

在另外一个实施方案中，本发明涉及已用根据本发明的构建体稳定转化的植物部分或植物细胞。

在另外一个实施方案中，本发明提供转基因植物或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，其中，由于在所述植物中引入和表达编码如本文定义的所述KELP多肽的核酸，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状、优选相对于对照植物增加的产量、并且更优选相对于对照植物增加的种子产量。因此，所述转基因植物包含编码如本文定义的KELP多肽的核酸，该核酸已稳定地引入所述植物中并在其中表达。本发明还涉及源自所述转基因植物的转基因植物细胞。

本发明的方法有利地适用于任何植物，特别是如本文定义的任何植物。尤其可用于本发明方法的植物包括属于植物界超家族的所有植物，尤其是单子叶植物和双子叶植物，包括饲料或青贮豆科植物、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木。

根据本发明优选的实施方案，植物为作物植物。作物植物的实例包括但不限于菊苣、胡萝卜、木薯、三叶草、大豆、甜菜、糖用甜菜(sugarbeet)、向日葵、卡诺拉油菜(canola)、苜蓿、油菜籽油菜(rapeseed)、亚麻籽、棉花、番茄、马铃薯和烟草。

根据本发明的另一个实施方案，植物是单子叶植物。单子叶植物的实例包括甘蔗。

根据本发明的另一个实施方案，植物是谷类。谷类的实例包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩耳特小麦（spelt）、裸麦(secale)、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、买罗高粱(milo)和燕麦。

本发明也延及植物的可收获部分，例如但不限于：种子、叶、果实、花、茎、根、根茎、块茎和球茎，所述可收获部分包含编码HAB1多肽或KELP多肽的重组核酸。本发明还涉及由该植物的可收获部分衍生的、优选直接衍生的产品，如干丸（pellet）或干粉、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。

本发明还包括编码如本文所述的HAB1多肽或KELP多肽的核酸以及这些HAB1多肽或KELP多肽在增强植物任一上述产量相关性状中的用途。例如，可以在育种程序中使用编码本文所述HAB1多肽或KELP多肽的核酸或所述HAB1多肽或KELP多肽本身，其中鉴定可能与HAB1多肽或KELP多肽编码基因遗传连锁的DNA标记。可以使用所述核酸/基因或所述HAB1多肽或KELP多肽本身定义分子标记。接着可以将此DNA或蛋白质标记在育种程序中使用，以在本发明的方法中选择具有如上文所定义的增强的产量相关性状的植物。此外，HAB1多肽或KELP多肽编码核酸/基因的等位基因变体可以用于标记辅助的育种程序。HAB1多肽或KELP多肽编码核酸还可以作为探针，用于对包含其的基因进行遗传和物理作图以及用作与那些基因连锁的性状的标志物。这样的信息可以在植物育种中使用，以开发具有期望表型的株系。

项目

1.一种相对于对照植物增强植物的产量相关性状的方法，其包括调节HAB1多肽编码核酸在植物中的表达，其中所述HAB1多肽包含PF00481PP2C结构域。

2.根据项目1的方法，其中所述调节的表达通过在植物中引入和表达编码所述HAB1多肽的所述核酸来实现。

3.根据项目1或2的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量，且优选包括相对于对照植物增加的种子产量。

4.根据项目1到3中任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状在干旱胁迫条件下获得。

5.根据项目1到4中任一项的方法，其中所述HAB1多肽包含下述基序中的一个或多个：

（i）基序1：PLWG[FLS][TEV]SICG[RK]RPEMED[DA][YV][AV][ATV]VPRF[LF][KDQ][ILV]P[ILS][KW]M[VL][AT][GD][DN][RAH](SEQ ID NO:55),

(ii)基序2：[LM][DS][PRA][SAM][SL]F[RH]L[TP][AS]H[FL]F[AG]VYDGH[DG]G[AVS]Q(SEQ ID NO:56),

6.根据项目1到5中任一项的方法，其中所述HAB1编码核酸来自植物来源，优选来自单子叶植物，还优选来自禾本科，更优选来自稻属，最优选来自稻。

7.根据项目1到6中任一项的方法，其中所述HAB1编码核酸编码表A1中列出的任何一个多肽，或是此核酸的部分，或是能够与此核酸杂交的核酸。

8.根据项目1到7中任一项的方法，其中所述核酸序列编码表A1中给出的任何多肽的直向同源物或旁系同源物。

9.根据项目1到8中任一项的方法，其中所述核酸编码SEQ ID NO:2所示多肽。

10.根据项目1到9中任一项的方法，其中所述核酸有效连接至组成型启动子、优选中等强度组成型启动子、优选植物启动子、更优选GOS2启动子、最优选来自稻的GOS2启动子。

11.可通过根据项目1到10中任一项的方法获得的植物、其植物部分，包括种子、或植物细胞，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含如项目1和5到9中任一项中定义的编码HAB1多肽的重组核酸。

12.构建体，其包含：

（i）如项目1和5到9中任一项中定义的编码HAB1的核酸；

（ii）一个或多个能够驱动（i）中核酸序列表达的控制序列；和任选的

（iii）转录终止序列。

13.根据项目12的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子、优选中等强度组成型启动子、优选植物启动子、更优选GOS2启动子、最优选来自稻的GOS2启动子。

14.根据项目12或13的构建体在用于制备相对于对照植物具有增强的产量相关性状、优选增加的种子产量的植物的方法中的应用。

15.用根据项目12或13的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。

16.产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状、优选相对于对照植物增加的种子产量的转基因植物的方法，其包括：

（i）向植物细胞或植物中引入和表达如项目1和5到9中任一项中定义的编码HAB1多肽的核酸；和

（ii）在促进植物生长和发育的条件下培养所述植物细胞或植物。

17.转基因植物或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，其中所述转基因植物，由于如项目1和5到9中任一项中定义的编码HAB1多肽的核酸的调节表达，相对于对照植物具有增强的产量相关性状、优选相对于对照植物增加的种子产量。

18.根据项目11、15或17的转基因植物或源自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，例如甜菜、糖用甜菜或紫花苜蓿；或单子叶植物例如甘蔗；或谷类例如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩耳特小麦（spelt）、裸麦、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、买罗高粱(milo)或燕麦。

19.根据项目18的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是枝条生物量和/或种子。

20.产生自根据项目18的植物和/或根据项目19的植物可收获部分的产品。

21.如项目1和5到9中任一项中定义的编码HAB1多肽的核酸用于相对于对照植物增强植物的产量相关性状、优选相对于对照植物增加植物的种子产量的用途。

22.一种相对于对照植物增强植物的产量相关性状的方法，其包括调节KELP多肽编码核酸在植物中的表达，其中所述KELP多肽包含下述基序中的一个或多个：

(i)基序3:GRLSDKRRVT[ILV]Q[DE]F[RK]GK[TS]LVSIRE[YF](SEQ ID NO:137),

(ii)基序4：YKKDGKELP[ST][SA]KGISLT[EDA]EQWS[TA][FL][KR](SEQ ID NO：138),

(iii)基序5：AS[EK][KR]L[GA][LI]DLSE[PSK][ES][YRH]K[AK]FVR[HQS]VV[EN][SK]F(SEQ ID NO:139).

