DE112011103723T5

DE112011103723T5 - Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen und Verfahren zu deren Herstellung

Info

Publication number: DE112011103723T5
Application number: DE112011103723T
Authority: DE
Inventors: Ana Isabel Sanz Molinero; Valerie Frankard
Original assignee: BASF Plant Science Co GmbH
Current assignee: BASF Plant Science Co GmbH
Priority date: 2010-11-10
Filing date: 2011-11-08
Publication date: 2013-08-08
Also published as: EP2638166A4; CN103298943A; US20130298288A1; EP2638166A1; WO2012063200A1; AU2011327749A1; MX2013005236A; CA2815969A1; BR112013011523A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Steigerung verschiedener ökonomisch wichtiger Ertragsmerkmale in Pflanzen. Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein HAB1-(Hypersensitive to ABA1)-Polypeptid oder ein KELP-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein HAB1-Polypeptid oder ein KELP-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen gesteigerte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch bislang unbekannte, für HAB1 codierende Nukleinsäuren und Konstrukte, die für HAB1 oder KELP codierende Nukleinsäuren enthalten, bereit, die sich für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein HAB1(Hypersensitive to ABA1)-Polypeptid oder ein KELP-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein HAB1-Polypeptid oder ein KELP-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen gesteigerte Ertragsmerkmale im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die bei den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind.
Die stetig anwachsende Weltbevölkerung und die schwindende Reserve an anbaufähigem Land, das für die Landwirtschaft zur Verfügung steht, treibt die Forschung hin zur Erhöhung der Effizienz der Landwirtschaft. Herkömmliche Methoden für Verbesserungen bei Kulturpflanzen und Gartenpflanzen wenden selektive Züchtungstechniken zum Identifizieren von Pflanzen mit wünschenswerten Merkmalen an. Allerdings weisen derartige selektive Züchtungstechniken mehrere Nachteile dahingehend auf, dass diese Techniken typischerweise arbeitsintensiv sind und zu Pflanzen führen, welche häufig heterogene genetische Komponenten enthalten, welche nicht immer dazu führen können, dass die erwünschte Eigenschaft von Elternpflanzen weitergegeben wird. Die Fortschritte in der Molekularbiologie haben es der Menschheit erlaubt, das Keimplasma von Tieren und Pflanzen zu modifizieren. Die gentechnische Manipulation von Pflanzen beinhaltet die Isolierung und Manipulierung von genetischem Material (typischerweise in der Form von DNA oder RNA) und die anschließende Einbringung dieses genetischen Materials in eine Pflanze. Diese Technologie weist das Vermögen auf, Kulturpflanzen oder Pflanzen mit verschiedenen verbesserten wirtschaftlichen, landwirtschaftlichen oder gärtnerischen Eigenschaften zur Verfügung zu stellen.
Eine Eigenschaft von besonderem wirtschaftlichem Interesse ist ein erhöhter Ertrag. Der Ertrag ist normalerweise als der messbare Gewinn von ökonomischem Wert aus einer Kulturpflanze definiert. Dies kann in Bezug auf die Quantität und/oder Qualität definiert sein. Der Ertrag ist direkt von mehreren Faktoren, wie zum Beispiel der Anzahl und Größe der Organe, der Pflanzenarchitektur (zum Beispiel der Anzahl an Verzweigungen), der Samenproduktion, der Blatt-Seneszenz und sonstigem, abhängig. Wurzelentwicklung, Nährstoffaufnahme, Stresstoleranz und Jungpflanzenvitalität können ebenfalls bedeutende Faktoren bei der Bestimmung des Ertrags sein. Das Optimieren der oben erwähnten Faktoren kann daher zu einer Erhöhung des Kulturpflanzenertrags beitragen.
Der Samenertrag ist ein besonders wichtiges Merkmal, da die Samen vieler Pflanzen für die menschliche und tierische Ernährung wichtig sind. Kulturpflanzen, wie Mais, Reis, Weizen, Canola und Sojabohne, machen über die Hälfte der gesamten menschlichen Kalorienaufnahme aus, ob durch direkten Verzehr der Samen selbst oder durch Verzehr von Fleischprodukten, welche auf Grundlage verarbeiteter Samen erzeugt wurden. Sie stellen ebenfalls eine Quelle für Zucker, Öle und viele Arten von Metaboliten, die in industriellen Verfahren verwendet werden, dar. Samen enthalten einen Embryo (die Quelle von neuen Sprossen und Wurzeln) sowie ein zahlreiche Gene und erfordert den Transfer von Metaboliten aus den Wurzeln, Blättern und Stängeln in den wachsenden Samen. Das Endosperm assimiliert im Besonderen die Stoffwechselvorläufer von Kohlenhydraten, Ölen und Proteinen und synthetisiert sie zu Speichermakromolekülen, um das Korn auszufüllen.
Eine andere bedeutende Eigenschaft für viele Kulturpflanzen ist die Jungpflanzenvitalität. Die Verbesserung der Jungpflanzenvitalität ist ein wichtiges Ziel bei modernen Reis-Züchtungsprogrammen sowohl in gemäßigten als auch tropischen Reis-Kultivaren. Lange Wurzeln sind wichtig für eine korrekte Bodenverankerung bei in Wasser ausgesätem Reis. Falls Reis direkt in überflutete Ackerfelder ausgesät wird und falls die Pflanzen rasch durch das Wasser auftauchen müssen, stehen längere Sprosse mit der Wuchskraft in Zusammenhang. Wo eine Aussaat mit Drillvorrichtung praktiziert wird, sind längere Mesokotyle und Koleoptile für eine günstige Setzlingsemergenz bedeutsam. Die Fähigkeit, Jungpflanzenvitalität künstlich in Pflanzen einzubringen, wäre für die Landwirtschaft von großer Bedeutung. Zum Beispiel war eine geringe Jungpflanzenvitalität eine Einschränkung bei der Einführung von Mais-(Zea Mais L.)-Hybriden auf der Basis von ”Corn Belt”-Keimplasma im europäischen Atlantikraum.
Ein weiteres wichtiges Merkmal ist das einer verbesserten Toleranz gegenüber abiotischem Stress. Abiotischer Stress ist eine Hauptursache für weltweiten Ernteverlust, wobei die Durchschnittserträge für die meisten wichtigen Kulturpflanzen um mehr als 50% reduziert werden (Wang et al., Planta 218, 1–14, 2003). Abiotische Stressfaktoren können durch Dürre, Salzgehalt, Temperaturextreme, chemische Toxizität und oxidativen Stress verursacht werden. Die Fähigkeit zur Verbesserung der Pflanzentoleranz gegenüber abiotischem Stress wäre weltweit für Landwirte von großem wirtschaftlichen Vorteil und würde den Anbau von Kulturpflanzen während ungünstiger Bedingungen sowie in Territorien, auf welchen eine Kultivierung von Kulturpflanzen ansonsten nicht möglich sein kann, gestatten.
Der Kulturpflanzenertrag kann daher durch Optimieren von einem der oben erwähnten Faktoren erhöht werden.
Abhängig von der Endanwendung kann die Modifikation bestimmter Ertragseigenschaften gegenüber anderen bevorzugt sein. Beispielsweise kann für Anwendungen wie Futtermittel- oder Holzproduktion oder Biotreibstoff-Ressourcen ein Zuwachs bei den vegetativen Teilen einer Pflanze wünschenswert sein, und für Anwendungen wie Mehl-, Stärke- oder Ölproduktion kann ein Zuwachs hinsichtlich der Samenparameter besonders erwünscht sein. Sogar unter den Samenparametern können, abhängig vom Verwendungszweck, manche gegenüber anderen bevorzugt sein. Verschiedene Mechanismen können zur Erhöhung des Samenertrags beitragen, ungeachtet dessen, ob diese in Form einer erhöhten Samengröße oder einer erhöhten Samenzahl vorliegen.
Weiterhin wurde jetzt auch gefunden, dass sich verschiedene Ertragsmerkmale in Pflanzen verbessern lassen, indem man in einer Pflanze die Expression einer in einer Pflanze für ein HAB1(Hypersensitive to ABA1)-Polypeptid oder ein KELP-Polypeptid codierenden Nukleinsäure moduliert.
Hintergrund
Hypersensitive to ABA1 (HAB1)
HYPERSENSITIVE TO ABA1 (HAB1) ist eine Proteinphosphatase vom Typ 2C (PP2C), die eine Schlüsselrolle als ein negativer Regulator der ABA-Signalvermittlung spielt und eng mit ABI1, ABI2 und At1g17550 (HAB2) verwandt ist. Speziell wurde gezeigt, dass HAB1, ABI1, ABI2 und PP2CA sowohl Samenreaktionen als auch vegetative Reaktionen auf ABA beeinflussen. Das Phytohormon Abscisinsäure (ABA) ist an der Anpassung an Umweltstress und der Steuerung der Pflanzenentwicklung beteiligt. ABA bindet an den Rezeptor PYR1, der wiederum an PP2Cs bindet und diese hemmt. In Gegenwart von exogener ABA zeigen hab1-1-Mutanten eine gegenüber ABA überempfindliche Inhibierung der Samenkeimung. Der gegenüber ABA überempfindliche Phänotyp von hab1-1-Samen deutet zusammen mit der reduzierten ABA-Empfindlichkeit. von 35S:HAB1-Pflanzen auf eine Rolle von HAB1 als negativer Regulator der ABA-Signalvermittlung. HAB1 ist Teil eines Proteinkomplexes, in welchem PYL5 und SWI3B identifiziert wurden. In-vitro-Experimente haben gezeigt, dass i) HAB1 OST1 dephosphoryliert und deaktiviert, ii) HAB1 und die verwandten PP2Cs ABI1 und ABI2 mit OST1 wechselwirken. Diese Ergebnisse bieten Belege dafür, dass PP2Cs direkt an der ABA-abhängigen Aktivierung von OST1 beteiligt sind, und legen weiterhin nahe, dass der Aktivierungsmechanismus von mit AMPK/Snf1 verwandten Kinasen über die Inhibierung der Regulierung von PP2Cs von Pflanzen bis Menschen konserviert ist.
KELP-Polypeptid
Die Aktivierung der Transkription in Eukaryoten hängt vom Zusammenspiel zwischen sequenzspezifischen Transkriptionsaktivatoren und allgemeinen Transkriptionsfaktoren ab. Während in vitro direkte Kontakte zwischen Aktivatoren und allgemeinen Faktoren gezeigt wurden, scheint für die transkriptionelle Aktivierung einiger Gene eine weitere, als Koaktivatoren bezeichnete Klasse von Proteinen erforderlich zu sein.
Es wurde berichtet, dass es sich bei den KELP-Proteinen von Pflanzen um Transkriptionskoaktivatoren handelt. Ein KELP-Protein aus Arabidopsis, bei dem es sich um einen putativen Transkriptionskoaktivator für ein mit Pathogenese in Zusammenhang stehendes Gen handelt, wurde bereits von Cormack et al. beschrieben (1998 – Plant Journal, 14(6), 685–692). Ursprünglich wurde mittels Hefe-Zwei-Hybrid-System gezeigt, dass KELP mit einem anderen Transkriptionskoaktivator, KIWI, wechselwirkt (Cormack et al., 1998). Die Autoren führten Zwei-Hybrid-Wechselwirkungsscreeningstudien in Hefe durch, durch die die Wechselwirkung von zwei Proteinen aus Arabidopsis, die beide Sequenzähnlichkeit mit einer Familie von Transkriptionskoaktivatoren aus einem Bereich verschiedener Organismen zeigen, festgestellt wurde. Ein modifizierter Hefe-Zwei-Hybrid-Ansatz unter Verwendung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) aus Aequora Victoria wurde entwickelt und angewendet, um einen der putativen Pflanzentranskriptionskoaktivatoren aus einer Arabidopsis-cDNA-Bibliothek zu klonieren. Cormack et al. (1998) berichteten, dass die beiden als KIWI und KELP bezeichneten Proteine sich beide hetero- und homomer assoziieren können, und ihre Gene wurden kloniert und auf dem Arabidopsis-Genom kartiert. Man nimmt an, dass beide Proteine eine Rolle bei der Genaktivierung während der Abwehr von Pathogenen und der Entwicklung der Pflanze spielen. Cormack et al. (1998) berichten weiterhin, dass das Arabidopsis-Genom eine Kopie des identifizierten KELP-Gens enthält, und sie kartierten KELP auf dem Chromosom 4. Das KELP-Protein aus Arabidopsis soll sechs potentielle Proteinkinase-C-(PKC)- und vier potentielle Kaseinkinase-II-(CK2)-Phosphorylierungsstellen enthalten.
Matsushita et al. (2001 – Mol Cells, 12(1): 57–66) beschrieben einen Klon, der für ein mit dem KELP von A. thaliana (AtKELP) in hohem Grade homologes Protein codiert. Die Autoren führten ein Far-Western-Screening einer Brassica campestris-cDNA-Bibliothek durch, wobei sie als Sonde ein rekombiniertes Bewegungsprotein (Movement Protein, MP) des Tomatenmosaiktobamovirus (TOMV) einsetzten. Es wurde gefunden, dass es sich bei einem der positiven Klone, der als MIP102 bezeichnet wurde, um ein putatives Ortholog für einen Transkriptionskoaktivator KELP aus Arabidopsis thaliana handelt. Die Autoren präsentierten die Nukleotidsequenz der MIP102-cDNA und deren abgeleitete Aminosäuresequenz.
Sasaki et al. (2009 – Mol. Plant Pathol. 10(2): 161–173) untersuchten die Auswirkungen der vorübergehenden Überexpression von KELP auf eine ToMV-Infektion und die intrazelluläre Lokalisierung von MP in Nicotiana benthamiana, einem experimentellen Wirt des Virus. Bei Kobombardierungsexperimenten wurde die Bewegung des Virus von Zelle zu Zelle durch eine Überexpression von KELP inhibiert. Weiterhin führte die Überexpression von KELP, das mit ToMV-MP kolokalisiert war, zur Verminderung der plasmodesmonalen Assoziation von MP. In Abwesenheit einer MP-Expression war KELP durch das Lokalisierungssignal in seiner N-terminalen Hälfte im Kern und im Zytoplasma lokalisiert. Die Autoren regten an, dass eine Überexpression von KELP als inhibierender Faktor bei der Virusbewegung fungieren kann.
Zusammenfassung
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass man durch Modulieren der Expression einer für ein wie hier definiertes HAB1-Polypeptid oder KELP-Polypeptid codierenden Nukleinsäure Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, insbesondere einem erhöhten Ertrag und ganz insbesondere einem erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, erhält, wenn die Pflanzen unter Dürrestressbedingungen herangezogen werden.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen wie hier bereitgestellt in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, bei dem man die Expression einer für ein wie hier definiertes HAB1-Polypeptid oder KELP-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze moduliert.
Die Titel und Überschriften in der vorliegenden Beschreibung dienen lediglich zum Zweck der Übersichtlichkeit und für Verweise und sollen die Bedeutung bzw. Interpretation der vorliegenden Beschreibung in keiner Weise beeinträchtigen.
Definitionen
Die folgenden Definitionen werden in der gesamten vorliegenden Erfindung verwendet.
Polypeptid(e)/Protein(e)
Die Begriffe ”Polypeptid” und ”Protein” werden hierin austauschbar verwendet und betreffen Aminosäuren in einer polymeren Form von beliebiger Länge, welche durch Peptidbindungen miteinander verbunden sind.
Polynukleotid(e)/Nukleinsäure(n)/Nukleinsäuresequenz(en)/Nukleotidsequenz(en)
Die Begriffe ”Polynukleotid(e)”, ”Nukleinsäuresequenz(en)”, ”Nukleotidsequenz(en)”, ”Nukleinsäure(n)”, ”Nukleinsäuremolekül” werden hierin austauschbar verwendet und beziehen sich auf Nukleotide, entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide oder eine Kombination von beiden, in einer polymeren unverzweigten Form von beliebiger Länge.
Homolog(e)
”Homologe” eines Proteins umfassen Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, Proteine und Enzyme, welche Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen im Vergleich zum betreffenden unmodifizierten Protein aufweisen und eine ähnliche biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodifizierte Protein, aus dem sie abgeleitet sind, besitzen.
Eine Deletion bezieht sich auf die Entfernung von einer oder mehreren Aminosäuren aus einem Protein.
Eine Insertion bezieht sich darauf, dass ein oder mehrere Aminosäurereste in eine vorbestimmte Stelle in einem Protein eingeführt werden. Insertionen können N-terminale und/oder C-terminale Fusionen sowie Intra-Sequenz-Insertionen einzelner oder mehrerer Aminosäuren umfassen. Im Allgemeinen werden Insertionen innerhalb der Aminosäuresequenz kleiner als N- oder C-terminale Fusionen, und zwar in der Größenordnung von etwa 1 bis 10 Resten, sein. Zu Beispielen für N- oder C-terminale Fusionsproteine oder -peptide zählen die Bindungsdomäne oder Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsaktivators, wie im Hefe-Zwei-Hybrid-System verwendet, Phagen-Hüllproteine, (Histidin)-6-Tag, Glutathion-S-Transferase-Tag, Protein A, Maltose-Bindungsprotein, Dihydrofolatreduktase, Tag·100-Epitop, c-myc-Epitop, FLAG^®-Epitop, lacZ, CMP (Calmodulin-bindendes Peptid), HA-Epitop, Protein-C-Epitop und VSV-Epitop.

Eine Substitution bezieht sich auf die Ersetzung von Aminosäuren des Proteins durch andere Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (wie etwa einer ähnlichen Hydrophobizität, Hydrophilizität, Antigenizität, Neigung zur Bildung oder Aufbrechung von α-helikalen Strukturen oder β-Blatt-Strukturen). Aminosäuresubstitutionen sind typischerweise an Einzelresten vorhanden, können aber abhängig von den funktionellen Erfordernissen, welche dem Polypeptid auferlegt sind, gehäuft vorliegen und können im Bereich von 1 bis 10 Aminosäuren liegen; Insertionen werden üblicherweise eine Größenordnung von etwa 1 bis 10 Aminosäureresten aufweisen. Die Aminosäuresubstitutionen sind vorzugsweise konservative Aminosäuresubstitutionen. Tabellen mit konservativen Substitutionen sind im Stand der Technik gut bekannt (siehe zum Beispiel Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company (Hrsg.) und Tabelle 1 unten). Tabelle 1: Beispiele für konservierte Aminosäuresubstitutionen

Rest	Konservative Substitutionen	Rest	Konservative Substitutionen
Ala	Ser	Leu	Ile; Val
Arg	Lys	Lys	Arg; Gln
Asn	Gln; His	Met	Leu; Ile
Asp	Glu	Phe	Met; Leu; Tyr
Gln	Asn	Ser	Thr; Gly
Cys	Ser	Thr	Ser; Val
Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp; Phe
His	Asn; Gln	Val	Ile; Leu
Ile	Leu, Val

Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen können mit Hilfe von auf dem Fachgebiet allgemein bekannten Peptidsynthesetechniken, wie etwa der Festphasen-Peptidsynthese und dergleichen, oder durch rekombinante DNA-Manipulation leicht ausgeführt werden. Verfahren für die Manipulierung von DNA-Sequenzen zur Erzeugung von Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten eines Proteins sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt. Zum Beispiel sind Techniken zur Herstellung von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in der DNA dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt und schließen M13-Mutagenese, T7-Gen-in-vitro-Mutagenese (USB, Cleveland, OH), QuickChange-ortsgerichtete Mutagenese (Stratagene, San Diego, CA), PCR-vermittelte ortsgerichtete Mutagenese oder sonstige ortsgerichtete Mutagenese-Protokolle ein.
Derivate
”Derivate” beinhalten Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, welche im Vergleich zur Aminosäuresequenz der natürlich vorkommenden Form des Proteins, wie dem Protein von Interesse, Substitutionen von Aminosäuren mit nicht natürlich vorkommenden Aminosäureresten, oder Additionen von nicht natürlich vorkommenden Aminosäureresten, umfassen können. ”Derivate” eines Proteins beinhalten außerdem Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, welche natürlich vorkommende, veränderte (glykosylierte, acylierte, prenylierte, phosphorylierte, myristoylierte, sulfatierte etc.) oder nicht natürlich veränderte Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden Form des Polypeptids umfassen. Ein Derivat kann außerdem eine(n) oder mehrere Nicht-Aminosäure-Substituenten oder -Additionen im Vergleich zu der Aminosäuresequenz, aus der es abgeleitet ist, wie zum Beispiel ein Reportermolekül oder einen anderen Liganden, der kovalent oder nichtkovalent an die Aminosäuresequenz gebunden ist, wie etwa ein Reportermolekül, das gebunden ist, um dessen Nachweis zu erleichtern, sowie nichtnatürlich vorkommende Aminosäurereste im Vergleich zur Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Proteins umfassen. Ferner zählen zu ”Derivaten” ebenfalls Fusionen der natürlich vorkommenden Form des Proteins mit Tagging-Peptiden, wie FLAG, HIS6 oder Thioredoxin (für einen Übersichtsartikel über Tagging-Peptide, siehe Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523–533, 2003).
Ortholog(e)/Paralog(e)
Orthologe und Paraloge umfassen evolutionäre Konzepte, die zur Beschreibung der anzestralen Beziehungen von Genen zur Anwendung kommen. Paraloge sind Gene innerhalb derselben Spezies, welche aus der Duplikation eines anzestralen Gens hervorgegangen sind; Orthologe sind Gene aus unterschiedlichen Organismen, welche durch Speziation hervorgegangen sind, und sind ebenfalls von einem gemeinsamen anzestralen Gen abgeleitet.
Domäne, Motiv/Consensus-Sequenz/Signatur
Der Begriff ”Domäne” bezieht sich auf einen Satz von Aminosäuren, welche an spezifischen Positionen entlang eines Alignments von Sequenzen evolutionär verwandter Proteine konserviert sind. Während Aminosäuren an anderen Positionen zwischen Homologen variieren können, deuten Aminosäuren, welche an spezifischen Positionen hochkonserviert sind, auf Aminosäuren hin, die wahrscheinlich in der Struktur, Stabilität oder Funktion eines Proteins wesentlich sind. Identifiziert durch das hohe Ausmaß ihrer Konservierung in alignierten Sequenzen einer Familie von Proteinhomologen können sie als Identifikatoren verwendet werden, um zu ermitteln, ob ein beliebiges betreffendes Polypeptid einer bereits identifizierten Polypeptidfamilie angehört.
Der Begriff ”Motiv” oder ”Consensus-Sequenz” oder ”Signatur” bezieht sich auf eine kurze konservierte Region in der Sequenz von evolutionär verwandten Proteinen. Motive sind häufig hochkonservierte Teile von Domänen, aber können ebenfalls lediglich einen Teil der Domäne einschließen oder außerhalb einer konservierten Domäne liegen (wenn alle Aminosäuren des Motives außerhalb einer definierten Domäne liegen).
Es gibt Spezialdatenbanken für die Identifizierung von Domänen, zum Beispiel SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242–244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315–318), Prosite (Bucher und Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids. Res. 32: D134–D137, (2004)), oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276–280 (2002)). Eine Auswahl an Werkzeugen für die Analyse von Proteinsequenzen in silico ist auf dem ExPASy-Proteomics-Server (Schweizer Institut für Bioinformatik; Gasteiger et al., ExPASy: the Proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003)) verfügbar. Domänen oder Motive können auch unter Anwendung von Routinetechniken, wie etwa durch Sequenzalignment, identifiziert werden.
Verfahren für das Alignment von Sequenzen zum Vergleich sind im Fachgebiet allgemein bekannt, wobei GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA zu derartigen Verfahren zählen. GAP verwendet den Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48: 443–453) zur Ermittlung des globalen (d. h. die vollständigen Sequenzen überspannenden) Alignments von zwei Sequenzen, welches die Anzahl an Übereinstimmungen maximiert und die Anzahl an Lücken minimiert. Der BLAST-Algorithmus (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–10) berechnet die prozentuale Sequenzidentität und führt eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den zwei Sequenzen durch. Die Software zum Ausführen der BLAST-Analyse ist über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) öffentlich verfügbar. Homologe können leicht identifiziert werden, indem zum Beispiel der ClustalW-Multiple-Sequenz-Alignment-Algorithmus (Version 1.83) mit den vorgegebenen paarweisen Alignment-Parametern und einer Bewertungsmethode in Prozent angewandt wird. Die globalen Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität können auch unter Anwendung eines der Verfahren ermittelt werden, die im MatGAT-Software-Paket (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 10. Juli 2003; 4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences) verfügbar sind. Zur Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven kann eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt werden, wie es dem Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein wird. Darüber hinaus können, anstatt der Verwendung von Volllängensequenzen zur Identifizierung von Homologen, auch spezifische Domänen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können über die gesamte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz oder über ausgewählte Domänen oder konservierte Motiv(e) hinweg bestimmt werden, wobei die oben erwähnten Programme unter Anwendung der Standardparameter verwendet werden. Für lokale Alignments ist der Smith-Waterman-Algorithmus besonders nützlich (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol. 147(1); 195–7).
Reciprocal BLAST
In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung einer beliebigen der in Tabelle A des Beispielteils aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im Allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nichtgefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Abfragesequenz abgeleitet ist, zurückgeBLASTet. Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Abfragesequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Abfragesequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Abfragesequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Abfragesequenz zu den höchsten Treffern zählt.
Hoch eingestufte Übereinstimmungstreffer sind diejenigen mit einem niedrigen E-Wert. Je niedriger der E-Wert, umso signifikanter die Wertung (oder in anderen Worten, umso niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Treffer durch Zufall gefunden wurde). Wie man den E-Wert berechnet, ist im Stand der Technik bekannt. Zusätzlich zu E-Werten werden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg. Im Fall von großen Familien kann ClustalW eingesetzt werden, gefolgt von einem Nachbarkopplungs- bzw. ”Neighbour joining”-Baum, um bei der Visualisierung der Clusterung verwandter Gene zu helfen und Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
Hybridisierung
Der Begriff ”Hybridisierung”, wie hierin definiert, ist ein Verfahren, bei dem im Wesentlichen homologe komplementäre Nukleotidsequenzen sich aneinander anlagern. Das Hybridisierungsverfahren kann vollständig in Lösung stattfinden, d. h. beide komplementären Nukleinsäuren liegen in Lösung vor. Das Hybridisierungsverfahren kann ebenfalls stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren an eine Matrix, wie magnetische Kügelchen, Sepharose-Kügelchen oder ein beliebiges anderes Harz, immobilisiert ist. Das Hybridisierungsverfahren kann ferner stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren an einem festen Träger immobilisiert ist, wie etwa einer Nitrozellulose- oder Nylonmembran, oder z. B. durch Photolithographie beispielsweise an einem silikatischen Glasträger immobilisiert ist (wobei man letzteres als Nukleinsäure-Arrays oder Mikroarrays oder als Nukleinsäure-Chips kennt). Um zu ermöglichen, dass eine Hybridisierung stattfindet, werden die Nukleinsäuremoleküle im Allgemeinen thermisch oder chemisch denaturiert, um einen Doppelstrang in zwei Einzelstränge aufzuschmelzen und/oder Haarnadeln oder andere Sekundärstrukturen aus einzelsträngigen Nukleinsäuren zu entfernen.
Der Begriff ”Stringenz” bezieht sich auf die Bedingungen, unter denen eine Hybridisierung stattfindet. Die Stringenz einer Hybridisierung wird von Bedingungen, wie der Temperatur, Salzkonzentration, Ionenstärke und der Hybridisierungspuffer-Zusammensetzung, beeinflusst. Im Allgemeinen werden Niederstringenzbedingungen so gewählt, dass sie um etwa 30°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert sind. Mittlere Stringenzbedingungen liegen vor, wenn die Temperatur 20°C unterhalb von T_m liegt, und Hochstringenzbedingungen liegen vor, wenn die Temperatur 10°C unterhalb von T_m liegt. Hochstringenz-Hybridisierungsbedingungen werden in der Regel zum Isolieren von hybridisierenden Sequenzen angewandt, die eine hohe Sequenzähnlichkeit zur Ziel-Nukleinsäuresequenz aufweisen. Allerdings können Nukleinsäuren hinsichtlich der Sequenz abweichen und aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes immer noch ein im Wesentlichen identisches Polypeptid codieren. Deshalb können manchmal mittelstringente Hybridisierungsbedingungen erforderlich sein, um derartige Nukleinsäuremoleküle zu identifizieren.
Der T_m ist die Temperatur bei definierter Ionenstärke und definiertem pH-Wert, bei welcher 50% der Zielsequenz an eine perfekt passende Sonde hybridisieren. Der T_m ist von den Lösungsbedingungen und der Basenzusammensetzung sowie der Länge der Sonde abhängig. Zum Beispiel hybridisieren längere Sequenzen spezifisch bei höheren Temperaturen. Die maximale Rate der Hybridisierung wird bei etwa 16°C bis 32°C unter dem T_m erhalten. Das Vorhandensein von einwertigen Kationen in der Hybridisierungslösung verringert die elektrostatische Abstoßung zwischen den zwei Nukleinsäure-Strängen, wodurch die Hybridbildung gefördert wird; dieser Effekt ist für Natriumkonzentrationen von bis zu 0,4 M sichtbar (für höhere Konzentrationen kann dieser Effekt vernachlässigt werden). Formamid senkt die Schmelztemperatur von DNA-DNA- und DNA-RNA-Doppelsträngen um 0,6 bis 0,7°C für jedes Prozent an Formamid, und die Zugabe von 50% Formamid gestattet, dass die Hybridisierung bei 30 bis 45°C durchgeführt werden kann, obwohl die Rate der Hybridisierung vermindert wird. Basenpaar-Fehlpaarungen verringern die Hybridisierungsrate und die thermische Stabilität der Doppelstränge. Im Durchschnitt, und für große Sonden, sinkt der T_m um etwa 1°C je Prozent an Basenfehlpaarung. Der T_m kann mit Hilfe der folgenden Gleichungen, abhängig von den Typen der Hybride, berechnet werden:

1) DNA-DNA-Hybride (Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem., 138: 267–284, 1984): T_m = 81,5°C + 16,6 × log₁₀[Na⁺]^a + 0,41 × %[G/C^b] – 500 × [L^c]^–1 – 0,61 × % Formamid
2) DNA-RNA- oder RNA-RNA-Hybride: T_m = 79,8°C + 18,5(log₁₀[Na⁺]^a) + 0,58(%G/C^b) + 11,8(%G/C^b)² – 820/L^c
3) Oligo-DNA- oder Oligo-RNA^d-Hybride: Für < 20 Nukleotide: T_m = 2 (l_n) Für 20–35 Nukleotide: T_m = 22 + 1,46 (l_n) ^a oder für ein sonstiges einwertiges Kation, aber nur exakt im Bereich von 0,01–0,4 M. ^b nur exakt für %GC im Bereich von 30% bis 75%. ^c L = Länge des Duplex in Basenpaaren. ^d Oligo, Oligonukleotid; l_n = effektive Länge des Primers = 2 × (Anz. v. G/C) + (Anz. v. A/T).

