DE112008001730T5 - Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

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Abstract

Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure moduliert, die ein ertragsverbesserndes Polypeptid kodiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Folgendem besteht:
– bHLH6-ähnlichem (basisches Helix-Loop-Helix 6-ähnlichem) Protein,
– einem GRP (wachstumsregulierenden Protein, engl. Growth Regulating Protein), wobei das GRP aus der folgenden Gruppe ausgewählt wird:
– einem RrmJ/FtsJ-Ribosomen-RNA-Methyltransferase-Polypeptid (RrmJ/FtsJ-Polypeptid)
– einem basischen Helix-Loop-Helix 4-(bHLH4-)Polypeptid
– einem Isopentenyltransferase-(IPT-)Polypeptid
– einem STO-(Salztoleranz-)Protein
– einem UGE-(UDP-Glucose 4-Epimerase- oder UDP-Gal 4-Epimerase-)Polypeptid.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und befasst sich mit einem Verfahren zur Verbesserung verschiedener Pflanzen-Ertragsmerkmale durch Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein ertragssteigerndes Polypeptid codiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
    • – bHLH6-ähnlichem (basischem Helix-Loop-Helix 6-ähnlichen) Protein,
    • – einem GRP (Growth Regulating Protein, wachstumregulierenden Protein), wobei das GRP ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
    • – einem RrmJ/FtsJ ribosomalen RNA-Methyltransferase-Polypeptid (RrmJ/FtsJ Polypeptid)
    • – einem basischen Helix-Loop-Helix 4 (bHLH4)-Polypeptid
    • – einem Isopentenyltransferase(IPT)-Polypeptid
    • – einem STO(Salztoleranz)-Protein
    • – einem UGE(UDP-Glucose-4-Epimerase oder UDP-Gal-4-Epimerase)-Polypeptid, in einer Pflanze.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Pflanzen mit modulierter Expression einer Nukleinsäure, die ein ertragssteigerndes Polypeptid kodiert, wobei die Pflanzen verbesserte Ertragsmerkmale im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • Da die Weltbevölkerung ständig zunimmt und immer weniger Kulturfläche für die Landwirtschaft verfügbar ist, muss die Forschung gezwungenermaßen die Effizienz der Landwirtschaft verbessern. Herkömmliche Maßnahmen für kulturpflanzen- und gartenbauliche Verbesserungen nutzen Selektionszüchtungstechniken, um Pflanzen mit wünschenswerten Eigenschaften zu identifizieren. Diese Selektionszüchtungstechniken weisen jedoch mehrere Nachteile auf, nämlich, dass diese Techniken gewöhnlich arbeitsintensiv sind und Pflanzen ergeben, die häufig heterogene genetische Komponenten enthalten, die nicht immer dazu führen, dass das wünschenswerte Merkmal von den Elternpflanzen weiter vererbt wird. Durch Fortschritte in der Molekularbiologie ist es der Menschheit nun möglich, das Protoplasma von Tieren und Pflanzen zu modifizieren. Die pflanzliche Gentechnik beinhaltet die Isolation und Manipulation von genetischem Material (gewöhnlich in Form von DNA oder RNA) und die anschließende Einführung von diesem genetischen Material in eine Pflanze. Mit dieser Technologie kann man Kulturpflanzen oder Pflanzen mit verschiedenen verbesserten wirtschaftlichen, agronomischen oder gartenbaulichen Merkmalen produzieren.
  • Ein Merkmal von besonderem wirtschaftlichem Interesse ist erhöhter Ertrag. Ertrag wird normalerweise als messbares Kulturpflanzenprodukt mit wirtschaftlichem Wert definiert. Dies kann bezüglich Quantität und/oder Qualität definiert werden. Der Ertrag hängt direkt von verschiedenen Faktoren ab, wie zum Beispiel Anzahl und Größe der Organe, der Pflanzenarchitektur (zum Beispiel die Anzahl an Verzweigungen), der Samenproduktion, der Blattalterung und anderen. Weitere wichtige Faktoren, die den Ertrag bestimmen, sind Wurzelentwicklung, Nährstoffaufnahme, Stresstoleranz und Jungpflanzenvitalität. Eine Optimierung der oben genannten Faktoren kann daher zur Erhöhung des Kulturpflanzenertrags beitragen.
  • Der Samenertrag ist deshalb ein besonders wichtiges Merkmal, weil die Samen vieler Pflanzen für die menschliche und tierische Ernährung wichtig sind. Kulturpflanzen wie Mais, Reis, Weizen, Canola-Raps und Sojabohne machen mehr als die Hälfte der Gesamtkalorienaufnahme des Menschen aus, und zwar entweder durch direkten Verzehr der Samen selbst oder durch den Verzehr von Fleischprodukten, die mit verarbeiteten Samen erzeugt wurden. Sie bilden weiterhin eine Quelle für Zucker, Öle und viele Arten von Stoffwechselprodukten, die in industriellen Verfahren eingesetzt werden. Samen enthalten einen Embryo (den Ursprung für neue Sprosse und Wurzeln) und ein Endosperm (die Nährstoffquelle für das Embryowachstum während der Keimung und des frühen Wachstums der Keimlinge). An der Entwicklung eines Samens sind viele Gene beteiligt; sie erfordert den Transfer von Stoffwechselprodukten von den Wurzeln, Blättern und Stängeln in den wachsenden Samen. Insbesondere das Endosperm assimiliert die Stoffwechselvorstufen von Kohlenhydraten, Ölen und Proteinen und synthetisiert daraus Speichermakromoleküle, die das Korn ausfüllen.
  • Ein weiteres interessantes Merkmal ist die Blühzeit einer Pflanze. Die Lebenszeit einer Pflanze kann in Phasen unterteilt werden, wie Keimung, vegetatives Wachstum, reproduktives Wachstum und Seneszenz. Die Blühzeit ist diejenige Zeit, die zwischen dem Säen und dem Beginn des reproduktiven Wachstums vergeht. Sie ist ein entscheidender Moment im Leben einer Pflanze, die den Übergang vom vegetativen zum reproduktiven Wachstum bestimmt, der in einigen Pflanzen mit dem Beginn der Seneszenz zusammenfällt. Bei vielen Pflanzen ist dies der Zeitpunkt, bei dem das apikale Sprossmeristem die Blattbildung einstellt und die Blütenbildung beginnt, was eine große Auswirkung auf die Morphogenese hat, die beispielsweise die Anzahl der gebildeten Organe und die Gesamtgröße und Form der Pflanze beeinflusst. Die Blühzeit beeinflusst auch andere Ertragsmerkmale in Pflanzen. Eine frühblühende Sorte zeigte eine geringere Verzweigung oder Ausläuferbildung und ist daher weniger buschig. Solche Eigenschaften können für den Landwirt beispielsweise insofern vorteilhaft sein, als sie beispielsweise die Bestandsführung erleichtern. Ein verzögertes Blühen kann hingegen Pflanzen mit mehr vegetativen Organen ergeben, beispielsweise mehr Blättern, was bei vielen Kulturpflanzen ein wünschenswertes Merkmal ist, insbesondere bei Kulturpflanzen, bei denen vegetative Organe geerntet werden, wie Salat. Die relative Dauer der vegetativen und reproduktiven Phase einer Pflanze beeinflusst direkt ihren Samenertrag. Bei einigen Pflanzen ist die Steuerung der Blühzeit ein Mechanismus, mit dem man die negative Auswirkung von Stressfaktoren, wie Trockenheit, umgeht. Die Blühzeit kann auch die Qualitätsmerkmale der Kulturpflanzen beeinflussen, wie beispielsweise die Kräuterqualität bei Weidefutterpflanzen, wo eine Verzögerung der Blüte zu einer höheren Verdaulichkeit führt. Die Blühzeit beeinflusst die Länge der Kultivierungssaison. Die Modifizierung der Blühzeit einer Kulturpflanze kann möglicherweise das geographische Kultivierungsgebiet erweitern und somit die Anbaufläche vergrößern. Es lassen sich auch Pflanzen erhalten, die in einer bestimmten Umgebung für die Landwirtschaft zugänglicher sind, beispielsweise ermöglicht eine frühe Blüte ein spätes Einpflanzen in Gebieten, in denen die Bestandsentwicklung durch negative Temperaturen negativ behaftet ist, oder ermöglicht eine frühe Ernte, so dass biotischer und abiotischer Druck am Ende der Saison verhindert wird, so dass sich der Ertrag der Kulturpflanze steigern lässt. Die Fähigkeit zur Steuerung der Blühzeit ist daher ein wichtiger Faktor bei vielen industriellen Anwendungen auf dem Gebiet der Landwirtschaft.
  • Ein weiteres wichtiges Merkmal für viele Pflanzen ist die Jungpflanzenvitalität. Die Verbesserung der Jungpflanzenvitalität ist eine wichtige Aufgabe bei modernen Reiszüchtungsprogrammen bei gemäßigten sowie tropischen Reis-Kultivaren. Lange Wurzeln sind für eine korrekte Boden-Verankerung in wassergesetztem Reis wichtig. Wird Reis direkt auf geflutete Felder gesät, und müssen die Pflanzen rasch durch das Wasser auftauchen, sind längere Stängel mit Wüchsigkeit gepaart. Bei der Ausführung von Drill- bzw. Reihensaat sind längere Mesokotyle und Koleoptile wichtig für ein gutes Auflaufen des Keimlings. Die Fähigkeit zu gentechnischen Einbringung von Jungpflanzenvitalität in Pflanzen ist in der Landwirtschaft von großer Bedeutung. Eine schlechte Jungpflanzenvitalität war beispielsweise eine Einschränkung bei der Einführung von Mais(Zea mays L.)-Hybriden auf der Basis von dem im Maisgürtel vorherrschenden Protoplasma im Europäischen Atlantik.
  • Ein weiteres wichtiges Merkmal ist die verbesserte abiotische Stresstoleranz. Abiotischer Stress ist eine Hauptursache für weltweite Ernteverluste und reduziert die durchschnittlichen Erträge bei den meisten Hauptkulturpflanzenarten um mehr als 50% (Wang et al., Planta (2003), 218: 1–14). Abiotischer Stress kann durch Trockenheit, Versalzung, Temperaturextrema, chemische Toxizität und aus 59348: Überschuss oder Fehlen von Nährstoffen (Makroelementen und/oder Mikroelementen), Strahlung und oxidativen Stress verursacht werden. Die Fähigkeit, die Pflanzentoleranz gegenüber abiotischen Stress zu verbessern, wäre weltweit von großem wirtschaftlichem Vorteil für die Landwirte und würde den Anbau von Kulturpflanzen unter ungünstigen Bedingungen und in Gebieten, wo ein Anbau von Kulturpflanzen sonst nicht möglich wäre, gestatten.