23.根据项目22的方法，其中所述调节的表达通过在植物中引入和表达编码所述KELP多肽的所述核酸来实现。

24.根据项目22或23的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量，且优选包括相对于对照植物增加的种子产量。

25.根据项目22到24中任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。

26.根据项目22到24中任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状在干旱胁迫、盐胁迫或氮缺乏条件下获得。

27.根据项目22到26中任一项的方法，其中所述KELP多肽还包含下述基序中的一个或多个：

(i)基序6：DD[DE]GDLIICRLSDKR[RK]VT[IL]Q(SEQ ID NO:140);

(ii)基序7：GKELP[ST]SKGISLT[ED]EQWS[TA][FL](SEQ ID NO:141);

(iii)基序8：[LI]DLS[EKQ][PSK][EKS][YFH]KA[FY]V[RK][HSQ]VV[NE][AKST]FL(SEQ ID NO:142).

28.根据项目22到27中任一项的方法，其中所述KELP多肽包含DEK_C结构域（PF02229）和/或PC4结构域（PF08766）。

29.根据项目22到28中任一项的方法，其中所述KELP编码核酸编码表A2中列出的任一多肽，或是此核酸的部分，或是能够与此核酸杂交的核酸。

30.根据项目22到29中任一项的方法，其中所述核酸序列编码表A2中给出的任何多肽的直向同源物或旁系同源物。

31.根据项目22到30中任一项的方法，其中所述KELP编码核酸具有植物来源，优选来自双子叶植物，还优选来自十字花科，更优选来自拟南芥属，最优选来自拟南芥。

32.根据项目22到31中任一项的方法，其中所述核酸编码SEQ IDNO:65所示多肽。

33.根据项目22到32中任一项的方法，其中所述核酸有效连接至组成型启动子、优选中等强度组成型启动子、优选植物启动子、更优选GOS2启动子、最优选来自稻的GOS2启动子。

34.可通过根据项目22到33中任一项的方法获得的植物、其植物部分（包括种子）、或植物细胞，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含如项目22和27到32中任一项中定义的编码KELP多肽的重组核酸。

35.构建体，其包含：

（i）如项目22和27到32中任一项中定义的编码KELP的核酸；

（ii）一个或多个能够驱动（i）中核酸序列表达的控制序列；和任选的

（iii）转录终止序列。

36.根据项目35的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子、优选中等强度组成型启动子、优选植物启动子、更优选GOS2启动子、最优选来自稻的GOS2启动子。

37.根据项目35或36的构建体的用途，用于制备具有增强的产量相关性状、优选相对于对照植物增加的产量、和更优选相对于对照植物增加的种子产量的植物的方法中。

38.用根据项目35或36的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。

39.产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状、优选相对于对照植物增加的产量、和更优选相对于对照植物增加的种子产量的转基因植物的方法，其包括：

（i）向植物细胞或植物中引入和表达如项目22和27到32中任一项中定义的编码KELP多肽的核酸；和

（ii）在促进植物生长和发育的条件下培养所述植物细胞或植物。

40.转基因植物或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，其中所述转基因植物，由于如项目22和27到32中任一项中定义的编码KELP多肽的核酸的调节表达，相对于对照植物具有增强的产量相关性状、优选相对于对照植物增加的产量、和更优选相对于对照植物增加的种子产量。

41.根据项目34、38或40的转基因植物或源自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物例如甜菜、糖用甜菜或紫花苜蓿；或单子叶植物例如甘蔗；或谷类例如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩耳特小麦（spelt）、裸麦、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、买罗高粱(milo)或燕麦。

42.根据项目34、38、40和41中任一项的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是枝条生物量和/或种子。

43.产生自根据项目34、38、40和41中任一项的植物和/或根据项目42的植物可收获部分的产品。

44.如项目22和27到32中任一项中定义的编码KELP多肽的核酸用于相对于对照植物增强植物的产量相关性状、优选相对于对照植物增加产量、和更优选相对于对照植物增加植物的种子产量的用途。

45.如项目22和27到32中任一项中定义的编码KELP多肽的核酸作为生物标记的用途。

附图说明

现参考以下附图描述本发明，其中：

图1为SEQ ID NO:2的结构域结构，其中保守基序1和2为粗体加下划线表示，并且PP2C结构域（PF00481）为斜体表示。

图2为多种HAB1多肽的多重比对。星号指示在多种蛋白质序列中相同的氨基酸，冒号代表高度保守的氨基酸置换，圆点代表较不保守的氨基酸置换；在其他位置上，不存在序列保守性。当使用保守氨基酸时，这些比对可以用于定义进一步基序或标签序列。

图3显示了HAB1多肽的系统发生树（Saez等人，2004）。

图4显示了实施例3的MATGAT表。

图5为双元载体（binary vector），用于处于稻GOS2启动子（pGOS2）控制之下的HAB1编码核酸在稻中的增加表达。

图6为SEQ ID NO:65的结构域结构，其中指出了保守结构域DEK_C（有下划线的）和PC4（粗斜体的），并且指出了基序3至8。

图7为多个代表性KELP多肽的多重比对。星号指示在多种蛋白质序列中相同的氨基酸，冒号代表高度保守的氨基酸置换，圆点代表较不保守的氨基酸置换；在其他位置上，不存在序列保守性。当使用保守氨基酸时，这些比对可以用于定义进一步基序。

图8显示了多个KELP多肽的系统发生树。可以区分两组KELP蛋白质，I和II组。

图9显示了MATGAT表（实施例3）。所示ID编号对应于下述序列：1.拟南芥_AT4G00980.1；2.欧洲油菜_TC69162；3.；芜菁_AB050390；4.甜菜_CK136750；5.大叶茶_TC17586；6.瓜儿豆（C.tetragonoloba）_TA988_3832；7.红花_EL406762；8.乳浆大戟（E.esula）_DV112325；9.野草莓（F.vesca）_TA10966_57918；10.树棉（G.arboreum）_BF270051；11.树棉_BF274071；12.陆地棉_DR455976；13.陆地棉_TC172528；14.大豆_Glyma03g41890.1；15.大豆_TC289440；16.牵牛（I.nil）_TC8417；17.莴苣_DY977130；18.莴苣_TC21002；19.臭莴苣（L.virosa）_DW152822；20.苹果（M.domestica）_TC30840；21.木薯（M.esculenta）_TA5895_3983；22.烟草_NP916922；23.烟草_TC53347；24.北美白云杉（P.glauca）_DV993483；25.展叶剑叶藓（P.patens）_NP13148677；26.火炬松（P.taeda）_DR054457；27.毛果杨（P.trichocarpa）_797303；28.枳（P.trifoliata）_CV707049；29.两色蜀黍_Sb03g032430.1；30.番柿(S.lycopersicum)_TC195535；31.江南卷柏（S.moellendorffii）_83446；32.拟南芥_AT4G00980.1（SEQ ID NO:65）；33.直果草属物种（Triphysaria_sp）_TC7488；34.葡萄（V.vinifera）_GSVIVT00006727001；35.玉蜀黍_TC523187。