Nicht-spezifische Bindung kann unter Anwendung einer von vielen bekannten Techniken reguliert werden, wie zum Beispiel Blockieren der Membran mit proteinhaltigen Lösungen, Zusetzungen von heterologer RNA, DNA und SDS zum Hybridisierungspuffer und Behandlung mit Rnase. Für nicht-homologe Sonden kann eine Serie von Hybridisierungen durchgeführt werden mittels Variieren von (i) progressivem Senken der Annealing-Temperatur (zum Beispiel von 68°C auf 42°C) oder (ii) progressivem Senken der Formamidkonzentration (zum Beispiel von 50% auf 0%). Der Fachmann auf dem Gebiet kennt verschiedene Parameter, welche während einer Hybridisierung verändert werden können und welche die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
Neben den Hybridisierungsbedingungen hängt die Spezifität der Hybridisierung in der Regel auch von der Funktion von Nach-Hybridisierungs-Waschschritten ab. Um den aus nichtspezifischer Hybridisierung resultierenden Hintergrund zu entfernen, werden Proben mit verdünnten Salzlösungen gewaschen. Zu den kritischen Faktoren bei derartigen Waschschritten zählen die Ionenstärke und Temperatur der letztendlichen Waschlösung: je niedriger die Salzkonzentration und je höher die Waschtemperatur, umso höher ist die Stringenz des Waschschritts. Die Waschbedingungen werden typischerweise bei oder unter der Hybridisierungsstringenz durchgeführt. Eine positive Hybridisierung ergibt ein Signal, welches mindestens das Zweifache von demjenigen des Hintergrundes ist. Im Allgemeinen sind geeignete Stringenzbedingungen für Nukleinsäure-Hybridisierungsassays oder Genamplifikations-Nachweisverfahren wie oben angegeben festgelegt. Auch können mehr oder weniger stringente Bedingungen gewählt werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt verschiedene Parameter, welche während des Waschens abgeändert werden können und welche die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
Zum Beispiel umfassen typische Hochstringenz-Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, die Hybridisierung bei 65°C in 1 × SSC oder bei 42°C in 1 × SSC und 50% Formamid, gefolgt von Waschen bei 65°C in 0,3 × SSC. Beispiele für Mittelstringenz-Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, umfassen Hybridisierung bei 50°C in 4 × SSC oder bei 40°C in 6 × SSC und 50% Formamid, gefolgt von Waschen bei 50°C in 2 × SSC. Die Länge des Hybrids ist die vorhergesehene Länge für die hybridisierende Nukleinsäure. Wenn Nukleinsäuren von bekannter Sequenz hybridisiert werden, kann die Hybridlänge bestimmt werden durch Alignieren der Sequenzen und Identifizieren der hierin beschriebenen konservierten Regionen. 1 × SSC steht für 0,15 M NaCl und 15 mM Natriumcitrat; die Hybridisierungslösung und Waschlösungen können zusätzlich 5× Denhardt-Reagens, 0,5–1,0% SDS, 100 μg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA, 0,5% Natriumpyrophosphat enthalten.
Für die Zwecke des Definierens der Höhe der Stringenz kann auf Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York oder auf Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 und jährliche Aktualisierungen) Bezug genommen werden.
Spleißvariante
Der Begriff ”Spleißvariante”, wie hierin verwendet, umfasst Varianten einer Nukleinsäuresequenz, in welchen ausgewählte Introns und/oder Exons herausgeschnitten, ersetzt, verschoben oder hinzugefügt worden sind oder in welchen Introns verkürzt oder verlängert worden sind. Derartige Varianten werden solche sein, in denen die biologische Aktivität des Proteins im Wesentlichen erhalten bleibt; dies kann durch selektives Beibehalten von funktionellen Segmenten des Proteins bewirkt werden. Derartige Spleißvarianten können in der Natur vorgefunden werden oder vom Menschen erzeugt sein. Verfahren zum Vorhersagen und Isolieren derartiger Spleißvarianten sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt (siehe zum Beispiel Foissac und Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25).
Allelvariante
Allele oder Allelvarianten sind alternative Formen eines gegebenen Gens, welche an der gleichen chromosomalen Position lokalisiert sind. Allelvarianten umfassen Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) sowie ”kleine Insertions/Deletions-Polymorphismen” (INDELs). Die Größe von INDELs beträgt in der Regel weniger als 100 Bp. SNPs und INDELs bilden die größte Gruppe von Sequenzvarianten in natürlich vorkommenden polymorphen Stämmen der meisten Organismen.
Endogenes Gen
Die Bezugnahme hierin auf ein ”endogenes” Gen bezieht sich nicht nur auf das betreffende Gen, wie es in einer Pflanze in seiner natürlichen Form (d. h. ohne dass irgendein menschlicher Eingriff stattgefunden hat) vorgefunden wird, sondern bezieht sich außerdem auf das gleiche Gen (oder ein(e) im Wesentlichen homologe(s) Nukleinsäure/Gen) in einer isolierten Form, welches anschließend in eine Pflanze (wieder)eingeführt wird (ein Transgen). Zum Beispiel kann eine transgene Pflanze, die ein derartiges Transgen enthält, eine erhebliche Reduktion der Transgen-Expression und/oder eine erhebliche Reduktion der Expression des endogenen Gens erfahren. Das isolierte Gen kann aus einem Organismus isoliert werden oder vom Menschen, zum Beispiel durch chemische Synthese, erzeugt werden.
Gen-Shuffling/gerichtete Evolution
Gen-Shuffling oder gerichtete Evolution besteht aus Iterationen des DNA-Shuffling, gefolgt von einem geeigneten Screening und/oder Selektieren, um Varianten von Nukleinsäuren oder Abschnitten davon zu erzeugen, welche Proteine mit einer modifizierten biologischen Aktivität codieren (Castle et al., (2004) Science 304(5674): 1151–4; U.S.-Patente 5 811 238 und 6 395 547 ).
Konstrukt
Zusätzliche Steuerungselemente können Transkriptions- sowie Translationsverstärker einschließen. Dem Fachmann werden für eine Verwendung bei der Durchführung der Erfindung geeignete Terminator- und Verstärkersequenzen bekannt sein. Zur Erhöhung der Menge an reifer Nachricht, die sich im Zytosol anreichert, kann man in der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder in der Codierungssequenz außerdem eine Intronsequenz einfügen, wie im Definitionsabschnitt beschrieben. Bei anderen Steuerungssequenzen (neben Promotor, Verstärker, Silencer, Intronsequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) kann es sich um Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente handeln. Solche Sequenzen sollten dem Fachmann bekannt sein oder sollten sich von diesem leicht in Erfahrung bringen lassen.
Die genetischen Konstrukte der Erfindung können ferner eine Replikationsursprung-Sequenz enthalten, welche für die Beibehaltung und/oder Replikation in einem spezifischen Zelltyp erfordert wird. Ein Beispiel besteht in dem Fall, dass ein genetisches Konstrukt in einer Bakterienzelle als ein episomales genetisches Element (z. B. Plasmid- oder Cosmid-Molekül) gehalten werden muss. Bevorzugte Replikationsursprünge schließen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, den f1-ori und colE1 ein.
Für den Nachweis des erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie in den Verfahren der Erfindung verwendet, und/oder die Selektion von transgenen Pflanzen, welche diese Nukleinsäuren umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (oder Reportergene) zu verwenden. Deshalb kann das genetische Konstrukt gegebenenfalls ein selektierbares Markergen umfassen. Selektierbare Marker sind hierin im Abschnitt ”Definitionen” ausführlicher beschrieben. Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden, sobald sie nicht länger benötigt werden. Techniken zur Markerentfernung sind auf dem Fachgebiet bekannt, wobei nützliche Techniken oben im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben sind.
Regulatorisches Element/Steuerungssequenz/Promotor
Die Begriffe ”regulatorisches Element”, ”Steuerungssequenz” und ”Promotor” werden hierin alle austauschbar verwendet und beziehen sich, wobei sie in einem weiten Kontext zu verstehen sind, auf regulatorische Nukleinsäuresequenzen, die zum Bewirken der Expression der Sequenzen in der Lage sind, an welche sie ligiert sind. Der Begriff ”Promotor” bezieht sich typischerweise auf eine Nukleinsäure-Steuerungssequenz, welche sich stromaufwärts vom transkriptionellen Start eines Gens befindet und welche an der Erkennung und Bindung von RNA-Polymerase und anderen Proteinen beteiligt ist, wodurch die Transkription einer funktionsfähig verbundenen Nukleinsäure gesteuert wird. Bei den zuvor erwähnten Begriffen sind transkriptionelle regulatorische Sequenzen eingeschlossen, die aus einem klassischen eukaryotischen genomischen Gen abgeleitet sind (einschließend die TATA-Box, welche für eine exakte Transkriptionsinitiation erforderlich ist, mit einer CCAAT-Box-Sequenz oder ohne), sowie weitere regulatorische Elemente (d. h. ”Upstream-aktivierende Sequenzen”, ”Enhancer” und ”Silencer”), welche die Genexpression als Reaktion auf entwicklungsmäßige und/oder externe Stimuli oder in einer gewebespezifischen Weise verändern. Ebenfalls im Begriff eingeschlossen ist eine transkriptionelle regulatorische Sequenz eines klassischen prokaryotischen Gens, wobei er in diesem Fall eine –35-Box-Sequenz und/oder transkriptionsregulierende –10-Box-Sequenzen einschließen kann. Der Begriff ”regulatorisches Element” beinhaltet außerdem ein synthetisches Fusionsmolekül oder Derivat, welches die Expression eines Nukleinsäuremoleküls in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ herbeiführt, aktiviert oder steigert.
Ein ”Pflanzenpromotor” umfasst regulatorische Elemente, welche die Expression eines codierenden Sequenzsegments in Pflanzenzellen vermitteln. Folglich muss ein Pflanzenpromotor nicht von pflanzlichem Ursprung sein, sondern kann aus Viren oder Mikroorganismen stammen, beispielsweise aus Viren, welche Pflanzenzellen angreifen. Der ”Pflanzenpromotor” kann auch aus einer Pflanzenzelle stammen, z. B. aus der Pflanze, welche mit der Nukleinsäuresequenz transformiert wird, die im erfindungsgemäßen Verfahren exprimiert werden soll und hierin beschrieben ist. Dies gilt auch für andere regulatorische ”Pflanzen”-Signale, wie etwa ”pflanzliche” Terminatoren. Die Promotoren stromaufwärts der Nukleotidsequenzen, welche in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitution(en), -insertion(en) und/oder -deletion(en) modifiziert sein, ohne die Funktionalität oder Aktivität von weder den Promotoren, dem offenen Leserahmen (ORF) nach 3'-regulatorischen Region, wie Terminatoren oder sonstigen 3'-regulatorischen Regionen, welche sich entfernt vom ORF befinden, zu stören. Es ist weiterhin möglich, dass die Aktivität der Promotoren durch die Modifikation ihrer Sequenz erhöht ist oder dass sie vollständig durch aktivere Promotoren ersetzt sind, selbst Promotoren aus heterologen Organismen. Für die Expression in Pflanzen muss das Nukleinsäuremolekül, wie oben beschrieben, funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein oder diesen umfassen, welcher das Gen zum richtigen Zeitpunkt und mit dem erforderlichen räumlichen Expressionsmuster exprimiert.
Für die Identifizierung von funktionell äquivalenten Promotoren können die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster eines Kandidaten-Promotors analysiert werden, zum Beispiel durch funktionsfähiges Verknüpfen des Promotors mit einem Reportergen und Testen des Expressionsspiegels und -musters des Reportergens in verschiedenen Geweben der Pflanze. Zu geeigneten, allgemein bekannten Reportergenen zählen zum Beispiel Beta-Glucuronidase oder Beta-Galactosidase. Die Promotoraktivität wird durch Messen der enzymatischen Aktivität der Beta-Glucuronidase oder Beta-Galactosidase getestet. Die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster können dann mit denjenigen eines Referenzpromotors verglichen werden (wie etwa jenem, der in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird). Alternativ kann die Promotorstärke durch Quantifizieren von mRNA-Konzentrationen oder durch Vergleichen von mRNA-Konzentrationen der in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäure mit mRNA-Konzentrationen von Haushaltsgenen, wie etwa 18S-rRNA, untersucht werden, wobei im Fachgebiet bekannte Verfahren, wie Northern-Blotting mit densitometrischer Analyse von Autoradiogrammen, quantitative Echtzeit-PCR oder RT-PCR (Neid et al., 1996 Genome Methods 6: 986–994) zur Anwendung kommen. Mit ”schwacher Promotor” wird im Allgemeinen ein Promotor bezeichnet, der die Expression einer codierenden Sequenz auf einem geringen Niveau antreibt. Mit ”geringes Niveau” sind Niveaus von etwa 1/10000 Transkripten bis etwa 1/100000 Transkripten bis etwa 1/5000000 Transkripten pro Zelle gemeint. Demgegenüber treibt ein ”starker Promotor” die Expression einer codierenden Sequenz bei einem hohen Niveau oder bei etwa 1/10 Transkripten bis etwa 1/100 Transkripten bis etwa 1/1000 Transkripten pro Zelle an. Mit ”mittelstarker Promotor” ist im Allgemeinen ein Promotor gemeint, der die Expression einer codierenden Sequenz bei einem niedrigeren Niveau als ein starker Promotor antreibt, insbesondere bei einem Niveau, welches in allen Fällen unterhalb von demjenigen liegt, das unter der Steuerung eines 35S-CaMV-Promotors erhalten wird.
Funktionsfähig verbunden
Der Begriff ”funktionsfähig verbunden”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine funktionale Verknüpfung zwischen der Promotorsequenz und dem Gen von Interesse, so dass die Promotorsequenz in der Lage ist, die Transkription des Gens von Interesse zu initiieren.
Konstitutiver Promotor

Ein ”konstitutiver Promotor” bezieht sich auf einen Promotor, der während der meisten, aber nicht notwendigerweise allen, Phasen des Wachstums und der Entwicklung, sowie unter den meisten Umweltbedingungen, in mindestens einer/einem Zelle, Gewebe oder Organ transkriptionell aktiv ist. Die nachstehende Tabelle 2a gibt Beispiele für konstitutive Promotoren an. Tabelle 2a: Beispiele für konstitutive Promotoren

Genquelle	Literaturstelle
Aktin	McElroy et al., Plant Cell, 2: 163–171, 1990
HMGP	WO 2004/070039
CAMV 35S	Odell et al., Nature, 313: 810–812, 1985
CaMV 19S	Nilsson et al., Physiol. Plant. 100: 456–462, 1997
GOS2	de Pater et al., Plant J. Nov.; 2(6): 837–44, 1992, WO 2004/065596
Ubiquitin	Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675–689, 1992
Reis-Cyclophilin	Buchholz et al., Plant Mol. Biol. 25(5): 837–43, 1994
Mais-H3-Histon	Lepetit et al., Mol. Gen. Genet. 231: 276–285, 1992
Luzerne-H3-Histon	Wu et al. Plant Mol. Biol. 11: 641–649, 1988
Aktin 2	An et al., Plant J. 10(1); 107–121, 1996
34S FMV	Sanger et al., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433–443
kleine Rubisco-Untereinheit	US 4,962,028
OCS	Leisner (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(5): 2553
SAD1	Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
SAD2	Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
nos	Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12(20): 7831–7846
V-ATPase	WO 01/14572
Super-Promotor	WO 95/14098
G-Box-Proteine	WO 94/12015

Ubiquitärer Promotor
Ein ubiquitärer Promotor ist in im Wesentlichen allen Geweben oder Zellen eines Organismus aktiv.
Entwicklungsmäßig regulierter Promotor
Ein entwicklungsmäßig regulierter Promotor ist während bestimmter Entwicklungsstadien oder in Teilen der Pflanze, die entwicklungsbedingten Änderungen unterliegen, aktiv.
Induzierbarer Promotor
Ein induzierbarer Promotor zeigt induzierte oder erhöhte Transkriptionsinitiation als Reaktion auf eine Chemikalie (ein Übersichtsartikel findet sich bei Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89–108), einen umweltmäßigen oder physikalischen Stimulus, oder kann ”stressinduzierbar” sein, d. h. aktiviert werden, wenn eine Pflanze verschiedenen Stressbedingungen ausgesetzt wird, oder ”pathogeninduzierbar” sein, d. h. aktiviert werden, wenn eine Pflanze der Exposition an verschiedene Pathogene ausgesetzt wird.
Organspezifischer/gewebespezifischer Promotor
Ein organspezifischer oder gewebespezifischer Promotor ist ein solcher, der fähig ist, die Transkription in bestimmten Organen oder Geweben präferentiell zu initiieren, wie etwa Blättern, Wurzeln, Samengewebe etc. Zum Beispiel ist ein ”wurzelspezifischer Promotor” ein Promotor, der vorwiegend in Pflanzenwurzeln transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluss beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine beliebige Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird. Promotoren, die zum Initiieren der Transkription nur in bestimmten Zellen fähig sind, werden hierin als ”zellspezifisch” bezeichnet.

Beispiele für wurzelspezifische Promotoren sind in der nachstehenden Tabelle 2b aufgeführt: Tabelle 2b: Beispiele für wurzelspezifische Promotoren

Genquelle	Literaturstelle
RCc3	Plant Mol Biol. 1995 Jan; 27(2): 237–48
Arabidopsis PHT1	Koyama et al. J Biosci Bioeng. 2005 Jan; 99(1): 38–42 Mudge et al. (2002, Plant J. 31: 341)
Medicago-Phosphat-Transporter	Xiao et al., 2006, Plant Biol (Stuttg). 2006 Jul; 8(4): 439–49
Arabidopsis Pyk10	Nitz et al. (2001) Plant Sci. 161(2): 337–346
wurzelexprimierbare Gene	Tingey et al., EMBO J. 6: 1, 1987.
Tabakauxin-induzierbares Gen	Van der Zaal et al., Plant Mol. Biol. 16, 983, 1991.
β-Tubulin	Oppenheimer et al., Gene 63: 87, 1988.
tabakwurzelspezifische Gene	Conkling et al., Plant Physiol. 93: 1203, 1990.
B. napus G1-3b-Gen	US-Patent Nr. 5 401 836
SbPRP1	Suzuki et al., Plant Mol. Biol. 21: 109–119, 1993.
LRX1	Baumberger et al. 2001, Genes & Dev. 15: 1128
BTG-26 Brassica napus	US 20,050,044,585
LeAMT1 (Tomate)	Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139)
LeNRT1-1 (Tomate)	Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139)
Klasse I Patatin-Gen (Kartoffel)	Liu et al., Plant Mol. Biol. 17(6): 1139–1154
KDC1 (Daucus carota)	Downey et al. (2000, J. Biol. Chem. 275: 39420)
TobRB7-Gen	W. Song (1997) Doktorarbeit, North Carolina State University, Raleigh, NC, USA
OsRAB5a (Reis)	Wang et al. 2002, Plant Sci. 163: 273
ALF5 (Arabidopsis)	Diener et al. (2001, Plant Cell 13: 1625)
NRT2; 1Np (N. plumbaginifolia)	Quesada et al. (1997, Plant Mol. Biol. 34: 265)

Ein samenspezifischer Promotor ist hauptsächlich in Samengewebe transkriptionell aktiv, jedoch nicht notwendigerweise ausschließlich in Samengewebe (in Fällen von Leckexpression). Der samenspezifische Promotor kann während der Samenentwicklung und/oder während der Keimung aktiv sein. Der samenspezifische Promotor kann endosperm-/aleuron-/embryospezifisch sein. Beispiele samenspezifischer Promotoren (endosperm-/aleuron-/embryospezifisch) sind in Tabelle 2c bis Tabelle 2f nachstehend gezeigt. Weitere Beispiele samenspezifischer Promotoren sind in Qing Qu und Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113–125, 2004) beschrieben, deren Offenbarung hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist, als ob sie vollständig dargestellt wäre. Tabelle 2c: Beispiele für samenspezifische Promotoren

Genquelle	Literaturstelle
samenspezifische Gene	Simon et al., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985;
	Scofield et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987.;
	Baszczynski et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.
Paranuss-Albumin	Pearson et al., Plant Mol. Biol. 18: 235–245, 1992.
Legumin	Ellis et al., Plant Mol. Biol. 10: 203–214, 1988.
Glutelin (Reis)	Takaiwa et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15–22, 1986;
	Takaiwa et al., FEBS Letts. 221: 43–47, 1987.
Zein	Matzke et al., Plant Mol. Biol., 14(3): 323–32 1990
napA	Stalberg et al., Planta 199: 515–519, 1996.
Weizen LMW- und HMW-Glutenin-1	Mol. Gen. Genet. 216: 81–90, 1989; NAR 17: 461–2, 1989
Weizen SPA	Albani et al., Plant Cell, 9: 171–184, 1997
Weizen, α, β, γ-Gliadine	EMBO J. 3: 1409–15, 1984
Gerste Itr1-Promotor	Diaz et al. (1995) Mol. Gen. Genet. 248(5): 592–8
Gerste B1, C, D, Hordein	Theor. Appl. Gen. 98: 1253–62, 1999; Plant J. 4: 343–55, 1993; Mol. Gen. Genet. 250: 750–60, 1996
Gerste DOF	Mena et al., The Plant Journal, 116(1): 53–62, 1998
blz2	EP99106056.7
synthetischer Promotor	Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629–640, 1998.
Reis Prolamin NRP33	Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998
Reis a-Globulin Glb-1	Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998
Reis OSH1	Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
Reis α-Globulin REB/OHP-1	Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513–522, 1997
Reis ADP-Glucose-Pyrophosphorylase	Trans. Res. 6: 157–68, 1997
Mais ESR-Genfamilie	Plant J. 12: 235–46, 1997
Sorghum α-Kafirin	DeRose et al., Plant Mol. Biol 32: 1029–35, 1996
KNOX	Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
Reis-Oleosin	Wu et al, J. Biochem. 123: 386, 1998
Sonnenblumen-Oleosin	Cummins et al., Plant Mol. Biol. 19: 873–876, 1992
PRO0117, putatives Reis 40S-ribosomales Protein	WO 2004/070039
PRO0136, Reis Alanin-Aminotransferase	unveröffentlicht
PRO0147, Trypsininhibitor ITR1 (Gerste)	unveröffentlicht
PRO0151, Reis WSI18	WO 2004/070039
PRO0175, Reis RAB21	WO 2004/070039
PRO005	WO 2004/070039
PRO0095	WO 2004/070039
α-Amylase (Amy32b)	Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266–7270, 1991
Cathepsin β-ähnliches Gen	Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
Gerste Ltp2	Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994
Chi26	Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994
Mais B-Peru	Selinger et al., Genetics 149; 1125–38, 1998

Tabelle 2d: Beispiele für endospermspezifische Promotoren

Genquelle	Literaturstelle
Glutelin (Reis)	Takaiwa et al., (1986) Mol. Gen. Genet. 208: 15–22 Takaiwa et al. (1987) FEBS Letts. 221: 43–47
Zein	Matzke et al., (1990) Plant Mol. Biol. 14(3): 323–32
Weizen LMW- und HMW-Glutenin-1	Colot et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 216: 81–90 Anderson et al. (1989) NAR 17: 461–2
Weizen SPA	Albani et al. (1997) Plant Cell 9: 171–184
Weizen Gliadine	Rafalski et al. (1984) EMBO 3: 1409–15
Gerste Itr1-Promotor	Diaz et al. (1995) Mol. Gen. Genet. 248(5): 592–8
Gerste B1, C, D, Hordein	Cho et al. (1999) Theor. Appl. Genet. 98: 1253–62; Muller et al. (1993) Plant J. 4: 343–55; Sorenson et al. (1996) Mol. Gen. Genet. 250: 750–60
Gerste DOF	Mena et al., (1998) Plant J. 116(1): 53–62
blz2	Onate et al. (1999) J. Biol. Chem. 274(14): 9175–82
synthetischer Promotor	Vicente-Carbajosa et al. (1998) Plant J. 13: 629–640
Reis Prolamin NRP33	Wu et al., (1998) Plant Cell Physiol. 39(8) 885–889
Reis Globulin Glb-1	Wu et al. (1998) Plant Cell Physiol. 39(8) 885–889
Reis Globulin REB/OHP-1	Nakase et al. (1997) Plant Mol. Biol. 33: 513–522
Reis ADP-Glucose-Pyrophosphorylase	Russell et al. (1997) Trans. Res. 6: 157–68
Mais ESR-Genfamilie	Opsahl-Ferstad et al. (1997) Plant J. 12: 235–46
Sorghum Kafirin	DeRose et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32: 1029–35

Tabelle 2e: Beispiele für embryospezifische Promotoren:

Genquelle	Literaturstelle
Reis OSH1	Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
KNOX	Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
PRO0151	WO 2004/070039
PRO0175	WO 2004/070039
PRO005	WO 2004/070039
PRO0095	WO 2004/070039

Tabelle 2f: Beispiele für aleuronspezifische Promotoren:

Genquelle	Literaturstelle
α-Amylase (Amy32b)	Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266–7270, 1991
Cathepsin β-ähnliches Gen	Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
Gerste Ltp2	Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994
Chi26	Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994
Mais B-Peru	Selinger et al., Genetics 149; 1125–38, 1998

Ein für grünes Gewebe spezifischer Promotor, wie hierin definiert, ist ein Promotor, der vorwiegend in grünem Gewebe transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluss beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine beliebige Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird.