  • Der Kulturpflanzenertrag kann somit durch Optimierung von einem der vorstehend genannten Faktoren gesteigert werden.
  • Je nach dem Endgebrauch kann die Modifikation bestimmter Ertragsmerkmale gegenüber anderen bevorzugt sein. Für Anwendungen wie Viehfutter- oder Holzproduktion oder für den Rohstoff Biokraftstoff kann eine Steigerung der vegetativen Pflanzenteile gewünscht sein, und für Anwendungen, wie die Mehl-, Stärke- oder Ölproduktion kann eine Steigerung der Samenparameter besonders gewünscht sein. Sogar unter den Samenparametern können je nach der Anwendung einige anderen gegenüber bevorzugt sein. Verschiedene Mechanismen können zur Steigerung des Samenertrags beitragen, und zwar in der Form einer erhöhten Samengröße oder einer gesteigerten Samenanzahl.
  • Ein Ansatz zur Steigerung des Ertrags (Samenertrag und/oder Biomasse) in Pflanzen kann über die Modifikation interner Wachstumsmechanismen einer Pflanze erfolgen, wie Zellzyklus oder verschiedene Signalwege, die an dem Pflanzenwachstum oder Verteidigungsmechanismen beteiligt sind.
  • Es wurde jetzt entdeckt, dass verschiedene Ertragsmerkmale in Pflanzen gesteigert werden können, durch Modulation der Expression in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, die ein ertragssteigerndes Polypeptid codiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus
    • – bHLH6-ähnlichem (basischem Helix-Loop-Helix 6-ähnlichem) Protein,
    • – einem GRP (wachstumsregulierenden Protein), wobei das GRP ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
    • – einem RrmJ/FtsJ ribosomalen RNA-Methyltransferase-Polypeptid (RrmJ/FtsJ Polypeptid)
    • – einem basischen Helix-Loop-Helix 4 (bHLH4) Polypeptid
    • – einem Isopentenyltransferase(IPT)-Polypeptid
    • – einem STO(Salztoleranz)-Protein
    • – einem UGE(UDP-Glucose4-Epimerase oder UDP-Gal 4-Epimerase)-Polypeptid.
  • Stand der Technik
  • bHLH6-ähnliches (basisches Helix-Loop-Helix 6-ähnliches) Protein
  • Transkriptionsfaktoren werden gewöhnlich als Proteine definiert, die eine sequenzspezifische DNA-Bindung zeigen, und die die Transkription aktivieren und/oder reprimieren können. Die Familie der basischen Helix-Loop-Helix-Transkriptionsfaktoren ist eine der größten Familien der Transkriptionsfaktoren, die in Arabidopsis thaliana (Toledo-Ortiz et al., Plant Cell 15, 1749–1770, 2003; Bailey et al., Plant Cell 15, 2497–2501, 2003) und in Reis (Li et al Plant Physiol. 141, 1167–1184, 2006) charakterisiert wurde. Die unterscheidende Eigenschaft der bHLH-Transkriptionsfaktor-Famile ist die Anwesenheit einer zweiteiligen Domäne, die aus etwa 60 Aminosäuren besteht. Diese zweiteilige Domäne umfasst eine DNA-bindende basische Region, die an eine Konsensus-Hexanucleotid-E-box bindet, und zwei α-Helices, die durch eine variable Loop-Region getrennt ist, die sich C-terminal von der basischen Domäne befindet. Die beiden α-Helices fördern die Dimerisierung, was die Bildung von Homo- und Heterodimeren zwischen verschiedenen Familienmitgliedern ermöglicht. Die bHLH-Domäne ist zwar evolutionär konserviert, jedoch gibt es nur eine geringe Sequenzähnlichkeit zwischen den Stämmen außerhalb der Domäne. Li et al. (2006) klassifizieren die bHLH-Transkriptionsfaktoren von Reis und Arabidopsis auf der Basis der Sequenz der bHLH-Domänen in 22 Subfamilien.
  • AtbHLH6 (AtMYC2) ist ein a 68 kDa MYC-bezogener Transkriptionsaktivator mit einer bHLH DNA-Bindungsdomäne (Abe et al, Plant Cell 9, 1859–1868, 1997). Er wird durch Dehydratisierungsstress und bei Behandlung mit Abszisinsäure (ABA) induziert. AtMYC2 erkennt eine MYC-Erkennungsstelle in dem Promotor des rd22 Gens, einem ABA empfindlichen Protein ohne ABRE-Element in dem Promotor. Pflanzen, die AtMYC2 überexprimieren, sind gegenüber ABA empfindlicher, mit einer gesteigerten ABA-induzierten Genexpression, wohingegen eine Insertionsmutante den entgegengesetzten Effekt zeigte (reduzierte ABA-Empfindlichkeit and verringerte ABA-induzierte Genexpression); zudem waren AtMYC2-überexprimierende Pflanzen gegenüber osmotischem Stress resistenter (Abe et al., Plant Cell 15, 63–78, 2003). Pflanzen, die AtMYC2 überexprimieren, zeigten nachgewiesenermaßen keine morphologischen Änderungen, verglichen mit Wildtyp-Pflanzen und auch die Zellform in Blättern war nicht betroffen. Es wurde darüber hinaus gezeigt, dass AtMYC2 an Pathogen- und Wundenreaktionen; an Tryptophan und von Tryptophanhergeleitetem Sekundärstoffwechsel sowie an der Toleranz gegen Methylviologen (Paraquat) (Dombrecht et al., Plant Cell 19, 2225–2245, 2007) beteiligt ist.
  • STO(Salztoleranz)-Protein
  • STO-Protein, Salztoleranz-Protein, wurde erstmals aus Arabidopsis thaliana identifiziert in einer Untersuchung auf Gene, die eine defekte Salzreaktion in einer Calcienurin-Mutante in Hefe unterdrücken (Lippuner et al. 1996). Verfahren zur Verleihung von Salztoleranz in einer Pflanze durch Expression von Arabidopsis STO wurden vorher offenbart ( US 5,859,337 ; Nagaoka und Takano 2003, J. Exp. Bot. 54, 391–396).
  • Strukturell wird STO durch die Anwesenheit einer bestens bekannten Domäne, der sogenannten B-Box-Domäne charakterisiert, in der die Struktur CX2CX16CX2C konserviert ist. Die B-Box-Domäne ist eine gemischte Domäne, die sich in den Proteinen archaebakteriellen, prokaryotischen und eukaryotischen Ursprungs befindet. Sie befindet sich im Wesentlichen in Transkriptionsfaktoren, Ribonukleoproteinen und Protoonkoproteinen. Die B-Box-Domäne in STO ähnelt strukturell derjenigen in dem Arabidopsis thaliana Protein CONSTANS, einem Transkriptionsfaktor, der an der Repression der Blühzeit beteiligt ist. STO und CONSTANs gehören jedoch zu verschiedenen Proteinfamilien, wobei CONSTANS zusätzlich zur B-Box durch das Vorliegen einer pflanzenspezifischen konservierten Domäne gekennzeichnet ist, der sogenannten CCT-Box, wohingegen in der STO-Proteinfamilie nur die B-Box vorhanden ist (Griffiths et al. 2003, Plant Phys, 131, 1855–1867; Lagercrants et al. 2000 Mol. Biol. Evol. 17, 1499–1507).
  • Die biologische Funktion von STO in Arabidopsis wurden mittels Zunahme und Verlust von Funktionsmutanten untersucht (Indorf, et al. 2007, Plant J. 51 (4): 563–74.). Die aus diesen Untersuchungen hervorgehenden Daten schlugen eine Rolle von STO an der Lichtsignalisierung vor, wohingegen es erwähnt wurde, dass STO als negativer Regulator bei der Phytochrom- und Blaulichtsignalisierung beteiligt ist. Diese Untersuchungen zielten auf das Verständnis der Rolle von STO bei Salzstress und Lichtreaktion.
  • UGE (UDP-Glucose-4-Epimerase oder UDP-Gal-4-Epimerase)-Polypeptid
  • Die Biosynthese von Kohlenhydraten in Pflanzen erfordert spezifische Glycosyltransferasen, die auf aktivierte Zucker wirken, gewöhnlich Uridin-(UDP), Adenosin- oder Guanosindiphosphathexosen und -pentosen. Nucleotidzucker sind an ihren Glycosyleinheiten durch Nucleotidzuckerinterkonversionsenzyme modifiziert, so dass verschiedene Zucker erhalten werden, die die Zwischenprodukte bei der Aufnahme der freien Zucker sind, die beim Abbau von Nähr- oder Speicher-Kohlenhydraten und anderen Quellen freigesetzt werden. Eines der am besten charakterisierten Zuckerinterkonversionsenzyme ist UGE (EC.5.1.3.2 gemäß der Enzym-Nomenklatur der IUBMB – International Union of Biochemistry and Molecular Biology).
  • UGE, UDP-Glucose-4-Epimerase oder UDP-Gal-4-Epimerase (EC.5.1.3.2) katalysiert die Interkonversion von UDP-Glucose und UDP-Galactose. Verschiedene Konzentrationen des Cofaktors NAD+/NADH (Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid -oxidiert/reduziert-) können zur unterschiedlichen Stimulation der Reaktion führen. Röntgenkristallographie und anderen Untersuchungen zufolge sind UGEs dimer, jedoch wurden auch aktive Monomere und höhere Polymere unter bestimmten experimentellen Bedingungen beschrieben (Thoden et al. 2005 J. Biol. Chem 280, 21900–21907).
  • UGE ist für die de novo Biosynthesis von UDP-Gal, einer Vorstufe für die Biosynthese vieler verschiedener Kohlenhydrate, Glycolipide und Glycoside, wichtig. UGE ist ebenfalls für die katabolische Aufnahme von Galactose in den zentralen Stoffwechsel erforderlich, und daher verschlimmert ein UGE-Mangel die Galactosetoxizität in Pflanzen (Dormann und Benning, 1998; Plant J. 13, 641–652) und in Hefe und bewirkt auch verschiedene Formen der Galactosämie beim Menschen.