图10为双元载体，用于处于稻GOS2启动子（pGOS2）控制之下的KELP编码核酸在稻中的增加表达。

实施例

现参考以下实施例描述本发明，所述实施例仅意在举例说明。如下实施例并不旨在限制本发明的范围。

DNA操作：除非另外说明，重组DNA技术根据描述于(Sambrook(2001)《分子克隆：实验室手册》，第三版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约)或者Ausubel等(1994),Current Protocols in Molecular Biology,Current Protocols第一卷和第二卷的标准方案进行。用于植物分子工作的标准材料和方法由R.D.D.Croy描述于Plant Molecular Biology Labfase(1993)，由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell ScientificPublications(UK)出版。

实施例1：

HAB1多肽——与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2相关的序列的鉴定

利用了数据库序列搜索工具，例如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410;和Altschul等(1997)NucleicAcids Res.25:3389-3402)，在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库所保持的序列中，鉴定了与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2相关的序列(全长cDNA、EST或基因组序列)。该程序通过将核酸或多肽序列与序列数据库进行比较，以及通过计算匹配的统计学显著性，用于寻找序列之间的局部相似的区域。例如，在TBLASTN算法中，利用了SEQ ID NO:1的核酸编码的多肽，其中使用默认设置，开启过滤器以忽略低复杂度序列。分析的输出视窗为两两比较，并根据概率分值(E值)排序，其中分值反映特定比对偶然发生的概率(E值越低，命中事件的显著性越高)。除了E值之外，还对比较进行同一性百分比记分。同一性百分比是指两比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度上的相同核苷酸(或氨基酸)数。在一些情况下，可调整缺省参数来改变搜索的严格性。例如增加E值以显示不太严格的匹配。这样，可鉴定到短的几乎完全的匹配。

表A1提供与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2相关的核酸序列的列表。

表A1：HAB1核酸和多肽的实例

KELP多肽——与SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65相关的序列的鉴定

利用了数据库序列搜索工具，例如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410;和Altschul等(1997)NucleicAcids Res.25:3389-3402)，在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库所保持的序列中，鉴定了与SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65相关的序列(全长cDNA、EST或基因组序列)。该程序通过将核酸或多肽序列与序列数据库进行比较，以及通过计算匹配的统计学显著性，用于寻找序列之间的局部相似的区域。例如，在TBLASTN算法中，利用了SEQ ID NO:64的核酸编码的多肽，其中使用默认设置，开启过滤器以忽略低复杂度序列。分析的输出视窗为两两比较，并根据概率分值(E值)排序，其中分值反映特定比对偶然发生的概率(E值越低，命中事件的显著性越高)。除了E值之外，还对比较进行同一性百分比记分。同一性百分比是指两比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度上的相同核苷酸(或氨基酸)数。在一些情况下，可调整缺省参数来改变搜索的严格性。例如增加E值以显示不太严格的匹配。这样，可鉴定到短的几乎完全的匹配。

表A2提供SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65以及与SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65相关的核酸序列的列表。

表A2：KELP核酸和多肽的实例

序列已经由研究机构如基因组研究机构(Institute for GenomicResearch,TIGR；始于TA)尝试性地进行了装配并向公众公开。例如，可以通过关键词搜索，或是采用BLAST算法，运用目的核酸序列或多肽序列，利用真核基因直向同源物(Eukaryotic Gene Orthologs,EGO)数据库来鉴定这样的相关序列。已经针对特定的生物，例如一些原核生物，创建了专门的核酸序列数据库，例如由联合基因组研究所(Joint GenomeInstitute)创建。此外，对私有数据库的使用也已允许鉴定新型核酸和多肽序列。

实施例2：多肽序列的比对

HAB1多肽序列的比对

使用Clustal2.0渐进式比对算法（Thompson等人（1997）NucleicAcids Res25:4876-4882；Chenna等人（2003）Nucleic Acids Res31:3497-3500）与标准设置（慢比对，相似性矩阵：Gonnet，空位开放罚分10，空位延伸罚分：0.2），执行多肽序列的比对。进行微小的人工编辑以进一步优化比对。HAB1多肽在图2中进行比对。

如Saez等人，2004中所述，通过比对32种拟南芥PP2Cs的催化核心，构建了HAB1多肽的系统发生树（图3）：紫花苜蓿(Medicagosativa)，MP2C（O24078）；欧洲山毛榉（Fagus sylvatica）,FsPP2C1（Q9M3V0）和FsPP2C2（Q9M3V1）；冰叶日中花（Mesembryanthemum crystallinum）,McPP2C（Q9ZSQ7）；玉蜀黍（Zea mays）,ZmKAPP（O49973）；稻(Oryza sativa),OsKAPP（O81444）；和烟草(Nicotiana tabacum),NtPP2C1（Q9FEW0）。使用拟南芥HAB1的氨基酸序列作为查询序列，在TAIR和NCBI数据库中进行psi-blast序列相似性搜索。集合植物PP2C家族的代表性成员，并且采用clustalx1.81、使用在标识符后示出的氨基酸范围进行比对。在拟南芥HAB1、At1g17550、ABI1和ABI2的情况下，使用的氨基酸范围分别是180–511、179–511、118–434和103–423。最后，生成放射树并且用treeview3.2展示。指出了拟南芥PP2Cs的AGI标识符，并且指出了来自其他植物物种的PP2Cs的SWISS-PROT TrEMBL（SPTREMBL）蛋白质条目。关于ABI1、ABI2、HAB1、PP2CA、KAPP和POLTERGEIST的拟南芥基因组项目（Arabidopsis Genome Initiative）（AGI）标识符分别是At4g26080、At5g57050、At1g72770、At3g11410、At5g19280和At2g46920。

KELP多肽序列的比对

多个KELP多肽在图7中进行比对。使用Clustal（2.0.11）渐进式比对算法（Thompson等人（1997）Nucleic Acids Res25:4876-4882；Chenna等人（2003）Nucleic Acids Res31:3497-3500）与标准设置（慢比对，相似性矩阵：Blosum62，空位开放罚分10，空位延伸罚分：0.2），执行多肽序列的比对。进行微小的人工编辑以进一步优化比对。