Beispiele für für grünes Gewebe spezifische Promotoren, welche zur Ausführung der Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind in der nachstehenden Tabelle 2g gezeigt. Tabelle 2g: Beispiele für für grünes Gewebe spezifische Promotoren

Gen	Expression	Literaturstelle
Mais, Orthophosphat-Dikinase	blattspezifisch	Fukavama et al., Plant Physiol. 2001 Nov; 127(3): 1136–46
Mais, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase	blattspezifisch	Kausch et al., Plant Mol Biol. 2001 Jan; 45(1): 1–15
Reis, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase	blattspezifisch	Lin et al., 2004 DNA Seq. 2004 Aug; 15(4): 269–76
Reis, kleine Rubisco-Untereinheit	blattspezifisch	Nomura et al., Plant Mol Biol. 2000 Sep; 44(1): 99–106
Reis, beta-Expansin EXBP9	sprossspezifisch	WO 2004/070039
Straucherbse, kleine Rubisco-Untereinheit	blattspezifisch	Panguluri et al., Indian J Exp Biol. 2005 Apr; 43(4): 369–72
Erbse RBCS3A	blattspezifisch

Ein weiteres Beispiel eines gewebespezifischen Promotors ist ein meristemspezifischer Promotor, der vorwiegend in meristematischem Gewebe transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluss beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine gewisse Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird. Beispiele für für grünes Meristem spezifische Promotoren, welche zur Ausführung der Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind in der nachstehenden Tabelle 2h gezeigt. Tabelle 2h: Beispiele für meristemspezifische Promotoren

Genquelle	Expressionsmuster	Literaturstelle
Reis OSH1	Spross-Apikalmeristem, vom globulären Embryostadium bis zum Setzlingsstadium	Sato et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122
Reis Metallothionein	meristemspezifisch	BAD87835.1
WAK1 & WAK2	Spross- und Wurzel-Apikalmeristeme, und in expandierenden Blättern und Kelchblättern	Wagner & Kohorn (2001) Plant Cell 13(2): 303–318

Terminator
Der Begriff ”Terminator” beinhaltet eine Steuerungssequenz, welche eine DNA-Sequenz am Ende einer Transkriptionseinheit ist, welche die 3'-Prozessierung und Polyadenylierung eines Primärtranskripts und die Termination der Transkription signalisiert. Der Terminator kann aus dem natürlichen Gen, aus einer Vielzahl anderer Pflanzengene oder aus T-DNA abgeleitet sein. Der hinzuzufügende Terminator kann zum Beispiel aus den Nopalin-Synthase- oder Octopin-Synthase-Genen oder alternativ aus einem anderen Pflanzengen oder, weniger bevorzugt, aus einem beliebigen anderen eukaryotischen Gen abgeleitet sein.
Selektierbarer Marker, selektierbares Markergen/Reportergen
Unter ”selektierbarer Marker”, ”selektierbares Markergen” oder ”Reportergen” ist ein beliebiges Gen eingeschlossen, welches einer Zelle, in der es exprimiert wird, einen Phänotyp verleiht, so dass die Identifizierung und/oder Selektion von Zellen erleichtert wird, die mit einem Nukleinsäurekonstrukt der Erfindung transfiziert oder transformiert sind. Diese Markergene ermöglichen die Identifizierung eines erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuremoleküle durch eine Reihe unterschiedlicher Prinzipien. Geeignete Marker können aus Markern ausgewählt werden, welche Antibiotikum- oder Herbizid-Resistenz vermitteln, welche eine neue metabolische Eigenschaft einbringen oder welche eine visuelle Selektion zulassen. Zu Beispielen von selektierbaren Markergenen zählen Gene, die Resistenz gegen Antibiotika (wie etwa nptII, das Neomycin und Kanamycin phosphoryliert, oder hpt, das Hygromycin phosphoryliert, oder Gene, welche Resistenz zum Beispiel gegen Bleomycin, Streptomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Ampicillin, Gentamycin, Geneticin (G418), Spectinomycin oder Blasticidin vermitteln) sowie gegen Herbizide vermitteln (zum Beispiel bar, das Resistenz gegen Basta^® vermittelt; aroA oder gox, welche Resistenz gegen Glyphosat vermitteln, oder die Gene, welche zum Beispiel Resistenz gegen Imidazolinon, Phosphinothricin oder Sulfonylharnstoff vermitteln), oder Gene, die ein metabolisches Merkmal bereitstellen (wie etwa manA, das Pflanzen gestattet, Mannose als einzige Kohlenstoffquelle zu verwenden, oder Xylose-Isomerase für die Verwertung von Xylose, oder antinutritive Marker, wie die Resistenz gegen 2-Desoxyglucose). Die Expression von visuellen Markergenen führt zur Erzeugung von Farbe (zum Beispiel β-Glucuronidase, GUS oder β-Galactosidase mit seinen gefärbten Substraten, beispielsweise X-Gal), Lumineszenz (wie etwa das Luciferin/Luciferase-System) oder Fluoreszenz (grünfluoreszierendes Protein, GFP, und Derivate davon). Diese Liste repräsentiert nur eine kleine Anzahl von möglichen Markern. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit derartigen Markern vertraut. Es werden, abhängig von dem Organismus und dem Selektionsverfahren, unterschiedliche Marker bevorzugt.
Es ist bekannt, dass bei einer stabilen oder transienten Integration von Nukleinsäuren in Pflanzenzellen nur eine Minderheit der Zellen die Fremd-DNA aufnimmt und, falls gewünscht, diese in ihr Genom integriert, was vom verwendeten Expressionsvektor und der angewandten Transfektionstechnik abhängig ist. Um diese Integranten zu identifizieren und zu selektieren, wird üblicherweise ein Gen, das für einen selektierbaren Marker codiert (wie diejenigen, die oben beschrieben sind), zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Diese Marker können zum Beispiel in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene, beispielsweise aufgrund von Deletion durch herkömmliche Verfahren, nicht funktionsfähig sind. Darüber hinaus können Nukleinsäuremoleküle, die für einen selektierbaren Marker codieren, auf demselben Vektor, der die Sequenz umfasst, welche die erfindungsgemäßen oder in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide codiert, oder ansonsten in einem separaten Vektor in eine Wirtszelle eingebracht werden. Zellen, welche stabil mit der eingebrachten Nukleinsäure transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (beispielsweise überleben Zellen, welche den selektierbaren Marker integriert haben, wohingegen die anderen Zellen sterben).
Da die Markergene, insbesondere Gene für Resistenz gegen Antibiotika und Herbizide, in der transgenen Wirtszelle nicht länger erforderlich oder unerwünscht sind, sobald die Nukleinsäuren erfolgreich eingebracht worden sind, wendet das erfindungsgemäße Verfahren zum Einbringen der Nukleinsäuren in vorteilhafter Weise Techniken an, welche die Entfernung oder Exzision dieser Markergene ermöglichen. Ein derartiges Verfahren ist die sogenannte Co-Transformation. Das Co-Transformations-Verfahren verwendet zwei Vektoren gleichzeitig für die Transformation, wobei ein Vektor die erfindungsgemäße Nukleinsäure trägt und ein zweiter das/die Markergen(e) trägt. Ein großer Anteil an Transformanten empfängt oder, im Fall von Pflanzen, umfasst (bis zu 40% oder mehr der Transformanten) beide Vektoren. Im Fall der Transformation mit Agrobakterien empfangen die Transformanten in der Regel nur einen Teil des Vektors, d. h. die von der T-DNA flankierte Sequenz, welche üblicherweise die Expressionskassette repräsentiert. Die Markergene können anschließend durch Ausführen von Kreuzungen aus der transformierten Pflanze entfernt werden. In einem anderen Verfahren werden in ein Transposon integrierte Markergene für die Transformation gemeinsam mit der gewünschten Nukleinsäure verwendet (bekannt als Ac/Ds-Technologie). Die Transformanten können mit einer Transposase-Quelle gekreuzt werden, oder die Transformanten werden mit einem Nukleinsäurekonstrukt, welches die Expression einer Transposase vermittelt, transient oder stabil transformiert. In einigen Fällen (ungefähr 10%) springt das Transposon aus dem Genom der Wirtszelle heraus, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, und geht verloren. In einer weiteren Anzahl von Fällen springt das Transposon an eine andere Stelle. In diesen Fällen muss das Markergen durch Ausführen von Kreuzungen eliminiert werden. In der Mikrobiologie wurden Techniken entwickelt, welche das Detektieren derartiger Ereignisse ermöglichen oder erleichtern. Ein weiteres vorteilhaftes Verfahren beruht auf sogenannten Rekombinationssystemen; deren Vorteil besteht darin, dass auf die Eliminierung durch Kreuzung verzichtet werden kann. Das am besten bekannte System dieses Typs ist das sogenannte Cre/lox-System. Cre1 ist eine Rekombinase, welche die zwischen den loxP-Sequenzen befindlichen Sequenzen entfernt. Wenn das Markergen zwischen den loxP-Sequenzen integriert ist, wird es entfernt, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, und zwar durch die Expression der Rekombinase. Weitere Rekombinationssysteme sind das HIN/HIX-, FLP/FRT- und REP/STB-System (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255–22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553–566). Eine ortsspezifische Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in das Pflanzengenom ist möglich. Selbstverständlich können diese Verfahren auch auf Mikroorganismen, wie Hefe, Pilze oder Bakterien, angewandt werden.
Transgen/Transgen/Rekombinant
Für die Zwecke der Erfindung bedeuten ”transgen”, ”Transgen” oder ”rekombinant”, zum Beispiel in Hinsicht auf eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette, ein Genkonstrukt oder einen Vektor, der die Nukleinsäuresequenz umfasst, oder einen Organismus, der mit den Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten oder Vektoren gemäß der Erfindung transformiert ist, alle diejenigen Konstruktionen, die durch rekombinante Verfahren bewerkstelligt werden, in welchen entweder

(a) die Nukleinsäuresequenzen, die in den Verfahren der Erfindung nützliche Proteine codieren, oder
(b) genetische Steuerungssequenz(en), welche funktionsfähig mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz verknüpft ist/sind, wie beispielsweise ein Promotor, oder
(c) a) und b),