  • UGE-Enzyme sind im Genom von Mikroorganismen sowie höheren Organismen codiert. In der Modellpflanze Arabidopsis thaliana wurden 5 verschiedene paraloge Gene identifiziert, die UGE-Isoformen codieren. Die Genome von Reis und Pappel codieren mindestens sieben vorhergesagte UGE-Isoformen.
  • Die enzymatischen Eigenschaften und die genetische Rolle der UGE-Isoformen wurden in Arabidopsis thaliana in biochemischen Untersuchungen sowie durch Charakterisierung von Zunahme und Verlust von Funktionsmutanten untersucht. Alle 5 Arabidopsis UGEs sind in ähnlichen Temperaturbereichen (30–40°C) und pH-Wert-Bereichen (PH7–PH9) enzymatisch aktiv. Homo- und Heterodimere können zwischen den UGE-Isoformen gebildet werden. Die fünf Isoformen sind in vivo funktionell und können den Verlust von Funktion in der Hefe GAL10-Mutante, der die UGE-Funktion fehlt, komplementieren. Letztere spiegelt die funktionelle Konservierung der UGE-Enzymaktivitäten zwischen UGEs von Mikroorganismen und höheren Pflanzen wider (Barber et al. 2006; JBC 281, 17276–17285). In Arabidopsis werden die 5 paralogen Gene, die die UGEs codieren, vorzugsweise in den Wurzeln exprimiert. Mutationen oder der Verlust der UGE-Funktion führen im Allgemeinen zu Wachstumsdefekten der vegetativen Organe, und die Blüten sind kleiner und anormal geformt. Überrachenderweise war die Blütenzahl und Position nicht verändert, obschon Sterilität beobachtet wurde (Rosti et al. 2007; The Plant Cell 19, 1565–1579). Gemäß der UGE-Aktivität war der Galactosegehalt der Zellwand verändert. Das US-Patent 6,992,236 offenbart aus Pflanzen stammende UGE-Gene und lehrt Verfahren zur ihrer Expression in Pflanzen, so dass der Kohlenhydrat-Stoffwechsel in Pflanzen modifiziert werden kann.
  • Zusammenfassung
  • Es wurde überraschend entdeckt, dass die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein ertragssteigerndes Polypeptid codiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus
    • – bHLH6-ähnlichem (basischem Helix-Loop-Helix 6-ähnlichem) Protein,
    • – einem GRP (wachstumsregulierenden Protein), wobei das GRP ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
    • – einem RrmJ/FtsJ ribosomalen RNA-Methyltransferase-Polypeptid (RrmJ/FtsJ Polypeptid)
    • – einem basischen Helix-Loop-Helix 4 (bHLH4) Polypeptid
    • – einem Isopentenyltransferase(IPT)-Polypeptid
    • – einem STO(Salztoleranz)-Protein
    • – einem UGE(UDP-Glucose-4-Epimerase oder UDP-Gal-4-Epimerase)-Polypeptid. Pflanzen verbesserte Ertragsmerkmale verglichen mit Kontrollpflanzen verleiht.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale einer Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die verbesserten Ertragsmerkmale umfassen einen gesteigerten Ertrag und eine gesteigerte Auflaufvitalität.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale einer Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend die Modulation der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid codiert, in einer Pflanze, wobei das GRP-Polypeptid ein RrmJ/FtsJ ribosomales RNA-Methyltransferase-Polypeptid (RrmJ/FtsJ Polypeptid) ist. Die verbesserten Ertragsmerkmale umfassen gesteigerten Samenertrag, gesteigerte Anzahl gefüllter Samen, gesteigerte Samenfüllrate und gesteigerter Harvest-Index.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale einer Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend die Modulation (Vorzugsweise Steigerung) der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid codiert, in einer Pflanze, wobei das GRP-Polypeptid ein basisches Helix-Loop-Helix 4 (bHLH4) Polypeptid ist. Die verbesserten Ertragsmerkmale umfassen vorzugsweise verbesserte Samenertragsmerkmale, umfassend ein oder mehrere von Jungpflanzenvitalität, gesteigerter Greenness-Index, gesteigerter Gesamtsamenertrag pro Pflanze, gesteigerte Anzahl gefüllter Samen, gesteigerte Samenfüllrate, gesteigerte, und gesteigerter Harvest index.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale einer Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend die Modulation (vorzugsweise Steigerung) der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid codiert, in einer Pflanze, wobei das GRP-Polypeptid ein Isopentenyltransferase (IPT)-Polypeptid ist. Die verbesserten Ertragsmerkmale sind eine oder mehrere von: gesteigerter Gesamtsamenertrag pro Pflanze, gesteigerte Anzahl gefüllter Samen, gesteigerte Gesamtanzahl der Samen und gesteigerter Harvest index.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale bei Pflanzen, insbesondere die Steigerung der Jungpflanzenvitalität und die Veränderung der Blühzeit, insbesondere Verkürzung der Blühzeit, im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein STO-Polypeptid codiert, in einer Pflanze.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale bei Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, insbesondere gesteigertem Ertrag, bereitgestellt, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein UGE-Polypeptid codiert, in einer Pflanze.
  • Definitionen
  • Die Begriffe Verbessern und/oder Steigern und/oder verbesserte und/oder gesteigerte Pflanzenertragsmerkmale sollen hier das Verbessern und/oder Steigern und/oder verbesserte und/oder gesteigerte Pflanzenwachstumseigenschaften umfassen.
  • Polypeptid(e)/Protein(e)
  • Die Begriffe ”Polypeptid” und ”Protein” werden im vorliegenden Text austauschbar eingesetzt und beziehen sich auf Aminosäuren in polymerer Form mit beliebiger Länge, welche über Peptidbindungen miteinander verbunden sind.
  • Polynukleotid(e)/Nukleinsäure(n)/Nukleinsäuresequenz(en)/Nukleotidsequenz(en)
  • Die Begriffe ”Polynukleotid(e)”, ”Nukleinsäuresequenz(en)”, ”Nukleotidsequenz(en)”, ”Nukleinsäure(n)”, ”Nukleinsäuremolekül” werden im vorliegenden Text austauschbar eingesetzt und beziehen sich auf Nukleotide, und zwar entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide oder eine Kombination davon, in einer polymeren unverzweigten Form mit einer beliebigen Länge.
  • Kontrollpflanze(n)
  • Die Wahl von geeigneten Kontrollpflanzen ist ein Routinebestandteil eines Versuchsaufbaus und kann entsprechende Wildtyppflanzen oder entsprechende Pflanzen ohne das interessierende Gen beinhalten. Gewöhnlich gehört die Kontrollpflanze zur selben Pflanzenart oder sogar derselben Sorte wie die zu beurteilende Pflanze. Bei der Kontrollpflanze kann es sich auch um eine Nullizygote der zu beurteilenden Pflanze handeln. Nullizygoten sind Individuen, denen das Transgen aufgrund von Segregation fehlt. Eine ”Kontrollpflanze” steht im vorliegenden Zusammenhang nicht nur für ganze Pflanzen, sondern auch Pflanzenteile, darunter Samen und Samenteile.
  • Homologon/Homologa
  • ”Homologa” eines Proteins umfassen Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, Proteine und Enzyme mit Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen im Vergleich zu dem jeweiligen nichtmodifizierten Protein, sie weisen eine ähnliche biologische und funktionelle Aktivität wie das nichtmodifizierte Protein, von dem sie abstammen, auf.
  • Eine Deletion bezieht sich auf die Entfernung von einer oder mehreren Aminosäuren aus einem Protein.
  • Eine Insertion bezieht sich auf einen oder mehrere Aminosäurereste, die in eine vorbestimmte Stelle in ein Protein eingeführt werden. Insertionen können N-terminale und/oder C-terminale Fusionen sowie Insertionen von einzelnen oder multiplen Aminosäuren in eine Sequenz hinein umfassen. Im Allgemeinen sind Insertionen innerhalb der Aminosäuresequenz kleiner als N- oder C-terminale Fusionen, und zwar in einer Größenordnung von ungefähr 1 bis 10 Resten. Zu Beispielen für N- oder C-terminale Fusionsproteine oder -peptide gehören die Bindungsdomäne oder Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsaktivators, wie er im Hefe-Zwei-Hybrid-System verwendet wird, Phagen-Hüllproteine, (Histidin)-6-Tag, Glutathion-S-Transferase-Tag, Protein A, Maltose-Bindungsprotein, Dihydrofolatreduktase, Tag·100-Epitop, c-myc-Epitop, FLAG®-Epitop, lacZ, CMP (Calmodulin-bindendes Peptid), HA-Epitop, Protein-C-Epitop und VSV-Epitop.
  • Eine Substitution bezieht sich auf den Austausch von Aminosäuren des Proteins durch andere Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (wie ähnlicher Hydrophobie, Hydrophilie, Antigenität, Neigung zur Bildung oder zum Bruch von α-Helixstrukturen oder β-Faltblattstrukturen). Aminosäuresubstitutionen sind typischerweise solche von einzelnen Resten, sie können jedoch je nach den funktionellen Zwängen, die dem Polypeptid auferlegt werden, in Form von Clustern vorliegen; Insertionen liegen üblicherweise in der Größenordnung von ungefähr 1 bis 10 Aminosäureresten vor. Bei den Aminosäuresubstitutionen handelt es sich vorzugsweise um konservative Aminosäuresubstitutionen. Konservative Substitutionstabellen sind dem Fachmann bestens bekannt (siehe zum Beispiel Creighton (1984), Proteins. W. H. Freeman and Company (Hrsg.) und Tabelle 1 unten). Tabelle 1: Beispiele für konservierte Aminosäuresubstitutionen
    Rest konservative Substitutionen Rest konservative Substitutionen
    Ala Ser Leu Ile; Val
    Arg Lys Lys Arg; Gln
    Asn Gln; His Met Leu; Ile
    Asp Glu Phe Met; Leu; Tyr
    Gln Asn Ser Thr; Gly
    Cys Ser Thr Ser; Val
    Glu Asp Trp Tyr
    Gly Pro Tyr Trp; Phe
    His Asn; Gln Val Ile; Leu
    Ile Leu, Val
  • Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen lassen sich leicht mit Hilfe von dem Fachmann bekannten Peptidsynthese-Techniken, wie Festphasen-Peptidsynthese und dergleichen, oder durch rekombinante DNA-Manipulation, herstellen. Verfahren für die Manipulation von DNA-Sequenzen zur Herstellung von Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten eines Proteins sind im Stand der Technik bestens bekannt. So kennt der Fachmann zum Beispiel Techniken zur Herstellung von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in DNA; wozu M13-Mutagenese, T7-Gen-in-vitro-Mutagenese (USB, Cleveland, OH), QuickChange ortsgerichtete Mutagenese (Stratagene, San Diego, CA), PCR-vermittelte ortsgerichtete Mutagenese oder andere Protokolle für die ortsgerichtete Mutagenese gehören.