构建KELP多肽的系统发生树（图8）。使用Dendroscope2.0.1（Hudson等人（2007）绘制了矩形进化树。该树使用每个聚类的代表性成员生成。

实施例3：计算多肽序列之间的全局同一性百分比

用于本发明方法的全长多肽序列之间的全局相似性和同一性百分比，利用本领域可获得的方法之一MatGAT(矩阵全局比对工具)软件(BMC Bioinformatics.20034:29.MatGAT:an application that generatessimilarity/identity matrices using protein or DNA sequences.CampanellaJJ,Bitincka L,Smalley J;软件由Ledion Bitincka托管)来确定。MatGAT软件无需对数据进行预比对，即可产生DNA或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵。该程序利用Myers和Miller全局比对算法(空位开放罚分为12，而空位延伸罚分为2)进行一系列的两两比对，利用例如Blosum62(对于多肽而言)计算相似性和同一性，然后将结果排列成距离矩阵。

HAB1多肽

多肽序列全长上的全局相似性和同一性的分析结果显示于图4中。序列相似性示于对角线下半部，而序列同一性示于对角线上半部。比较所用的参数有：记分矩阵：Blosum62，首个空位：12，延伸空位：2。与SEQ ID NO:2相比较，用于实施本发明方法的HAB1多肽序列之间的序列同一性（以%表示）可以低至36%，但一般高于40%。

KELP多肽

多肽序列全长上的全局相似性和同一性的分析结果显示于图9中。序列相似性示于对角线下半部，而序列同一性示于对角线上半部。比较所用的参数有：记分矩阵：Blosum62，首个空位：12，延伸空位：2。与SEQ ID NO:65相比较，用于实施本发明方法的KELP多肽序列之间的序列同一性（以%表示）一般高于20%，且优选高于25%。

实施例4：鉴定可以用于实施本发明方法的多肽序列中所含的结构域

蛋白质家族、结构域和位点整合资源(Integrated Resource of ProteinFamilies,Domains and Sites(InterPro))数据库是进行基于文本以及序列的搜索的、常用标签数据库的一个整合界面。InterPro数据库将这些数据库结合起来，这些数据库利用不同的方法学和有关充分表征的蛋白质的不同程度的生物信息来产生蛋白质标签。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAMs。Pfam是覆盖许多常见蛋白质结构域和家族的、多重序列比对和隐马尔可夫模型的大集合。Pfam由位于英国的桑格研究所服务器（Sanger Institute server）托管。Interpro由位于英国的欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute)托管。

HAB1多肽

SEQ ID NO:2所示多肽序列的InterPro扫描（InterPro数据库，发布29.0）结果示于表B1中。

表B1:SEQ ID NO:2所示多肽序列的InterPro扫描结果（主要登录号）。

在一个实施方案中，HAB1多肽包含这样的保守结构域（或基序），其与SEQ ID NO:2中从氨基酸134到439的保守结构域具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。

KELP多肽

SEQ ID NO:65所示多肽序列的InterPro扫描（InterPro数据库，发布28.0）结果示于表B2中。

表B2:SEQ ID NO:65所示多肽序列的InterPro扫描结果（主要登录号）。

实施例5：HAB1多肽或KELP多肽序列的拓扑学预测

TargetP1.1预测真核蛋白质的亚细胞定位。位置分配所基于的是如下任一N-末端前序列的预测性存在：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)。最终预测所基于的分值并非真正的概率，且加起来并不必为1。不过，根据TargetP，得分最高的定位是最可能的，且分值之间的关系(可靠性级别)可作为所述预测的可靠性的指标。可靠性级别(RC)范围从1到5，其中1表示最强的预测。TargetP由丹麦技术大学(Technical University of Denmark)的服务器维护。

对于经预测包含N末端前序列的序列，还可预测潜在切割位点。

HAB1多肽

SEQ ID NO:2所示多肽序列的TargetP1.1分析结果示于表C1。选择的是“植物”生物组、未规定截断值、要求转运肽的预测长度。SEQ IDNO:2所示多肽序列的亚细胞定位可能是细胞质或核，预测无转运肽。

表C1：SEQ ID NO:2所示多肽序列的TargetP1.1分析。缩写：Len，长度；cTP，叶绿体转运肽；mTP，线粒体转运肽;SP，分泌途径信号肽;Other，其他亚细胞靶向;Loc，预测的位置；RC，可靠性级别；TPlen，预测的转运肽长度。

KELP多肽

表C2中给出的PSORT算法的结果表明例如下述情况

表C2：

核	确定性=0.546（肯定）<succ>
		线粒体基质空间	确定性=0.100（肯定）<succ>
内质网（膜）	确定性=0.000（不明确）<succ>
		内质网（腔）	确定性=0.000（不明确）<succ>

因此，基于这些结果，KELP多肽可以预测为定位于核中。

许多其他算法可用于实施此类分析，包括：

-在丹麦技术大学的服务器上托管的ChloroP1.1；

-在澳大利亚布里斯班的昆士兰大学分子生物科学学院（Institute forMolecular Bioscience）的服务器上托管的Protein Prowler SubcellularLocalisation Predictor1.2版;

-在Edmonton,Alberta,Canada的阿尔伯特大学（University ofAlberta）的服务器上托管的PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB2.5;

-在丹麦技术大学的服务器上托管的TMHMM；

-PSORT(URL:psort.org)

-PLOC(Park和Kanehisa,Bioinformatics,19,1656-1663,2003)。

实施例6：用于HAB1多肽的功能测定试验（从Vlad等人2009进行修改）

HAB1作为谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白在大肠杆菌（Escherichiacoli）中产生，并且使用标准方案进行纯化（Leung等人，Plant Cell9:759–771，1997；Gosti等人，Plant Cell11:1897–1910，1999；Robert等人，FEBS Lett.580:4691–4696，2006）。CIP购自New EnglandBiolabs。定制合成如下规定的序列磷酸肽作为粗制肽：OST1AL，SVLHSQPKpSTVGTPAY；OST1S-4D,SVLHDQPKpSTVGTPAY；OST1K-1L,SVLHSQPLpSTVGTPAY；OST1T1Q,SVLHSQPKpSQVGTPAY；和OST1V2D,SVLHSQPKpSTDGTPAY。

首先将磷酸肽溶解于DMSO中作为20mM原液，随后在5mMTris-HCl，pH7.4中稀释至200μM。在含有5μL200μM磷酸肽溶液的384孔黑色板（Greiner Bio-One；781076）中分析肽的去磷酸化。此外，将无机磷酸盐（Pi）标准品（从8到0.002μM）加入不同孔中，用于Pi的绝对定量。磷酸肽（50μM终浓度）在25℃在20μL反应溶液（50mM Tris-HCl，pH7.8，20mM乙酸镁，1mM DTT和0.05%Tween20）中同时去磷酸化，所述反应溶液含有0.5μM磷酸传感器（Invitrogen；PV4406）和蛋白磷酸酶（0.15至7.5ng/μL）。在初步研究中验证，没有检测到来自污染性磷酸盐至高达50μM的最终磷酸肽浓度的荧光背景。使用Tecan Infinite M200（激发415nm/发射450nm），实时记录肽的去磷酸化共2小时（在90秒时间点），作为磷酸盐传感器的荧光增加。使用对数Pi标准曲线，将荧光信号转换为游离磷酸盐的量，并且在曲线的线性期中计算磷酸肽各自的去磷酸化速度（Vi）。