US 5 565 350

WO 00/15815

Es versteht sich daher, dass mit einer transgenen Pflanze für die Absichten der Erfindung, wie oben, gemeint ist, dass die im Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuren nicht im Genom der Pflanze vorliegen oder daher stammen bzw. im Genom der Pflanze vorliegen, sich jedoch nicht an ihrem natürlichen Genort im Genom der Pflanze befinden, wobei es möglich ist, dass die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden. Wie erwähnt, bedeutet ”transgen” jedoch ebenfalls, dass, obwohl die erfindungsgemäßen oder im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren an ihrer natürlichen Position im Genom einer Pflanze vorliegen, die Sequenz im Hinblick auf die natürliche Sequenz modifiziert worden ist und/oder dass die regulatorischen Sequenzen der natürlichen Sequenzen modifiziert worden sind. Es versteht sich, dass ”transgen” vorzugsweise die Expression der Nukleinsäuren gemäß der Erfindung an einem unnatürlichen Genort im Genom, d. h. homolog, bedeutet oder dass vorzugsweise eine heterologe Expression der Nukleinsäuren stattfindet. Bevorzugte transgene Pflanzen sind hierin erwähnt.
Es sollte weiterhin angemerkt werden, dass im Rahmen der vorliegenden Erfindung der Ausdruck ”isolierte Nukleinsäure” oder ”isoliertes Polypeptid” in einigen Fällen als Synonym für eine ”rekombinante Nukleinsäure” bzw. ein ”rekombinantes Polypeptid” angesehen werden kann und sich auf eine Nukleinsäure bzw. ein Polypeptid bezieht, die bzw. das sich nicht in seiner natürlichen genetischen Umgebung befindet und/oder die bzw. das durch rekombinante Methoden modifiziert wurde.
Modulierung
Der Begriff ”Modulierung” bedeutet in Bezug auf Expression oder Genexpression ein Verfahren, in welchem der Expressionsspiegel durch die Genexpression im Vergleich zur Kontrollpflanze verändert wird, wobei der Expressionsspiegel erhöht oder verringert werden kann. Die ursprüngliche, nicht modulierte Expression kann jede Art von Expression einer strukturellen RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA mit anschließender Translation sein. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann die ursprüngliche, nicht modulierte Expression auch das Fehlen jeglicher Expression bedeuten. Der Begriff ”Modulieren der Aktivität” soll jedwede Änderung der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder codierten Proteine bedeuten, welche zu einem erhöhten Ertrag und/oder erhöhten Wachstum der Pflanzen führt. Die Expression kann von null (nicht vorhandene oder nicht messbare Expression) auf eine bestimmte Menge zunehmen oder von einer bestimmten Menge auf unmessbar kleine Mengen oder null abnehmen.
Expression
Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” bedeutet die Transkription eines spezifischen Gens oder spezifischer Gene oder eines spezifischen genetischen Konstrukts. Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” bedeutet insbesondere die Transkription von einem Gen oder Genen oder einem genetischen Konstrukt zu struktureller RNA (rRNA, tRNA) oder zu mRNA mit oder ohne anschließende Translation der Letzteren in ein Protein. Das Verfahren beinhaltet die Transkription von DNA und die Prozessierung des resultierenden mRNA-Produkts.
Erhöhte Expression/Überexpression
Der Begriff ”erhöhte Expression” oder ”Überexpression”, wie hierin verwendet, bedeutet eine beliebige Art von Expression, welche zusätzlich zum ursprünglichen Wildtyp-Expressionsniveau erfolgt. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann das ursprüngliche, beim Wildtyp beobachtete Expressionsniveau auch null sein, d. h. nicht vorhandene oder nicht messbare Expression.
Verfahren zur Erhöhung der Expression von Genen oder Genprodukten sind im Fachgebiet gut dokumentiert und beinhalten zum Beispiel die durch geeignete Promotoren angetriebene Überexpression, die Verwendung von Transkriptions-Enhancern oder von Translations-Enhancern. Isolierte Nukleinsäuren, welche als Promotor- oder Enhancer-Elemente dienen, können in einer geeigneten Position (typischerweise stromaufwärts) einer nicht-heterologen Form eines Polynukleotids eingebracht werden, so dass die Expression einer Nukleinsäure, welche das Polypeptid von Interesse codiert, hochreguliert wird. Beispielsweise können endogene Promotoren in vivo durch Mutation, Deletion und/oder Substitution verändert werden (siehe Kmiec, US 5 565 350 ; Zarling et al., WO9322443 ), oder isolierte Promotoren können in der richtigen Orientierung und im richtigen Abstand zu einem Gen der vorliegenden Erfindung in eine Pflanzenzelle eingebracht werden, so dass die Expression des Gens gesteuert wird.
Wenn eine Polypeptidexpression gewünscht wird, ist es im Allgemeinen wünschenswert, eine Polyadenylierungsregion am 3'-Ende einer codierenden Polynukleotidregion einzuschließen.
Die Polyadenylierungsregion kann aus dem natürlichen Gen, aus einer Vielzahl anderer Pflanzengene oder aus T-DNA abgeleitet sein. Die 3'-Ende-Sequenz, welche hinzugefügt werden soll, kann zum Beispiel aus den Genen für Nopalin-Synthase oder Octopin-Synthase oder alternativ dazu aus einem anderen Pflanzengen, oder, weniger bevorzugt, aus einem beliebigen sonstigen eukaryotischen Gen abgeleitet sein.
Auch eine Intronsequenz kann an die 5'-untranslatierte Region (UTR) oder die codierende Sequenz der partiellen codierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge der reifen Nachricht zu erhöhen, welche sich im Cytosol akkumuliert. Der Einschluss eines spleißbaren Introns in der Transkriptionseinheit sowohl in pflanzlichen als auch tierischen Expressionskonstrukten erhöht gezeigtermaßen die Genexpression sowohl auf der mRNA- als auch der Protein-Ebene bis zu 1000-fach (Buchman und Berg (1988) Mol. Cell Biol. 8: 4395–4405; Callis et al. (1987) Genes Dev. 1: 1183–1200). Eine derartige Intron-Verstärkung der Genexpression ist typischerweise am größten bei Platzierung nahe dem 5'-Ende der Transkriptionseinheit. Die Verwendung der Mais-Introns Adh1-S-Intron 1, 2 und 6 sowie des Bronze-1-Introns sind im Fachgebiet bekannt. Für allgemeine Informationen siehe: The Maize Handbook, Kapitel 116, Freeling und Walbot, Hrsg., Springer, N.Y. (1994)
Verringerte Expression
Eine Bezugnahme hierin auf ”verringerte Expression” oder ”Reduktion oder wesentliche Eliminierung” von Expression wird verwendet, um eine Verringerung der endogenen Genexpression und/oder der Polypeptidspiegel und/oder der Polypeptidaktivität im Vergleich zu Kontrollpflanzen zu bezeichnen. Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung beträgt, mit zunehmender Präferenz, mindestens 10%, 20%, 30%, 40% oder 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% oder 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Verringerung im Vergleich zu derjenigen von Kontrollpflanzen.
Für die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze wird eine ausreichende Länge von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden einer Nukleinsäuresequenz benötigt. Um ein ”Gensilencing” durchzuführen, kann diese so gering wie 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 oder weniger Nukleotide sein, wobei sie alternativ so groß sein kann wie das gesamte Gen (einschließlich der 5'- und/oder 3'-UTR, entweder zum Teil oder insgesamt). Die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden kann aus der Nukleinsäure, welche das Protein von Interesse codiert (Zielgen), oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist, abgeleitet sein. Vorzugsweise ist die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden in der Lage, Wasserstoffbrücken mit dem Zielgen (entweder Sense- oder Antisense-Strang) zu bilden, und weiter bevorzugt besitzt die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, mit zunehmender Präferenz, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% Sequenzidentität zum Zielgen (entweder Sense- oder Antisense-Strang). Eine Nukleinsäuresequenz, welche ein (funktionales) Polypeptid codiert, ist keine Voraussetzung für die verschiedenen hierin erörterten Verfahren zur Reduktion oder wesentlichen Eliminierung der Expression eines endogenen Gens.
Diese Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression kann unter Anwendung von routinemäßigen Hilfsmitteln und Techniken erzielt werden. Ein bevorzugtes Verfahren für die Reduktion oder wesentliche Eliminierung von endogener Genexpression erfolgt durch Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, eines genetischen Konstrukts, in welches die Nukleinsäure (in diesem Fall eine Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs von einem beliebigen Protein von Interesse in der Lage ist) als ein invertierter Repeat (teilweise oder vollständig), getrennt durch einen Abstandhalter (nicht codierende DNA), einkloniert ist.
In einem derartigen bevorzugten Verfahren wird die Expression des endogenen Gens reduziert oder im Wesentlichen eliminiert durch RNA-vermitteltes Silencing unter Verwendung eines ”Inverted Repeat” einer Nukleinsäure oder eines Teils davon (in diesem Fall einer Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist), welcher vorzugsweise zur Ausbildung einer Haarnadelstruktur fähig ist. Der ”Inverted Repeat” wird in einen Expressionsvektor kloniert, der Steuerungssequenzen umfasst. Eine nicht codierende DNA-Nukleinsäuresequenz (ein Abstandhalter, zum Beispiel ein Matrix-Anheftungs-Region-Fragment (MAR), ein Intron, ein Polylinker etc.) befindet sich zwischen den zwei invertierten Nukleinsäuren, welche den ”Inverted Repeat” bilden. Nach der Transkription des ”Inverted Repeat” wird eine chimäre RNA mit einer selbst-komplementären Struktur gebildet (teilweise oder vollständig). Diese doppelsträngige RNA-Struktur wird als die Haarnadel-RNA (hpRNA) bezeichnet. Die hpRNA wird von der Pflanze zu siRNAs prozessiert, welche in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebaut werden. Der RISC spaltet die mRNA-Transkripte weiter, wodurch die Anzahl von mRNA-Transkripten, die zu Polypeptiden translatiert werden sollen, wesentlich verringert wird. Für weitere allgemeine Details siehe zum Beispiel Grierson et al. (1998) WO 98/53083 ; Waterhouse et al. (1999) WO 99/53050 ).
Die Ausführung der Verfahren der Erfindung beruht nicht auf dem Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einem genetischen Konstrukt, in welches die Nukleinsäure als ein ”Inverted Repeat” einkloniert ist, sondern es können ein oder mehrere beliebige von einigen, allgemein bekannten ”Gen-Silencing”-Verfahren zur Anwendung kommen, um die gleichen Effekte zu erzielen.
Ein derartiges Verfahren für die Reduktion der endogenen Genexpression ist das RNA-vermittelte Silencing von Genexpression (Herunterregulieren). Das Silencing wird in diesem Fall in einer Pflanze von einer doppelsträngigen RNA-Sequenz (dsRNA) ausgelöst, welche im Wesentlichen ähnlich zum endogenen Zielgen ist. Diese dsRNA wird von der Pflanze zu etwa 20 bis etwa 26 Nukleotiden weiterprozessiert, welche als kurze interferierende RNAs (siRNAs) bezeichnet werden. Die siRNAs werden in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebaut, welcher das mRNA-Transkript des endogenen Zielgens spaltet, wodurch die Anzahl von mRNA-Transkripten, die in ein Polypeptid translatiert werden sollen, wesentlich verringert wird. Vorzugsweise entspricht die doppelsträngige RNA-Sequenz einem Zielgen.
Ein anderes Beispiel eines RNA-Silencing-Verfahrens beinhaltet das Einbringen von Nukleinsäuresequenzen oder Teilen davon (in diesem Fall einer Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist) in einer Sense-Orientierung in eine Pflanze. ”Sense-Orientierung” bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, welche homolog zu einem mRNA-Transkript davon ist. Deswegen wird man in eine Pflanze mindestens eine Kopie der Nukleinsäuresequenz einführen. Die zusätzliche Nukleinsäuresequenz wird die Expression des endogenen Gens verringern, was zur Entstehung eines Phänomens führt, welches als Co-Suppression bekannt ist. Die Reduktion der Genexpression wird noch erheblicher sein, wenn mehrere zusätzliche Kopien einer Nukleinsäuresequenz in die Pflanze eingebracht werden, da eine positive Korrelation zwischen hohen Transkriptspiegeln und der Auslösung von Co-Suppression besteht.
Ein anderes Beispiel eines RNA-Silencing-Verfahrens beinhaltet die Verwendung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen. Eine ”Antisense”-Nukleinsäuresequenz umfasst eine Nukleotidsequenz, welche zu einer ”Sense”-Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein codiert, komplementär ist, d. h. komplementär zum codierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Transkriptsequenz ist. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz ist vorzugsweise komplementär zu dem endogenen Gen, welches abgeschaltet werden soll. Die Komplementarität kann in der ”codierenden Region” und/oder in der ”nicht codierenden Region” eines Gens lokalisiert sein. Der Begriff ”codierende Region” bezieht sich auf eine Region der Nukleotidsequenz, welche Codons umfasst, die in Aminosäurereste translatiert werden. Der Begriff ”nicht codierende Region” bezieht sich auf 5'- und 3'-Sequenzen, welche die codierende Region flankieren und welche transkribiert, jedoch nicht in Aminosäuren translatiert werden (ebenfalls bezeichnet als 5'- und 3'-untranslatierte Regionen).
Antisense-Nukleinsäuresequenzen können gemäß den Regeln der Watson-und-Crick-Basenpaarung entworfen werden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann zur gesamten Nukleinsäuresequenz (in diesem Fall eine Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist) komplementär sein, aber kann ebenfalls ein Oligonukleotid sein, welches den Antisense zu lediglich einem Teil der Nukleinsäuresequenz (einschließlich der 5'- und 3'-UTR der mRNA) darstellt. Zum Beispiel kann die Antisense-Oligonukleotidsequenz komplementär zu der Region sein, welche die Translationsstartstelle eines mRNA-Transkripts umgibt, das ein Polypeptid codiert. Die Länge einer geeigneten Antisense-Oligonukleotidsequenz ist im Fachgebiet bekannt und kann bei etwa 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 oder 10 Nukleotiden Länge oder weniger beginnen. Eine Antisense-Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung kann unter Anwendung von chemischer Synthese und enzymatischen Ligationsreaktionen mit Hilfe von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren konstruiert werden. Zum Beispiel kann eine Antisense-Nukleinsäuresequenz (z. B. eine Antisense-Oligonukleotidsequenz) chemisch synthetisiert werden, wobei natürlich vorkommende Nukleotide oder verschiedenartig modifizierte Nukleotide verwendet werden, entworfen zur Erhöhung der biologischen Stabilität der Moleküle oder zur Erhöhung der physikalischen Stabilität des zwischen den Antisense- und Sense-Nukleinsäuresequenzen gebildeten Duplex, wobei z. B. Phosphorthioat-Derivate und acridinsubstituierte Nukleotide verwendet werden können. Beispiele von modifizierten Nukleotiden, welche zum Erzeugen der Antisense-Nukleinsäuresequenzen verwendet werden können, sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Zu bekannten Nukleotidmodifikationen zählen Methylierung, Cyclisierung und 'Caps' sowie Substitution von einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analog, wie etwa Inosin. Andere Modifikationen von Nukleotiden sind im Fachgebiet allgemein bekannt.
Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann biologisch unter Verwendung eines Expressionsvektors hergestellt werden, in welchen eine Nukleinsäuresequenz in einer Antisense-Orientierung subkloniert worden ist (d. h., die von der insertierten Nukleinsäure transkribierte RNA wird bezüglich einer Zielnukleinsäure von Interesse eine Antisense-Orientierung aufweisen). Vorzugsweise findet die Erzeugung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen in Pflanzen mittels eines stabil integrierten Nukleinsäurekonstrukts statt, das einen Promotor, ein funktionsfähig verbundenes Antisense-Oligonukleotid und einen Terminator umfasst.
Die zum Silencing in den Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuremoleküle (ob in eine Pflanze eingeführt oder in situ erzeugt) hybridisieren oder binden an für ein Polypeptid codierende genomische DNA und/oder mRNA-Transkripte, um dadurch die Expression des Proteins zu inhibieren, z. B. durch Inhibieren von Transkription und/oder Translation. Die Hybridisierung kann durch herkömmliche Nukleotidkomplementarität unter Bildung eines stabilen Duplex erfolgen oder, zum Beispiel im Fall einer Antisense-Nukleinsäuresequenz, welche an DNA-Duplexe bindet, durch spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix. Antisense-Nukleinsäuresequenzen können durch Transformation oder direkte Injektion an einer spezifischen Gewebestelle in eine Pflanze eingebracht werden. Alternativ dazu können Antisense-Nukleinsäuresequenzen modifiziert sein, um ausgewählte Zellen anzuzielen, und dann systemisch verabreicht werden. Für die systemische Verabreichung können Antisense-Nukleinsäuresequenzen zum Beispiel so modifiziert werden, dass sie spezifisch an Rezeptoren oder Antigene, die auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert werden, binden, z. B. durch Verknüpfen der Antisense-Nukleinsäuresequenz an Peptide oder Antikörper, welche an Zelloberflächen-Rezeptoren oder Antigene binden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenzen können Zellen auch unter Verwendung der hierin beschriebenen Vektoren zugeführt werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt ist die Antisense-Nukleinsäuresequenz eine a-anomere Nukleinsäuresequenz. Eine a-anomere Nukleinsäuresequenz bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, in welchen, im Gegensatz zu den gewöhnlichen b-Einheiten, die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al. (1987) Nucl. Ac. Res. 15: 6625–6641).
Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann außerdem ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al. (1987) Nucl. Ac. Res. 15, 6131–6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analog (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215, 327–330) umfassen.
Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung von endogener Genexpression kann auch unter Verwendung von Ribozymen durchgeführt werden. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonuklease-Aktivität, welche zum Spalten einer einzelsträngigen Nukleinsäuresequenz, wie einer mRNA, zu der sie eine komplementäre Region aufweisen, in der Lage sind. Somit können Ribozyme (z. B. Hammerkopf-Ribozyme; beschrieben in Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334, 585–591) verwendet werden, um ein Polypeptid codierende mRNA-Transkripte katalytisch zu spalten, wodurch die Anzahl an mRNA-Transkripten, welche in ein Polypeptid translatiert werden sollen, wesentlich verringert wird. Ein Ribozym mit Spezifität für eine Nukleinsäuresequenz kann entworfen werden (siehe zum Beispiel: Cech et al. US-Patent Nr. 4 987 071 ; und Cech et al. US-Patent Nr. 5 116 742 ). Alternativ dazu können mRNA-Transkripte, welche einer Nukleinsäuresequenz entsprechen, verwendet werden, um eine katalytische RNA mit einer spezifischen Ribonuklease-Aktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen zu selektieren (Bartel und Szostak (1993) Science 261, 1411–1418). Die Verwendung von Ribozymen für das Gen-Silencing in Pflanzen ist im Fachgebiet bekannt (z. B. Atkins et al. (1994) WO 94/00012 ; Lenne et al. (1995) WO 95/03404 ; Lutziger et al. (2000) WO 00/00619 ; Prinsen et al. (1997) WO 97/13865 und Scott et al. (1997) WO 97/38116 ).
Gen-Silencing kann auch durch Insertionsmutagenese (beispielsweise T-DNA-Insertion oder Transposon-Insertion) oder durch Strategien erzielt werden, wie sie unter anderem von Angell und Baulcombe ((1999) Plant J. 20(3): 357–62), (Amplicon VIGS WO 98/36083 ) oder Baulcombe ( WO 99/15682 ) beschrieben werden.
Gen-Silencing kann auch auftreten, wenn eine Mutation auf einem endogenen Gen und/oder eine Mutation auf einem/einer isolierten Gen/Nukleinsäure, welche(s) anschließend in eine Pflanze eingebracht wird, vorhanden ist. Die Reduzierung oder wesentliche Eliminierung kann durch ein nicht funktionelles Polypeptid verursacht werden. Zum Beispiel kann das Polypeptid an verschiedene interagierende Proteine binden; eine oder mehrere Mutation(en) und/oder Verkürzung(en) können daher ein Polypeptid vorsehen, das noch zum Binden an interagierende Proteine (wie etwa Rezeptorproteine) in der Lage ist, aber seine normale Funktion nicht aufzeigen kann (wie etwa Signalleitungs-Ligand).
Ein weiteres Vorgehen für das Gen-Silencing besteht im Targeting von Nukleinsäuresequenzen, die zur regulatorischen Region des Gens (z. B. dem Promotor und/oder Enhancern) komplementär sind, wodurch tripelhelikale Strukturen gebildet werden, welche die Transkription des Gens in Zielzellen verhindern. Siehe Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569–84, 1991; Helene et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 27–36 1992; und Maher, L. J. Bioassays 14, 807–15, 1992.
Andere Verfahren, wie etwa die Verwendung von Antikörpern, die gegen ein endogenes Polypeptid gerichtet sind, zum Inhibieren von dessen Funktion in planta oder zum Eingreifen in den Signalleitungsweg, an dem ein Polypeptid beteiligt ist, werden dem Fachmann allgemein bekannt sein. Insbesondere kann es in Betracht gezogen werden, dass vom Menschen geschaffene Moleküle zum Inhibieren der biologischen Funktion eines Zielpolypeptids oder zur Störung des Signalleitungsweges, an dem das Zielpolypeptid beteiligt ist, nützlich sein können.
Alternativ dazu kann ein Screening-Programm angesetzt werden, um natürliche Varianten eines Gens in einer Pflanzenpopulation zu identifizieren, wobei die Varianten Polypeptide mit verringerter Aktivität codieren. Solche natürlichen Varianten können beispielsweise auch zur Ausführung von homologer Rekombination angewandt werden.
Künstliche und/oder natürliche MicroRNAs (miRNAs) können verwendet werden, um Genexpression und/oder mRNA-Translation zu verhindern. Endogene miRNAs sind einzelsträngige, kleine RNAs mit einer Länge von typischerweise 19–24 Nukleotiden. Sie funktionieren vorwiegend zum Regulieren der Genexpression und/oder mRNA-Translation. Die meisten pflanzlichen MicroRNAs (miRNAs) weisen eine perfekte oder beinahe perfekte Komplementarität zu ihren Zielsequenzen auf. Allerdings gibt es natürliche Ziele mit bis zu fünf Fehlpaarungen. Sie werden aus längeren nicht codierenden RNAs mit charakteristischen Rückfaltungsstrukturen durch doppelstrangspezifische RNAsen der Dicer-Familie prozessiert. Nach der Prozessierung werden sie in den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) durch Binden an dessen Hauptkomponente, ein Argonaut-Protein, eingebaut. MiRNAs dienen als die Spezifitätskomponenten des RISC, da sie mit Zielnukleinsäuren, vorwiegend mRNAs, im Cytoplasma eine Basenpaarung eingehen. Anschließende regulatorische Ereignisse beinhalten die Ziel-mRNA-Spaltung und Zerstörung und/oder die Translationsinhibition. Effekte der miRNA-Überexpression spiegeln sich deshalb häufig in verringerten mRNA-Spiegeln von Zielgenen wider.
Artifizielle MikroRNAs (amiRNAs), welche typischerweise eine Länge von 21 Nukleotiden besitzen, können in spezifischer Weise gentechnisch erzeugt werden, um die Genexpression von einzelnen oder mehreren Genen von Interesse negativ zu regulieren. Determinanten der Pflanzen-MikroRNA-Zielauswahl sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Empirische Parameter für die Zielerkennung sind definiert worden und können angewandt werden, um beim Entwurf von spezifischen amiRNAs zu helfen (Schwab et al., Dev. Cell 8, 517–527, 2005). Zweckdienliche Hilfsmittel für den Entwurf und die Erzeugung von amiRNAs und ihren Vorläufern sind ebenfalls öffentlich verfügbar (Schwab et al., Plant Cell 18, 1121–1133, 2006).
Für eine optimale Leistung erfordern die Gen-Silencing-Techniken, die zum Reduzieren der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze angewandt werden, die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen aus monokotylen Pflanzen für die Transformation monokotyler Pflanzen und aus dikotylen Pflanzen für die Transformation dikotyler Pflanzen. Vorzugsweise wird eine Nukleinsäuresequenz aus einer beliebigen gegebenen Pflanzenspezies in dieselbe Spezies eingebracht. Zum Beispiel wird eine Nukleinsäuresequenz aus Reis in eine Reispflanze transformiert. Allerdings ist es kein absolutes Erfordernis, dass die einzuführende Nukleinsäuresequenz aus derselben Pflanzenspezies stammt, wie die Pflanze, in welche sie eingeführt wird. Es ist ausreichend, dass eine wesentliche Homologie zwischen dem endogenen Zielgen und der einzuführenden Nukleinsäure besteht.
Beispiele verschiedener Verfahren für die Reduzierung oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze sind oben beschrieben. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird ohne Weiteres in der Lage sein, die oben genannten Verfahren zum Silencing so anzupassen, dass eine Reduzierung der Expression eines endogenen Gens in einer gesamten Pflanze oder in Teilen davon erreicht wird, beispielsweise durch Verwenden eines geeigneten Promotors.
Transformation
Der Begriff ”Einbringung” oder ”Transformation”, wie hierin darauf Bezug genommen wird, beinhaltet den Transfer eines exogenen Polynukleotids in eine Wirtszelle, ungeachtet des für den Transfer angewandten Verfahrens. Pflanzengewebe, das zur anschließenden klonalen Vermehrung in der Lage ist, ob durch Organogenese oder Embryogenese, kann mit einem genetischen Konstrukt der vorliegenden Erfindung transformiert und eine gesamte Pflanze daraus regeneriert werden. Das gewählte jeweilige Gewebe wird abhängig von den klonalen Propagationssystemen variieren, welche für die zu transformierende jeweilige Spezies verfügbar und am besten geeignet sind. Beispielhafte Gewebeziele schließen Blattscheiben, Pollen, Embryos, Kotyledonen, Hypokotyle, Megagametophyten, Callusgewebe, existierendes meristematisches Gewebe (z. B. Apikalmeristem, Achselknospen und Wurzelmeristeme) und induziertes Meristemgewebe (z. B. Kotylmeristem und Hypokotylmeristem) ein. Das Polynukleotid kann transient oder stabil in eine Wirtszelle eingebracht und kann nicht integriert, zum Beispiel als ein Plasmid, beibehalten werden. Alternativ dazu kann es in das Wirtsgenom integriert werden. Die resultierende transformierte Pflanzenzelle kann dann zum Regenerieren einer transformierten Pflanze auf eine Weise, welche dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist, verwendet werden.
Der Transfer von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Die Transformation von Pflanzenspezies ist heutzutage eine durchaus routinemäßige Technik. In vorteilhafter Weise kann ein beliebiges von mehreren Transformationsverfahren angewandt werden, um das Gen von Interesse in eine geeignete Vorfahrenzelle einzubringen. Die für die Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen beschriebenen Verfahren können für transiente oder für stabile Transformation angewandt werden. Transformationsverfahren beinhalten die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Chemikalien, welche die Aufnahme freier DNA erhöhen, direkte Injektion der DNA in die Pflanze, Beschuss mit einer Partikelkanone, Transformation unter Verwendung von Viren oder Pollen sowie Mikroprojektion. Man kann Verfahren auswählen unter dem Calcium/Polyethylenglykol-Verfahren für Protoplasten (Krens, F. A. et al., (1982) Nature 296, 72–74; Negrutiu, I., et al. (1987) Plant Mol. Biol. 8: 363–373); der Elektroporation von Protoplasten (Shillito R. D. et al. (1985) Bio/Technol. 3, 1099–1102); der Mikroinjektion in Pflanzenmaterial hinein (Crossway, A., et al., (1986) Mol. Gen. Genet., 202: 179–185); dem Beschuss mit DNA- oder RNA-beschichteten Teilchen (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70), der Infektion mit (nicht integrierenden) Viren und dergleichen. Transgene Pflanzen, einschließlich transgener Kulturpflanzen, werden vorzugsweise durch Agrobacterium-vermittelte Transformation hergestellt. Ein vorteilhaftes Transformationsverfahren ist die Transformation in planta. Zu diesem Zweck ist es zum Beispiel möglich, den Agrobakterien zu gestatten, auf Pflanzensamen einzuwirken, oder das Pflanzenmeristem mit Agrobakterien zu inokulieren. Es hat sich gemäß der Erfindung als besonders zweckmäßig erwiesen zu gestatten, dass eine Suspension transformierter Agrobakterien auf die intakte Pflanze oder zumindest auf die Blütenanlagen einwirkt. Die Pflanze wird anschließend weiter wachsen gelassen, bis die Samen der behandelten Pflanze erhalten werden (Clough und Bent, Plant J. (1998) 16, 735–743). Verfahren für die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Reis schließen allgemein bekannte Verfahren für die Reistransformation ein, wie etwa diejenigen, welche in einem beliebigen von Folgenden beschrieben sind: Europäische Patentanmeldung EP 1198985 A1 , Aldemita und Hodges (Planta 199: 612–617, 1996); Chan et al. (Plant Mol. Biol. 22 (3): 491–506, 1993), Hiei et al. (Plant J. 6 (2): 271–282, 1994), deren Offenbarungen hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind, als ob sie vollständig dargestellt wären. Im Falle einer Mais-Transformation ist das bevorzugte Verfahren so beschaffen, wie entweder in Ishida et al. (Nat. Biotechnol 14(6): 745–50, 1996) oder Frame et al. (Plant Physiol. 129(1): 13–22, 2002) beschrieben, deren Offenbarungen hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind, als ob sie vollständig dargestellt wären. Die Verfahren sind beispielhaft ferner in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128–143 und in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205–225) beschrieben. Die Nukleinsäuren oder das Konstrukt, welche(s) exprimiert werden soll/sollen, wird/werden vorzugsweise in einen Vektor kloniert, der zum Transformieren von Agrobacterium tumefaciens geeignet ist, zum Beispiel pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Mit einem derartigen Vektor transformierte Agrobakterien können dann auf bekannte Weise für die Transformation von Pflanzen verwendet werden, wie etwa Pflanzen, welche als Modell herangezogen werden, wie Arabidopsis (Arabidopsis thaliana wird innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung nicht als Kulturpflanze betrachtet), oder Kulturpflanzen, wie zum Beispiel Tabakpflanzen, beispielsweise durch Eintauchen von zerquetschten Blättern oder zerhackten Blättern in einer Agrobakterienlösung und danach Kultivieren derselben in geeigneten Medien. Die Transformation von Pflanzen mittels Agrobacterium tumefaciens ist zum Beispiel von Hofgen und Willmitzer in Nucl. Acids Res. (1988) 16, 9877, beschrieben oder ist unter anderem aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38, bekannt.
Zusätzlich zur Transformation von somatischen Zellen, welche dann zu intakten Pflanzen regeneriert werden müssen, ist es ebenfalls möglich, die Zellen von Pflanzenmeristemen und insbesondere diejenigen Zellen, welche sich zu Gameten entwickeln, zu transformieren. In diesem Fall folgen die transformierten Gameten der natürlichen Pflanzenentwicklung, wodurch es zur Entstehung transgener Pflanzen kommt. So werden beispielsweise Samen von Arabidopsis mit Agrobakterien behandelt, und Samen werden aus den sich entwickelnden Pflanzen erhalten, von denen ein gewisser Anteil transformiert und somit transgen ist [Feldman, KA, und Marks, MD (1987). Mol. Gen. Genet. 208: 1–9; Feldmann, K., (1992). in: C. Koncz, N-H. Chua und J. Shell (Hrsg.), Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, S. 274–289]. Alternative Verfahren basieren auf der wiederholten Entfernung der Infloreszenzen und der Inkubation der Schnittstelle im Zentrum der Rosette mit transformierten Agrobakterien, wodurch in ähnlicher Weise transformierte Samen zu einem späteren Zeitpunkt erhalten werden können (Chang (1994). Plant J. 5: 551–558; Katavic (1994). Mol. Gen. Genet., 245: 363–370). Ein besonders effektives Verfahren ist jedoch das Vakuuminfiltrationsverfahren mit seinen Modifikationen, wie dem ”Floral dip”-Verfahren. Im Falle von Vakuuminfiltration von Arabidopsis werden intakte Pflanzen unter verringertem Druck mit einer Agrobakteriensuspension behandelt [Bechthold, N. (1993). C. R. Acad. Sci. Paris Life Sci., 316: 1194–1199], wohingegen im Fall des ”Floral dip”-Verfahrens das sich entwickelnde Blütengewebe kurz mit einer tensidbehandelten Agrobakteriensuspension inkubiert wird [Clough, SJ, und Bent, AF (1998) The Plant J. 16, 735–743]. In beiden Fällen wird ein gewisser Anteil an transgenen Samen geerntet, und diese Samen können von nicht transgenen Samen durch Kultivieren unter den oben beschriebenen selektiven Bedingungen unterschieden werden. Darüber hinaus besitzt die stabile Transformation von Plastiden Vorteile, weil Plastide in den meisten Kulturpflanzen maternal vererbt werden, was das Risiko eines Transgen-Flusses durch Pollen verringert oder eliminiert. Die Transformation des Chloroplastengenoms wird im Allgemeinen durch ein Verfahren bewirkt, das in Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225–229] schematisch geschildert worden ist. Kurz gesagt werden die zu transformierenden Sequenzen zusammen mit einem selektierbaren Markergen zwischen flankierende Sequenzen, die homolog zum Chloroplastengenom sind, kloniert. Diese homologen flankierenden Sequenzen lenken die ortsspezifische Integration in das Plastom. Plastidale Transformation ist für viele verschiedene Pflanzenspezies beschrieben worden, und eine Übersicht findet man in Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J. Mol. Biol. 21. Sep. 2001; 312 (3): 425–38, oder Maliga, P. (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20–28. In jüngster Zeit ist über einen weiteren biotechnologischen Fortschritt in Form von markerfreien Plastidentransformanten, welche mittels eines transienten, cointegrierten Markergens hergestellt werden können, berichtet worden (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225–229).
Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können durch alle Verfahren regeneriert werden, mit denen der Fachmann vertraut ist. Geeignete Verfahren können in den oben erwähnten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Hofgen und Willmitzer gefunden werden.
Nach einer Transformation werden Pflanzenzellen oder Zellgruppierungen im Allgemeinen hinsichtlich der Gegenwart von einem oder mehreren Markern selektiert, welche von pflanzlich exprimierbaren Genen codiert werden, die mit dem Gen von Interesse co-transferiert werden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Um transformierte Pflanzen zu selektieren, wird das in der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial in der Regel selektiven Bedingungen unterworfen, so dass transformierte Pflanzen von nicht transformierten Pflanzen unterschieden werden können. Zum Beispiel können die in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Samen eingepflanzt und nach einer anfänglichen Wachstumsperiode einer geeigneten Selektion durch Besprühen unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht im Wachsenlassen der Samen, zutreffendenfalls nach Sterilisation, auf Agarplatten unter Anwendung eines geeigneten Auswahlmittels, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ werden die transformierten Pflanzen hinsichtlich der Gegenwart eines selektierbaren Markers, wie derjenigen, die oben beschrieben sind, gescreent.
Im Anschluss an DNA-Transfer und Regeneration können vermeintlich transformierte Pflanzen auch, zum Beispiel unter Anwendung von Southern-Analyse, hinsichtlich der Gegenwart des Gens von Interesse, der Kopienzahl und/oder der genomischen Organisation untersucht werden. Alternativ oder zusätzlich können Expressionsspiegel der neu eingeführten DNA unter Anwendung von Northern- und/oder Western-Analyse überwacht werden, wobei beide Techniken dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt sind.
Die erzeugten, transformierten Pflanzen können durch eine Vielzahl von Methoden vermehrt werden, wie etwa durch klonale Propagation oder klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (oder T1) geselbstet und homozygote Transformanten der zweiten Generation (oder T2) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann durch klassische Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten transformierten Organismen können eine Vielzahl von Formen annehmen. Zum Beispiel können sie Chimären von transformierten Zellen und nicht transformierten Zellen; klonale Transformanten (wobei z. B. alle Zellen transformiert sind, um die Expressionskassette zu enthalten); Propfungen von transformierten und nicht transformierten Geweben (z. B. in Pflanzen, in denen ein transformierter Wurzelstock an einen nicht transformierten Spross gepfropft wird) sein.
T-DNA-Aktivierungs-Tagging
T-DNA-Aktivierungs-Tagging (Hayashi et al. Science (1992) 1350–1353) beinhaltet die Insertion von T-DNA, üblicherweise enthaltend einen Promotor (es kann sich auch um einen Translations-Enhancer oder ein Intron handeln), in die genomische Region des Gens von Interesse oder 10 kb stromaufwärts oder stromabwärts der codierenden Region eines Gens in einer derartigen Konfiguration, dass der Promotor die Expression des angezielten Gens steuert. Typischerweise wird die Regulierung der Expression des angezielten Gens durch seinen natürlichen Promotor gestört, und das Gen kommt unter die Kontrolle des neu eingebrachten Promotors. Der Promotor ist typischerweise in einer T-DNA eingebettet. Diese T-DNA wird statistisch in das Pflanzengenom insertiert, zum Beispiel durch Agrobacterium-Infektion, und führt zur modifizierten Expression von Genen nahe der insertierten T-DNA. Die resultierenden transgenen Pflanzen zeigen dominante Phänotypen aufgrund der modifizierten Expression von Genen nahe dem eingebrachten Promotor.
TILLING
Der Begriff ”TILLING” ist eine Abkürzung für ”Targeted Induced Local Lesions In Genomes” und bezieht sich auf eine Mutagenesetechnologie, die zum Erzeugen und/oder Identifizieren von Nukleinsäuren nützlich ist, welche Proteine mit modifizierter Expression und/oder Aktivität codieren. TILLING erlaubt auch die Selektion von Pflanzen, welche derartige Mutantenvarianten tragen. Diese Mutantenvarianten können eine modifizierte Expression aufzeigen, entweder hinsichtlich Stärke oder Lokalisierung oder Zeitgebung (wenn die Mutationen zum Beispiel den Promotor betreffen). Diese Mutantenvarianten können eine höhere Aktivität aufzeigen als sie von dem Gen in seiner natürlichen Form aufgewiesen wird. TILLING vereinigt Hochdichte-Mutagenese mit Hochdurchsatz-Screeningverfahren. Die beim TILLING typischerweise befolgten Schritte sind: (a) EMS-Mutagenese (Redei, GP und Koncz, C (1992), in: Methods in Arabidopsis Research, Koncz, C, Chua, NH, Schell, J (Hrsg.) Singapur, World Scientific Publishing Co, S. 16–82; Feldmann et al., (1994) in: Meyerowitz. EM, Somerville. CR (Hrsg.), Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, S. 137–172; Lightner, J. und Caspar, T. (1998) in: J. Martinez-Zapater, J. Salinas, (Hrsg.), Methods in Molecular Biology, Band 82. Humana Press, Totowa, NJ, S. 91–104); (b) DNA-Präparation und Poolen der Individuen; (c) PCR-Amplifikation einer Region von Interesse; (d) Denaturieren und Annealen, um die Bildung von Heteroduplexen zu gestatten; (e) DHPLC, wobei die Gegenwart eines Heteroduplex in einem Pool als ein Extra-Peak im Chromatogramm nachgewiesen wird; (f) Identifikation des Mutanten-Individuums; und (g) Sequenzieren des Mutanten-PCR-Produkts. Verfahren für TILLING sind im Fachgebiet allgemein bekannt (McCallum et al., (2000) Nat. Biotechnol. 18: 455–457; übersichtmäßig zusammengefasst von Stemple (2004) Nat. Rev. Genet. 5(2): 145–50).
Homologe Rekombination
Homologe Rekombination gestattet die Einbringung einer gewählten Nukleinsäure in einem Genom an einer definierten gewählten Position. Homologe Rekombination ist eine Standardtechnologie, die in den biologischen Wissenschaften für niedere Organismen, wie Hefe oder das Moos Physcomitrella, routinemäßig angewandt wird. Verfahren zur Durchführung homologer Rekombination in Pflanzen sind nicht nur für Modellpflanzen beschrieben worden (Offringa et al. (1990) EMBO J. 9(10): 3077–84), sondern auch für Kulturpflanzen, zum Beispiel Reis (Terada et al. (2002) Nat. Biotech. 20(10): 1030–4; Iida und Terada (2004) Curr. Opin. Biotech. 15(2): 132–8), und es existieren Vorgehensweisen, welche, ungeachtet des Zielorganismus, allgemein anwendbar sind (Miller et al., Nature Biotechnol. 25, 778–785, 2007).
Ertragsmerkmale
Ertragsmerkmale sind Merkmale bzw. Charakteristika, die mit dem Pflanzenertrag in Zusammenhang stehen. Ertragsmerkmale können eines oder mehrere der folgenden nicht einschränkenden Liste von Merkmalen umfassen: frühe Blütezeit, Ertrag, Biomasse, Samenertrag, Früh-Wuchskraft, Grünheitsindex, erhöhte Wachstumsrate, verbesserte agronomische Eigenschaften wie z. B. verbesserte Flutungstoleranz (was bei Reis zu einem höheren Ertrag führt), Wasserausnutzungseffizienz (Water Use Efficiency, WUE), verbesserte Stickstoffausnutzungseffizienz (Nitrogen Use Efficiency, NUE) usw.
Ertrag
Der Begriff ”Ertrag” bedeutet im Allgemeinen einen messbaren Gewinn von wirtschaftlichem Wert, typischerweise in Bezug auf eine spezifizierte Kulturpflanze, ein Gebiet und eine Zeitperiode. Individuelle Pflanzenteile tragen auf Basis ihrer Anzahl, Größe und/oder ihres Gewichts direkt zum Ertrag bei, oder die tatsächliche Ausbeute ist der Ertrag pro Quadratmeter für eine Kulturpflanze und pro Jahr, was mittels Dividieren der Gesamtproduktion (einschließlich sowohl geernteter als auch geschätzter Produktion) durch die bepflanzten Quadratmeter bestimmt wird.
Die Begriffe ”Ertrag” einer Pflanze und ”Pflanzenertrag” werden hier austauschbar verwendet und sollen sich auf vegetative Biomasse wie Wurzel- und/oder Sprossbiomasse, auf die reproduktiven Organe und/oder auf Verbreitungseinheiten wie Samen dieser Pflanze beziehen.
Die Blüten von Mais sind unisexuell; männliche Blütenstände (Fahnen) haben ihren Ursprung im apikalen Stamm und weibliche Blütenstände (Ähren) gehen von den Spitzen der Achselknospen aus. Der weibliche Blütenstand produziert ein Paar Ährchen an der Oberfläche einer zentralen Achse (Kolben). Jedes weibliche Ährchen schließt zwei fruchtbare Einzelblüten ein, von denen gewöhnlich eine nach einer Befruchtung zum Maiskorn reift. So kann sich eine Ertragserhöhung bei Mais unter anderem in einem oder mehreren der Folgenden zeigen: einer Erhöhung der Anzahl an Pflanzen, welche pro Quadratmeter hervorgebracht werden, einer Erhöhung der Anzahl von Ähren pro Pflanze, einer Erhöhung der Anzahl an Ackerreihen, der Anzahl der Kerne pro Reihe, des Kerngewichts, des Tausendkerngewichts, der Ährenlänge/des Ährendurchmessers, einer Erhöhung der Samenfüllrate, welche die Anzahl an mit Samen gefüllten Einzelblüten (d. h. samenhaltigen Einzelblüten) dividiert durch die Gesamtzahl an Einzelblüten und multipliziert mit 100 ist).
Blütenstände in Reispflanzen werden als Rispen bezeichnet. Die Rispe trägt Ährchen, bei denen es sich um die Grundeinheit der Rispe handelt und die aus einem Blütenstiel und einer Einzelblüte besteht. Die Einzelblüte befindet sich auf dem Blütenstiel und umfasst eine Blüte, die von zwei Schutzspelzen bedeckt ist: eine größere Spelze (die Deckspelze bzw. das Lemma) und eine kürzere Spelze (die Vorspelze bzw. das Palea). Nimmt man also Reis als Beispiel, so kann sich eine Ertragserhöhung unter anderem als Erhöhung eines oder mehrerer der Folgenden zeigen: Anzahl an Pflanzen pro Quadratmeter, Anzahl von Rispen pro Pflanze, Rispenlänge, Anzahl an Ährchen pro Rispe, Anzahl an Blüten (bzw. Einzelblüten) pro Rispe, einer Erhöhung der Samenfüllrate, welche die Anzahl an mit Samen gefüllten Einzelblüten (d. h. samenhaltigen Einzelblüten dividiert durch die Gesamtzahl an Einzelblüten und multipliziert mit 100 ist), einer Erhöhung des Tausendkerngewichts.
Frühe Blütezeit
Pflanzen mit einer ”frühen Blütezeit”, so wie der Begriff hier verwendet wird, sind Pflanzen, die eher zu blühen beginnen als Kontrollpflanzen. Dieser Ausdruck bezieht sich daher auf Pflanzen, die eher zu blühen beginnen. Die Blütezeit von Pflanzen lässt sich abschätzen, indem man die Anzahl an Tagen (”Zeit bis zur Blüte”) zwischen dem Säen und dem Erscheinen einer ersten Blüte zählt. Die ”Blütezeit” einer Pflanze lässt sich zum Beispiel unter Anwendung des in WO 2007/093444 beschriebenen Verfahrens bestimmen.
Jungpflanzenvitalität
”Jungpflanzenvitalität” bezieht sich auf aktives gesundes, gut ausgewogenes Wachstum, insbesondere während der frühen Stadien des Pflanzenwachstums, und kann aus einer erhöhten Pflanzenfitness resultieren, beispielsweise aufgrund dessen, dass die Pflanzen besser an ihre Umgebung angepasst sind (d. h. Optimieren der Verwendung von Energieressourcen und der Aufteilung zwischen Spross und Wurzel). Pflanzen mit Jungpflanzenvitalität zeigen außerdem erhöhtes Setzling-Überleben und eine bessere Hervorbringung der Kulturpflanze, was häufig zu sehr gleichmäßigen Feldern (wobei die Kulturpflanze in gleichmäßiger Weise wächst, d. h. die Mehrheit der Pflanzen die verschiedenen Stadien der Entwicklung im Wesentlichen zur gleichen Zeit erreicht) und oftmals zu einem besseren und höheren Ertrag führt. Deshalb kann die Jungpflanzenvitalität durch Messen verschiedener Faktoren, wie etwa Tausendkerngewicht, Prozentsatz der Keimung, Prozentsatz der Emergenz, Setzlingswachstum, Setzlingshöhe, Wurzellänge, Wurzel- und Sprossbiomasse und vielen anderen, bestimmt werden.
Erhöhte Wachstumsrate
Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (einschließlich Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen überall in der gesamten Pflanze herrschen. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Der Lebenszyklus einer Pflanze kann so verstanden werden, dass die Zeit gemeint ist, welche benötigt wird, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, in welchem die Pflanze trockene reife Samen erzeugt hat, die ähnlich zum Ausgangsmaterial sind. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren, wie Keimschnelligkeit, Jungpflanzenvitalität, Wachstumsrate, Grünheits-Index, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung, beeinflusst werden. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann an einer oder mehreren Stufen im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Pflanzenlebenszyklus stattfinden. Eine erhöhte Wachstumsrate während der frühen Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann eine gesteigerte Wuchskraft reflektieren. Die Erhöhung in der Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, was gestattet, dass Pflanzen später ausgesät und/oder früher geerntet werden, als es sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt kann mit einer früheren Blütezeit erreicht werden). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, kann sie das weitere Aussäen von Samen derselben Pflanzenspezies ermöglichen (zum Beispiel Säen und Ernten von Reispflanzen, gefolgt von Säen und Ernten weiterer Reispflanzen, alle innerhalb einer herkömmlichen Wachstumsperiode). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht wird, kann sie, in ähnlicher Weise, das weitere Aussäen von Samen anderer Pflanzenspezies ermöglichen (zum Beispiel das Säen und Ernten von Maispflanzen, gefolgt zum Beispiel von Aussaat und gegebenenfalls Ernte von Sojabohne, Kartoffel oder einer beliebigen anderen geeigneten Pflanze). Im Falle mancher Kulturpflanzen kann auch das mehrmalige Abernten vom gleichen Wurzelstock möglich sein. Das Ändern des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Quadratmeter führen (aufgrund einer Erhöhung der Mehrmaligkeit (z. B. in einem Jahr), mit der eine beliebige jeweilige Pflanze angebaut und geerntet werden kann). Eine Erhöhung der Wachstumsrate kann auch die Kultivierung transgener Pflanzen in einem weiteren geographischen Gebiet als bei ihren Wildtyp-Gegenstücken zulassen, da die territorialen Eingrenzungen für den Anbau einer Kulturpflanze häufig von nachteiligen Umweltbedingungen entweder zur Zeit des Pflanzens (frühe Jahreszeit) oder zur Zeit des Erntens (späte Jahreszeit) bestimmt werden. Derartige nachteilige Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt wird. Die Wachstumsrate lässt sich durch Ableiten verschiedener Parameter aus den Wachstumskurven bestimmen, wobei es sich bei den Parametern unter anderem um die folgenden handeln kann: T-Mid (die Zeit, die Pflanzen zum Erreichen von 50% ihrer Maximalgröße benötigen) und T-90 (die Zeit, die Pflanzen zum Erreichen von 90% ihrer Maximalgröße benötigen).
Stressresistenz
Eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate tritt ungeachtet dessen, ob sich die Pflanze unter Nichtstressbedingungen befindet oder ob die Pflanze verschiedenen Stressformen ausgesetzt ist, im Vergleich zu Kontrollpflanzen auf. Pflanzen antworten in der Regel auf eine Exposition gegenüber Stress, indem sie langsamer wachsen. Unter Bedingungen von starkem Stress kann die Pflanze das Wachstum sogar vollständig einstellen. Mäßiger Stress ist demgegenüber hierin als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist, der nicht dazu führt, dass die Pflanze das Wachstum vollständig ohne Fähigkeit zur Wiederaufnahme des Wachstums einstellt. Mäßiger Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35%, 30% oder 25%, weiter bevorzugt weniger als 20% oder 15%, im Vergleich zur Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Auf grund der Fortschritte in den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerungs-, Düngungs-, Pestizidbehandlungen) werden starke Stressfaktoren bei kultivierten Kulturpflanzen nicht häufig angetroffen. Als eine Konsequenz ist das von mäßigem Stress induzierte beeinträchtigte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal für die Landwirtschaft. Mäßige Stressfaktoren sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (umweltbedingten) Stressfaktoren, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotische Stressfaktoren können zurückzuführen sein auf Dürre oder überschüssiges Wasser, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Frost-Temperaturen.
”Biotische Stressfaktoren” sind typischerweise diejenigen Stressarten, welche von Pathogenen wie Bakterien, Viren, Pilzen, Nematoden und Insekten hervorgerufen werden.
Der abiotische Stress kann ein osmotischer Stress sein, der von einem Wasserstress (z. B. wegen Dürre), Salzstress oder einem Froststress verursacht wird. Bei abiotischem Stress kann es sich auch um oxidativen Stress oder Kältestress handeln. ”Froststress” soll sich auf Stress aufgrund von Frosttemperaturen, d. h. Temperaturen, bei denen verfügbare Wassermoleküle gefrieren und zu Eis werden, beziehen. ”Kältestress”, der auch als ”Kühlstress” bezeichnet wird, soll sich auf kalte Temperaturen, z. B. Temperaturen unter 10°, oder vorzugsweise unter 5°C, bei denen Wassermoleküle jedoch nicht gefrieren, beziehen. Wie von Wang et al. (Planta (2003) 218: 1–14) berichtet, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, welche Pflanzenwachstum und Produktivität nachteilig beeinflussen. Dürre, Salzgehalt, extreme Temperaturen und oxidativer Stress sind bekanntermaßen miteinander verbunden und können Wachstums- und Zellschaden durch ähnliche Mechanismen herbeiführen. Rabbani et al. (Plant Physiol (2003) 133: 1755–1767) beschreiben ein besonders hohes Ausmaß an ”Wechselverbindung” zwischen Dürre-Stress und Stress durch hohen Salzgehalt. Zum Beispiel manifestieren sich Dürre und/oder Versalzung hauptsächlich als osmotischer Stress, was zur Zerstörung von Homöostase und Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, welcher oft Stress durch hohe oder niedrige Temperatur, Salzgehalt oder Dürre begleitet, kann die Denaturierung von funktionellen Proteinen und Strukturproteinen verursachen. Als Konsequenz aktivieren diese verschiedenartigen Umwelt-Stressfaktoren häufig ähnliche Zell-Signalwege und zelluläre Antworten, wie etwa die Produktion von Stressproteinen, die Heraufregulierung von Antioxidantien, die Akkumulierung von kompatiblen gelösten Stoffen und einen Wachstumsstillstand. Der Begriff ”Nichtstress”-bedingungen, wie hierin verwendet, bezeichnet diejenigen Umweltbedingungen, welche ein optimales Wachstum von Pflanzen gestatten. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt normale Bodenbedingungen und klimatische Bedingungen für eine gegebene Örtlichkeit. Pflanzen mit optimalen Wachstumsbedingungen (die unter Nichtstressbedingungen kultiviert wurden) ergeben typischerweise, mit zunehmender Präferenz, mindestens 97%, 95%, 92%, 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% oder 75% der durchschnittlichen Produktion einer solchen Pflanze in einer gegebenen Umgebung. Die durchschnittliche Produktion kann auf der Grundlage von Ernte und/oder Saison berechnet werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt Durchschnittsertrags-Produktionen einer Kulturpflanze.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können insbesondere unter Nichtstressbedingungen durchgeführt werden. In einem Beispiel können die Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Nichtstressbedingungen wie milder Dürre durchgeführt werden, wodurch man Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält.
Bei einer anderen Ausführungsform können die Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Stressbedingungen durchgeführt werden.
In einem Beispiel können die Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Stressbedingungen wie Dürre durchgeführt werden, wodurch man Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält. In einem anderen Beispiel können die Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Stressbedingungen wie Nährstoffmangel durchgeführt werden, wodurch man Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält.
Ein Nährstoffmangel kann aus einem Mangel an Nährstoffen wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor resultieren. In noch einem anderen Beispiel können die Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Stressbedingungen wie Salzstress durchgeführt werden, wodurch man Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält. Der Begriff Salzstress ist nicht auf Kochsalz (NaCl) beschränkt, sondern kann sich unter anderem auch auf eine oder mehrere der folgenden Substanzen beziehen: NaCl, KCl, LiCl, MgCl₂, CaCl₂.
In noch einem anderen Beispiel können die Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Stressbedingungen wie Kältestress oder Froststress durchgeführt werden, wodurch man Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält.
Erhöhen/Verbessern/Steigern
Die Begriffe ”erhöhen”, ”verbessern” oder ”steigern” sind austauschbar und sollen im Sinne der Patentanmeldung mindestens 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% oder 10%, vorzugsweise mindestens 15% oder 20%, weiter bevorzugt 25%, 30%, 35% oder 40% mehr Ertrag und/oder Wachstum im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wie hierin definiert, bedeuten.
Samenertrag
Erhöhter Samenertrag kann sich als eines oder mehrere der Folgenden manifestieren:

(a) eine Zunahme bei der Samenbiomasse (Gesamtsamengewicht), welche auf Einzelsamenbasis und/oder pro Pflanze und/oder pro Quadratmeter bezogen sein kann;
(b) eine erhöhte Anzahl an Blüten pro Pflanze;
(c) eine erhöhte Anzahl an Samen;
(d) eine erhöhte Samenfüllrate (welche als das Verhältnis zwischen der Zahl gefüllter Einzelblüten, dividiert durch die Gesamtzahl an Einzelblüten ausgedrückt wird);
(e) ein erhöhter Ernteindex, welcher als ein Verhältnis des Ertrags an erntefähigen Teilen, wie Samen, dividiert durch die Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile, ausgedrückt wird; und
(f) ein erhöhtes Tausendkerngewicht (TKW), welches aus der gezählten Anzahl an Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert wird. Ein erhöhtes TKW kann aus erhöhter Samengröße und/oder erhöhtem Samengewicht resultieren und kann auch aus einer Erhöhung der Embryo- und/oder Endospermgröße resultieren.