  • Derivate
  • ”Derivate” beinhalten Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, die im Vergleich zu der Aminosäuresequenz der natürlich vorkommenden Form des Proteins, wie das interessierende Protein, Substitutionen von Aminosäuren durch nicht natürlich vorkommende Aminosäurereste oder Additionen von nicht natürlich vorkommenden Aminosäureresten umfassen. ”Derivate” eines Proteins umfassen auch Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, die natürlich vorkommende veränderte (glykosylierte, acylierte, prenylierte, phosphorylierte, myristoylierte, sulfatierte usw.) oder nicht natürlich veränderte Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden Form des Polypeptids umfassen. Ein Derivat kann auch eine(n) oder mehrere Nicht-Aminosäure-Substituenten oder Additionen im Vergleich zu der Aminosäuresequenz, von der es abstammt, umfassen, zum Beispiel ein Reportermolekül oder einen anderen Liganden, das bzw. der kovalent oder nichtkovalent an die Aminosäuresequenz gebunden ist, wie ein Reportermolekül, das gebunden ist, damit es leichter nachgewiesen werden kann, und nicht natürlich vorkommende Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Proteins. ”Derivate” umfassen darüber hinaus auch Fusionen der natürlich vorkommenden Form des Proteins mit Tagging-Peptiden, wie FLAG, HIS6 oder Thioredoxin (für einen Überblick über Tagging-Peptide, siehe Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523–533, 2003).
  • Ortholog(a)/Paralog(a)
  • Orthologa und Paraloga umfassen Evolutionskonzepte, mit denen die Stammbeziehungen von Genen beschrieben werden. Paraloga sind Gene innerhalb derselben Art, die durch Duplikation eines Urgens entstanden sind, und Orthologa sind Gene von unterschiedlichen Organismen, die durch Artbildung entstanden sind, und die auch von einem gemeinsamen Urgen abstammen.
  • Domäne
  • Der Begriff ”Domäne” steht für einen Satz von Aminosäuren, die an spezifischen Positionen entlang eines Alignments von Sequenzen von evolutionsmäßig verwandten Proteinen konserviert sind. Während Aminosäuren an anderen Positionen zwischen Homologa variieren können, zeigen Aminosäuren, die an spezifischen Positionen stark konserviert sind, Aminosäuren an, die wahrscheinlich für die Struktur, Stabilität oder Funktion eines Proteins essentiell sind. Sie werden durch ihren hohen Konservierungsgrad in als Alignment dargestellten Sequenzen einer Familie von Proteinhomologa identifiziert und können als Identifikatoren verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein bestimmtes Polypeptid zu einer bereits identifizierten Polypeptidfamilie gehört.
  • Motiv/Konsensussequenz/Signatur
  • Der Begriff ”Motiv” oder ”Konsensussequenz” oder ”Signatur” steht für eine kurze konservierte Region in der Sequenz von evolutionsmäßig verwandten Proteinen. Bei Motiven handelt es sich häufig um hochkonservierte Teile von Domänen, sie können jedoch auch nur einen Teil der Domäne beinhalten oder außerhalb einer konservierten Domäne lokalisiert sein (wenn alle Aminosäuren des Motivs außerhalb einer definierten Domäne liegen).
  • Hybridisierung
  • Der Begriff ”Hybridisierung” ist wie hier definiert ein Vorgang, bei dem im Wesentlichen homologe komplementäre Nukleotidsequenzen Basenpaarungen eingehen. Der Hybridisierungsvorgang kann vollständig in Lösung stattfinden, d. h. beide komplementären Nukleinsäuren liegen in Lösung vor. Der Hybridisierungsvorgang kann auch stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren auf einer Matrix, wie magnetischen Perlen, Sepharose-Perlen oder einem anderen Harz immobilisiert ist. Der Hybridisierungsvorgang kann außerdem stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren an einen festen Träger, wie eine Nitrozellulose- oder Nylonmembran, immobilisiert ist oder mittels z. B. Photolithographie auf z. B. einen Quarzglasträger immobilisiert ist (wobei letzteres als Nukleinsäure-Arrays oder ”micorarrays” oder Nukleinsäure-Chips bekannt ist). Die Nukleinsäuremoleküle werden im Allgemeinen thermisch oder chemisch denaturiert, um einen Doppelstrang zu zwei Einzelsträngen aufzuschmelzen und/oder um ”hairpins” oder andere Sekundärstrukturen aus einzelsträngigen Nukleinsäuren zu entfernen, so dass die Hybridisierung stattfinden kann.
  • Der Begriff ”Stringenz” steht für diejenigen Bedingungen, unter denen eine Hybridisierung stattfindet. Die Stringenz der Hybridisierung wird durch Bedingungen, wie Temperatur, Salzkonzentration, Ionenstärke und Zusammensetzung des Hybridisierungspuffers beeinflusst. Im Allgemeinen werden niedrige Stringenzbedingungen so gewählt, dass sie ungefähr 30°C niedriger sind als die Schmelztemperatur (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert. Mittlere Stringenzbedingungen liegen dann vor, wenn die Temperatur 20°C unter Tm liegt, und hohe Stringenzbedingungen dann, wenn die Temperatur 10°C unter Tm liegt. Hochstringente Hybridisierungsbedingungen werden gewöhnlich zur Isolation von hybridisierenden Sequenzen, die eine hohe Sequenzähnlichkeit zur Zielnukleinsäuresequenz aufweisen, eingesetzt. Die Sequenzen der Nukleinsäuren können jedoch aufgrund der Degeneration des genetischen Codes voneinander abweichen, und dennoch kodieren die Nukleinsäuren ein im Wesentlichen identisches Polypeptid. Zum Identifizieren von solchen Nukleinsäuremolekülen können daher manchmal Hybridisierungsbedingungen mit mittlerer Stringenz erforderlich sein.
  • Bei dem Tm-Wert handelt es sich um diejenige Temperatur bei definierter Ionenstärke und definiertem pH-Wert, bei der 50% der Zielsequenz mit einer perfekt passenden Sonde hybridisiert. Der Tm-Wert hängt von den Lösungsbedingungen und der Basenzusammensetzung und der Länge der Sonde ab. Längere Sequenzen hybridisieren zum Beispiel spezifisch bei höheren Temperaturen. Die maximale Hybridisierungsrate wird bei etwa 16°C bis 32°C unter dem Tm-Wert erzielt. Das Vorliegen von einwertigen Kationen in der Hybridisierungslösung reduziert die elektrostatische Abstoßung zwischen den beiden Nukleinsäuresträngen und fördert so die Hybridbildung; dieser Effekt wird für Natriumkonzentrationen von bis zu 0,4 M beobachtet (bei höheren Konzentrationen kann dieser Effekt außer Acht gelassen werden). Formamid verringert die Schmelztemperatur von DNA-DNA- und DNA-RNA-Doppelsträngen mit 0,6 bis 0,7°C pro Prozent Formamid, und die Zugabe von 50% Formamid ermöglicht eine Hybridisierung bei 30 bis 45°C, obwohl die Hybridisierungsrate gesenkt wird. Basenpaar-Fehlpaarungen verringern die Hybridisierungsrate und die Hitzestabilität der Doppelstränge. Durchschnittlich, und für lange Sonden sinkt der Tm-Wert um ungefähr 1°C pro Prozent Basen-Fehlpaarung. Der Tm-Wert kann je nach der Art der Hybride mit den folgenden Gleichungen berechnet werden:
    • 1) DNA-DNA-Hybride (Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem., 138: 267–284, 1984): Tm = 81,5°C + 16,6 × log10[Na+]a + 0,41 × %[G/Cb] – 500 × [Lc]–1 – 0,61 × %Formamid
    • 2) DNA-RNA- oder RNA-RNA-Hybride: Tm = 79,8 + 18,5 (log10[Na+]a) + 0,58 (%G/Cb) + 11,8 (%G/Cb)2 – 820/Lc
    • 3) oligo-DNA- oder oligo-RNAd-Hybride: Für < 20 Nukleotide: Tm = 2 (In) Für 20–35 Nukleotide: Tm = 22 + 1,46 (In)
    a
    oder für ein anderes einwertiges Kation, jedoch nur im Bereich von 0,01–0,4 M genau.
    b
    nur für %GC im Bereich von 30% bis 75% genau.
    c
    L = Länge des Doppelstrangs in Basenpaaren.
    d
    oligo, Oligonukleotid; In, effektive Länge des Primers = 2 × (Anz. G/C) + (Anz. A/T).