实施例7：

HAB1编码核酸序列的克隆

使用定制的稻幼苗cDNA文库作为模板，通过PCR来扩增核酸序列。使用商购可得的校对Taq DNA聚合酶在标准条件下执行PCR，其中使用在50μl PCR混合物中的200ng模板。使用的引物是prm13731（SEQ ID NO:60；有义，起始密码子为粗体）：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggaggacctcgccctg-3’和prm13732（SEQ ID NO:61；反义，互补）：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcatgctttgctcttgaacttcc-3’，其包括进行Gateway重组的AttB位点。同样利用标准方法纯化扩增的PCR片段。接着进行Gateway操作的第一步，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生Gateway术语所称的“进入（entry）克隆”，即pHAB1。作为技术一部分的质粒pDONR201购自英骏公司（Invitrogen）。

随后包含SEQ ID NO:1的进入克隆与用于稻转化的目的载体（destination vector）一起用于LR反应。此载体在T-DNA边界内包含如下功能性元件：植物可选择标记；可筛选标记表达盒；旨在与已克隆到进入克隆中的目的核酸序列进行LR体内重组的Gateway盒。用于组成型表达的稻GOS2启动子（SEQ ID NO:62）位于此Gateway盒的上游。

在LR重组步骤之后，根据本领域众所周知的方法将所产生的表达载体pGOS2::HAB1（图5）转化到农杆菌菌株LBA4044内。

KELP编码核酸序列的克隆

使用定制的拟南芥幼苗cDNA文库作为模板，通过PCR来扩增本实施例的核酸序列。使用Hifi Taq DNA聚合酶在标准条件下执行PCR，其中使用在50μl PCR混合物中的200ng模板。使用的引物是prm01515（SEQ ID NO:134；有义，起始密码子为有下划线的）：5’ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcacaatggagaaagagacgaaggag3’和prm01516（SEQ IDNO:135；反义，互补的）：5’ggggaccactttgtacaagaaagctgggtatgttcttcattcagacacgc3’，其包括进行Gateway重组的AttB位点。同样利用标准方法纯化扩增的PCR片段。接着进行Gateway操作的第一步，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生Gateway术语所称的“进入（entry）克隆”，即pKELP。作为

技术一部分的质粒pDONR201购自英骏公司。

随后包含SEQ ID NO:64的进入克隆与用于稻转化的目的载体（destination vector）一起用于LR反应。此载体在T-DNA边界内包含如下功能性元件：植物可选择标记；可筛选标记表达盒；旨在与已克隆到进入克隆中的目的核酸序列进行LR体内重组的Gateway盒。用于组成型特异性表达的稻GOS2启动子（SEQ ID NO:136）位于此Gateway盒的上游。

在LR重组步骤之后，根据本领域众所周知的方法，将所产生的表达载体pGOS2::KELP（图10）转化到农杆菌菌株LBA4044内。

实施例8：植物转化

稻转化

用含表达载体的农杆菌转化稻(Oryza sativa)植物。使粳稻栽培种日本晴(Nipponbare)的成熟干种子脱壳。通过在70%乙醇中孵育1分钟，接着在0.2%HgCl2中孵育30分钟，接着用无菌蒸馏水洗6次，每次15分钟进行消毒。然后使消毒的种子在含有2,4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。在黑暗中孵育四周之后，切下盾片来源的胚发生愈伤组织，并在相同的培养基中增殖。两周之后，通过在相同培养基中传代培养另外2周来扩增或者增殖愈伤组织。在共培养之前3天，在新鲜培养基上传代培养胚发生愈伤组织块(以加强细胞分裂活性)。

含有表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培养。农杆菌接种于含有合适抗生素的AB培养基上，并在28℃培养3天。接着收集细菌并悬浮在液体共培养培养基中至光密度(OD600)约为1。接着将悬浮液转移至培养皿，并将愈伤组织浸于悬浮液中15分钟。随后将愈伤组织在滤纸上沾干，转移至固化的共培养培养基中，并在黑暗中于25℃孵育3天。在选择剂的存在下，共培养的愈伤组织在含有2,4-D的培养基上于28℃暗培养四周。在此期间，发育出了快速生长的抗性愈伤组织岛。将此材料转移至再生培养基并在光照下孵育之后，释放了胚发生潜力，在接下来的四至五周发育出了芽。将芽从愈伤组织切下，并在含生长素的培养基中孵育2到3周，将其从培养基转移至土壤。变硬的芽在高湿度和短白昼条件下在温室中培养。

一个构建体产生35-90个或约35个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养室转移到温室。在定量PCR分析验证T-DNA插入物的拷贝数后，只保留对选择剂表现出耐受性的单拷贝转基因植物用以收获T1种子。在移植后三至五个月收获种子。该方法以超过50%的比率产生了单基因座转化体(Aldemita和Hodges1996,Chan等,1993,Hiei等,1994)。

实施例9：其他作物转化

玉米转化

用Ishida等(1996)Nature Biotech14(6):745-50所述方法的改良方案进行玉米(Zea mays)转化。在玉米中转化是基因型依赖性的，并且只有特定的基因型适于转化和再生。近交系A188(明尼苏达大学)或以A188为亲本的杂种是转化供体材料的优良来源，但是也可以成功使用其它基因型。授粉后约11天(DAP)，当未成熟胚的长度是约1至1.2mm时，从玉米植物收获穗。共培养未成熟胚和含有表达载体的根癌农杆菌，并通过器官发生回收转基因植物。切离的胚依次生长在含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可使用多种选择标记)的愈伤组织诱导培养基、和玉米再生培养基上。培养板在光照下于25℃孵育2-3周，或直到芽发育。从每个胚中将绿芽转移到玉米生根培养基上并在25℃孵育2-3周，直到根发育。将生根的芽移植到温室的土壤中。从表现出对选择剂具有耐受性且含有单拷贝T-DNA插入片段的植物产生T1种子。

小麦转化

运用Ishida等(1996)Nature Biotech14(6):745-50描述的方法，进行小麦的转化。栽培种Bobwhite(可从CIMMYT,Mexico(墨西哥)获得)常用来进行转化。共培养未成熟胚和含有表达载体的根癌农杆菌，并通过器官发生回收转基因植株。与农杆菌孵育后，胚依次体外生长在含有选择试剂(例如咪唑啉酮，但可使用多种选择标记)的愈伤组织诱导培养基，和再生培养基上。培养板在光照下于25℃孵育2-3周，或直到芽发育。绿芽从每个胚转移到生根培养基上并在25℃孵育2-3周，直到根发育。将生根的芽移植到温室的土壤中。从表现出对选择剂具有耐受性且含有单拷贝T-DNA插入片段的植物产生T1种子。