Die Ausdrücke ”gefüllte Einzelblüten” und ”gefüllte Samen” können als Synonyme betrachtet werden.
Eine Erhöhung im Samenertrag kann sich auch als eine Erhöhung in Samengröße und/oder Samenvolumen manifestieren. Ferner kann sich eine Erhöhung des Samenertrags auch als eine Erhöhung bei Samenfläche und/oder Samenlänge und/oder Samenbreite und/oder Samenumfang manifestieren.
Grünheits-Index
Der ”Grünheits-Index”, wie hierin verwendet, wird aus Digitalbildern von Pflanzen berechnet. Für jedes Pixel, das zu dem Pflanzenobjekt auf dem Bild gehört, wird das Verhältnis des Grünwerts gegenüber dem Rotwert (im RGB-Modell zum Codieren von Farbe) berechnet. Der Grünheits-Index wird als der Prozentsatz an Pixeln ausgedrückt, für den das Grün-zu-Rot-Verhältnis einen gegebenen Schwellenwert übersteigt. Unter normalen Wachstumsbedingungen, unter Salzstress-Wachstumsbedingungen und unter Wachstumsbedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit wird der Grünheits-Index von Pflanzen in der letzten Abbildung vor dem Aufblühen gemessen. Im Gegensatz dazu wird der Grünheits-Index von Pflanzen unter Dürrestress-Wachstumsbedingungen in der ersten Abbildung nach der Dürre gemessen.
Biomasse
Der Ausdruck ”Biomasse” soll sich, so wie er hier verwendet wird, auf das Gesamtgewicht einer Pflanze beziehen. Bei der Definition von Biomasse kann man einen Unterschied zwischen der Biomasse eines oder mehrerer Teile einer Pflanze machen, welche eines oder mehrere der Folgenden einschließen können:

– oberirdische Teile wie z. B., jedoch nicht darauf beschränkt, Sprossbiomasse, Samenbiomasse, Blattbiomasse usw.;
– oberirdische erntbare Teile wie z. B., jedoch nicht darauf beschränkt, Sprossbiomasse, Samenbiomasse, Blattbiomasse usw.;
– unterirdische Teile wie z. B., jedoch nicht darauf beschränkt, Wurzelbiomasse, Knollen, Zwiebeln usw.;
– unterirdische (erntbare) Teile wie z. B., jedoch nicht darauf beschränkt, Wurzelbiomasse Knollen, Zwiebeln usw.;
– vegetative Biomasse wie Wurzelbiomasse, Sprossbiomasse usw.;
– Fortpflanzungsorgane; und
– Diasporen wie Samen.

Markerunterstützte Züchtungsprogramme
Solche Züchtungsprogramme erfordern manchmal das Einbringen von allelischer Variation durch mutagene Behandlung der Pflanzen, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese angewandt wird; alternativ dazu kann das Programm mit einer Sammlung von Allelvarianten mit unabsichtlich verursachtem sogenanntem ”natürlichen” Ursprung beginnen. Die Identifizierung von Allelvarianten findet dann zum Beispiel mittels PCR statt. Hierauf folgt ein Schritt zur Selektion von höherwertigen Allelvarianten der betreffenden Sequenz, welche erhöhten Ertrag ergeben. Die Selektion wird in der Regel durch Überwachen der Wachstumsleistung von Pflanzen, die verschiedene Allelvarianten der betreffenden Sequenz enthalten, ausgeführt. Die Wachstumsleistung kann in einem Gewächshaus oder auf dem Feld überwacht werden. Weitere wahlfreie Schritte beinhalten das Kreuzen von Pflanzen, in denen die höherwertige Allelvariante identifiziert worden ist, mit einer anderen Pflanze. Dies könnte beispielsweise angewandt werden, um eine Kombination interessanter phänotypischer Merkmale zu erzeugen.
Verwendung als Sonden beim Genkartieren
Die Verwendung von für das interessierende Protein codierenden Nukleinsäuren zur genetischen und physikalischen Kartierung der Gene erfordert lediglich eine Nukleinsäuresequenz von mindestens 15 Nukleotiden Länge. Diese Nukleinsäuren können als Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus(RFLP)-Marker verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J., Fritsch, EF., und Maniatis, T., (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) von restriktionsverdauter pflanzlicher genomischer DNA können mit den für das interessierende Protein codierenden Nukleinsäuren sondiert werden. Die resultierenden Bandenmuster können dann genetischen Analysen mit Hilfe von Computerprogrammen wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181) unterzogen werden, um eine genetische Karte zu erstellen. Darüber hinaus können die Nukleinsäuren verwendet werden, um Southern-Blots zu sondieren, die mit Restriktionsendonuklease behandelte genomische DNAs aus einer Auswahl von Individuen enthalten, welche Eltern und Nachkommen einer definierten genetischen Kreuzung repräsentieren. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird aufgezeichnet und verwendet, um die Position der für das interessierende Protein codierenden Nukleinsäure in der genetischen Karte zu berechnen, welche zuvor unter Verwendung dieser Population erhalten wurde (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
Die Herstellung und Anwendung von pflanzengenabgeleiteten Sonden zur Verwendung in der genetischen Kartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung von spezifischen cDNA-Klonen unter Anwendung der oben geschilderten Methodik oder Variationen davon. Zum Beispiel können F2-Intercross-Populationen, Rückkreuzungs-Populationen, wahllos gekreuzte Populationen, beinahe isogene Linien und andere Individuengruppierungen für die Kartierung verwendet werden. Derartige Methodiken sind dem Fachmann allgemein bekannt.
Die Nukleinsäuresonden können auch für eine physikalische Kartierung verwendet werden (d. h. Platzierung von Sequenzen auf physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al. in: Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346, und darin zitierte Literaturstellen).
In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden bei der direkten Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung(FISH)-Kartierung verwendet werden (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154). Obwohl derzeitige Verfahren zur FISH-Kartierung die Verwendung großer Klone begünstigen (mehrere kb bis einige hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20), können Verbesserungen der Empfindlichkeit eine Ausführung der FISH-Kartierung unter Verwendung kürzerer Sonden erlauben.
Eine Vielzahl von auf Nukleinsäure-Amplifikation basierenden Verfahren zur genetischen und physikalischen Kartierung kann unter Verwendung der Nukleinsäuren durchgeführt werden. Zu Beispielen zählen die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), Polymorphismus von PCR-amplifizierten Fragmenten (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotid-Verlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Radiation Hybrid Mapping bzw. Bestrahlungs-Hybridkartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy Mapping (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Für diese Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäure verwendet, um Primerpaare zur Verwendung in der Amplifikationsreaktion oder in Primerverlängerungsreaktionen zu entwerfen und herzustellen. Das Entwerfen derartiger Primer ist dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt. In Verfahren unter Anwendung von PCR-basierter genetischer Kartierung kann es notwendig sein, DNA-Sequenzunterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in der Region zu identifizieren, die der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch im Allgemeinen für Kartierungsverfahren nicht notwendig.
Pflanze
Der Begriff ”Pflanze”, wie hierin verwendet, beinhaltet ganze Pflanzen, Vorfahren und Nachkommen der Pflanzen sowie Pflanzenteile, einschließlich Samen, Sprosse, Stängel, Blätter, Wurzeln (einschließlich Knollen), Blüten und Gewebe und Organe, wobei jedes der Zuvorgenannten das Gen/die Nukleinsäure von Interesse umfasst. Der Begriff ”Pflanze” beinhaltet außerdem Pflanzenzellen, Suspensionskulturen, Callusgewebe, Embryos, meristematische Regionen, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen, wobei wiederum jedes der Zuvorgenannten das Gen/die Nukleinsäure von Interesse umfasst.
Zu Pflanzen, welche in den Verfahren der Erfindung besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die der Superfamilie Viridiplantae angehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, einschließlich Viehfutter- oder Grünfutter-Leguminosen, Zierpflanzen, Nahrungspflanzen, Bäume oder Sträucher, die aus der Liste ausgewählt sind, die unter anderem Acerspp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolnifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolns, Arachis spp., Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (z. B. Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholltia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (z. B. Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Canola, Ölsamenraps, Rübsen]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (z. B. Elaeis guineensis, Elaeis olifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (z. B. Glycine max, Soja hispida oder Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (z. B. Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (z. B. Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglansspp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (z. B. Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Meliltus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (z. B. Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (z. B. Solanum tuberosum, Solanum integrlfolium oder Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor; Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (z. B. Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum oder Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp. umfasst.
Kontrollpflanze(n)
Die Auswahl von geeigneten Kontrollpflanzen ist ein routinemäßiger Teil eines experimentellen Ansatzes und kann entsprechende Wildtyp-Pflanzen oder entsprechende Pflanzen ohne das Gen von Interesse einschließen. Die Kontrollpflanze stammt typischerweise aus der gleichen Pflanzenart oder sogar aus der gleichen Varietät wie die zu untersuchende Pflanze. Die Kontrollpflanze kann auch eine Nullizygote der zu untersuchenden Pflanze sein. Nullizygoten sind Individuen, denen das Transgen aufgrund von Segregation fehlt. Eine ”Kontrollpflanze”, wie hierin verwendet, bezieht sich nicht nur auf ganze Pflanzen, sondern auch auf Pflanzenteile, einschließlich Samen und Samenteile.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Überraschenderweise wurde nun festgestellt, dass man durch Modulieren der Expression einer für ein HAB1-Polypeptid oder ein KELP-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält.
Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer für ein HAB1-Polypeptid oder ein KELP-Polypeptid codierenden Nukleinsäure moduliert und gegebenenfalls auf Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen selektiert. Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in dieser Pflanze die Expression einer für ein HAB1-Polypeptid oder ein KELP-Polypeptid codierenden Nukleinsäure moduliert und gegebenenfalls auf Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen selektiert.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer für ein HAB1-Polypeptid oder ein KELP-Polypeptid codierenden Nukleinsäure ist das Exprimieren einer für ein HAB1-Polypeptid oder ein KELP-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze.
Im Folgenden soll jeder Verweis auf ein ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignetes Protein” so verstanden werden, dass damit ein wie hier definiertes HAB1-Polypeptid oder ein KELP-Polypeptid gemeint ist. Jeder Verweis auf eine ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Nukleinsäure” soll im Folgenden so verstanden werden, dass damit eine Nukleinsäure gemeint ist, die dazu fähig ist, für solch ein HAB1-Polypeptid oder ein KELP-Polypeptid zu codieren. Die in eine Pflanze einzuführende (und daher für die Durchführung der Methoden der Erfindung geeignete) Nukleinsäure ist eine beliebige Nukleinsäure, die für den im Folgenden beschriebenen Typ von Protein codiert, im Folgenden auch als ”HAB1-Nukleinsäure” oder ”HAB1-Gen” bzw. ”KELP-Nukleinsäure” oder ”KELP-Gen” bezeichnet.
Ein wie hier definiertes ”HAB1-Polypeptid” bezieht sich auf ein beliebiges Polypeptid, welches eine PP2C-Domäne (PFAM PF00481) umfasst. Vorzugsweise umfasst das für die Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignete HAB1-Polypeptid eines oder beide der folgenden Motive:
Motiv 1 (SEQ ID NR: 55):
PLWG[FLS][TEV]SICG[RK]RPEMED[DA][YV][AV][ATV]VPRF[LF][KDQ][ILV]P[ILS][KW]M[VL][A T][GD][DNl[RAH]
Motiv 2 (SEQ ID NR: 56):
[LM][DS][PRA][SAM][SL]F[RH]L[TP][AS]H[FL]F[AG]VYDGH[DG]G[AVS]Q
Zusätzlich oder alternativ dazu umfasst das HAB1-Polypeptid eines oder mehrere der folgenden Signatursequenzen:
Signatur 1: NCGDSR (SEQ ID NR: 57)
Signatur 2: SRSIGD (SEQ ID NR: 58)
Signatur 3: LASDG (SEQ ID NR: 59)
Die wie hier verwendeten Begriffe ”HAB1” oder ”HAB1-Polypeptid” sollen auch wie hier unter ”HAB1-Polypeptid” definierte Homologe einschließen.
Die Motive 1 and 2 wurden unter Anwendung des MEME-Algorithmus (Bailey und Elkan, Proceedings of the Second International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology, S. 28–36, AAAI Press, Menlo Park, Kalifornien, 1994) abgeleitet. Bei den einzelnen Positionen innerhalb eines MEME-Motivs sind die Reste gezeigt, die in dem abgefragten Satz von Sequenzen mit einer Häufigkeit von mehr als 0,2 vorhanden sind. Reste in eckigen Klammern stellen Alternativen dar.
Zusätzlich oder alternativ dazu hat das Homolog eines HAB1-Proteins mit zunehmender Präferenz mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zur Aminosäure gemäß SEQ ID NR: 2, mit der Maßgabe, dass das homologe Protein eines oder mehrere der wie oben umrissenen konservierten Motive umfasst. Die Gesamtsequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern und vorzugsweise mit Sequenzen reifer Proteine (d. h. ohne Berücksichtigung von Sekretionssignalen oder Transitpeptiden), ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden. Vorzugsweise haben die Motive in einem HAB1-Polypeptid mit zunehmender Präferenz mindestens 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einem beliebigen oder mehreren der durch SEQ ID NR: 55 bis SEQ ID NR: 56 wiedergegebenen Motive (Motive 1 und 2).
Anders ausgedrückt wird bei einer anderen Ausführungsform ein Verfahren bereitgestellt, bei dem das HAB1-Polypeptid eine konservierte Domäne (oder ein konserviertes Motiv) mit mindestens 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der konservierten Domäne von Aminosäure 134 bis Aminosäure 439 in SEQ ID NR: 2 umfasst.
Wie hier definierte KELP-Polypeptide gehören zur Gruppe der Transkriptionskoaktivatoren. Transkriptionskoaktivatoren sind Adaptermoleküle, die Signale von Aktivatorproteinen (Aktivatorproteine binden an als Verstärker (Enhancer) bekannte Gene, die bei der Festlegung helfen, welche Gene angeschaltet sind, und die die Transkription beschleunigen) und Repressorproteinen (Repressorproteine binden an Gene, die als Silencer bezeichnet werden und die Aktivatorproteine stören und die Transkription verlangsamen) koordinieren. Transkriptionskoaktivatoren sind Adaptermoleküle, die Informationen zu Basalfaktoren vermitteln, die dann einer RNA-Polymerase ”sagen”, wo und wann mit der Transkription anzufangen ist. Transkriptionskoaktivatoren aktivieren die Transkription von einem RNA-Polymerase-II-Promotor.
Es wurde weiterhin beschrieben, dass KELP-Proteine aus Pflanzen an der Genaktivierung während der Pathogenabwehr beteiligt sind. Matsushita et al. (2001) beispielsweise berichten, dass Bewegungsproteine (Movement Proteins, MP) des Tomatenmosaiktobamovirus (TOMV) an aus verschiedenen Pflanzenarten gewonnene KELP-Proteine binden können. Mindestens 31 Aminosäuren aus dem Carboxylterminus von ToMV-MP scheinen für die Wechselwirkung mit KELP entbehrlich zu sein. Andere aus Kreuzblütlertobamovirus CTMV-W und Gurkenmosaikcucumovirus gewonnene MPs zeigten ebenfalls vergleichbare Bindungsfähigkeiten. Die Autoren legten daher nahe, dass diese Bewegungsproteine gewöhnlich mit KELP in Wechselwirkung treten könnten, möglicherweise zur Modulation der Genexpression des Wirtes.
Ganz insbesondere umfasst gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ein erfindungsgemäßes ”KELP-Polypeptid” eines oder mehrere der folgenden Motive:

(i) Motiv 3: CRLSDKRRVT[ILV]Q[DE]F[RK]GK[TS]LVSIRE[YF] (SEQ ID NR: 137),
(ii) Motiv 4: YKKDGKELP[ST][SA]KGISLT[EDA]EQWS[TA][FL][KR] (SEQ ID NR: 138),
(iii) Motiv 5: AS[EK][KR]L[GA][LI]DLSE[PSK][ES][YRH]K[AK]FVR[HQS]VV[EN][SK]F (SEQ ID NR: 139).

Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst ein erfindungsgemäßes ”KELP-Polypeptid” weiterhin eines oder mehrere der folgenden Motive:

(i) Motiv 6: DD[DE]GDLIICRLSDKR[RK]VT[IL]Q (SEQ ID NR: 140);
(ii) Motiv 7: GKELP[ST]SKGISLT[ED]EQWS[TA][FL] (SEQ ID NR: 141);
(iii) Motiv 8: [LI]DLS[EKQ][PSK][EKS][YFH]KA[FY]V[RK][HSQ]VV[NE][AKST]FL (SEQ ID NR: 142).

Besonders bevorzugt umfasst das KELP-Polypeptid mit zunehmender Präferenz mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5 oder alle 6 der aus der aus den Motiven 3 bis 8 bestehenden Gruppe ausgewählten Motive. Die Motive 3 bis 8 wurden unter Anwendung des MEME-Algorithmus (Bailey und Elkan, Proceedings of the Second International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology, S. 28–36, AAAI Press, Menlo Park, Kalifornien, 1994) abgeleitet. Bei den einzelnen Positionen innerhalb eines MEME-Motivs sind die Reste gezeigt, die in dem abgefragten Satz von Sequenzen mit einer Häufigkeit von mehr als 0,2 vorhanden sind. Reste in eckigen Klammern stellen Alternativen dar.
Die wie hier verwendeten Begriffe ”KELP” oder ”KELP-Polypeptid” sollen auch wie hier unter ”KELP-Polypeptid” definierte Homologe einschließen.
Ein Homolog eines KELP-Proteins hat mit zunehmender Präferenz mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zur Aminosäure gemäß SEQ ID NR: 65. Die Gesamtsequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern und vorzugsweise mit Sequenzen reifer Proteine (d. h. ohne Berücksichtigung von Sekretionssignalen oder Transitpeptiden), ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden. Vorzugsweise haben die Motive in einem KELP-Polypeptid mit zunehmender Präferenz mindestens 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einem beliebigen oder mehreren der durch SEQ ID NR: 137 bis SEQ ID NR: 142 wiedergegebenen Motive (Motive 3 bis 8).
Gemäß einer anderen Ausführungsform bezieht sich ein wie hier definiertes ”KELP-Polypeptid” auf ein beliebiges eine DEK_C-Domäne (PF 02229) und/oder eine PC4-Domäne (PF08766) umfassendes Polypeptid.
Gemäß einer anderen Ausführungsform umfasst das KELP-Polypeptid eine konservierte Domäne mit mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% Sequenzidentität zu einer oder mehreren der konservierten Domäne, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(i) einer konservierten Domäne von Aminosäuren der Koordinaten 108 bis 172 von SEQ ID NR: 65;
(ii) einer konservierten Domäne von Aminosäuren der Koordinaten 108 bis 176 von SEQ ID NR: 65;
(iii) einer konservierten Domäne von Aminosäuren der Koordinaten 93 bis 169 von SEQ ID NR: 65; und
(iv) einer konservierten Domäne von Aminosäuren der Koordinaten 16 bis 71 von SEQ ID NR: 65.

Die Begriffe ”Domäne”, ”Signatur” und ”Motiv” sind hier im Abschnitt ”Definitionen” definiert.
Vorzugsweise bildet die Polypeptidsequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie dem in 3 (Saez et al., Plant J. 37, 354–369, 2004) gezeigten verwendet wird, lieber Cluster mit der Gruppe von HAB1-Polypeptiden (insbesondere Gruppe #5 in 3), die das Arabidopsis-Ortholog des Proteins gemäß SEQ ID NR: 2 umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe.
Weiterhin verfügen HAB1-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) typischerweise über eine Phosphataseaktivtät. Werkzeuge und Verfahren zum Messen der PP2C-Phosphatase-Aktivität sind im Stand der Technik gut bekannt (siehe zum Beispiel Vlad et al. Plant Cell 21, 3170–3184, 2009). Weitere Details finden sich in Beispiel 6.
Darüber hinaus liefern HAB1-Polypeptide, wenn sie gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung wie in den Beispielen 7 und 8 umrissen in Reis exprimiert werden, Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen, insbesondere einer erhöhten Samenfüllrate.
Die vorliegende Erfindung wird durch Transformieren von Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 1 dargestellt, die für die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 2 codiert. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die Verfahren der Erfindung lassen sich vorteilhaft mit einer beliebigen wie hier definierten für HAB1 codierenden Nukleinsäure oder einem beliebigen wie hier definierten HAB1-Polypeptid durchführen.
Beispiele für für HAB1-Polypeptide codierende Nukleinsäuren sind hier in Tabelle Al des Beispielteils angeführt. Solche Nukleinsäuren eignen sich zum Durchführen der Verfahren der Erfindung. Die in Tabelle A1 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des HAB1-Polypeptids gemäß SEQ ID NR: 2 ein, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche, wie sie im Definitionsabschnitt beschrieben ist, identifiziert werden; handelt es sich bei der Abfragesequenz um SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2, würde der zweite BLAST (back-BLAST) daher gegen Reissequenzen erfolgen.
Die Erfindung stellt außerdem bislang unbekannte, für das HAB1-Polypeptid codierende Nukleinsäuren und HAB1-Polypeptide, die sich dazu eignen, Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen gesteigerte Ertragsmerkmale zu verleihen, bereit.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird daher ein isoliertes Nukleinsäuremolekül aus der folgenden Reihe bereitgestellt:

(i) eine Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 13 und 19;
(ii) das Komplement einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 13 und 19;
(iii) eine Nukleinsäure, die für ein HAB1-Polypeptid mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 14 und 20 codiert und die zusätzlich oder alternativ dazu ein oder mehrere Motive mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu einem beliebigen oder mehreren der Motive in SEQ ID NR: 55 und SEQ ID NR: 56 umfasst und weiterhin vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen verleiht;
(iv) ein Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (i) bis (iii) unter hochstringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen verleiht.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird außerdem ein isoliertes Polypeptid aus der folgenden Reihe bereitgestellt:

(i) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 14 und 20;
(ii) eine Aminosäuresequenz mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 14 und 20, die zusätzlich oder alternativ dazu ein oder mehrere Motive mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu einem beliebigen oder mehreren der Motive in SEQ ID NR: 55 bis SEQ ID NR: 56 umfasst und weiterhin vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen verleiht;
(iii) Derivate von beliebigen der Aminosäuresequenzen gemäß (i) oder (ii) oben.

Vorzugsweise bildet die Polypeptidsequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 8 abgebildet ist, verwendet wird, lieber Cluster mit der Gruppe I der wie in 8 angegebenen KELP-Polypeptide, die die durch SEQ ID NR: 65 wiedergegebene Aminosäuresequenz umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe.
Weiterhin fungieren KELP-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) typischerweise als Transkriptionskoaktivatoren. Es wurde außerdem berichtet, dass diese Polypeptide in Hefe-Zwei-Hybrid-Screens mit anderen Klassen von Polypeptiden Wechselwirken (siehe z. B. Cormack et al., 1998). Darüber hinaus liefern KELP-Polypeptide, wenn sie gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung wie in den Beispielen 7 und 8 umrissen in transgenen Pflanzen wie z. B. Reis exprimiert werden, Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen, insbesondere einem erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
Die vorliegende Erfindung wird durch Transformieren von Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 64 dargestellt, die für die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 65 codiert. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die Verfahren der Erfindung lassen sich vorteilhaft mit einer beliebigen wie hier definierten für ein KELP-Polypeptid codierenden Nukleinsäure oder einem beliebigen wie hier definierten KELP-Polypeptid durchführen.
Beispiele für für KELP-Polypeptide codierende Nukleinsäuren sind hier in Tabelle A2 des Beispielteils angeführt. Solche Nukleinsäuren eignen sich zum Durchführen der Verfahren der Erfindung. Die in Tabelle A2 unten angeführten Aminosäuresequenzen schließen Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des KELP-Polypeptids gemäß SEQ ID NR: 65 ein, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche, wie sie im Definitionsabschnitt beschrieben ist, identifiziert werden; handelt es sich bei der Abfragesequenz um SEQ ID NR: 64 oder SEQ ID NR: 65, erfolgt der zweite BLAST (back-BLAST) daher gegen Arabidopsis-Sequenzen.
Auch Nukleinsäurevarianten können bei der Ausübung der Verfahren der Erfindung nützlich sein. Zu Beispielen solcher Varianten zählen Nukleinsäuren, welche für Homologe und Derivate von einer beliebigen der in Tabelle A1 beziehungsweise Tabelle A2 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codieren, wobei die Begriffe ”Homolog” und ”Derivat” wie hier definiert sind. Außerdem sind Nukleinsäuren in den Verfahren der Erfindung nützlich, die für Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen von einer beliebigen der in Tabelle A1 beziehungsweise Tabelle A2 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codieren. Homologe und Derivate, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, besitzen im Wesentlichen die gleiche biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodifizierte Protein, aus dem sie abgeleitet sind. Weitere für die Durchführung der Verfahren der Erfindung geeignete Varianten sind Varianten, bei denen der Codon-Einsatz optimiert ist oder bei denen miRNA-Targetstellen entfernt sind.
Weitere Nukleinsäurevarianten, die sich für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen, schließen Teile von für HAB1-Polypeptide codierenden Nukleinsäuren, Nukleinsäuren, die mit für HAB1-Polypeptide oder KELP-Polypeptide codierenden Nukleinsäuren hybridisieren, Spleißvarianten von für HAB1-Polypeptide oder KELP-Polypeptide codierenden Nukleinsäuren, Allelvarianten von für HAB1-Polypeptide oder KELP-Polypeptide codierenden Nukleinsäuren und durch Gen-Shuffling erhaltene Varianten von für HAB1-Polypeptide oder KELP-Polypeptide codierenden Nukleinsäuren ein. Die Begriffe Hybridisierungssequenz, Spleißvariante, Allelvariante und Gen-Shuffling sind wie hierin beschrieben beschaffen.
Nukleinsäuren, die für HAB1-Polypeptide oder KELP-Polypeptide codieren, müssen nicht Volllängennukleinsäuren sein, da die Ausführung der Verfahren der Erfindung nicht auf der Verwendung von Nukleinsäuresequenzen mit voller Länge beruht. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einem Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A1 beziehungsweise Tabelle A2 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einem Abschnitt von einer für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A1 beziehungsweise Tabelle A2 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codierenden Nukleinsäure.
Ein Abschnitt einer Nukleinsäure kann zum Beispiel durch Vornehmen einer oder mehrerer Deletionen an der Nukleinsäure hergestellt werden. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder sie können an andere codierende (oder nicht codierende) Sequenzen fusioniert sein, um zum Beispiel ein Protein zu erzeugen, das mehrere Aktivitäten vereint. Sofern es an andere codierende Sequenzen fusioniert ist, kann das resultierende Polypeptid, das nach Translation produziert wird, größer sein als jenes, das für den Proteinabschnitt vorhergesagt wird.
Was HAB1-Polypeptide betrifft, codieren Abschnitte, die bei den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind, für ein wie hier definiertes HAB1-Polypeptid und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A1 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A1 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuren oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A1 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuresequenzen stammen oder aus einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A1 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert.
Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 1. Vorzugsweise codiert der Abschnitt für ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie dem in 3 (Saez et al., 2004) gezeigten verwendet wird, lieber Cluster mit der Gruppe von HAB1-Polypeptiden (insbesondere Gruppe #5 in 3), die das Arabidopsis-Ortholog des Proteins gemäß SEQ ID NR: 2 umfassen, als mit einer anderen Gruppe und/oder umfasst eines oder beide der Motive 1 und 2 und/oder weist PP2C-Phosphataseaktivität auf und/oder weist mindestens 36% Sequenzidentität zu SEQ ID NR: 2 auf.
Was KELP-Polypeptide betrifft, codieren Abschnitte, die bei den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind, für ein wie hier definiertes KELP-Polypeptid und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A2 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A2 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuren oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A2 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A2 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuresequenzen stammen oder aus einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A2 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert.
Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 64. Vorzugsweise codiert der Abschnitt für ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die eines oder mehrere der folgenden Kennzeichen aufweist:

– wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in Figur 8 abgebildet ist, verwendet wird, bildet sie lieber Cluster mit der Gruppe I der wie in dieser Figur angegebenen KELP-Polypeptide, die die durch SEQ ID NR: 65 wiedergegebene Aminosäuresequenz umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe;
– sie umfasst eines oder mehrere der wie hier angegebenen Motive 3 bis 8;
– sie ist ein Transkriptionscoaktivator;
– sie hat mindestens 25% Sequenzidentität zu SEQ ID NR: 65.