  • Eine unspezifische Bindung kann dadurch bekämpft werden, dass man eine von mehreren bekannten Techniken einsetzt, wie zum Beispiel Blockieren der Membran mit proteinhaltigen Lösungen, Zusätze von heterologer RNA, DNA und SDS zum Hybridisierungspuffer und Behandlung mit RNase. Für nichthomologe Sonden können eine Reihe von Hybridisierungen durchgeführt werden, und zwar dadurch, dass man entweder (i) die Anlagerungstemperatur nach und nach senkt (zum Beispiel von 68°C auf 42°C) oder (ii) dass man die Formamidkonzentration nach und nach senkt (zum Beispiel von 50% auf 0%). Der Fachmann ist mit verschiedenen Parametern vertraut, die während der Hybridisierung verändert werden können und die die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
  • Neben den Hybridisierungsbedingungen hängt die Spezifität der Hybridisierung gewöhnlich auch von der Funktion der Waschvorgänge nach der Hybridisierung ab. Um einen Hintergrund, der durch unspezifische Hybridisierung entsteht, zu entfernen, werden die Proben mit verdünnten Salzlösungen gewaschen. Zu entscheidenden Faktoren solcher Waschvorgänge gehören die Ionenstärke und Temperatur der letzten Waschlösung: Je niedriger die Salzkonzentration und je höher die Waschtemperatur ist, desto höher ist die Stringenz des Waschvorgangs. Die Waschbedingungen werden gewöhnlich bei oder unter Hybridisierungsstringenz durchgeführt. Eine positive Hybridisierung ergibt ein Signal, das mindestens zweimal so stark wie der Hintergrund ist. Im Allgemeinen sind geeignete Stringenzbedingungen für Nukleinsäurehybridisierungs-Assays oder Genamplifizierungsnachweisverfahren wie oben dargestellt. Es können auch Bedingungen höherer oder niedrigerer Stringenz ausgewählt werden. Dem Fachmann sind die verschiedenen Parameter geläufig, die während des Waschens verändert werden können und die die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
  • Übliche hochstringente Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, umfassen zum Beispiel die Hybridisierung bei 65°C in 1 × SSC oder bei 42°C in 1 × SSC und 50% Formamid, wonach Waschen bei 65°C in 0,3 × SSC erfolgt. Beispiele für Hybridisierungsbedingungen mittlerer Stringenz für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, umfassen Hybridisierung bei 50°C in 4 × SSC oder bei 40°C in 6 × SSC und 50% Formamid, und anschließendes Waschen bei 50°C in 2 × SSC. Die Länge des Hybrids ist die erwartete Länge für die hybridisierende Nukleinsäure. Werden Nukleinsäuren mit einer bekannten Sequenz hybridisiert, kann die Hybridlänge dadurch bestimmt werden, dass man mit den Sequenzen ein Alignment durchführt und die darin beschriebenen konservierten Regionen identifiziert. 1 × SSC ist 0,15 M NaCl und 15 mM Natriumcitrat; die Hybridisierungslösung und die Waschlösungen können zusätzlich 5 × Denhardt-Reagens, 0,5–1,0% SDS, 100 μg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA und 0,5% Natriumpyrophosphat beinhalten.
  • Zur Bestimmung des Stringenzausmaßes kann Sambrook et al., (2001), Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laborstory Press, CSH, New York, oder Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989 und jährliche Neufassungen) herangezogen werden.
  • Spleißvariante
  • Der Begriff ”Spleißvariante”, wie er hier verwendet wird, umfasst Varianten einer Nukleinsäuresequenz, in der ausgewählte Introns und/oder Exons ausgeschnitten, ersetzt, versetzt oder zugefügt wurden, oder in der Introns verkürzt oder verlängert wurden. Bei solchen Varianten bleibt die biologische Aktivität des Proteins im Wesentlichen erhalten; dies lässt sich erzielen, indem man funktionelle Segmente des Proteins selektiv beibehält. Solche Spleißvarianten findet man in der Natur oder künstlich hergestellt. Verfahren zur Vorhersage und Isolation dieser Spleißvarianten sind im Stand der Technik bestens bekannt (siehe beispielsweise Foissac und Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25).
  • Allelvariante
  • Allele oder Allelvarianten sind alternative Formen eines bestimmten Gens, die sich an der gleichen Chromosomenposition befinden. Allelvarianten umfassen Einzelnukleotid-Polymorphismus (Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs)), sowie Kleine Insertions/Deletions-Polymorphismen (Small Insertion/Deletion Polymorphisms (INDELs)). Die Größe der INDELs ist gewöhnlich kleiner als 100 bp. SNPs und INDELs bilden den größten Satz an Sequenzvarianten in natürlich vorkommenden polymorphen Stämmen der meisten Organismen.
  • Genshuffling/gerichtete Evolution
  • Genshuffling oder gerichtete Evolution besteht aus iterativem DNA-Shuffling und anschließendem geeigneten Screening und/oder Selektieren, um Varianten von Nukleinsäuren oder Teilen davon zu erzeugen, die Proteine mit modifizierter biologischer Aktivität kodieren (Castle et al., (2004), Science 304 (5674): 1151–4; US-Patente 5,811,238 und 6,395,547 ).
  • Requlationselement/Kontrollsequenz/Promotor
  • Die Begriffe ”Regulationselement”, ”Kontrollsequenz” und ”Promotor” werden im vorliegenden Text jeweils austauschbar verwendet und sollen dahingehend breit interpretiert werden, dass sie regulatorische Nukleinsäuresequenzen bedeuten, die diejenigen Sequenzen, mit denen sie ligiert sind, exprimieren können. Der Begriff ”Promotor” bezieht sich gewöhnlich auf eine Nukleinsäurekontrollsequenz, die sich stromaufwärts vom Transkriptionsstart eines Gens befindet und die an der Erkennung und an der Bindung der RNA-Polymerase und anderer Proteine beteiligt ist, wodurch die Transkription einer funktionsfähig verknüpften Nukleinsäure gesteuert wird. Die oben genannten Begriffe umfassen auch Transkriptionsregulationssequenzen, die sich von einem klassischen eukaryontischen genomischen Gen ableiten (darunter auch die TATA-Box, die für eine präzise Initiation der Transkription erforderlich ist, mit oder ohne CCAAT-Box-Sequenz) sowie zusätzliche Regulationselemente (d. h. stromaufwärts aktivierende Sequenzen, Enhancer und Silencer), die die Genexpression auf Entwicklungsreize und/oder von außen wirkende Reize hin oder auf gewebespezifische Art und Weise verändern. Der Begriff beinhaltet auch eine Transkriptionsregulationssequenz eines klassischen prokaryontischen Gens, der in diesem Fall eine -35-Box-Sequenz und/oder -10-Box-Transkriptionsregulationssequenzen beinhaltet. Der Begriff ”Regulationselement” umfasst auch ein synthetisches Fusionsmolekül oder Derivat, das die Expression eines Nukleinsäuremoleküls in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ vermittelt, aktiviert oder verbessert.
  • Ein ”pflanzlicher Promotor” umfasst Regulationselemente, die die Expression eines kodierenden Sequenzabschnitts in pflanzlichen Zellen vermitteln. Ein pflanzlicher Promotor muss daher nicht pflanzlichen Ursprungs sein, sondern kann von Viren oder Mikroorganismen, zum Beispiel von Viren, die Pflanzenzellen angreifen, abstammen. Der ”pflanzliche Promotor” kann auch von einer Pflanzenzelle abstammen, z. B. von der Pflanze, die mit der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu exprimierenden und hier beschriebenen Nukleinsäuresequenz transformiert wird. Dies trifft auch auf andere ”pflanzliche” Regulationssignale, wie ”pflanzliche” Terminatoren zu. Die stromaufwärts der bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung geeigneten Nukleotidsequenzen gelegenen Promotor können durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitution(en), -insertion(en) und/oder -deletion(en) modifiziert werden, ohne dass die Funktionsfähigkeit oder Aktivität der Promotoren, des offenen Leserasters (ORF) oder der 3'-Regulationsregion wie Terminatoren oder anderen 3'-Regulationsregionen, die vom ORF beabstandet liegen, gestört wird. Weiterhin kann man auch die Aktivität der Promotoren durch Modifizieren ihrer Sequenz steigern oder sie vollständig durch aktivere Promotoren ersetzen, sogar durch Promotoren von heterologen Organismen. Für die Expression in Pflanzen muss das Nukleinsäuremolekül wie oben beschrieben funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein oder einen geeigneten Promotor umfassen, der das Gen zum richtigen Zeitpunkt und mit dem erforderlichen räumlichen Expressionsmuster exprimiert.
  • Zur Identifikation funktionell äquivalenter Promotoren kann die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster eines Kandidaten-Promotors analysiert werden, indem man den Promotor funktionsfähig mit einem Reporter-Gen verknüpft und das Expressionsausmaß und das Muster des Reportergens in verschiedenen Geweben der Pflanze untersucht. Geeignete bestens bekannte Reportergene umfassen beispielsweise Betaglucuronidase oder Betagalactosidase.
  • Die Promotor-Aktivität wird untersucht, indem man die Enzymaktivität der Betaglucuronidase oder Betagalactosidase misst. Die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster können dann mit der- bzw. demjenigen eines Referenz-Promotors verglichen werden (wie er beispielsweise in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird). Alternativ kann die Promotorstärke durch Quantifizieren der mRNA-Spiegel oder durch Vergleich der mRNA-Spiegel der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäure mit mRNA-Spiegeln von Housekeeping-Genen, wie 18S rRNA, untersucht werden, wobei Verfahren des Standes der Technik, wie Northern-Blotting mit densitometrischer Analyse der Autoradiogramme, quantitative Echtzeit-PCR oder RT-PCR verwendet werden (Neid et al., 1996 Genome Methods 6: 986–994). Ein ”schwacher Promotor” ist im Allgemeinen ein Promotor, der die Expression einer kodierenden Sequenz auf einem niedrigen Spiegel steuert.
  • ”Niedrige Spiegel” sind Spiegel von etwa 1/10000 Transkripten bis zu etwa 1/100000 Transkripte, bis etwa 1/500000 Transkripte pro Zelle. Ein ”starker Promotor” steuert die Expression einer kodierenden Sequenz dagegen auf hohem Spiegel, oder bei etwa 1/10 Transkripten bis etwa 1/100 Transkripten bis etwa 1/1000 Transkripten pro Zelle. Ein Beispiel für einen starken Promotor ist der 35S CaMV-Promotor.
  • Funktionsfähig verknüpft
  • Der Begriff ”funktionsfähig verknüpft” bedeutet im vorliegenden Zusammenhang eine funktionelle Verknüpfung zwischen der Promotorsequenz und dem interessierenden Gen, so dass die Promotorsequenz die Transkription des interessierenden Gens einleiten kann.
  • Konstitutiver Promotor
  • Ein ”konstitutiver Promotor” steht für einen Promotor, der während der meisten, jedoch nicht unbedingt allen, Wachstums- und Entwicklungsphasen und unter den meisten Umweltbedingungen in mindestens einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ transkriptionell aktiv ist. Beispiele für konstitutive Promotoren finden sich in Tabelle 2a unten. Tabelle 2a: Beispiele für konstitutive Promotoren
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  • Ubiquitärer Promotor
  • Ein ubiquitärer Promotor ist in im Wesentlichen allen Geweben oder Zellen eines Organismus aktiv.
  • Entwicklungsregulierter Promotor
  • Ein entwicklungsregulierter Promotor ist während gewisser Entwicklungsstadien oder in Teilen der Pflanze, bei denen entwicklungsrelevante Veränderungen auftreten, aktiv.