大豆转化

根据Texas A&M专利US5,164,310所述方法的改良方案转化大豆。若干商业大豆品种可以通过该方法转化。栽培种Jack(可以得自伊利诺斯种子公司(the Illinois Seed foundation))常用来进行转化。对大豆种子消毒以进行体外播种。从七日龄幼苗中切出下胚轴、胚根和一个子叶。进一步培养上胚轴和剩下的子叶以发育腋结。切离这些腋结并与含有表达载体的根癌农杆菌孵育。在共培养处理后，洗涤外植体并转移到选择培养基中。切离再生的芽，置于芽伸长培养基中。将长度不超过1cm的芽置于生根培养基中直到发育出根。将生根的芽移植到温室的土壤中。从对选择剂表现出耐受性且含有单拷贝T-DNA插入片段的植物产生T1种子。

油菜籽/卡诺拉油菜转化

利用5-6日龄幼苗的子叶柄和下胚轴作为外植体进行组织培养并根据Babic等(1998,Plant Cell Rep17:183-188)进行转化。商业栽培种Westar(加拿大农业(Agriculture Canada))是用作转化的标准品种，但是也可以使用其它品种。对卡诺拉油菜种子表面消毒，进行体外播种。从体外幼苗中切离附着有子叶的子叶柄外植体，并通过将子叶柄外植体的切割端浸入细菌悬浮液中来接种农杆菌(含有表达载体)。随后外植体在含有3mg/lBAP、3%蔗糖、0.7%植物琼脂(Phytagar)的MSBAP-3培养基中于23℃、16小时光照培养2天。与农杆菌共培养2天后，将子叶柄外植体转移到含有3mg/l BAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基中7天，然后在含有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养直到芽再生。当芽长5-10mm时，将其切下并转移到芽伸长培养基(MSBAP-0.5,含有0.5mg/l BAP)中。将约2cm长的芽转移到生根培养基(MS0)中进行根诱导。将生根的芽移植到温室的土壤中。从对选择剂表现出耐受性且含有单拷贝T-DNA插入片段的植物产生T1种子。

苜蓿转化

利用(McKersie等1999Plant Physiol119:839–847)的方法转化苜蓿(紫花苜蓿(Medicago sativa))的再生克隆。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的，因此需要再生植株。获得再生植株的方法已有描述。例如，这些可以选自栽培种Rangelander(加拿大农业(Agriculture Canada))或如Brown DCW和A Atanassov(1985.Plant Cell Tissue Organ Culture4:111-112)所述的任何其它商业苜蓿品种。可选的，已经选择了RA3品种(威斯康辛大学(University of Wisconsin))用于组织培养(Walker等,1978Am J Bot65:654-659)。子叶柄外植体与含有表达载体的根癌农杆菌C58C1pMP90(McKersie等,1999Plant Physiol119:839–847)或LBA4404的过夜培养物进行共培养。外植体在含有288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上在黑暗中共培养3天。将外植体在一半浓度的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤，并置于相同的SH诱导培养基中，但该培养基不含乙酰丁香酮而含有合适的选择剂和合适的抗生素以抑制农杆菌生长。数周后，体细胞胚转移到不含生长调节剂、不含抗生素、含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。体细胞胚随后在半强度Murashige-Skoog培养基上萌发。将生根的幼苗移植到了花盆中并在温室中生长。从对选择剂表现出耐受性且含有单拷贝T-DNA插入片段的植物产生T1种子。

棉花转化

按照US5,159,135中描述的方法使用根癌农杆菌转化棉花。于3%次氯酸钠溶液中20分钟，对棉花种子表面消毒，并且在具有500μg/ml头孢噻肟的蒸馏水中进行洗涤。然后将种子转移至具有50μg/ml苯菌灵(benomyl)的SH培养基中进行萌发。从4至6日龄的幼苗中取出下胚轴，切成0.5厘米的小块，置于0.8%琼脂上。将农杆菌悬浮液（每ml大约108个细胞，从用目的基因和适当的选择标记转化的过夜培养物稀释的）用于接种下胚轴外植体。在室温和光照下3天后，将组织转移至具有Murashige和Skoog盐和B5维生素(Gamborg等,Exp.Cell Res.50:151-158(1968))、0.1mg/l2,4-D、0.1mg/l6-糠氨基嘌呤(6-furfurylaminopurine)和750μg/ml MgCL2、以及50至100μg/ml头孢噻肟和400-500μg/ml羧苄青霉素(以杀死残留细菌)的固体培养基(1.6g/lGelrite)。在2至3个月（每4至6周进行一次传代培养）后分离单细胞系并且将其在选择培养基上进一步培养以进行组织扩增(30℃,16小时光周期)。接着将转化的组织在非选择培养基上进一步培养2至3个月以产生体细胞胚。将至少4mm长的健康外貌的胚转移至具有SH培养基（于细小蛭石中）的试管中，所述培养基补充有0.1mg/l吲哚乙酸、6-糠氨基嘌呤和赤霉酸。将胚在30℃和16小时的光周期下进行培养，将2至3叶期的小植株转移入具有蛭石和营养物的花盆。使植物变硬，然后转移至温室以进一步栽培。

实施例10：表型评估方法

10.1评估设置

产生大约35个独立的T0稻转化体。原代转化体由组织培养室转移到温室进行生长并收获T1种子。保留6个其中T1代发生转基因的存在/缺乏的3:1分离的事件。对于每一个此类事件，通过监测可视标记的表达，选出大约10个含转基因(杂合子和纯合子)的T1幼苗、以及大约10个缺少转基因(无效合子)的T1幼苗。转基因植物和相应的无效合子在随机位置上并排生长。温室条件为短白昼(12小时光照)，日间28℃，夜间22℃，相对湿度70%。除非植物用于胁迫筛选中，否则对在非胁迫条件下生长的植物定期浇水，以确保水和养分是非限制性的以及满足完成生长和发育的植物需要。

从播种期到成熟期，植物数次通过数码成像箱。在每个时间点上对每株植物从至少6个不同的角度获取数码图像(2048×1536像素，1千6百万色)。

可以在T2代中，按照与T1代相同的评估方法，例如用较少的事件和/或更多的个体/事件，对T1事件进行进一步的评估。

干旱筛选

在正常条件下在花盆土中生长了T1或T2植物，直到进入抽穗期。然后将其转移到“干”区，停止灌溉。向随机选择的花盆中插入土壤湿度探测仪，以监测土壤水含量(SWC)。当SWC下降低于一定的阈值时，自动向植物持续补水，直到再次达到正常水平。然后将植物再次重新转移到正常条件下。其余的栽培(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培养的植物相同。如针对在正常条件下生长所详述的那样，记录生长和产量参数。