Eine andere für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Nukleinsäurevariante ist eine Nukleinsäure, die unter Bedingungen verringerter Stringenz, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, zum Hybridisieren mit einer Nukleinsäure, die für ein wie hier definiertes HAB1-Polypeptid oder KELP-Polypeptid codiert, oder mit einem wie hier definierten Abschnitt in der Lage ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen, vorzugsweise zum Steigern des Samenertrags, bereitgestellt, bei dem man in eine Pflanze eine zum Hybridisieren mit einer der in Tabelle A1 beziehungsweise Tabelle A2 des Beispielteils angeführten Nukleinsäuren fähige Nukleinsäure einführt und dort exprimiert oder bei dem man in eine Pflanze eine zum Hybridisieren mit einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog einer der in Tabelle A1 beziehungsweise Tabelle A2 des Beispielteils angeführten Nukleinsäuresequenzen codiert, fähige Nukleinsäure einführt und dort exprimiert.
Hybridisierungssequenzen, die bei den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind und für ein wie hier definiertes HAB1-Polypeptid oder KELP-Polypeptid codieren, haben im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A1 beziehungsweise Tabelle A2 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise ist die Hybridisierungssequenz zum Hybridisieren mit dem Komplement einer beliebigen der in Tabelle A1 beziehungsweise A2 des Beispielteils aufgeführten Nukleinsäuren oder mit einem Abschnitt einer beliebigen dieser Sequenzen, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, in der Lage, oder die Hybridisierungssequenz ist zum Hybridisieren mit dem Komplement einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A1 beziehungsweise A2 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen codiert, fähig. Ganz besonders bevorzugt ist die Hybridisierungssequenz zum Hybridisieren mit dem Komplement einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 64 oder mit einem Abschnitt davon in der Lage.
Vorzugsweise codiert die Hybridisierungssequenz für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie vollständig ist und bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie dem in 3 (Saez et al., 2004) gezeigten verwendet wird, lieber Cluster mit der Gruppe von HAB1-Polypeptiden (insbesondere Gruppe #5 in 3), die das Arabidopsis-Ortholog. des Proteins gemäß SEQ ID NR: 2 umfassen, als mit einer anderen Gruppe bildet, und/oder umfasst eines oder beide der Motive 1 und 2 und/oder weist PP2C-Phosphataseaktivität auf und/oder weist mindestens 36% Sequenzidentität zu SEQ ID NR: 2 auf.
Vorzugsweise codiert die Hybridisierungssequenz für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die eines oder mehrere der folgenden Kennzeichen aufweist:

– wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 15 abgebildet ist, verwendet wird, bildet sie lieber Cluster mit der Gruppe I der wie in dieser Figur angegebenen KELP-Polypeptide, die die durch SEQ ID NR: 65 wiedergegebene Aminosäuresequenz umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe;
– sie umfasst eines oder mehrere der wie oben angegebenen Motive 3 bis 8;
– sie ist ein Transkriptionscoaktivator;
– sie hat mindestens 25% Sequenzidentität zu SEQ ID NR: 65.

Eine andere Nukleinsäurevariante, die in den Verfahren der Erfindung von Nutzen ist, ist eine Spleißvariante, die für ein wie hier definiertes HAB1-Polypeptid oder KELP-Polypeptid codiert, wobei eine Spleißvariante wie hier definiert ist. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Spleißvariante von einer beliebigen der in Tabelle A des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einer Spleißvariante von einer für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codierenden Nukleinsäure.
Bevorzugte Spleißvarianten sind Spleißvarianten einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 1 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 2 codiert. Vorzugsweise bildet die durch die Spleißvariante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie dem in 3 (Saez et al., 2004) gezeigten verwendet wird, lieber Cluster mit der Gruppe von HAB1-Polypeptiden (insbesondere Gruppe #5 in 3), die das Arabidopsis-Ortholog des Proteins gemäß SEQ ID NR: 2 umfassen, als mit einer anderen Gruppe und/oder umfasst eines oder beide der Motive 1 und 2 und/oder weist PP2C-Phosphataseaktivität auf und/oder weist mindestens 36% Sequenzidentität zu SEQ ID NR: 2 auf.
Bevorzugte Spleißvarianten sind Spleißvarianten einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 64 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 65 codiert. Vorzugsweise hat die von der Spleißvariante codierte Aminosäuresequenz eines oder mehrere der folgenden Kennzeichen:

– wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in Figur 8 abgebildet ist, verwendet wird, bildet sie lieber Cluster mit der Gruppe I der wie in dieser Figur angegebenen KELP-Polypeptide, die die durch SEQ ID NR: 65 wiedergegebene Aminosäuresequenz umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe;
– sie umfasst eines oder mehrere der wie oben angegebenen Motive 3 bis 8;
– sie ist ein Transkriptionscoaktivator;
– sie hat mindestens 25% Sequenzidentität zu SEQ ID NR: 65 codiert.

Eine andere Nukleinsäurevariante, die bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung von Nutzen ist, ist eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die für ein wie oben definiertes HAB1-Polypeptid oder KELP-Polypeptid codiert, wobei eine Allelvariante wie hier definiert ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Allelvariante einer beliebigen der in Tabelle A des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuren oder umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Allelvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert.
Die von in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen Allelvarianten codierten Polypeptide haben im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das HAB1-Polypeptid von SEQ ID NR: 2 und beliebige der in Tabelle A1 des Beispielteils gezeigten Aminosäuren. Allelvarianten kommen in der Natur vor, und zu den Verfahren der vorliegenden Erfindung gehört die Verwendung dieser natürlichen Allele. Vorzugsweise ist die Allelvariante eine Allelvariante von SEQ ID NR: 1 oder eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 2 codiert. Vorzugsweise bildet die durch die Allelvariante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie dem in 3 (Saez et al., 2004) gezeigten verwendet wird, lieber Cluster mit der Gruppe von HAB1-Polypeptiden (insbesondere Gruppe #5 in 3), die das Arabidopsis-Ortholog des Proteins gemäß SEQ ID NR: 2 umfassen, als mit einer anderen Gruppe und/oder umfasst eines oder beide der Motive 1 und 2 und/oder weist PP2C-Phosphataseaktivität auf und/oder weist mindestens 36% Sequenzidentität zu SEQ ID NR: 2 auf.
Die von in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen Allelvarianten codierten Polypeptide haben im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das KELP-Polypeptid von SEQ ID NR: 65 und beliebige der in Tabelle A2 des Beispielteils gezeigten Aminosäuren. Allelvarianten kommen in der Natur vor, und zu den Verfahren der vorliegenden Erfindung gehört die Verwendung dieser natürlichen Allele. Vorzugsweise ist die Allelvariante eine Allelvariante von SEQ ID NR: 65 oder eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 65 codiert. Vorzugsweise hat die von der Allelvariante codierte Aminosäuresequenz eines oder mehrere der folgenden Kennzeichen:

– wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 3 abgebildet ist, verwendet wird, bildet sie lieber Cluster mit der Gruppe I der wie in dieser Figur angegebenen KELP-Polypeptide, die die durch SEQ ID NR: 65 wiedergegebene Aminosäuresequenz umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe;
– sie umfasst eines oder mehrere der wie oben angegebenen Motive 3 bis 8;
– sie ist ein Transkriptionscoaktivator;
– sie hat mindestens 25% Sequenzidentität zu SEQ ID NR: 65.

Gen-Shuffling oder gerichtete Evolution können ebenfalls zur Anwendung kommen, um Varianten von Nukleinsäuren zu erzeugen, welche für wie oben definierte HAB1-Polypeptide oder KELP-Polypeptide codieren, wobei der Begriff ”Gen-Shuffling” wie hier definiert ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Variante einer beliebigen der in Tabelle A des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Variante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert, wobei die Nukleinsäurevariante durch Gen-Shuffling erhalten wird.
Vorzugsweise bildet die durch die durch Gen-Shuffling erhaltene Nukleinsäurevariante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie dem in 3 (Saez et al., 2004) gezeigten verwendet wird, lieber Cluster mit der Gruppe von HAB1-Polypeptiden (insbesondere Gruppe #5 in 3), die das Arabidopsis-Ortholog des Proteins gemäß SEQ ID NR: 2 umfassen, als mit einer anderen Gruppe und/oder umfasst eines oder beide der Motive 1 und 2 und/oder weist PP2C-Phosphataseaktivität auf und/oder weist mindestens 36% Sequenzidentität zu SEQ ID NR: 2 auf.
Vorzugsweise hat die von der durch Gen-Shuffling erhaltenen Nukleinsäurevariante codierte Aminosäuresequenz eines oder mehrere der folgenden Kennzeichen:

– wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in Figur 3 abgebildet ist, verwendet wird, bildet sie lieber Cluster mit der Gruppe I der wie in dieser Figur angegebenen KELP-Polypeptide, die die durch SEQ ID NR: 65 wiedergegebene Aminosäuresequenz umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe;
– sie umfasst eines oder mehrere der wie oben angegebenen Motive 3 bis 8;
– sie ist ein Transkriptionscoaktivator;
– sie hat mindestens 25% Sequenzidentität zu SEQ ID NR: 65.

Weiterhin lassen sich Nukleinsäurevarianten auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten. Zum Erzielen einer ortsgerichteten Mutagenese sind mehrere Verfahren verfügbar, wobei die üblichsten PCR-basierte Verfahren sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley, Hrsg.).
Für HAB1-Polypeptide oder KELP-Polypeptide codierende Nukleinsäuren lassen sich aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle gewinnen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Die für das HAB1-Polypeptid oder KELP-Polypeptid codierende Nukleinsäure stammt vorzugsweise aus eine Pflanze, weiter bevorzugt aus einer monokotylen oder dikotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, besonders bevorzugt aus der Familie Poaceae oder der Gattung Arabidopsis, ganz besonders bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Oryza sativa oder Arabidopsis thaliana.
Die Durchführung der Verfahren der Erfindung liefert Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen. Insbesondere erhält man durch die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit einem erhöhten Ertrag, insbesondere einem erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” sind hier ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben.
Ein Verweis auf gesteigerte Ertragsmerkmale bedeutet hier eine Erhöhung der Jung pflanzenvitalität und/oder der Biomasse (Gewicht) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze, was (i) oberirdische Teile und vorzugsweise oberirdische erntefähige Teile und/oder (ii) Teile im Erdboden und vorzugsweise erntefähige Teile im Erdboden einschließen kann. Insbesondere handelt es sich bei derartigen erntbaren Teilen um Samen, und die Durchführung der Verfahren der Erfindung führt zu Pflanzen, welche einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zum Samenertrag von Kontrollpflanzen aufweisen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erhöhung von Ertragsmerkmalen, vorzugsweise des Ertrags, insbesondere des Samenertrags, von Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die für ein wie hier definiertes HAB1-Polypeptid oder KELP-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung ergibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die für ein wie hier definiertes HAB1-Polypeptid oder KELP-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
Die Durchführung der Verfahren der Erfindung liefert unter Nichtstressbedingungen oder unter Dürrebedingungen herangezogene Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen herangezogenen Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags bei unter Nichtstressbedingungen oder unter Dürrebedingungen herangezogenen Pflanzen bereitgestellt, welches die Modulation der Expression einer für ein HAB1-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze umfasst.
Die Durchführung der Verfahren der Erfindung liefert unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, herangezogene Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen herangezogenen Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags bei unter Nährstoffmangelbedingungen herangezogenen Pflanzen bereitgestellt, welches die Modulation der Expression einer für ein HAB1-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze umfasst.
Die Durchführung der Verfahren der Erfindung liefert unter Salzstressbedingungen herangezogene Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen herangezogenen Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags bei unter Salzstressbedingungen herangezogenen Pflanzen bereitgestellt, welches die Modulation der Expression einer für ein HAB1-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze umfasst.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können unter Nichtstressbedingungen oder wie oben definierten Stressbedingungen durchgeführt werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Stressbedingungen durchgeführt.
In einem Beispiel werden die Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Stressbedingungen wie Dürre durchgeführt. Die Durchführung der Verfahren der Erfindung liefert unter Dürrestressbedingungen herangezogene Pflanzen mit erhöhten, wie hier bereitgestellten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen herangezogenen Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung von Ertragsmerkmalen bei unter Stressbedingungen und insbesondere unter Dürrebedingungen herangezogenen Pflanzen bereitgestellt, welches die Modulation der Expression einer für ein wie hier definiertes KELP-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze umfasst.
Gemäß einem anderen Beispiel liefert die Durchführung der Verfahren der Erfindung unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, herangezogene Pflanzen mit erhöhten, wie hier bereitgestellten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen herangezogenen Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung von wie hier bereitgestellten Ertragsmerkmalen bei unter Nährstoffmangelbedingungen herangezogenen Pflanzen bereitgestellt, welches die Modulation der Expression einer für ein KELP-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze umfasst. Gemäß noch einem anderen Beispiel liefert die Durchführung der Verfahren der Erfindung unter Salzstressbedingungen herangezogene Pflanzen mit erhöhten, wie hier bereitgestellten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen herangezogenen Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung von wie hier bereitgestellten Ertragsmerkmalen bei unter Salzstressbedingungen herangezogenen Pflanzen bereitgestellt, welches die Modulation der Expression einer für ein KELP-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze umfasst.
Die Erfindung stellt außerdem genetische Konstrukte und Vektoren zum Erleichtern des Einbringens und/oder der Expression von für HAB1-Polypeptide oder KELP-Polypeptide codierenden Nukleinsäuren in Pflanzen bereit. Die Genkonstrukte können in Vektoren insertiert werden, welche kommerziell erhältlich sein können, die für das Transformieren in Pflanzen hinein geeignet sind und für die Expression des Gens von Interesse in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung stellt ebenfalls die Verwendung eines wie hier definierten Genkonstrukts in den Verfahren der Erfindung bereit.
Genauer stellt die vorliegende Erfindung ein Konstrukt bereit, umfassend:

(a) eine für ein wie oben definiertes HAB1-Polypeptid oder KELP-Polypeptid codierende Nukleinsäure;
(b) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls
(c) eine Transkriptionsterminationssequenz.

Vorzugsweise ist die für ein HAB1-Polypeptid oder KELP-Polypeptid codierende Nukleinsäure wie oben definiert. Die Begriffe ”Steuerungssequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hier definiert.
Die Erfindung stellt weiterhin mit einem wie oben beschriebenen Konstrukt transformierte Pflanzen bereit. Die Erfindung stellt insbesondere mit einem wie oben beschriebenen Konstrukt transformierte Pflanzen bereit, die wie hier beschriebene erhöhte Ertragsmerkmale haben.
Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der jedwede der oben beschriebenen Nukleinsäuren umfasst. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit den genetischen Elementen gut vertraut, welche auf dem Vektor vorhanden sein müssen, um Wirtszellen, welche die Sequenz von Interesse enthalten, erfolgreich zu transformieren, zu selektieren und zu vermehren. Die Sequenz von Interesse ist funktionsfähig mit einer oder mehreren Steuerungssequenzen (mindestens mit einem Promotor) verbunden.
Vorteilhafterweise kann zur Steuerung der Expression der Nukleinsäuresequenz ein beliebiger Promotortyp verwendet werden, gleich ob natürlich oder synthetisch, vorzugsweise ist der Promotor jedoch pflanzlichen Ursprungs. Ein konstitutiver Promotor eignet sich besonders für die Verfahren. Vorzugsweise handelt es sich bei dem konstitutiven Promotor um einen ubiquitären konstitutiven Promotor mittlerer Stärke. Definitionen der verschiedenen Promotortypen finden sich hier im Abschnitt ”Definitionen”.
Es sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die für das HAB1-Polypeptid oder KELP-Polypeptid codierende Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 64 beschränkt ist, noch ist die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer für ein HAB1-Polypeptid oder KELP-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors beschränkt.
Bei dem konstitutiven Promotor handelt es sich vorzugsweise um einen Promotor mittlerer Stärke. Besonders bevorzugt handelt es sich um einen von Pflanzen abgeleiteten Promotor wie einen GOS2-Promotor oder einen Promotor mit im Wesentlichen der gleichen Stärke und im Wesentlichen dem gleichen Expressionsmuster (einen funktionell äquivalenten Promotor); besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Promotor um den GOS2-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen SEQ ID NR: 62 oder SEQ ID NR: 136 ähnelt, ganz besonders bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch SEQ ID NR: 62 oder SEQ ID NR: 136 wiedergegeben. Weitere Beispiele konstitutiver Promotoren finden sich hier im Abschnitt ”Definitionen”.
Gegebenenfalls können in dem in eine Pflanze eingeführten Konstrukt eine oder mehrere Terminatorsequenzen eingesetzt werden. Vorzugsweise umfasst das Konstrukt eine Expressionskassette, die einen GOS2-Promotor aus Reis umfasst, im Wesentlichen ähnlich SEQ ID NR: 62 oder SEQ ID NR: 136, funktionell verbunden mit der für das HAB1-Polypeptid oder das KELP-Polypeptid codierenden Nukelinsäure. Besonders bevorzugt umfasst das Konstrukt einen Zein-Terminator (t-zein), der an das 3'-Ende der HAB1-Codierungssequenz gebunden ist. Ganz besonders bevorzugt umfasst die Expressionskassette die Sequenz gemäß SEQ ID NR: 63 (pGOS2::HAB1::t-zein sequence) oder gemäß SEQ ID NR: 143 (pGOS2::KELP::terminator). Weiterhin können an dem in eine Pflanze eingeführten Konstrukt eine oder mehrere für selektierbare Marker codierende Sequenzen vorhanden sein.
Gemäß einem bevorzugten Merkmal der Erfindung ist die modulierte Expression eine erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuren oder Genen oder Genprodukten sind im Fachgebiet gut dokumentiert, und Beispiele sind im Abschnitt ”Definitionen” angegeben.
Wie oben erwähnt, wird ein bevorzugtes Verfahren zur Modulierung der Expression einer Nukleinsäure, die für ein HAB1-Polypeptid oder KELP-Polypeptid codiert, durchgeführt, indem man eine für ein HAB1-Polypeptid oder KELP-Polypeptid codierende Nukleinsäure in eine Pflanze einbringt und dort exprimiert; allerdings können die Effekte der Durchführung des Verfahrens, d. h. die Steigerung von Ertragsmerkmalen, auch unter Verwendung anderer gut bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING, homologer Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken ist im Abschnitt ”Definitionen” angegeben.
Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Produktion von transgenen Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren die Einführung und Expression einer Nukleinsäure, die für ein wie hier definiertes HAB1-Polypeptid oder KELP-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt genauer gesagt ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, insbesondere erhöhtem Samenertrag, bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

(i) Einführen und Exprimieren einer für ein HAB1-Polypeptid oder ein KELP-Polypeptid codierenden Nukleinsäure oder eines eine für ein HAB1-Polypeptid oder ein KELP-Polypeptid codierende Nukleinsäure umfassenden genetischen Konstrukts in eine Pflanze oder Pflanzenzelle; und
(ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.

Die Kultivierung der Pflanzenzelle unter das Wachstum und die Entwicklung von Pflanzen fördernden Bedingungen kann eine Regeneration und/oder ein Wachstum bis zur Reife beinhalten oder nicht.
Die Nukleinsäure von (i) kann eine beliebige der Nukleinsäuren sein, die zum Codieren eines wie hier definierten HAB1-Polypeptids oder KELP-Polypeptids in der Lage sind.
Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhältliche Pflanze, einen durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhältlichen Pflanzenteil davon einschließlich Samen oder eine durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhältliche Pflanzenzelle bereit, wobei die Pflanze, der Teil der Pflanze bzw. die Pflanzenzelle eine rekombinante, für ein wie hier definiertes KELP-Polypeptid codierende Nukleinsäure umfasst.
Die Nukleinsäure kann direkt in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst eingebracht werden (einschließlich Einbringung in ein Gewebe, Organ oder einen beliebigen anderen Teil einer Pflanze). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure vorzugsweise durch Transformation in eine Pflanze eingebracht. Der Begriff ”Transformation” ist ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” hierin beschrieben.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich in deutlicher Weise auf eine beliebige Pflanzenzelle oder Pflanze, welche durch ein beliebiges der hierin beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, sowie auf alle Pflanzenteile und Fortpflanzungskeime davon. Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (einschließlich Samen), die durch die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon umfassen ein Nukleinsäuretransgen, das für ein wie oben definiertes HAB1-Polypeptid oder KELP-Polypeptid codiert. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich ferner dahingehend, dass die Nachkommenschaft eines/einer primär transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, welche(s) durch ein beliebiges der zuvor erwähnten Verfahren hergestellt worden ist, beinhaltet ist, wobei die einzige Anforderung darin besteht, dass die Nachkommen dasselbe/dieselben genotypische(n) und/oder phänotypische(n) Merkmal(e) aufzeigen, wie diejenigen, welche von der Elternform in den Verfahren gemäß der Erfindung hervorgebracht werden.
Die Erfindung schließt auch Wirtszellen ein, die eine isolierte Nukleinsäure enthalten, welche für ein wie oben definiertes HAB1-Polypeptid oder KELP-Polypeptid codiert. Bevorzugte Wirtszellen gemäß der Erfindung sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die Nukleinsäuren oder den Vektor, welche in dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden, die Expressionskassette oder das Konstrukt oder der Vektor sind im Prinzip in vorteilhafter Weise alle Pflanzen, welche zum Synthetisieren der im Verfahren der Erfindung verwendeten Polypeptide in der Lage sind.
Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine durch ein wie hier beschriebenes Verfahren erhältliche Pflanze, einen durch ein wie hier beschriebenes Verfahren erhältlichen Pflanzenteil davon einschließlich Samen oder eine durch ein wie hier beschriebenes Verfahren erhältliche Pflanzenzelle bereit, wobei die Pflanze, der Teil der Pflanze bzw. die Pflanzenzelle eine rekombinante, für ein wie hier definiertes KELP-Polypeptid codierende Nukleinsäure umfasst, wobei die rekombinante Nukleinsäure stabil in das Genom der Pflanze integriert wurde.
Gemäß noch einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung einen mit einem erfindungsgemäßen Konstrukt stabil transformierten Pflanzenteil oder eine mit einem erfindungsgemäßen Konstrukt stabil transformierte Pflanzenzelle.
Gemäß noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vorzugsweise einem erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen und besonders bevorzugt einem erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, herrührend von der Einführung und Expression einer Nukleinsäure, die für ein wie hier definiertes KELP-Polypeptid codiert, oder eine von dieser transgenen Pflanze abgeleitete transgene Pflanzenzelle bereit. Die transgene Pflanze umfasst somit eine für ein wie hier definiertes KELP-Polypeptid codierende Nukleinsäure, die in die Pflanze stabil integriert und dort exprimiert wurde. Die Erfindung betrifft außerdem eine aus dieser transgenen Pflanze abgeleitete transgene Pflanzenzelle.
Die erfindungsgemäßen Verfahren sind vorteilhafterweise auf alle Pflanzen, insbesondere auf alle wie hier definierten Pflanzen, anwendbar. Zu Pflanzen, die in den Verfahren der Erfindung besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die der Superfamilie Viridiplantae angehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen einschließlich Viehfutter- oder Grünfutter-Leguminosen, Zierpflanzen, Nahrungspflanzen, Bäume oder Sträucher.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Pflanze eine Kulturpflanze. Beispiele für Kulturpflanzen schließen Endivie, Karotte, Maniok, Klee, Sojabohne, Rübe, Zuckerrübe, Sonnenblume, Canola, Luzerne, Raps, Flachs, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Pflanze eine monokotyle Pflanze. Zu Beispielen von monokotylen Pflanzen zählt Zuckerrohr.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Pflanze ein Getreide. Beispiele für Getreide schließen Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff, Milo und Hafer ein.
Die Erfindung erstreckt sich ebenfalls auf erntbare Teile einer Pflanze wie, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Wurzeln, Rhizome, Knollen und Zwiebeln, wobei diese erntbaren Teile eine rekombinante Nukleinsäure enthalten, die für ein HAB1-Polypeptid oder ein KELP-Polypeptid codiert. Die Erfindung betrifft ferner Produkte, die aus einem erntbaren Teil einer derartigen Pflanze, vorzugsweise direkt, abgeleitet sind, wie etwa trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls die Verwendung von Nukleinsäuren, die für wie hier beschriebene HAB1-Polypeptide oder KELP-Polypeptide codieren, und die Verwendung dieser HAB1-Polypeptide oder KELP-Polypeptide bei der Steigerung beliebiger der oben erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen. So können für hier beschriebene HAB1-Polypeptide oder KELP-Polypeptide codierende Nukleinsäuren oder die HAB1-Polypeptide oder KELP-Polypeptide selbst zum Beispiel bei Zuchtprogrammen Anwendung finden, bei denen man einen DNA-Marker identifiziert, der genetisch mit einem für ein HAB1-Polypeptid oder ein KELP-Polypeptid codierenden Gen verbunden sein kann. Die Nukleinsäuren/Gene oder die HAB1-Polypeptide oder KELP-Polypeptide selbst können verwendet werden, um einen molekularen Marker zu definieren. Dieser DNA- oder Proteinmarker kann dann in Züchtungsprogrammen verwendet werden, um Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, wie hierin oben definiert, in den Verfahren der Erfindung zu selektieren. Weiterhin können Allelvarianten einer für ein HAB1-Polypeptid oder KELP-Polypeptid codierenden Nukleinsäure/eines für ein HAB1-Polypeptid oder KELP-Polypeptid codierenden Gens in markergestützten Zuchtprogrammen Anwendung finden. Nukleinsäuren, die für HAB1-Polypeptide oder KELP-Polypeptide codieren, können auch als Sonden für die genetische und physikalische Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, sowie als Marker für mit diesen Genen gekoppelte Merkmale verwendet werden. Derartige Informationen können in der Pflanzenzucht nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwickeln.
Punkte

1. Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein HAB1-Polypeptid codiert, in einer Pflanze, wobei das HAB1-Polypeptid eine PF00481-PP2C-Domäne umfasst.
2. Verfahren gemäß Punkt 1, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für das HAB1-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
3. Verfahren gemäß Punkt 1 oder 2, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen und vorzugsweise einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
4. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 3, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Dürrestressbedingungen erhalten werden.
5. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 4, wobei das HAB1-Polypeptid eines oder mehrere der folgenden Motive umfasst:
6. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 5, wobei die für ein HAB1-Polypeptid codierende Nukleinsäure pflanzlichen Ursprungs ist, vorzugsweise aus einer monokotylen Pflanze, besonders bevorzugt aus der Familie Poaceae, noch mehr bevorzugt aus der Gattung Oryza, ganz besonders bevorzugt aus Oryza sativa.
7. Verfahren gemäß einer der Punkte 1 bis 6, wobei die Nukleinsäure, die für ein HAB1-Polypeptid codiert, für ein beliebiges der in Tabelle A1 aufgelisteten Polypeptide codiert oder ein Abschnitt einer derartigen Nukleinsäure oder eine zum Hybridisieren mit einer derartigen Nukleinsäure fähige Nukleinsäure ist.
8. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 7, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle A1 angegebenen Polypeptide codiert.
9. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 8, wobei die Nukleinsäure für das Polypeptid gemäß SEQ ID NR: 2 codieren.
10. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 9, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem konstitutiven Promotor mittlerer Stärke, vorzugsweise mit einem Promotor aus einer Pflanze, besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
11. Pflanze, Pflanzenteil davon, einschließlich Samen, oder Pflanzenzelle, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 10, wobei diese Pflanze, dieser Pflanzenteil bzw. diese Pflanzenzelle eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die für ein wie in einem der Punkte 1 und 5 bis 9 definiertes HAB1-Polypeptid codiert.
12. Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure, die für ein HAB1-Polypeptid codiert, wie in einer der Ausführungsformen 1 und 5 bis 9 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (i) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
13. Konstrukt gemäß Punkt 12, wobei es sich bei einer der Steuerungssequenzen um einen konstitutiven Promotor, vorzugsweise einen konstitutiven Promotor mittlerer Stärke, vorzugsweise einen Promotor aus einer Pflanze, besonders bevorzugt einen GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt einen GOS2-Promotor aus Reis, handelt.
14. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 12 oder 13 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen, vorzugsweise einem erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
15. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 12 oder 13 transformiert ist.
16. Verfahren zum Herstellen einer transgenen Pflanze mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vorzugsweise einem erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welches Folgendes umfasst: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein HAB1-Polypeptid codiert, wie in einem der Punkte 1 und 5 bis 9 definiert, in einer Pflanzenzelle oder Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle bzw. der Pflanze unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
17. Transgene Pflanze mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vorzugsweise einem erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, herrührend von einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein HAB1-Polypeptid codiert, wie in einem der Punkte 1 und 5 bis 9 definiert, oder eine von dieser transgenen Pflanze abgeleitete transgene Pflanzenzelle.
18. Transgene Pflanze gemäß Punkt 11, 15 oder 17, oder eine davon abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze wie Rübe, Zuckerrübe oder Luzerne oder eine Monokotyle wie Zuckerrohr oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff, Milo und Hafer ist.
19. Erntbare Teile einer Pflanze gemäß Punkt 18, wobei die erntbaren Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
20. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 18 und/oder aus erntbaren Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 19 abgeleitet sind.
21. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein HAB1-Polypeptid codiert, wie in einem der Punkte 1 und 5 bis 9 definiert, zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vorzugsweise zum Erhöhen des Samenertrags von Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
22. Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein KELP-Polypeptid codiert, in einer Pflanze, wobei das KELP-Polypeptid eine oder mehrere der folgenden Motive umfasst:
23. Verfahren gemäß Punkt 22, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für das KELP-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
24. Verfahren gemäß Punkt 22 oder 23, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen und vorzugsweise einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
25. Verfahren gemäß einem der Punkte 22 bis 24, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
26. Verfahren gemäß einem der Punkte 22 bis 24, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Dürrestressbedingungen, Salzstressbedingungen oder Stickstoffmangelbedingungen erhalten werden.
27. Verfahren gemäß einem der Punkte 22 bis 26, wobei das KELP-Polypeptid zusätzlich eines oder mehrere der folgenden Motive umfasst:
28. Verfahren nach einem der Punkte 22 bis 27, wobei das KELP-Polypeptid eine DEK_C-Domäne (PF 02229) und/oder eine PC4-Domäne (PF08766) umfasst.
29. Verfahren gemäß einem der Punkte 22 bis 28, wobei die für ein KELP-Polypeptid codierende Nukleinsäure für eines der in Tabelle A2 aufgelisteten Polypeptide codiert oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure oder eine zum Hybridisieren mit einer solchen Nukleinsäure fähige Nukleinsäure ist.
30. Verfahren gemäß einem der Punkte 22 bis 29, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle A2 angegebenen Polypeptide codiert.
31. Verfahren gemäß einem der Punkte 22 bis 30, wobei die für ein KELP-Polypeptid codierende Nukleinsäure pflanzlichen Ursprungs ist, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, besonders bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, noch mehr bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, ganz besonders bevorzugt aus Arabidopsis thaliana.
32. Verfahren gemäß einem der Punkte 22 bis 31, wobei die Nukleinsäure für das Polypeptid gemäß SEQ ID NR: 65 codiert.
33. Verfahren gemäß einem der Punkte 22 bis 32, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem konstitutiven Promotor mittlerer Stärke, vorzugsweise mit einem Promotor aus einer Pflanze, besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
34. Pflanze, Pflanzenteil davon, einschließlich Samen, oder Pflanzenzelle, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Punkte 22 bis 33, wobei diese Pflanze, dieser Pflanzenteil bzw. diese Pflanzenzelle eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die für ein wie in einem der Punkte 22 und 27 bis 32 definiertes KELP-Polypeptid codiert.
35. Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure, die für ein KELP-Polypeptid codiert, wie in einem der Punkte 22 und 27 bis 32 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (i) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
36. Konstrukt gemäß Punkt 35, wobei es sich bei einer der Steuerungssequenzen um einen konstitutiven Promotor, vorzugsweise einen konstitutiven Promotor mittlerer Stärke, vorzugsweise einen Promotor aus einer Pflanze, besonders bevorzugt einen GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt einen GOS2-Promotor aus Reis, handelt.
37. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 35 oder 36 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, vorzugsweise einem erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen und besonders bevorzugt einem erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
38. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 35 oder 36 transformiert ist.
39. Verfahren zum Herstellen einer transgenen Pflanze mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vorzugsweise einem erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen und besonders bevorzugt einem erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welches Folgendes umfasst: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein KELP-Polypeptid codiert, wie in einem der Punkte 22 und 27 bis 32 definiert, in einer Pflanzenzelle oder Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle bzw. der Pflanze unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
40. Transgene Pflanze mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vorzugsweise einem erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen und besonders bevorzugt einem erhöhten Samenertrag, herrührend von einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein KELP-Polypeptid codiert, wie in einem der Punkte 22 und 27 bis 32 definiert, oder eine von dieser transgenen Pflanze abgeleitete transgene Pflanzenzelle.
41. Transgene Pflanze gemäß Punkt 34, 38 oder 40, oder eine davon abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze wie Rübe, Zuckerrübe oder Luzerne oder eine Monokotyle wie Zuckerrohr oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff, Milo und Hafer ist.
42. Erntbare Teile einer Pflanze gemäß einem der Punkte 34, 38, 40 und 41, wobei die erntbaren Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
43. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß einem der Punkte 34, 38, 40 und 41 und/oder aus erntbaren Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 42 abgeleitet sind.
44. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein KELP-Polypeptid codiert, wie in einem der Punkte 22 und 27 bis 32 definiert, zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vorzugsweise zum Erhöhen des Ertrags in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, und besonders bevorzugt zum Erhöhen des Samenertrags in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
45. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein wie in einem der Punkte 22 und 27 bis 32 definiertes KELP-Polypeptid codiert, als Biomarker.