  • Induzierbarer Promotor
  • Ein induzierbarer Promotor weist eine induzierte oder erhöhte Transkriptionsinitiation auf einen chemischen Reiz (siehe Übersichtsartikel von Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89–108), einen Umweltreiz oder einen physikalischen Reiz hin auf, oder kann ”stressinduzierbar” sein, d. h. dann aktiviert werden, wenn eine Pflanze verschiedenen Stressbedingungen ausgesetzt ist, oder ”pathogen induzierbar”, d. h. wird dann aktiviert, wenn eine Pflanze verschiedenen Pathogenen ausgesetzt ist.
  • Organspezifischer/gewebespezifischer Promotor
  • Ein organspezifischer oder gewebespezifischer Promotor ist ein Promotor, der die Transkription bevorzugt in bestimmten Organen oder Geweben, wie den Blättern, Wurzeln, dem Samengewebe usw. initiieren kann. Ein ”wurzelspezifischer Promotor” ist beispielsweise ein Promotor, der in erster Linie in Pflanzenwurzeln transkriptionell aktiv ist, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch ”leaky”-Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist. Promotoren, die die Transkription nur in bestimmten Zellen initiieren können, werden im vorliegenden Text als ”zellspezifisch” bezeichnet.
  • Ein samenspezifischer Promotor ist vorwiegend in Samengewebe transkriptionell aktiv, aber nicht unbedingt ausschließlich in Samengewebe (in Fällen einer leaky Expression). Der samenspezifische Promotor kann während der Samenentwicklung und/oder während der Keimung aktiv sein. Aus 59392: Beispiele für samenspezifische Promotoren sind in Qing Qu und Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113–125, 2004) angegeben.
  • Aus 59348:
  • Der samenspezifische Promotor kann die Expression beispielsweise in einem oder mehreren Samengeweben antreiben, wie im Endosperm, Aleuron, Embryo. Beispiele für samenspezifische Promotoren sind in der nachstehenden Tabelle 2b gezeigt. Weitere Beispiele für samenspezifische Promotoren sind in Qing Qu und Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113–125, 2004) angegeben, deren Offenbarung hiermit durch Bezugnahme vollständig aufgenommen ist. Tabelle 2b: Beispiele für samenspezifische Promotoren
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    Mais B-Peru Selinger et al., Genetics 149; 1125–38, 1998
  • Ein für grünes Gewebe spezifischer Promotor wie im vorliegenden Text definiert ist ein Promotor, der vorwiegend in grünem Gewebe transkriptionell aktiv ist, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch ”leaky”-Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist. Aus 59392: Beispiele für Promotore, die für grünes Gewebe spezifisch sind, sind in Nomura et al., 2000 Plant Mol Biol. 44 (1): 99–106; WO 2004/070039 , angegeben.
  • Ein weiteres Beispiel für einen gewebespezifischen Promotor ist ein meristemspezifischer Promotor, der vorwiegend in Meristemgewebe transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch ”leaky”-Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist.
  • Terminator
  • Der Begriff ”Terminator” umfasst eine Kontrollsequenz, bei der es sich um eine DNA-Sequenz am Ende einer Transkriptionseinheit handelt, die die 3'-Prozessierung und Polyadenylierung eines primären Transkripts und die Transkriptionstermination signalisiert. Der Terminator kann von dem natürlichen Gen, von verschiedenen anderen pflanzlichen Genen oder von T-DNA abstammen. Der hinzuzufügende Terminator kann zum Beispiel vom Nopalinsynthasegen oder vom Octopinsynthasegen oder auch von einem anderen pflanzlichen Gen oder, was weniger bevorzugt ist, von einem beliebigen anderen eukaryontischen Gen abstammen.
  • Modulation
  • Der Begriff ”Modulation” steht in Bezug auf die Expression oder Genexpression für ein Verfahren, bei dem das Expressionsausmaß durch die Genexpression im Vergleich zu der Kontrollpflanze dahingehend geändert ist, dass das Expressionsausmaß erhöht oder gesenkt ist. Die ursprüngliche unmodulierte Expression kann eine Art Expression einer strukturellen RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA mit nachfolgender Translation sein. Der Begriff ”Modulation der Aktivität” bedeutet eine Änderung der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder der kodierten Proteine, die einen erhöhten Ertrag und/oder ein gesteigertes Wachstum der Pflanzen ergibt.
  • Expression
  • Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” steht für die Transkription eines spezifischen Gens oder spezifischer Gene oder eines spezifischen genetischen Konstrukts. Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” steht insbesondere für die Transkription eines Gens oder mehrerer Gene oder eines genetischen Konstrukts in strukturelle RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA mit oder ohne darauffolgende Translation des letzteren in ein Protein. Der Prozess beinhaltet die Transkription der DNA und die Prozessierung des resultierenden mRNA-Produkts.
  • Erhöhte Expression/Überexpression
  • Der Begriff ”erhöhte Expression” oder ”Überexpression”, wie es hier verwendet wird steht für eine beliebige Form von Expression, die über den Spiegel des ursprünglichen Wildtyp-Spiegel hinaus geht.
  • Verfahren zur Erhöhung der Expression von Genen oder Genprodukten sind im Stand der Technik gut dokumentiert und beinhalten beispielsweise die Überexpression, die durch geeignete Promotoren getrieben wird, die Verwendung von Transkriptions-Enhancern oder Translations-Enhancern. Isolierte Nukleinsäuren, die als Promotor- oder Enhancer-Elemente dienen, können in einer geeigneten Position (gewöhnlich stromaufwärts) einer nicht-heterologen Form eines Polynukleotids eingebracht werden, so dass die Expression einer Nukleinsäure, die das interessierende Polypeptid kodiert, aufwärtsreguliert wird. Endogene Promotoren können beispielsweise in vivo durch Mutation, Deletion und/oder Substitution verändert werden (siehe Kmiec, US 5,565,350 ; Zarling et al., WO9322443 ), oder isolierte Promotoren können in der korrekten Orientierung und im korrekten Abstand von einem erfindungsgemäßen Gen in eine Pflanzenzelle eingebracht werden, so dass die Expression des Gens gesteuert wird.
  • Ist eine Polypeptidexpression gewünscht, wird wünschenswerterweise eine Polyadenylierungsregion am 3'-Ende einer Polynukleotid-kodierenden Region aufgenommen. Die Polyadenylierungsregion kann von dem natürlichen Gen, von einer Anzahl anderer Pflanzengene oder von T-DNA hergeleitet sein. Die hinzuzufügende 3'-Endsequenz kann beispielsweise hergeleitet sein von Nopalinsynthase- oder Octopinsynthase-Genen oder alternativ von einem anderen Pflanzengen oder weniger bevorzugt von einem anderen eukaryotischen Gen
  • Eine Intronsequenz kann ebenfalls an der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder der kodierenden Sequenz der partiellen kodierenden Sequenz zugegeben werden, um die Menge der reifen Botschaft zu steigern, die sich im Cytosol ansammelt. Die Aufnahme eines spleißbaren Introns in die Transkriptionseinheit in Pflanzen- und Tier-Expressionskonstrukten steigert Befunden zufolge die Genexpression auf mRNA- und Protein-Ebenen bis zu 1000fach (Buchman and Berg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4395–4405; Callis et al. (1987) Genes Dev 1: 1183–1200). Eine solche Intron-Steigerung der Genexpression ist gewöhnlich am größten, wenn es sich nahe dem 5'-Ende der Transkriptionseinheit befindet. Die Verwendung der Mais-Introns Adh1-S-Intron 1, 2 und 6, das Bronze-1-Intron, sind im Stand der Technik bekannt. Für eine allgemeine Information siehe: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, N. Y. (1994).
  • Endogenes Gen
  • Eine Bezugnahme im vorliegenden Text auf ein ”endogenes” Gen betrifft nicht nur das fragliche Gen, wie es in einer Pflanze in seiner natürlichen Form gefunden wird (d. h. ohne dass ein menschlicher Eingriff vorliegt), sondern betrifft auch das gleiche Gen, (oder eine im Wesentlichen homologe Nukleinsäure bzw. Gen) in einer isolierten Form, das anschließend in eine Pflanze (wieder) eingebracht wird (ein Transgen). Eine transgene Pflanze, die ein solches Transgen enthält, kann beispielsweise eine wesentliche Reduktion der Transgenexpression und/oder eine wesentliche Reduktion der Expression des endogenen Gens erfahren. Das isolierte Gen kann aus einem Organismus isoliert werden oder von Menschenhand hergestellt werden, beispielsweise durch chemische Synthese.
  • Verringerte Expression
  • Eine Bezugnahme im vorliegenden Text auf ”verringerte Expression” oder ”Reduktion oder wesentliche Eliminierung” der Expression soll eine Abnahme der endogenen Genexpression und/oder der Polypeptid-Spiegel und/oder Polypeptid-Aktivität im Vergleich zu Kontrollpflanzen bedeuten. Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung ist in steigender Reihenfolge der Bevorzugung mindestens 10%, 20%, 30%, 40% oder 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, oder 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder noch mehr im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • Für eine optimale Leistung erfordern die Gensilencing-Techniken, die zur Reduktion der Expression in einer Pflanze eines endogenen Gens verwendet werden, die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen aus monokotylen Pflanzen zur Transformation monokotyler Pflanzen und aus dikotylen Pflanzen zur Transformation dikotyler Pflanzen. Vorzugsweise wird eine Nukleinsäuresequenz aus einer gegebenen Pflanzenart in die gleiche Pflanzenart eingebracht. Beispielsweise wird eine Nukleinsäuresequenz aus Reis in eine Reispflanze transformiert. Es ist jedoch kein absolutes Erfordernis, dass die einzubringende Nukleinsäuresequenz aus der gleichen Pflanzenart stammt wie die Pflanze, in die sie eingebracht wird. Es reicht, wenn eine wesentliche Homologie zwischen endogenem Zielgen und der einzubringenden Nukleinsäure vorliegt.
  • Aus 59391:
  • Für die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze ist eine hinreichende Länge der im Wesentlichen durchgehenden Nukleotide einer Nukleinsäuresequenz erforderlich. Zur Durchführung von Gensilencing können diese nur 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 oder weniger Nukleotide betragen (u. a. mit der 5'- und/oder 3'-UTR, und zwar entweder teilweise oder ganz). Der Bereich der im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotide kann von der Nukleinsäure, die das interessierende Protein (Zielgen) kodiert, oder von einer Nukleinsäure hergeleitet werden, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon des interessierenden Proteins kodieren kann. Der Bereich der im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotide kann Wasserstoffbrückenbindungen mit dem Zielgen eingehen (und zwar entweder mit dem Sense- oder Antisense-Strang), stärker bevorzugt hat der Bereich der im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotide in steigender Reihenfolge der Bevorzugung 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% Sequenzidentität zu dem Zielgen (entweder Sense- oder Antisense-Strang). Eine Nukleinsäuresequenz, die ein (funktionelles) Polypeptid kodiert, ist keine Anforderung für die verschiedenen hier erörterten Verfahren für die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens.