氮利用效率筛选

可以在除营养液以外为正常的条件下在花盆土中栽培T1或T2植物。从植物移植到成熟，用特定的营养液对花盆进行灌溉，所述营养液含有减小的氮(N)含量，通常少7到8倍。其余的栽培(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培养的植物相同。如对正常条件下生长所详细描述的那样，记录生长和产量参数。

盐胁迫筛选

将T1或T2植物生长在由椰壳纤维和焙烧粘土颗粒(argex)(3:1)制成的基质上。在小植株移植到温室后的头两周期间，应用正常营养液。过了头两周之后，向营养液中添加25mM盐(NaCl)，直至收获植物。如针对正常条件下的生长所详述的那样，记录生长和产量参数。

10.2统计学分析：F检验

利用双因素ANOVA(方差分析)作为统计模型，对植物表型特征进行总体评估。对用本发明基因转化的所有事件的所有植株的所有测量参数进行了F检验。进行F检验以检查基因在所有转化事件上的效应，并验证基因的总体效应，亦称为“整体基因效应”。真实整体基因效应的显著性阈值设置为F检验的5%概率水平。显著性F检验值指示存在基因效应，这意味着引起表型上差异的不仅仅是基因的存在或位置。

10.3测量的参数

从播种期到成熟期，植物数次通过数码成像箱。在每个时间点上对每株植物从至少6个不同的角度获取数码图像(2048×1536像素，1千6百万色)。这些测量用于确定不同参数。

生物量相关参数测量

植物地上面积(或者说叶生物量)通过计数数码图像中区别于背景的地上植物部分的像素总数而确定。此值取同一时间点从不同的角度拍摄的照片的平均值，并通过校准转换为以平方毫米表示的物理表面值。实验表明通过这种方法测量的地上植物面积与植物地上部分的生物量相关。该地上面积是在植物达到其最大叶生物量的时间点测量的面积。

根生物量增加表达为根总生物量(测量为在植物一生中观察到的最大根生物量)的增加；或者表达为根/枝条指数(测量为在根和枝条活跃生长期中根生物量和枝条生物量之间的比值)的增加。换言之，根/枝条指数定义为在根和枝条的活跃生长期中根生长速度与枝条生长速度的比值。根生物量可以使用如WO2006/029987中所述的方法进行测定。

与发育时间相关的参数

早期活力是萌发后三周的植物地上面积。通过计数区别于背景的地上植物部分的像素总数，测定了早期活力。此值取同一时间点从不同的角度拍摄的照片的平均值，并通过校准转换为以平方毫米表示的物理表面值。

当与对照植物相比AreaEmer值降低时，AreaEmer指示快速的早期发育。AreaEmer是植物为产生30%最终生物量所需的时间和为产生90%最终生物量所需的时间之间的比值（以%表示）。

植物的“到开花的时间”或“开花时间”可以使用如WO2007/093444中所述的方法进行测定。

种子相关参数测量

收获成熟的一级圆锥花序、计数、装袋、贴上条形码标记，然后在烤箱中于37℃干燥三天。随后将圆锥花序脱粒，收集并计数所有的种子。种子通常由干燥外壳（谷壳）覆盖。使用鼓风装置将饱满谷壳（本文也称为饱满小花）和空壳分开。弃去空壳，再次计数剩下的部分。在分析天平上称重饱满的谷壳。

通过计数在分离步骤之后剩下的饱满谷壳数，确定了种子总数。通过称量从植物收获的所有饱满谷壳，测量了种子总重量。

通过计数从植物收获的谷壳（无论是饱满的还是不饱满的）数，测量了每株植物的种子（或小花）总数。

根据计数的种子数及其总重量，外推得出千粒重（TKW）。

收获指数（HI）在本发明中定义为，种子总产量和地上面积（mm²）之间的比值乘以因子10⁶。

每个圆锥花序的花数在本发明中定义为，种子总数与成熟的一级圆锥花序数之间的比值。

“种子饱满率”在本发明中定义为，饱满种子（即含有种子的小花）数与种子总数（或小花总数）的比值（表示为%）。换言之，种子饱满率是充满种子的小花的百分比。

实施例11：转基因植物的表型评估结果

HAB1多肽

在干旱胁迫条件下表达HAB1核酸的转基因稻植物显示了增加的饱满率：6个测试品系中的5个具有88.8%的总体增加（p值<0.05）。

KELP多肽

在干旱胁迫条件下在T2代中表达编码SEQ ID NO:65的KELP多肽的核酸的转基因稻植物的评价结果呈现于下表D中。当如上文实施例部分中所述在干旱胁迫条件下生长时，对于种子产量相关参数，观察到了至少5%的增加，并且特别地，对于种子总重量、饱满种子数（即，含有种子的小花数）和饱满率，观察到了至少5%的增加。

表D：转基因稻植物的数据总结；对于每个参数，显示了总体增加百分比，对于每个参数，p值是<0.05。

参数	总体增加
		种子总重量	11.5
饱满种子数	14.0
		饱满率	21.2

Claims (44)

1.一种相对于对照植物增强植物的产量相关性状的方法，其包括调节HAB1多肽编码核酸在植物中的表达，其中所述HAB1多肽包含PF00481PP2C结构域。

2.根据权利要求1的方法，其中所述调节的表达通过在植物中引入和表达编码所述HAB1多肽的所述核酸来实现。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量，且优选包括相对于对照植物增加的种子产量。

4.根据权利要求1到3中任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状在干旱胁迫条件下获得。

5.根据权利要求1到4中任一项的方法，其中所述HAB1多肽包含下述基序中的一个或多个：

（i）基序1:PLWG[FLS][TEV]SICG[RK]RPEMED[DA][YV][AV][ATV]VPRF[LF][KDQ][ILV]P[ILS][KW]M[VL][AT][GD][DN][RAH](SEQ ID NO:55),

(ii)基序2：[LM][DS][PRA][SAM][SL]F[RH]L[TP][AS]H[FL]F[AG]VYDGH[DG]G[AVS]Q(SEQ ID NO:56)。

6.根据权利要求1到5中任一项的方法，其中所述HAB1编码核酸为植物来源的，优选来自单子叶植物，还优选来自禾本科，更优选来自稻属，最优选来自稻。

7.根据权利要求1到6中任一项的方法，其中所述HAB1编码核酸编码表A1中列出的任何一个多肽，或是此核酸的部分，或是能够与此核酸杂交的核酸。

8.根据权利要求1到7中任一项的方法，其中所述核酸序列编码表A1中给出的任何多肽的直向同源物或旁系同源物。

9.根据权利要求1到8中任一项的方法，其中所述核酸编码SEQ IDNO:2所示多肽。

10.根据权利要求1到9中任一项的方法，其中所述核酸有效连接至组成型启动子、优选中等强度组成型启动子、优选植物启动子、更优选GOS2启动子、最优选来自稻的GOS2启动子。