Beschreibung der Figuren
Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren beschrieben, in denen:
1 die Domänenstruktur von SEQ ID NR: 2 zeigt, wobei die konservierten Motive 1 und 2 fett unterstrichen sind und die PP2C-Domäne (PF00481) kursiv gezeigt ist.
2 ein multiples Alignment verschiedener HAB1-Polypeptide wiedergibt. Die Sternchen markieren identische Aminosäuren unter den verschiedenen Proteinsequenzen, die Doppelpunkte stellen hochkonservierte Aminosäuresubstitutionen dar, und die Punkte stellen weniger konservierte Aminosäuresubstitutionen dar; in den anderen Positionen gibt es keine Sequenzkonservierung. Diese Alignments lassen sich dazu nutzen, weitere Motive oder Signatursequenzen zu definieren, wenn man konservierte Aminosäuren verwendet.
3 einen phylogenetischen Baum von HAB1-Polypeptiden zeigt (Saez et al., 2004).
4 die MATGAT-Tabelle von Beispiel 3 zeigt.
5 den für eine erhöhte Expression einer für HAB1 codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Reis-GOS2-Promotors (pGOS2) in Oryza sativa verwendeten binären Vektor wiedergibt.
6 die Domänenstruktur von SEQ ID NR: 65 wiedergibt, wobei die konservierten Domänen DEK_C (unterstrichen) und PC4 (fett und kursiv) und die Motive 3 bis 8 gekennzeichnet sind.
7 ein multiples Alignment einer repräsentativen Anzahl an KELP-Polypeptiden darstellt. Die Sternchen markieren identische Aminosäuren unter den verschiedenen Proteinsequenzen, die Doppelpunkte stellen hochkonservierte Aminosäuresubstitutionen dar, und die Punkte stellen weniger konservierte Aminosäuresubstitutionen dar; in den anderen Positionen gibt es keine Sequenzkonservierung. Diese Alignments lassen sich dazu nutzen, weitere Motive zu definieren, wenn man konservierte Aminosäuren verwendet.
8 einen phylogenetischen Baum einer Reihe von KELP-Polypeptiden zeigt. Es lassen sich zwei Gruppen von KELP-Proteinen, Gruppe I und II, unterscheiden.
9 die MATGAT-Tabelle (Beispiel 3) zeigt. Die angegebenen ID-Nummern entsprechen den folgenden Sequenzen: 1. A. thaliana_AT4G00980.1; 2. B. napus_TC69162; 3.; B. rapa_AB050390; 4. B. vulgaris_CK136750; 5. C. sinensis_TC17586; 6. C. tetragonoloba_TA988_3832; 7. C. tinctorius_EL406762; 8. E. esula_DV112325; 9. F. vesca_TA1 0966_57918; 10. G. arboreum_BF270051; 11. G. arboreum_BF274071; 12. G. hirsutum_DR455976; 13. G. hirsutum_TC172528; 14. G. max_Glyma03g41890.1; 15. G. max_TC289440; 16. I. nil_TC8417; 17. L. sativa_DY977130; 18. L. sativa_TC21002; 19. L. virosa_DW152822; 20. M. domestica_TC30840; 21. M. esculenta_TA5895_3983; 22. N. tabacum_NP916922; 23. N. tabacum_TC53347; 24. P. glauca_DV993483; 25. P. patens_NP13148677; 26. P. taeda_DR054457; 27. P. trichocarpa_797303; 28. P. trifoliata_CV707049; 29. S. bicolor_Sb03g032430.1; 30. S. lycopersicum_TC195535; 31. S. moellendorffii_83446; 32. A. thaliana_AT4G00980.1 (SEQ ID NO: 65); 33. Triphysaria_sp_TC7488; 34. V. vinifera_GSVIVT00006727001; 35. Z. mays_TC523187.
10 den für eine erhöhte Expression einer für KELP codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Reis-GOS2-Promotors (pGOS2) in Oryza sativa verwendeten binären Vektor wiedergibt.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben, welche allein der Veranschaulichung dienen. Mit den folgenden Beispielen wird nicht beabsichtigt, den Umfang der Erfindung zu begrenzen.
DNA-Manipulation: Außer es ist anderweitig angegeben, werden rekombinante DNA-Techniken gemäß Standardprotokollen durchgeführt, die in (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) oder in den Bänden 1 und 2 von Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, beschrieben sind. Standardmaterialien und -verfahren für molekulares Arbeiten an Pflanzen sind in Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R. D. D. Croy, veröffentlicht von BIOS Scientific Publications Ltd (Großbritannien) und Blackwell Scientific Publications (Großbritannien), beschrieben.
Beispiel 1:
HAB1-Polypeptide – Identifikation von mit SEQ ID NR: 1 und SEQ ID NR: 2 verwandten Sequenzen
Mit SEQ ID NR: 1 und SEQ ID NR: 2 verwandte Sequenzen (vollständige cDNA, ESTs oder genomisch) wurden unter denjenigen, welche in der ”Entrez Nucleotides”-Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) bereitgehalten werden, mit Hilfe von Datenbank-Sequenzsuchwerkzeugen wie etwa dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–410 und Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402) identifiziert. Das Programm wird eingesetzt, um Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenzdatenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz von Übereinstimmungen zu finden. So wurde zum Beispiel das von der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 1 codierte Polypeptid für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, mit Standardvorgaben und abgeschaltetem Filter zum Ignorieren von Sequenzen geringer Komplexität. Das Analyse-Ergebnis wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet und gemäß der Wahrscheinlichkeitswertung (E-Wert) eingestuft, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass ein jeweiliges Alignment rein zufällig auftritt (je niedriger der E-Wert, umso signifikanter ist der Übereinstimmungstreffer). Zusätzlich zu E-Werten wurden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg. In einigen Fällen lassen sich die Vorgabeparameter anpassen, um die Stringenz der Suche zu modifizieren. Zum Beispiel kann man den E-Wert erhöhen, so dass weniger stringente Übereinstimmungen angezeigt werden. Auf diese Weise lassen sich kurze, fast exakte Übereinstimmungen identifizieren.

Tabelle A1 stellt eine Liste von Nukleinsäuresequenzen bereit, die mit SEQ ID NR: 1 und SEQ ID NR: 2 verwandt sind. Tabelle A1: Beispiele für HAB1-Nukleinsäuren und -Polypeptide:

Ursprungspflanze	Nukleinsäure-SEQ ID NR:	Protein-SEQ ID NR:
O. sativa_LOC_Os05g51510.1	1	2
O. sativa_LOC_Os05g46040.1	3	4
Zea_mays_GRMZM2G177386_T02	5	6
A. thaliana_AT5G57050.1	7	8
O. sativa_LOC_Os01g40094.1	9	10
T. aestivum_TC290577	11	12
Z. mays_ZM07MC01604_57783888@1598	13	14
A. thaliana_AT1G17550.1	15	16
G. max_Glyma09g07650.1	17	18
G. max_GM06MC22524_59766915@22040	19	20
V. vinifera_GSVIVT00032224001	21	22
V. vinifera_GSVIVT00034142001	23	24
G. max_Glyma06g05670.1	25	26
M. truncatula_CT967316_10.4	27	28
A. thaliana_AT1G72770.1	29	30
A. thaliana_AT4G26080.1	31	32
V. vinifera_GSVIVT00016515001	33	34
Aquilegia_sp_TC27753	35	36
M. truncatula_AC202312_4.3	37	38
C. longa_TA1684_136217	39	40
P. trichocarpa_645770	41	42
S. lycopersicum_TC206974	43	44
C. solstitialis_EH790150	45	46
C. sinensis_TC12533	47	48
C. maculosa_EH715990	49	50
V. corymbosum_TA670_69266	51	52
S. lycopersicum_TC196109	53	54

KELP-Polypeptide Identifikation von mit SEQ ID NR.: 64 und SEQ ID NR: 65 verwandten Sequenzen
Sequenzen (vollständige cDNA, ESTs oder genomisch), die mit SEQ ID NR: 64 und SEQ ID NR: 65 verwandt sind, wurden unter denjenigen, welche in der ”Entrez Nucleotides”-Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) bereitgehalten werden, mit Hilfe von Datenbank-Sequenzsuchwerkzeugen wie etwa dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–410 und Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402) identifiziert. Das Programm wird eingesetzt, um Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenzdatenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz von Übereinstimmungen zu finden. So wurde zum Beispiel das von der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 64 codierte Polypeptid für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, mit Standardvorgaben und abgeschaltetem Filter zum Ignorieren von Sequenzen geringer Komplexität. Das Analyse-Ergebnis wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet und gemäß der Wahrscheinlichkeitswertung (E-Wert) eingestuft, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass ein jeweiliges Alignment rein zufällig auftritt (je niedriger der E-Wert, umso signifikanter ist der Übereinstimmungstreffer). Zusätzlich zu E-Werten wurden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg. In einigen Fällen lassen sich die Vorgabeparameter anpassen, um die Stringenz der Suche zu modifizieren. Zum Beispiel kann man den E-Wert erhöhen, so dass weniger stringente Übereinstimmungen angezeigt werden. Auf diese Weise lassen sich kurze, fast exakte Übereinstimmungen identifizieren.

In Tabelle A2 sind SEQ ID NR: 64 und SEQ ID NR: 65 und eine Liste von Nukleinsäuresequenzen, die mit SEQ ID NR: 64 und SEQ ID NR: 65 bereitgestellt. Tabelle A2: Beispiele für KELP-Nukleinsäuren und -Polypeptide:

Ursprungspflanze	Nukleinsäure SEQ ID NR:	Protein SEQ ID NR:
A. thaliana_AT4G10920	64	65
A. thaliana_AT4G00980.1#1	66	67
B. napus_TC69162#1	68	69
B. rapa_A6050390#1	70	71
B. vulgaris_CK136750#1	72	73
C. sinensis_TC17586#1	74	75
C. tetragonoloba_TA988_3832#1	76	77
C. tinctorius_EL406762#1	78	79
E. esula_DV112325#1	80	81
F. vesca_TA10966_57918#1	82	83
G. arboreum_BF270051#1	84	85
G. arboreum_BF274071#1	86	87
G. hirsutum_DR455976#1	88	89
G. hirsutum_TC172528#1	90	91
G. max_Glyma03g41890.1#1	92	93
G. max_TC289440#1	94	95
I. nil_TC8417#1	96	97
L. sativa_DY977130#1	98	99
L. sativa_TC21002#1	100	101
L. virosa_DW152822#1	102	103
M. domestica_TC30840#1	104	105
M. esculenta_TA5895_3983#1	106	107
N. tabacum_NP916922#1	108	109
N. tabacum_TC53347#1	110	111
P. glauca_DV993483#1	112	113
P. patens_NP13148677#1	114	115
P. taeda_DR054457#1	116	117
P. trichocarpa_797303#1	118	119
P. trifoliata_CV707049#1	120	121
S. bicolor_Sb03g032430.1#1	122	123
S. lycopersicum_TC195535#1	124	125
S. moellendorffii_83446#1	126	127
Triphysaria_sp_TC7488#1	128	129
V. vinifera_GSVIVT00006727001#1	130	131
Z. mays_TC523187#1	132	133

Sequenzen sind durch Forschungsinstitutionen, wie The Institute for Genomic Research (TIGR; beginnend mit TA), provisorisch zusammengetragen und öffentlich zugänglich gemacht worden. Mit der Datenbank ”Eukaryotic Gene Orthologs” (EGO) zum Beispiel lassen sich derartige verwandte Sequenzen entweder durch Stichwort-Suche oder durch Anwendung des BLAST-Algorithmus mit der Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz von Interesse identifizieren.. Spezielle Nukleinsäuresequenz-Datenbanken wurden für bestimmte Organismen, z. B. bestimmte prokaryotische Organismen, erzeugt, wie etwa vom Joint Genome Institute. Weiterhin hat der Zugang zu nicht öffentlichen Datenbanken die Identifizierung neuer Nukleinsäure- und Polypeptidsequenzen ermöglicht.
Beispiel 2: Alignment von Polypeptidsequenzen
Alignment von HAB1-Polypeptidsequenzen
Das Alignment der Polypeptidsequenzen erfolgte unter Anwendung des ClustalW 2.0-Algorithmus für fortschreitendes Alignment (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:4876-4882; Chenna et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500) mit Standardeinstellungen (langsames Alignment, Ähnlichkeitsmatrix: Gonnet, Gap Opening Penalty 10, Gap Extension Penalty: 0,2). Zur weiteren Optimierung des Alignments wurde eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt. Die HAB1-Polypeptide sind in der 2 aligniert.
Der phylogenetische Baum von HAB1-Polypeptiden (3) wurde wie in Saez et al., 2004 durch Alignieren der katalytischen Kerne von 32 Arabidopsis-PP2Cs erstellt: Medicago sativa, MP2C (O24078); Fagus sylvatica, FsPP2C1 (Q9M3V0) und FsPP2C2 (Q9M3V1); Mesembryanthemum crystallinum, McPP2C (Q9ZSQ7); Zea mays, ZmKAPP (O49973); Oryza sativa, OsKAPP (O81444); und Nicotiana tabacum, NtPP2C1 (Q9FEW0). Unter Verwendung der Aminosäuresequenzen von Arabidopsis-HAB1A als Abfragesequenz wurde eine psi-blast-Suche auf Sequenzähnlichkeit in TAIR- und NCBI-Datenbanken durchgeführt. Repräsentative Mitglieder der Pflanzen-PP2C-Familie wurden gesammelt und unter Verwendung des nach der Kennzeichung angegebenen Aminosäurebereichs mit Clustalx 1.81 aligniert. Bei Arabidopsis HAB1, At1g17550, ABI1 und ABI2 war der verwendete Aminosäurebereich 180–511, 179–511, 118–434 beziehungsweise 103–423. Schließlich wurde ein Strahlenbaum erstellt und mit Treeview 3.2 bildlich dargestellt. Die AGI-Kennzeichungen für Arabidopsis-PP2Cs und SWISS-PROT-TrEMBL-(SPTREMBL)-Proteineinträge für PP2Cs aus anderen Pflanzenarten sind angegeben. Die Arabidopsis-Genome-Initiative-(AGI)-Kennzeichnungen von ABI1, ABI2, HAB1, PP2CA, KAPP und POLTERGEIST sind At4g26080, At5g57050, At1g72770, At3g11410, At5g19280 beziehungsweise At2g46920.
Alignment von KELP-Polypeptidsequenzen
Eine Reihe von KELP-Polypeptiden ist in 7 aligniert. Das Alignment der Polypeptidsequenzen erfolgte unter Anwendung des ClustalW-(2.0.11)-Algorithmus für fortschreitendes Alignment (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500) mit Standardeinstellungen (langsames Alignment, Ähnlichkeitsmatrix: Blosum 62, Gap Opening Penalty 10, Gap Extension Penalty: 0,2). Zur weiteren Optimierung des Alignments wurde eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt.
Ein phylogenetischer Baum von KELP-Polypeptiden (8) wurde erstellt. Ein rechteckiges Kladogramm wurde mit Dendroscope 2.0.1 gezeichnet (Hudson et al. (2007) Der Baum wurde mit repräsentativen Mitgliedern der einzelnen Kluster erstellt.
Beispiel 3: Berechnung der globalen prozentualen Identität zwischen Polypeptidsequenzen
Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeits-/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Gap Opening Penalty von 12 und einem Gap Extension Penalty von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix.
HAB1-Polypeptid
Ergebnisse der Analyse sind in 4 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg gezeigt. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt. Die im Vergleich verwendeten Parameter waren: Wertungsmatrix: Blosum62, First Gap: 12, Extending Gap: 2. Die Sequenzidentität (in %) zwischen den für die Durchführung der Verfahren der Erfindung geeigneten HAB1-Polypeptidsequenzen kann, verglichen mit der SEQ ID NR: 2, lediglich 36% betragen, ist aber im Allgemeinen höher als 40%.
KELP-Polypeptid
Ergebnisse der Software-Analyse sind in 9 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg gezeigt. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt. Die im Vergleich verwendeten Parameter waren: Wertungsmatrix: Blosum62, First Gap: 12, Extending Gap: 2. Die Sequenzidentität (in %) zwischen den für die Durchführung der Verfahren der Erfindung geeigneten KELP-Polypeptidsequenzen liegt im Allgemeinen über 20% und vorzugsweise über 25%, verglichen mit SEQ ID NR: 65.
Beispiel 4: Identifizierung von Domänen, die in Polypeptidsequenzen enthalten sind, die sich für die Durchführung der Verfahren der Erfindung eignen
Die ”Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites”(InterPro)-Datenbank ist eine integrierte Schnittstelle für die üblicherweise verwendeten Signaturdatenbanken für text- und sequenzbasierte Suchläufe. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, welche verschiedene Methodologien und unterschiedliche Klassen von biologischen Informationen über gut charakterisierte Proteine verwenden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu kollaborierenden Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Bei Pfam handelt es sich um eine große Sammlung von Mehrfach-Sequenzalignments und Hidden-Markov-Modellen, die viele herkömmliche Proteindomänen und -familien umfasst. Pfam wird am Server des Sanger Institute im Vereinigten Königreich gehostet. Interpro wird am European Bioinformatics Institute im Vereinigten Königreich gehostet.
HAB1-Polypeptid
Die Ergebnisse des InterPro-Scans (InterPro-Datenbank, Version 29.0) der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NR: 2 sind in der Tabelle B1 aufgeführt.
Gemäß einer Ausführungsform umfasst ein HAB1-Polypeptid eine konservierte Domäne (oder ein konserviertes Motiv) mit mindestens 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einer konservierten Domäne von Aminosäure 134 bis 439 in SEQ ID NR: 2).
KELP-Polypepfid

Die Ergebnisse des InterPro-Scans (InterPro-Datenbank, Version 28.0) der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NR: 65 sind in der Tabelle B2 aufgeführt. Tabelle B2: Ergebnisse des InterPro-Scans (Hauptzugangsnummern), der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NR: 65.

Datenbank	Nummer	Name	Start	Stopp	p-Wert	Zugangs
Gene3D (Version 3.0.0)	G3DSA:2.30.31.10	ssDNA-binding transcriptional regulator	108	172	1,40E–19	IPR009044
Superfamily (Version 1.69)	SSF54447	ssDNA-binding transcriptional regulator domain	108	172	1,50E–21	IPR009044
Pfam (Version 24.0)	PF02229	PC4; Transcriptional coactivator p15	93	169	6,90E–30	IPR003173
PANTHER (Version 6.1)	PTHR13215	RNA POLYMERASEII TRANSCRIPTIONAL COACTIVATOR; Transcriptional coactivator p15	108	176	5,00E–26	IPR003173
Pfam (Version 24.0)	PF08766	DEK_C	16	71	2,10E–16	IPR014876

Beispiel 5: Topologievorhersage für die HAB1-Polypeptid- oder KELP-Polypeptidsequenzen
TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung von eukaryotischen Proteinen voraus. Die Lagebestimmung basiert auf der vorhergesagten Gegenwart von einer beliebigen der N-terminalen Präsequenzen: Chloroplasten-Transit-Peptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Sekretorischer-Pfad-Signalpeptid (SP). Wertungen, auf welchen die endgültige Vorhersage beruht, sind nicht wirklich Wahrscheinlichkeiten, und sie addieren sich nicht notwendigerweise zu 1. Allerdings ist die Lokalisierung mit der höchsten Bewertung gemäß TargetP am wahrscheinlichsten, und die Beziehung zwischen den Wertungen (die Zuverlässigkeitsklasse) kann eine Angabe sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Zuverlässigkeitsklasse bzw. ”Reliability Class” (RC) liegt im Bereich von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage anzeigt. TargetP wird am Server der Technischen Universität Dänemark (Technical University of Denmark) bereitgehalten.
Für die Sequenzen, welche vorhergesagtermaßen eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann ebenfalls eine potentielle Spaltungsstelle vorhergesagt werden.
HAB1-Polypeptid
Die Ergebnisse der TargetP 1.1-Analyse der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NR: 2 sind in der Tabelle C1 aufgeführt. Die Organismengruppe ”Pflanze” wurde gewählt, es wurden keine Ausschlussbedingungen definiert, und die vorhergesagte Länge des Transitpeptids wurde angefordert. Bei der subzellulären Lokalisierung der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NR: 2 kann es sich um das Zytoplasma oder den Zellkern handeln, wobei kein Transitpeptid vorhergesagt wird. Tabelle C1: TargetP 1.1-Analyse der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NR: 2. Abkürzungen: Len, Länge; cTP, chloroplastisches Transitpeptid; mTP, mitochondriales Transitpeptid, SP, Signalpeptid für einen sekretorischen Pfad, andere, anderes subzelluläres Ziel, Loc, vorhergesagte Lokalisierung; RC, Verlässlichkeitsklasse; TPlen, vorhergesagte Länge des Transitpeptids.
KELP-Polypeptid

Die in Tabelle C2 angeführten Ergebnisse des PSORT-Algorithmus zeigen zum Beispiel Folgendes: Tabelle C2:

Kern	Gewissheit = 0.546 (bestätigt) <succ>
mitochondrialer Matrixraum	Gewissheit = 0.100 (bestätigt) <succ>
endoplasmatisches Retikulum (Membran)	Gewissheit = 0.000 (unklar) <succ>
endoplasmatisches Retikulum (Lumen)	Gewissheit = 0.000 (unklar) <succ>

Daher kann auf Grundlage dieser Ergebnisse vorhergesagt werden, dass KELP-Polypeptide im Kern lokalisiert sind.
Es können viele andere Algorithmen zur Durchführung derartiger Analysen verwendet werden, einschließlich:

• ChloroP 1.1, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
• Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, bereitgehalten auf dem Server des Institute for Molecular Bioscience, University of Queensland, Brisbane, Australien;
• PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, bereitgehalten auf dem Server der University of Alberta, Edmonton, Alberta, Kanada;
• TMHMM, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
• PSORT (URL: psort.org)
• PLOC (Park und Kanehisa, Bioinformatics, 19, 1656–1663, 2003).