11.可通过根据权利要求1到10中任一项的方法获得的植物、其植物部分,包括种子、或植物细胞，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含如权利要求1和5到9中任一项中定义的编码HAB1多肽的重组核酸。

12.构建体，其包含：

（i）如权利要求1和5到9中任一项中定义的编码HAB1的核酸；

（ii）一个或多个能够驱动（i）中核酸序列表达的控制序列；和任选的

（iii）转录终止序列。

13.根据权利要求12的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子、优选中等强度组成型启动子、优选植物启动子、更优选GOS2启动子、最优选来自稻的GOS2启动子。

14.根据权利要求12或13的构建体在用于制备相对于对照植物具有增强的产量相关性状、优选增加的种子产量的植物的方法中的应用。

15.用根据权利要求12或13的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。

16.产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状、优选相对于对照植物增加的种子产量的转基因植物的方法，其包括：

（i）向植物细胞或植物中引入和表达如权利要求1和5到9中任一项中定义的编码HAB1多肽的核酸；和

（ii）在促进植物生长和发育的条件下培养所述植物细胞或植物。

17.转基因植物或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，其中所述转基因植物，由于如权利要求1和5到9中任一项中定义的编码HAB1多肽的核酸的调节表达，相对于对照植物具有增强的产量相关性状、优选相对于对照植物具有增加的种子产量。

18.根据权利要求11、15或17的转基因植物或源自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，例如甜菜、糖用甜菜或紫花苜蓿；或单子叶植物例如甘蔗；或谷类例如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩耳特小麦、裸麦、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、买罗高粱或燕麦。

19.根据权利要求18的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是枝条生物量和/或种子。

20.产生自根据权利要求18的植物和/或根据权利要求19的植物可收获部分的产品。

21.如权利要求1和5到9中任一项中定义的编码HAB1多肽的核酸用于相对于对照植物增强植物的产量相关性状、优选相对于对照植物增加植物的种子产量的用途。

22.一种相对于对照植物增强植物的产量相关性状的方法，其包括调节KELP多肽编码核酸在植物中的表达，其中所述KELP多肽包含下述基序中的一个或多个：

（i)基序3：CRLSDKRRVT[ILV]Q[DE]F[RK]GK[TS]LVSIRE[YF](SEQ ID NO:137),

（ii)基序4：YKKDGKELP[ST][SA]KGISLT[EDA]EQWS[TA][FL][KR](SEQ ID NO:138),

(iii)基序5:AS[EX][KR]L[GA][LI]DLSE[PSK][ES][YRH]K[AK]FVR[HQS]VV[EN][SK]F(SEQ ID NO:139)。

23.根据权利要求22的方法，其中所述调节的表达通过在植物中引入和表达编码所述KELP多肽的所述核酸来实现。

24.根据权利要求22或23的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量，且优选包括相对于对照植物增加的种子产量。

25.根据权利要求22到24中任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。

26.根据权利要求22到25中任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状在干旱胁迫、盐胁迫或氮缺乏条件下获得。

27.根据权利要求22到26中任一项的方法，其中所述KELP多肽还包含下述基序中的一个或多个：

(i)基序6：DD[DE]GDLIICRLSDKR[RK]VT[IL]Q(SEQ ID NO:140);

(ii)基序7：GKELP[ST]SKGISLT[ED]EQWS[TA][FL](SEQ ID NO:141);

(iii)基序8：[LI]DLS[EKQ][PSK][EKS][YFH]KA[FY]V[RK][HSQ]VV[NE][AKST]FL(SEQ ID NO:142)。

28.根据权利要求22到27中任一项的方法，其中所述KELP多肽包含DEK_C结构域（PF02229）和/或PC4结构域（PF08766）。

29.根据权利要求22到28中任一项的方法，其中所述KELP编码核酸编码表A2中列出的任一多肽，或是此核酸的部分，或是能够与此核酸杂交的核酸。

30.根据权利要求22到29中任一项的方法，其中所述核酸序列编码表A2中给出的任何多肽的直向同源物或旁系同源物。

31.根据权利要求22到30中任一项的方法，其中所述KELP多肽编码核酸为植物来源的，优选来自双子叶植物，还优选来自十字花科，更优选来自拟南芥属，最优选来自拟南芥。

32.根据权利要求22到31中任一项的方法，其中所述核酸编码SEQID NO:65所示多肽。

33.根据权利要求22到32中任一项的方法，其中所述核酸有效连接至组成型启动子、优选中等强度组成型启动子、优选植物启动子、更优选GOS2启动子、最优选来自稻的GOS2启动子。

34.可通过根据权利要求22到33中任一项的方法获得的植物、其植物部分，包括种子、或植物细胞，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含如权利要求22和27到32中任一项中定义的编码KELP多肽的重组核酸。

35.构建体，其包含：

（i）如权利要求22和27到32中任一项中定义的编码KELP的核酸；

（ii）一个或多个能够驱动（i）中核酸序列表达的控制序列；和任选的

（iii）转录终止序列。

36.根据权利要求35的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子、优选中等强度组成型启动子、优选植物启动子、更优选GOS2启动子、最优选来自稻的GOS2启动子。

37.根据权利要求35或36的构建体在用于制备具有增强的产量相关性状、优选相对于对照植物增加的产量、和更优选相对于对照植物增加的种子产量的植物的方法中的应用。

38.用根据权利要求34或36的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。

39.产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状、优选相对于对照植物增加的产量、和更优选相对于对照植物增加的种子产量的转基因植物的方法，其包括：

（i）向植物细胞或植物中引入和表达如权利要求22和27到32中任一项中定义的编码KELP多肽的核酸；和

（ii）在促进植物生长和发育的条件下培养所述植物细胞或植物。

40.转基因植物或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，其中所述转基因植物，由于如权利要求22和27到32中任一项中定义的编码KELP多肽的核酸的调节表达，相对于对照植物具有增强的产量相关性状、优选相对于对照植物增加的产量、和更优选相对于对照植物增加的种子产量。

41.根据权利要求34、38或40的转基因植物或源自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物例如甜菜、糖用甜菜或紫花苜蓿；或单子叶植物例如甘蔗；或谷类例如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩耳特小麦、裸麦、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、买罗高粱或燕麦。

42.根据权利要求34、38、40和41中任一项的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是枝条生物量和/或种子。

43.产生自根据权利要求34、38、40和41中任一项的植物和/或根据权利要求42的植物可收获部分的产品。

44.如权利要求22和27到32中任一项中定义的编码KELP多肽的核酸用于相对于对照植物增强植物的产量相关性状、优选相对于对照植物增加植物的产量、和更优选相对于对照植物增加植物的种子产量的用途。

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