Beispiel 6: Funktionsassay für das HAB1-Polypeptid (modifiziert nach Vlad et al. 2009)
HAB1 wird als Glutathion-S-transferase-Fusionsproteine in Escherichia coli produziert und unter Anwendung einer Standardvorschrift aufgereinigt (Leung et al., Plant Cell 9: 759–771, 1997; Gosti et al., Plant Cell 11: 1897–1910, 1999; Robert et al., FEBS Lett. 580: 4691–4696, 2006). CIP wird von New England Biolabs bezogen. Phosphopeptide mit definierter Sequenz werden als rohe Peptide wie folgt maßgeschneidert synthetisiert: OST1AL, SVLHSQPKpSTVGTPAY; OST1S-4D, SVLHDQPKpSTVGTPAY; OST1K-1L, SVLHSQPLpSTVGTPAY; OST1T1Q, SVLHSQPKpSQVGTPAY und OST1V2D, SVLHSQPKpSTDGTPAY.
Die Phosphopeptide werden zunächst als 20-mM-Stammlösung in DMSO gelöst und dann mit 5 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4 auf 200 μM verdünnt. Die Dephosphorylierung der Peptide wird in schwarzen Platten mit 384 Vertiefungen (Greiner Bio-One; 781076), die 5 μl der 200-μM-Phosphopeptidlösungen enthalten, analysiert. Darüber hinaus werden verschiedene Vertiefungen zur absoluten Quantifizierung von Pi mit Standardlösungen an anorganischem Phosphat (Pi) (von 8 bis 0,002 μM) versetzt. Phosphopeptide (50 μM Endkonzentration) werden gleichzeitig bei 25°C in 20 μl Reaktionslösung (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,8, 20 mM Magnesiumacetat, 1 mM DTT und 0,05% Tween 20), die 0,5 μM Phosphatsensor (Invitrogen; PV4406) und die Proteinphosphatase (0,15 bis 7,5 ng/μl) enthält, dephosphoryliert. In einer vorläufigen Untersuchung wird verifiziert, dass bis zu einer Phosphopeptidendkonzentration von 50 μM kein von kontaminierendem Phosphat herrührender fluoreszenter Hintergrund nachweisbar ist. Die Dephosphorylierung von Peptiden wird in Echtzeit über 2 h (mit 90-s-Messpunkten) als Zunahme der Fluoreszenz des Phosphatsensors mit einem Tecan Infinite M200 (Anregung 415 nm/Emission 450 nm) aufgezeichnet. Das Fluoreszenzsignal wird mit einer logarithmischen Pi-Eichkurve in die Menge an freiem Phosphat umgerechnet, und die Dephosphorylierungsgeschwindigkeit (Vi) für die einzelnen Phosphopeptide wird im linearen Bereich der Kurve berechnet.
Beispiel 7:
Klonieren der für das HAB1-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz
Die Nukleinsäuresequenz wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine speziell erstellte cDNA-Bibliothek mit Oryza-sativa-Keimlingen verwendet wurde. Die PCR wurde mit im Handel erhältlicher Proofreading Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Matrize in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Bei den verwendeten Primern handelte es sich um prm13731 (SEQ ID NR: 60; sense, Startcodon fett): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggaggacctcgccctg-3' und prm13732 (SEQ ID NR: 61; revers, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcatgctttgctcttgaacttcc-3', die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls nach Standardmethoden aufgereinigt. Dann wurde der erste Schritt der Gateway-Vorschrift, die BP-Reaktion, durchgeführt, während der das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombiniert, wodurch man gemäß der Gateway-Terminologie einen ”entry clone”, pHAB1, erhielt. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Teil der Gateway^®-Technologie erworben.
Der die SEQ ID NR: 1 umfassende Eingangsklon wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor für die Transformation von Oryza sativa eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als Funktionselemente innerhalb der T-DNA-Grenzen: einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette; sowie eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den Eingangsklon kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 62) für die konstitutive spezifische Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pGOS2::HAB1 (5) nach im Stand der Technik gut bekannten Methoden in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
Klonieren der für das KELP-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz
Die Nukleinsäuresequenz dieses Beispiels wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine speziell erstellte cDNA-Bibliothek mit Arabidopsis thaliana-Keimlingen verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Matrize in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Bei den verwendeten Primern handelte es sich um prm01515 (SEQ ID NR: 134; sense, Startcodon unterstrichen): 5' ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcacaatggagaaagagacgaaggag 3' und prm01516 (SEQ ID NR: 135; revers, komplementär): 5' ggggaccactttgtacaagaaagctgggtatgttcttcattcagacacgc 3', die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls nach Standardmethoden aufgereinigt. Dann wurde der erste Schritt der Gateway-Vorschrift, die BP-Reaktion, durchgeführt, während der das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombiniert, wodurch man gemäß der Gateway-Terminologie einen ”entry clone”, pKELP, erhielt. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Teil der Gateway^®-Technologie erworben.
Der die SEQ ID NR: 64 umfassende Eingangsklon wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor für die Transformation von Oryza sativa eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als Funktionselemente innerhalb der T-DNA-Grenzen: einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette; sowie eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den Eingangsklon kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 136) für die konstitutive spezifische Expression befand sich stromaufwärts dieser Gateway-Kassette.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pGOS2::KELP (10) nach im Stand der Technik gut bekannten Methoden in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
Beispiel 8: Pflanzentransformation
Transformation von Reis
Das Agrobacterium, welches den Expressionsvektor enthielt, wurde zum Transformieren von Oryza sativa-Pflanzen verwendet. Reife trockene Samen des Reis-Japonica-Kultivars Nipponbare wurden einer Enthülsung unterzogen. Die Sterilisierung wurde durch Inkubieren während einer Minute in 70% Ethanol, gefolgt von 30 Minuten in 0,2% HgCl₂, gefolgt von sechsmaligem 15-minütigem Waschen mit sterilem destilliertem Wasser, durchgeführt. Die sterilen Samen wurden dann auf einem Medium keimen gelassen, welches 2,4-D enthielt (Callus-Induktionsmedium). Nach vierwöchiger Inkubation im Dunkeln wurden embryogene, vom Scutellum abgeleitete Calli herausgeschnitten und auf dem gleichen Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Calli durch Subkultivieren auf dem gleichen Medium weitere 2 Wochen lang vervielfältigt oder vermehrt. Embryogene Callus-Stücke wurden 3 Tage vor der Cokultivierung auf frischem Medium subkultiviert (zur Steigerung der Zellteilungsaktivität).
Der Agrobacterium-Stamm LBA4404, welcher den Expressionsvektor enthielt, wurde für die Co-Kultivierung verwendet. Agrobacterium wurde auf AB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika inokuliert und 3 Tage lang bei 28°C kultiviert. Die Bakterien wurden dann gesammelt und in einem flüssigen Cokultivierungsmedium in einer Dichte (OD₆₀₀) von etwa 1 suspendiert. Die Suspension wurde dann in eine Petrischale überführt und die Calli wurden 15 Minuten lang in die Suspension eingetaucht. Die Callusgewebe wurden dann auf einem Filterpapier trocken getupft und auf verfestigtes Cokultivierungsmedium überführt und 3 Tage lang im Dunkeln bei 25°C inkubiert. Cokultivierte Calli wurden auf 2,4-D-enthaltendem Medium 4 Wochen lang im Dunkeln bei 28°C in Gegenwart eines Auswahlmittels wachsen gelassen. Während dieser Periode entwickelten sich rasch wachsende, resistente Callus-Inseln. Nach dem Übertragen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation bei Licht wurde das embryogene Potenzial freigesetzt, und Sprosse entwickelten sich in den nächsten vier bis fünf Wochen. Die Sprosse wurden aus den Calli herausgeschnitten und 2 bis 3 Wochen lang auf einem auxinhaltigen Medium inkubiert, von welchem sie in den Erdboden überführt wurden. Gehärtete Sprosse wurden unter hoher Feuchtigkeit und bei kurzen Tagen in einem Gewächshaus wachsen gelassen.
35 bis 90 oder ungefähr 35 unabhängige T0-Reis-Transformanten wurden für ein Konstrukt erzeugt. Die primären Transformanten wurden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus überführt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Bestätigung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wurden lediglich transgene Einzelkopie-Pflanzen, welche Toleranz gegenüber dem Auswahlmittel zeigen, für die Ernte von T1-Samen beibehalten. Die Samen wurden dann drei bis fünf Monate nach dem Umpflanzen geerntet. Das Verfahren ergab Einzel-Locus-Transformanten bei einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).
Beispiel 9: Transformation anderer Kulturpflanzen
Transformation von Mais
Die Transformation von Mais (Zea mays) wird mit einer Abwandlung des Verfahrens durchgeführt, welches von Ishida et al. (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50 beschrieben wurde. Die Transformation in Mais ist genotypabhängig, und nur spezifische Genotypen sind einer Transformation und Regeneration zuführbar. Die Inzucht-Linie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als Elternteil sind gute Quellen von Spendermaterial für eine Transformation, aber auch andere Genotypen können erfolgreich verwendet werden. Ähren werden aus der Maispflanze ungefähr 11 Tage nach der Bestäubung (DAP) abgeerntet, wenn die Länge des unreifen Embryos ungefähr 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryos werden mit Agrobacterium tumefaciens, welches den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Herausgeschnittene Embryos werden auf Callus-Induktionsmedium und anschließend Mais-Regenerationsmedium, welches das Auswahlmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, wobei jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden können), wachsen gelassen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C 2–3 Wochen lang, oder bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Mais-Bewurzelungsmedium überführt und bei 25°C 2 bis 3 Wochen lang, bis sich Wurzeln entwickeln, inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden von Pflanzen erzeugt, die Toleranz gegenüber dem Auswahlmittel zeigen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Transformation von Weizen
Die Transformation von Weizen wird mit dem Verfahren durchgeführt, welches von Ishida et al. (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50 beschrieben wurde. Üblicherweise wird das Kultivar Bobwhite (erhältlich von CIMMYT, Mexiko) bei der Transformation verwendet. Unreife Embryos werden mit Agrobacterium tumefaciens, welches den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Nach der Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryos in vitro auf Callus-Induktionsmedium, und dann Regenerationsmedium, welches das Auswahlmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, wobei jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden können), wachsen gelassen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C 2–3 Wochen lang, oder bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Bewurzelungsmedium überführt und 2–3 Wochen lang, bis sich Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Auswahlmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Transformation von Sojabohne
Sojabohne wird gemäß einer Modifikation der in der US-Patentschrift 5,164,310 von Texas A&M beschriebenen Methode transformiert. Mehrere kommerzielle Sojabohnensorten sind einer Transformation nach diesem Verfahren zugänglich. Üblicherweise wird das Kultivar Jack (erhältlich von der Illinois Seed Foundation) zur Transformation verwendet. Sojabohnensamen werden für das In-vitro-Aussäen sterilisiert. Das Hypokotyl, die Keimwurzel und ein Kotyledon werden aus sieben Tage alten Jungsämlingen herausgeschnitten. Das Epikotyl und das verbleibende Kotyledon werden weiter wachsen gelassen, um axilläre Nodi zu entwickeln. Diese axillären Nodi werden herausgeschnitten und mit Agrobacterium tumefaciens inkubiert, welches den Expressionsvektor enthält. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und auf Selektionsmedien überführt. Regenerierte Sprosse werden herausgeschnitten und auf ein Sprossverlängerungsmedium gebracht. Sprosse, welche nicht länger als 1 cm sind, werden auf Bewurzelungsmedium gebracht, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Auswahlmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Transformation von Raps/Canola
Kotyledonäre Keimblattstiele sowie Hypokotyle von einem 5–6 Tage alten Jungsämling werden als Explantate für die Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (1998, Plant Cell Rep. 17: 183–188) transformiert. Kommerzielle Kultivar Westar (Agriculture Canada) ist die zur Transformation verwendete Standardvarietät, aber auch andere Varietäten können verwendet werden. Canola-Samen werden für das In-vitro-Aussäen oberflächensterilisiert. Die Kotyledon-Keimblattstiel-Explantate mit dem anhängigen Kotyledon werden von den In-vitro-Sämlingen abgeschnitten und mit Agrobacterium (enthaltend den Expressionsvektor) durch Eintauchen des Schnittendes des Keimblattstiel-Explantats in die Bakteriensuspension inokuliert. Die Explantate werden dann 2 Tage lang auf MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar, bei 23°C, 16 Stunden Licht, kultiviert. Nach zwei Tagen Cokultivierung mit Agrobacterium werden die Blattstiel-Explantate auf MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l) während 7 Tagen überführt und danach auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin und Auswahlmittel bis zur Sprossregeneration kultiviert. Wenn die Sprosse 5–10 mm Länge aufweisen, werden sie abgeschnitten und auf Sprossverlängerungsmedium (MSBAP-0,5, enthaltend 0,5 mg/l BAP) überführt. Sprosse von etwa 2 cm Länge werden auf das Bewurzelungsmedium (MS0) zur Wurzelinduktion überführt. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Auswahlmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Transformation von Luzerne
Ein sich regenerierender Klon von Luzerne (Medicago sativa) wird unter Anwendung des Verfahrens von McKersie et al. (1999, Plant Physiol. 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Luzerne ist genotypabhängig, und daher wird eine sich regenerierende Pflanze benötigt. Verfahren zum Erhalten von sich regenerierenden Pflanzen sind beschrieben worden. Zum Beispiel können diese aus dem Kultivar Rangelander (Agriculture Canada) oder einer beliebigen anderen kommerziellen Luzerne-Varietät ausgewählt werden, wie es durch Brown, DCW, und A. Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) beschrieben wurde. Alternativ dazu ist die RA3-Varietät (University of Wisconsin) zur Verwendung in der Gewebekultur ausgewählt worden (Walker et al., 1978, Am. J. Bot. 65: 654–659). Blattstiel-Explantate werden mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (Mckersie et al., 1999 Plant Physiol. 119: 839–847) oder LBA4404, enthaltend den Expressionsvektor, cokultiviert. Die Explantate werden drei Tage lang im Dunkeln auf SH-Induktionsmedium cokultiviert, welches 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K2SO4 und 100 μm Acetosyringinon enthält. Die Explantate werden in Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke (Murashige und Skoog, 1962) gewaschen und auf dem gleichen SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon, aber mit einem geeigneten Auswahlmittel und einem geeigneten Antibiotikum zum Inhibieren des Agrobacterium-Wachstums ausplattiert. Nach einigen Wochen werden somatische Embryos auf BOi2Y-Entwicklungsmedium, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika sowie 50 g/l Saccharose enthält, überführt. Somatische Embryos werden anschließend auf Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke keimen gelassen. Bewurzelte Setzlinge wurden in Blumentöpfe umgepflanzt und in einem Gewächshaus wachsen gelassen. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Auswahlmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Transformation von Baumwolle
Baumwolle wird unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens gemäß dem in US 5,159,135 beschriebenen Verfahren transformiert. Die Baumwollsamen werden 20 Minuten lang in 3%iger Natriumhypochloritlösung oberflächensterilisiert und in destilliertem Wasser mit 500 μg/ml Cefotaxim gewaschen. Die Samen werden dann für die Keimung in SH-Medium mit 50 μg/ml Benomyl überführt. Hypokotyle von 4 bis 6 Tage alten Setzlingen werden entfernt, in Stücke von 0,5 cm geschnitten und auf 0,8%igen Agar platziert. Eine Agrobacterium-Suspension (ungefähr 108 Zellen pro ml, verdünnt aus einer Übernachtkultur, transformiert mit dem Gen von Interesse und geeigneten Selektionsmarkern) wird für die Inokulation der Hypokotyl-Explantate verwendet. Nach 3 Tagen bei Raumtemperatur und Beleuchtung überführt man die Gewebe auf ein festes Medium (1,6 g/l Gelrite) mit Murashige-und-Skoog-Salzen mit B5-Vitaminen (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50: 151–158 (1968)), 0,1 mg/l 2,4-D, 0,1 mg/l 6-Furfurylaminopurin und 750 μg/ml MgCl2 sowie mit 50 bis 100 μg/ml Cefotaxim und 400–500 μg/ml Carbenicillin zum Abtöten restlicher Bakterien. Individuelle Zelllinien werden nach zwei bis drei Monaten (mit Unterkulturen alle vier bis sechs Wochen) isoliert und werden auf selektivem Medium zur Gewebevermehrung weiter kultiviert (30°C, 16 h Lichtperiode). Transformierte Gewebe werden anschließend auf nicht-selektivem Medium 2 bis 3 Monate lang weiter kultiviert, was zur Entstehung von somatischen Embryos führt. Gesund aussehende Embryos von mindestens 4 mm Länge werden in Röhrchen mit SH-Medium in feinem Vermiculit, das mit 0,1 mg/l Indolessigsäure, 6-Furfurylaminopurin und Gibberellinsäure ergänzt ist, überführt. Die Embryos werden bei 30°C mit einer Lichtperiode von 16 h kultiviert, und Pflänzchen im 2- bis 3-Blattstadium werden in Blumentöpfe mit Vermiculit und Nährstoffen überführt. Die Pflanzen werden abgehärtet und anschließend für die weitere Kultivierung ins Gewächshaus verbracht.
Beispiel 10: Vorgehen bei der phänotypischen Auswertung
10.1 Auswertungsansatz
Ungefähr 35 unabhängige T0-Reis-Transformanten wurden erzeugt. Die primären Transformanten wurden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus zum Kultivieren und Ernten von T1-Samen überführt. Sechs Ereignisse, bei denen die T1-Nachkommenschaft hinsichtlich Gegenwart/Abwesenheit des Transgens bei 3:1 segregierte, wurden beibehalten. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Setzlinge, enthaltend das Transgen (Hetero- und Homozygote), und ungefähr 10 T1-Setzlinge, denen das Transgen fehlte (Nullizygote), durch Überwachen der Expression des sichtbaren Markers selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden an zufälligen Positionen Seite an Seite wachsen gelassen. Die Gewächshausbedingungen bestanden aus kurzen Tagen (12 Stunden Licht), 28°C im Licht und 22°C im Dunkeln sowie einer relativen Feuchtigkeit von 70%. Pflanzen, welche unter Nichtstressbedingungen wachsen gelassen wurden, wurden in regelmäßigen Intervallen bewässert, um sicherzustellen, dass Wasser und Nährstoffe nicht limitierend sind, und um die Bedürfnisse der Pflanze zum Abschließen von Wachstum und Entwicklung zu erfüllen, es sei denn, sie wurden in einem Stresstest eingesetzt.
Vom Stadium des Aussäens bis zum Stadium der Reife wurden die Pflanzen mehrmals durch eine digitale Bilderzeugungs-Kammer hindurchgeleitet. An jedem Zeitpunkt wurden Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln aufgenommen.
T1-Ereignisse können unter Befolgen desselben Auswertungsvorgehens wie für die T1-Generation, z. B. mit weniger Ereignissen und/oder mit mehr Individuen pro Ereignis, in der T2-Generation weiter ausgewertet werden.
Dürre-Screen
T1- oder T2-Pflanzen wurden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, bis sie sich dem Stadium des Ähren/Rispenschiebens näherten. Sie wurden dann in einen ”Trocken”-Bereich überführt, in welchem die Bewässerung weggelassen wurde. Zur Überwachung des Bodenwassergehalts (SWC) wurden Bodenfeuchtigkeitssonden in zufällig ausgewählte Blumentöpfe gesteckt. Fiel der SWC unter bestimmte Schwellenwerte, so wurden die Pflanzen automatisch wieder fortwährend bewässert, bis erneut ein normaler Spiegel erreicht wurde. Die Pflanzen wurden dann zurück zu normalen Bedingungen überführt. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) war der gleiche wie bei Pflanzen, die nicht unter abiotischen Stress-Bedingungen herangezogen wurden. Wachstums- und Ertragsparameter wurden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
Screen der Stickstoffausnutzungseffizienz
T1- oder T2-Pflanzen werden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, mit Ausnahme der Nährstofflösung. Die Blumentöpfe werden vom Umpflanzen bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährstofflösung bewässert, welche einen verringerten Stickstoff(N)-Gehalt enthält, üblicherweise zwischen 7- bis 8-mal weniger. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) ist der gleiche wie für Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress wachsen gelassen wurden. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
Salzstress-Screen
T1- oder T2-Pflanzen wurden auf einem Substrat wachsen gelassen, das aus Kokosfasern und gebackenem Ton (Argex) (Verhältnis 3 zu 1) hergestellt ist. Eine normale Nährstofflösung wurde während der ersten zwei Wochen nach dem Umpflanzen der Pflänzchen in dem Gewächshaus verwendet. Nach den ersten zwei Wochen wurden der Nährstofflösung 25 mM Salz (NaCl) zugesetzt, bis die Pflanzen geerntet wurden. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
10.2 Statistische Analyse: F-Test
Eine Zwei-Faktor-ANOVA (Analyse von Varianten) wurde als ein statistisches Modell für die Gesamtauswertung von phänotypischen Pflanzenmerkmalen verwendet. Ein F-Test wurde bei allen gemessenen Parametern von allen Pflanzen aller Ereignisse, die mit dem Gen der vorliegenden Erfindung transformiert waren, durchgeführt. Der F-Test wurde durchgeführt, um eine Prüfung hinsichtlich eines Effekts des Gens über alle Transformationsereignisse hinweg vorzunehmen und einen Gesamteffekt des Gens, ebenfalls bekannt als globaler Geneffekt, zu bestätigen. Der Schwellenwert für Signifikanz für einen echten globalen Geneffekt wurde bei einer 5%-Wahrscheinlichkeitsstufe für den F-Test festgesetzt. Ein signifikanter F-Testwert deutet auf einen Geneffekt hin, was heißt, dass es nicht nur die bloße Gegenwart oder Position des Gens ist, welche die Unterschiede beim Phänotyp verursacht.
10.3 Gemessene Parameter
Vom Stadium des Aussäens bis zum Stadium der Reife wurden die Pflanzen mehrmals durch eine digitale Bilderzeugungs-Kammer hindurchgeleitet. An jedem Zeitpunkt wurden Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln aufgenommen, wie in WO2010/031780 beschrieben. Mit diesen Messungen wurden verschiedene Parameter bestimmt.
Messung von biomassebezogenen Parametern
Die oberirdische Pflanzenfläche (oder blattartige Biomasse) wurde durch Zählen der Gesamtzahl an Pixeln auf den Digitalbildern von oberirdischen Pflanzenteilen, die sich vom Hintergrund unterscheiden lassen, bestimmt. Dieser Wert wurde für die Bilder gemittelt, welche zum gleichen Zeitpunkt aus den unterschiedlichen Winkeln aufgenommen worden waren, und wurde durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert umgewandelt, der in Quadratmillimetern ausgedrückt wird. Experimente zeigen, dass die auf diese Weise gemessene oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist die Fläche, welche an dem Zeitpunkt gemessen wird, an dem die Pflanze ihre maximale Blatt-Biomasse erreicht hatte.
Die Erhöhung der Wurzelbiomasse wird als eine Erhöhung der Gesamtwurzelbiomasse (gemessen als das Maximum der Biomasse von Wurzeln, das während der Lebensdauer einer Pflanze beobachtet wird); oder als eine Erhöhung im Wurzel/Spross-Index, gemessen als das Verhältnis zwischen Wurzelmasse und Sprossmasse in der Periode des aktiven Wachstums von Wurzel und Spross, ausgedrückt. Mit anderen Worten, der Wurzel-Spross-Index ist definiert als das Verhältnis der Schnelligkeit des Wurzelwachstums zur Schnelligkeit des Sprosswachstums in der Zeit des aktiven Wachstums von Wurzel und Spross. Die Wurzelbiomasse lässt sich nach der in WO 2006/029987 beschriebenen Methode bestimmen.
Mit der Entwicklungszeit in Zusammenhang stehende Parameter
Die Jungpflanzenvitalität ist die oberirdische Pflanzenfläche drei Wochen nach der Keimung. Die Jungpflanzenvitalität wurde durch Zählen der Gesamtzahl an Pixeln von oberirdischen Pflanzenteilen, welche sich vom Hintergrund unterscheiden lassen, bestimmt. Dieser Wert wurde für die Bilder gemittelt, welche zum gleichen Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommen worden waren, und wurde durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert umgewandelt, der in Quadratmillimetern ausgedrückt wird.
AreaEmer gibt einen Hinweis auf eine schnelle Frühentwicklung, wenn dieser Wert im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermindert ist. Er stellt das Verhältnis in % zwischen der Zeit, die eine Pflanze benötigt, um 30% der Endbiomasse zu produzieren, und der Zeit, die benötigt wird, um 90% der Endbiomasse zu produzieren, dar.
Die ”Zeit bis zur Blüte” oder ”Blütezeit” der Pflanze lässt sich unter Anwendung des in WO 2007/093444 beschriebenen Verfahrens bestimmen.
Messungen von samenbezogenen Parametern
Die reifen Hauptrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode etikettiert und dann drei Tage lang in einem Ofen bei 37°C getrocknet. Die Rispen wurden dann gedroschen, und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die Samen sind gewöhnlich von einer trockenen äußeren Umhüllung, der Hülse, bedeckt. Die gefüllten Hülsen (hier auch als gefüllte Einzelblüten bezeichnet) wurden von den leeren Hülsen unter Verwendung einer Luftgebläsevorrichtung getrennt. Die leeren Hülsen wurden verworfen, und die verbleibende Fraktion wurde erneut gezählt. Die gefüllten Hülsen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Gesamtanzahl an Samen wurde durch Zählen der Anzahl an gefüllten Hülsen bestimmt, welche nach dem Trennungsschritt verblieb. Das Gesamtsamengewicht wurde durch Wiegen aller von einer Pflanze abgeernteten gefüllten Hülsen gemessen. Die Gesamtanzahl an Samen (oder Einzelblüten) pro Pflanze wurde durch Auszählen der von einer Pflanze geernteten Hülsen (gleich ob gefüllt oder nicht) bestimmt. Das Tausendkerngewicht (TKW) wird aus der gezählten Anzahl an Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert. Der Ernteindex (Harvest Index, HI) ist in der vorliegenden Erfindung definiert als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamengewicht und der oberirdischen Fläche (mm²), multipliziert mit einem Faktor von 10⁶. Die Anzahl an Blüten pro Rispe, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, ist das Verhältnis zwischen der Gesamtzahl an Samen zur Anzahl an reifen Hauptrispen. Die ”Samenfüllrate”, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, ist der Anteil (ausgedrückt als ein %-Wert) der Anzahl gefüllter Samen (d. h. der Samen enthaltenden Einzelblüten) gegenüber der Gesamtzahl an Samen (d. h. Gesamtzahl an Einzelblüten). In anderen Worten ist die Samenfüllrate der Anteil an mit Samen gefüllten Einzelblüten in Prozent.
Beispiel 11: Ergebnisse der phänotypischen Auswertung der transgenen Pflanzen
HAB1-Polypeptid
Unter Dürrestressbedingungen zeigten transgene, eine HAB1-Nukleinsäure exprimierende Reispflanzen eine erhöhte Füllrate: 5 von 6 getesteten Linien mit einer Gesamtzunahme von 88,8% (p-Wert < 0,05).
KELP-Polypeptid
Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen in der T2-Generation, die eine Nukleinsäure, die für das KELP-Polypeptid von SEQ ID NR: 65 codiert, unter Dürrestressbedingungen exprimieren, sind unten in Tabelle D gezeigt. Bei einer Kultivierung unter Dürrebedingungen wie im Beispielteil oben beschrieben wurde eine Zunahme von mindestens 5% bei mit dem Samenertrag in Zusammenhang stehenden Parametern und insbesondere eine Zunahme von mindestens 5% beim Gesamtsamengewicht, der Anzahl an gefüllten Samen (d. h. der Anzahl an Samen enthaltenden Einzelblüten) und der Füllrate beobachtet. Tabelle D: Zusammenfassung der Daten für transgene Reispflanzen; gezeigt ist die Gesamtzunahme in Prozent für jeden Parameter, und für alle Parameter ist der p-Wert < 0,05.

Parameter Gesamtzunahme

Samengesamtgewicht 11,5

Anzahl an gefüllten Samen 14,0

Füllrate 21,2

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein HAB1-Polypeptid codiert, in einer Pflanze, wobei das HAB1-Polypeptid eine PF00481-PP2C-Domäne umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren der Nukleinsäure, die für das HAB1-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen und vorzugsweise einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Dürrestressbedingungen erhalten werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das HAB1-Polypeptid eines oder mehrere der folgenden Motive umfasst:
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die für ein HAB1-Polypeptid codierende Nukleinsäure pflanzlichen Ursprungs ist, vorzugsweise aus einer monokotylen Pflanze, besonders bevorzugt aus der Familie Poaceae, noch mehr bevorzugt aus der Gattung Oryza, ganz besonders bevorzugt aus Oryza sativa.
Verfahren gemäß einer der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Nukleinsäure, die für ein HAB1-Polypeptid codiert, für ein beliebiges der in Tabelle A1 aufgelisteten Polypeptide codiert oder ein Abschnitt einer derartigen Nukleinsäure oder eine zum Hybridisieren mit einer derartigen Nukleinsäure fähige Nukleinsäure ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle A1 angegebenen Polypeptide codiert.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Nukleinsäure für das Polypeptid gemäß SEQ ID NR: 2 codiert.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem konstitutiven Promotor mittlerer Stärke, vorzugsweise mit einem Promotor aus einer Pflanze, besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
Pflanze, Pflanzenteil davon, einschließlich Samen, oder Pflanzenzelle, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei diese Pflanze, dieser Pflanzenteil bzw. diese Pflanzenzelle eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die für ein wie in einem der Ansprüche 1 und 5 bis 9 definiertes HAB1-Polypeptid codiert.
Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure, die für ein HAB1 codiert, wie in einem der Ansprüche 1 und 5 bis 9 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (i) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz
Konstrukt gemäß Anspruch 12, wobei es sich bei einer der Steuerungssequenzen um einen konstitutiven Promotor, vorzugsweise einen konstitutiven Promotor mittlerer Stärke, vorzugsweise einen Promotor aus einer Pflanze, besonders bevorzugt einen GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt einen GOS2-Promotor aus Reis, handelt.
Verwendung eines Konstrukts gemäß Anspruch 12 oder 13 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen, vorzugsweise einem erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Anspruch 12 oder 13 transformiert ist.
Verfahren zum Herstellen einer transgenen Pflanze mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vorzugsweise einem erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welches Folgendes umfasst: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein HAB1-Polypeptid codiert, wie in einem der Ansprüche 1 und 5 bis 9 definiert, in einer Pflanzenzelle oder Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle bzw. der Pflanze unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
Transgene Pflanze mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vorzugsweise einem erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, herrührend von einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein HAB1-Polypeptid codiert, wie in einem der Ansprüche 1 und 5 bis 9 definiert, oder eine von dieser transgenen Pflanze abgeleitete transgene Pflanzenzelle.
Transgene Pflanze gemäß Anspruch 11, 15 oder 17, oder eine davon abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze wie Rübe, Zuckerrübe oder Luzerne oder eine Monokotyle wie Zuckerrohr oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff, Milo und Hafer ist.
Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Anspruch 18, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Anspruch 18 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Anspruch 19 abgeleitet sind.
Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein HAB1-Polypeptid codiert, wie in einem der Ansprüche 1 und 5 bis 9 definiert, zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vorzugsweise zum Erhöhen des Samenertrags von Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein KELP-Polypeptid codiert, in einer Pflanze, wobei das KELP-Polypeptid eine oder mehrere der folgenden Motive umfasst:
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein KELP-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 22 oder 23, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen und vorzugsweise einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22 bis 24, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22 bis 25, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Dürrestressbedingungen, Salzstressbedingungen oder Stickstoffmangelbedingungen erhalten werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22 bis 26, wobei das KELP-Polypeptid zusätzlich eines oder mehrere der folgenden Motive umfasst:
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 27, wobei das KELP-Polypeptid eine DEK_C-Domäne (PF 02229) und/oder eine PC4-Domäne (PF08766) umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22 bis 28, wobei die für ein KELP-Polypeptid codierende Nukleinsäure für eines der in Tabelle A2 aufgelisteten Polypeptide codiert oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure oder eine zum Hybridisieren mit einer solchen Nukleinsäure fähige Nukleinsäure ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22 bis 29, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle A2 angegebenen Polypeptide codiert.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22 bis 30, wobei die für ein KELP-Polypeptid codierende Nukleinsäure pflanzlichen Ursprungs ist, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, besonders bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, noch mehr bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, ganz besonders bevorzugt aus Arabidopsis thaliana.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22 bis 31, wobei die Nukleinsäure für das Polypeptid gemäß SEQ ID NR: 65 codiert.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22 bis 32, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem konstitutiven Promotor mittlerer Stärke, vorzugsweise mit einem Promotor aus einer Pflanze, besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
Pflanze, Pflanzenteil davon, einschließlich Samen, oder Pflanzenzelle, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22 bis 33, wobei diese Pflanze, dieser Pflanzenteil bzw. diese Pflanzenzelle eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die für ein wie in einem der Ansprüche 22 und 27 bis 32 definiertes KELP-Polypeptid codiert.
Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure, die für ein KELP codiert, wie in einem der Ansprüche 22 und 27 bis 32 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (i) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
Konstrukt gemäß Anspruch 35, wobei es sich bei einer der Steuerungssequenzen um einen konstitutiven Promotor, vorzugsweise einen konstitutiven Promotor mittlerer Stärke, vorzugsweise einen Promotor aus einer Pflanze, besonders bevorzugt einen GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt einen GOS2-Promotor aus Reis, handelt.
Verwendung eines Konstrukts gemäß Anspruch 35 oder 36 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, vorzugsweise einem erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen und besonders bevorzugt einem erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Anspruch 34 oder 36 transformiert ist.
Verfahren zum Herstellen einer transgenen Pflanze mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vorzugsweise einem erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen und besonders bevorzugt einem erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welches Folgendes umfasst: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein KELP-Polypeptid codiert, wie in einem der Ansprüche 22 und 27 bis 32 definiert, in einer Pflanzenzelle oder Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle bzw. der Pflanze unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
Transgene Pflanze mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vorzugsweise einem erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen und besonders bevorzugt einem erhöhten Samenertrag, herrührend von einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein KELP-Polypeptid codiert, wie in einem der Ansprüche 22 und 27 bis 32 definiert, oder eine von dieser transgenen Pflanze abgeleitete transgene Pflanzenzelle.
Transgene Pflanze gemäß Anspruch 34, 38 oder 40, oder eine davon abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze wie Rübe, Zuckerrübe oder Luzerne oder eine Monokotyle wie Zuckerrohr oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff, Milo und Hafer ist.
Erntbare Teile einer Pflanze gemäß einem der Ansprüche 34, 38, 40 und 41, wobei die erntbaren Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
Produkte, die aus einer Pflanze gemäß einem der Ansprüche 34, 38, 40 und 41 und/oder aus erntbaren Teilen einer Pflanze gemäß Anspruch 42 abgeleitet sind.
Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein KELP-Polypeptid codiert, wie in einem der Ansprüche 22 und 27 bis 32 definiert, zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vorzugsweise zum Erhöhen des Ertrags in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, und besonders bevorzugt zum Erhöhen des Samenertrags in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.