  • Diese Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression kann mit Routine-Werkzeugen und -Techniken erzielt werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Reduktion oder wesentlichen Eliminierung der endogenen Genexpression erfolgt durch Einbringen und Exprimieren eines Genkonstruktes, in das die Nukleinsäure (in diesem Fall ein Bereich von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen abstammen, oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von einem der interessierenden Proteine kodieren kann) als inverted Repeat (teilweise oder ganz), getrennt durch einen Spacer (nicht-kodierende DNA) kloniert wird, in einer Pflanze.
  • In einem solchen bevorzugten Verfahren wird die Expression des endogenen Gens reduziert oder im Wesentlichen eliminiert durch RNA-vermitteltes Silencing mit einem inverted Repeat einer Nukleinsäure oder einem Teil davon (in diesem Fall einem Bereich von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen hergeleitet sind, oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon des interessierenden Proteins kodieren kann), der vorzugsweise eine Hairpin-Struktur bilden kann. Der inverted repeat wird in einen Expressionsvektor kloniert, der Kontrollsequenzen umfasst. Eine nichtkodierende DNA-Nukleinsäuresequenz (ein Spacer, beispielsweise ein Fragment der Matrixbindungsregion (matrix attachment region fragment (MAR)), ein Intron, ein Polylinker, etc.) befindet sich zwischen den beiden invertierten Nukleinsäuren, die den inverted Repeat bilden. Nach der Transkription des inverted repeats wird eine chimäre RNA mit einer selbstkomplementären Struktur gebildet (teilweise oder vollständig). Diese doppelsträngige RNA-Struktur wird als Hairpin-RNA (hpRNA) bezeichnet. Die hpRNA wird durch die Pflanze in siRNAs prozessiert, die in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex eingebracht sind (RISC).
  • Der RISC spaltet zudem die mRNA-Transkripte, wodurch im Wesentlichen die Anzahl der mRNA-Transkripte in Polypeptide translatiert wird. Für weitere allgemeine Einzelheiten können beispielsweise Grierson et al. (1998) WO 98/53083 ; Waterhouse et al. (1999) WO 99/53050 ) herangezogen werden.
  • Die Leistungsfähigkeit der erfindungsgemäßen Verfahren beruht nicht auf der Einbringung und Expression eines Genkonstrukts, in das die Nukleinsäure als inverted Repeat kloniert wurde, in eine bzw. einer Pflanze, aber eine oder mehrere einiger bekannter ”Gen-Silencing”-Verfahren kann zur Erzielung der gleichen Effekte verwendet werden.
  • Ein solches Verfahren zur Reduktion der endogenen Genexpression ist das RNA-vermittelte Silencing der Genexpression (Abwärtsregulation). Das Silencing wird in diesem Fall in einer Pflanze durch eine doppelsträngige RNA-Sequenz (dsRNA) getriggert, die dem endogenen Zielgen im Wesentlichen ähnelt. Diese dsRNA wird weiter durch die Pflanze in etwa 20 bis etwa 26 Nukleotide prozessiert, die als kurze interferierende RNAs (short interfering RNAs (siRNAs)) bezeichnet werden. Die siRNAs werden in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebracht, der das mRNA-Transkript des endogenen Zielgens spaltet, wodurch die Anzahl der zu einem Polypeptid zu translatierenden mRNA-Transkripte verringert wird. Die doppelsträngige RNA-Sequenz entspricht einem Zielgen.
  • Ein weiteres Beispiel für ein RNA-Silencing-Verfahren beinhaltet die Einbringung von Nukleinsäure-Sequenzen oder Teilen davon (in diesem Fall ein Bereich von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen hergeleitet sind, oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon des interessierenden Proteins kodieren kann) in einer Sense-Orientierung in eine Pflanze. ”Sense Orientierung” betrifft eine DNA-Sequenz, die zu einem mRNA-Transkript davon homolog ist. In eine Pflanze wird daher mindestens eine Kopie der Nukleinsäuresequenz eingebracht. Die zusätzliche Nukleinsäure verringert die Expression des endogenen Gens, was ein Phänomen erzeugt, das als Co-Suppression bezeichnet wird. Die Reduktion der Genexpression wird ausgeprägter, wenn mehrere zusätzliche Kopien einer Nukleinsäuresequenz in die Pflanze eingebracht werden, da es eine positive Korrelation zwischen hohen Transkriptspiegeln und dem Triggern der Co-Suppression gibt.
  • Ein weiteres Beispiel für ein RNA-Silencing-Verfahren beinhaltet die Verwendung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen. Eine ”Antisense”-Nukleinsäuresequenz umfasst eine Nukleotid-Sequenz, die zu einer ”Sense”-Nukleinsäuresequenz, die ein Protein kodiert, komplementär ist, d. h. komplementär zum kodierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA- Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Transkriptsequenz. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz ist vorzugsweise komplementär zu dem zu silencenden endogenen Gen. Die Komplementarität kann sich in der ”kodierenden Region” und/oder in der ”nicht-kodierenden Region” eines Gens befinden. Der Begriff ”kodierende Region” betrifft eine Region der Nukleinsäuresequenz, die Codons umfasst, die zu Aminosäureresten translatiert werden. Der Begriff ”nicht kodierende Region” betrifft 5'- und 3'-Sequenzen, die die kodierende Region flankieren, die transkribiert, aber nicht zu Aminosäuren translatiert werden (und die auch als 5'- und 3'- untranslatierte Regionen bezeichnet werden).
  • Antisense-Nukleinsäuresequenzen können gemäß den Basenpaarungsregeln von Watson und Crick entwickelt werden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann komplementär zur gesamten Nukleinsäuresequenz sein (in diesem Fall ein Bereich von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen hergeleitet sind, oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon des interessierenden Proteins kodieren kann), kann aber auch ein Oligonukleotid sein, das nur zu einem Teil der Nukleinsäuresequenz Antisense-Orientierung aufweist (wie auch mRNA 5' und 3'UTR). Die Antisense-Oligonukleotidsequenz kann beispielsweise komplementär zu der Region sein, die die Translationsstartstelle eines mRNA-Transkripts umgibt, das ein Polypeptid kodiert. Die Länge einer geeigneten Antisense-Oligonukleotid-Sequenz ist im Stand der Technik bekannt und kann bei etwa 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 oder 10 Nukleotiden Länge oder weniger beginnen. Eine erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäuresequenz kann durch chemische Synthese und enzymatische Ligationsreaktionen mit Verfahren des Standes der Technik konstruiert werden. Eine Antisense-Nukleinsäuresequenz (beispielsweise eine Antisense-Oligonukleotid-Sequenz) kann beispielsweise chemisch synthetisiert werden, wobei natürlich vorkommende Nukloeotide oder verschiedene modifizierte Nukleotide verwendet werden, die dazu ausgelegt sind, dass die biologische Stabilität der Moleküle oder die physikalische Stabilität des Doppelstrangs erhöht wird, der zwischen den Antisense- und den Sense-Nukleinsäuresequenzen gebildet wird, beispielsweise können Phosphorthioat-Derivate und acridinsubstituierte Nukleotide verwendet werden. Beispiele für modifizierte Nukleotide, die sich zur Erzeugung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen verwenden lassen, sind im Stand der Technik bestens bekannt. Bekannte Nukleotid-Modifikationen umfassen, Methylierung, Cyclisierung und 'Caps' sowie die Substitution von einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analogon, wie Inosin. Andere Modifikationen von Nukleotiden sind im Stand der Technik bekannt.
  • Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann biologisch produziert werden mit einem Expressionsvektor, in den eine Nukleinsäuresequenz in Antisense-Orientierung subkloniert wurde (d. h. RNA, die aus der eingefügten Nukleinsäure transkribiert wurde, ist zu einer interessierenden Ziel-Nukleinsäure in Antisense-Orientierung). Die Produktion der Antisense-Nukleinsäuresequenzen in Pflanzen erfolgt vorzugsweise durch ein stabil integriertes Nukleinsäure-Konstrukt, das einen Promotor, ein funktionsfähig verknüpftes Antisense-Oligonukleotid und einen Terminator umfasst.
  • Die Nukleinsäuremoleküle, die in den erfindungsgemäßen Verfahren zum Silencen verwendet werden (unabhängig davon, ob sie in eine Pflanze eingebracht wurden, oder in situ erzeugt wurden), hybridisieren mit oder binden an mRNA-Transkripte und/oder genomische DNA, die ein Polypeptid kodiert, wodurch die Expression des Proteins gehemmt wird, beispielsweise durch Hemmen der Transkription und/oder Translation. Die Hybridisierung kann durch konventionelle Nukleotid-Komplementarität erfolgen, so dass man einen stabilen Doppelstrang erhält, oder beispielsweise im Falle einer Antisense-Nukleinsäuresequenz, die an DNA-Doppelstränge bindet, über spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix. Antisense-Nukleinsäuresequenzen können durch Transformation oder direkte Injektion an einer bestimmten Gewebestelle in eine Pflanze eingebracht werden. Alternativ können die Antisense-Nukleinsäuresequenzen zum Anzielen ausgewählter Zellen modifiziert werden und dann systemisch verabreicht werden. Zur systemischen Verabreichung können die Antisense-Nukleinsäuresequenzen beispielsweise derart modifiziert werden, dass sie spezifisch an Rezeptoren oder Antigene binden, die auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert werden, beispielsweise durch Verknüpfen der Antisense-Nukleinsäuresequenz an Peptide oder Antikörper, die an Zelloberflächenrezeptoren oder Antigene binden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenzen können auch auf Zellen übertragen werden, und zwar mit den hier beschriebenen Vektoren.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt ist die Antisense-Nukleinsäuresequenz eine a-anomere Nukleinsäuresequenz. Eine a-anomere Nukleinsäuresequenz bildet spezifische doppelständige Hybride mit komplementärer RNA, in der im Gegensatz zu den üblichen b-Einheiten die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al. (1987) Nucl Ac Res 15: 6625–6641). Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann auch ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al. (1987) Nucl Ac Res 15, 6131–6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analogon umfassen (Inoue et al. (1987) FERS Lett. 215, 327–330).
  • Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der endogenen Genexpression kann auch mit Ribozymen durchgeführt werden. Die Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonuklease-Aktivität, die eine einzelsträngige Nukleinsäuresequenz spalten können, wie eine mRNA, zu der sie eine komplementäre Region aufweisen. Somit können Ribozyme (beispielsweise Hammerkopf-Ribozyme (beschrieben in Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334, 585–591) zur katalytischen Spaltung von mRNA-Transkripten verwendet werden, die in ein Polypeptid translatiert werden, wodurch die Anzahl der mRNA-Transkripte, die ein Polypeptid kodieren, erheblich verringert wird. Ein Ribozym mit Spezifität für eine Nukleinsäuresequenz kann entwickelt werden (siehe beispielsweise: Cech et al. U.S. Patent No. 4,987,071 ; und Cech et al. U.S. Patent No. 5,116,742 ). Alternativ können mRNA-Transkripte, die einer Nukleinsäuresequenz entsprechen, zur Auswahl einer katalytischen mRNA mit einer spezifischen Ribonukleaseaktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen ausgewählt werden (Bartel and Szostak (1993) Science 261, 1411–1418). Die Verwendung von Ribozymen zum Gen-Silencing ist im Stand der Technik bekannt (beispielsweise Atkins et al. (1994) WO 94/00012 ; Lenne et al. (1995) WO 95/03404 ; Lutziger et al. (2000) WO 00/00619 ; Prinsen et al. (1997) WO 97/13865 und Scott et al. (1997) WO 97/38116 ).
  • Das Gensilencing kann ebenfalls durch Insertionsmutagenese erzielt (beispielsweise T-DNA-Insertion oder Transposon-Insertion) oder durch Strategien, wie sie u. a. von Angell and Baulcombe ((1999) Plant J 20 (3): 357–62), (Amplicon VIGS WO 98/36083 ), oder Baulcombe ( WO 99/15682 ) beschrieben wurden.
  • Das Gensilencing kann auch erfolgen, wenn eine Mutation an einem endogenem Gen und/oder eine Mutation an einem isolierten Gen bzw. einer isolierten Nukleinsäure vorliegt, die anschließend in eine Pflanze eingeführt wurde. Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung kann durch ein nicht-funktionelles Polypeptid verursacht werden. Das Polypeptid kann beispielsweise an verschiedene wechselwirkende Proteine binden; eine oder mehrere Mutationen und/oder Verkürzungen können daher ein Polypeptid bereitstellen, das noch an wechselwirkende Proteine binden kann (wie Rezeptorproteine), die aber ihre normale Funktion nicht ausüben können (beispielsweise als signalgebender Ligand).
  • Ein weiterer Ansatz zum Gensilencing ist durch Anzielen von Nukleinsäuresequenzen, die zur regulatorischen Region des Gens komplementär sind (beispielsweise Promotor und/oder Enhancer), so dass dreifach helikale Strukturen erzeugt werden, die die Transkription des Gens in Zielzellen verhindern. Siehe Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569–84, 1991; Helene et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 660, 27–36 1992; und Maher, L. J. Bioassays 14, 807–15, 1992.
  • Andere Verfahren, wie die Verwendung von Antikörpern gegen ein endogenes Polypeptid zur Hemmung seiner Funktion in Pflanzen oder die Interferenz in dem Signalweg, an dem ein Polypeptid beteiligt ist, sind dem Fachmann bestens bekannt. Es kann insbesondere angestrebt werden, dass sich von Menschenhand gemachte Moleküle zur Hemmung der biologischen Funktion eines Ziel-Polypeptids oder zum Eingreifen in den Signalweg, an dem das Ziel-Polypeptid beteiligt ist, eignet.
  • Alternativ kann ein Screening-Programm aufgestellt werden, mit dem man in einer Pflanze die natürlichen Genvarianten identifiziert, wobei die Varianten Polypeptide mit reduzierter Aktivität kodieren. Solche natürlichen Varianten können auch beispielsweise zur Durchführung einer homologen Rekombination verwendet werden.
  • Künstliche und/oder natürliche mikroRNAs (miRNAs) können zum Knockout der Genexpression und/oder mRNA-Translation verwendet werden. Endogene miRNAs sind einzelsträngige kleine RNAs mit gewöhnlich 19 bis 24 Nukleotiden Länge. In erster Linie regulieren sie die Genexpression und/oder mRNA-Translation. Die meisten PflanzenmikroRNAs (miRNAs) haben eine perfekte oder nahezu perfekte Komplementarität zu ihren Zielsequenzen. Es gibt jedoch natürliche Ziele mit bis zu 5 Mismatches. Sie werden aus längeren nicht-kodierenden RNAs mit charakteristischen Rückfaltungsstrukturen durch doppelstrangspezifische RNAsen der Dicer-Familie prozessiert. Bei der Prozessierung werden sie durch Bindung an ihre Hauptkomponente, ein Argonaut-Protein, in den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebracht. MiRNAs wirken als Spezifitäts-Komponenten von RISC, da sie mit Ziel-Nukleinsäuren, meist mRNAs im Cytoplasma Basenpaare eingehen. Nachfolgende Regulationsereignisse umfassen Ziel-mRNA-Spaltung und die Zerstörung und/oder translationale Hemmung. Die Effekte der miRNA-Überexpression spiegeln sich somit oft in verringerten mRNA-Spiegeln der Zielgene wider.
  • Künstliche mikroRNAs (amiRNAs), die gewöhnlich 21 Nukleotide lang sind, können genetisch modifiziert werden, so dass sie die Genexpression einzelner oder multipler interessierender Gene negativ regulieren. Determinanten der Pflanzen-mikroRNA-Zielselektion sind im Stand der Technik bestens bekannt. Empirische Parameter zur Zielerkennung wurden definiert und können zur Unterstützung der Aufmachung spezifischer amiRNAs verwendet werden (Schwab et al., Dev. Cell 8, 517–527, 2005). Herkömmliche Werkzeuge zur Aufmachung und Erzeugung von amiRNAs und ihrer Vorstufen sind ebenfalls öffentlich zugänglich (Schwab et al., Plant Cell 18, 1121–1133, 2006).
  • Für eine optimale Leistung erfordern die Gensilencing-Techniken, die zur Reduktion der Expression in einer Pflanze eines endogenen Gens verwendet werden, die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen aus monokotylen Pflanzen zur Transformation monokotyler Pflanzen und aus dikotylen Pflanzen zur Transformation dikotyler Pflanzen. Vorzugsweise wird eine Nukleinsäuresequenz aus einer gegebenen Pflanzenart in die gleiche Pflanzenart eingebracht. Beispielsweise wird eine Nukleinsäuresequenz aus Reis in eine Reispflanze transformiert. Es ist jedoch kein absolutes Erfordernis, dass die einzubringende Nukleinsäuresequenz aus der gleichen Pflanzenart stammt wie die Pflanze, in die sie eingebracht wird. Es reicht, wenn eine wesentliche Homologie zwischen endogenem Zielgen und der einzubringenden Nukleinsäure vorliegt.
  • Vorstehend sind Beispiele für verschiedene Verfahren zur Verringerung oder wesentlichen Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze beschrieben. Der Fachmann kann leicht die vorstehend genannten Verfahren zum Silencing so anpassen, dass die Reduktion der Expression eines endogenen Gens in einer vollständigen Pflanze oder in Teilen davon durch die Verwendung beispielsweise eines geeigneten Promotors erzielt wird.
  • Der Fachmann ist mit den verschiedenen Techniken zur Minderung der Expression eines Gens vertraut.
  • Selektionsmarker(gen)/Reportergen
  • ”Selektionsmarker”, ”Selektionsmarkergen” oder ”Reportergen” beinhaltet jegliches Gen, das einer Zelle, in der es exprimiert wird, um die Identifikation und/oder Selektion von Zellen, die mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt transfiziert sind oder transformiert sind, zu erleichtern, einen Phänotyp verleiht. Mit diesen Markergenen kann ein erfolgreicher Transfer der Nukleinsäuremoleküle mittels einer Reihe von unterschiedlichen Prinzipien identifiziert werden. Geeignete Marker können aus Markern ausgewählt werden, die Antibiotika- oder Herbizidresistenz verleihen, die ein neues Stoffwechselmerkmal einführen oder die eine visuelle Selektion gestatten. Zu Selektionsmarkergenen gehören zum Beispiel Gene, die Resistenz gegen Antibiotika (wie nptII, das Neomycin und Kanamycin phosphoryliert, oder hpt, das Hygromycin phosphoryliert, oder Gene, die Resistenz gegen zum Beispiel Bleomycin, Streptomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Ampicillin, Gentamycin, Geneticin (G418), Spectinomycin oder Blasticidin verleihen), gegen Herbizide (zum Beispiel bar, das Resistenz gegen Basta® vermittelt; aroA oder gox, die Resistenz gegen Glyphosat vermitteln, oder die Gene, die Resistenz gegen z. B. Imidazolinon, Phosphinothricin oder Sulfonylharnstoff verleihen), oder Gene, die ein Stoffwechselmerkmal bereitstellen (wie manA, das es Pflanzen ermöglicht, Mannose als einzige Kohlenstoffquelle zu verwerten, oder Xyloseisomerase für die Verwertung von Xylose, oder Antinährstoffmarker, wie Resistenz gegen 2-Desoxyglucose), vermitteln. Die Expression visueller Markergene führt zur Bildung von Farbe (zum Beispiel β-Glucuronidase, GUS oder β-Galactosidase mit ihren gefärbten Substraten, zum Beispiel X-Gal), Lumineszenz (wie das Luziferin/Luziferase-System) oder Fluoreszenz (Green Fluorescent Protein, GFP, und seine Derivate). Diese Aufzählung stellt nur eine kleine Anzahl von möglichen Markern dar. Der Fachmann ist mit solchen Markern vertraut. Je nach dem Organismus und dem Selektionsverfahren werden unterschiedliche Marker bevorzugt.
  • Bei stabiler oder transienter Integration von Nukleinsäuren in Pflanzenzellen nimmt bekanntlich nur ein kleiner Teil der Zellen die fremde DNA auf, und integriert sie wenn gewünscht je nach dem verwendeten Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionstechnik in ihr Genom. Zur Identifikation und Selektion dieser Integranten wird gewöhnlich ein Gen, das einen selektierbaren Marker kodiert (wie diejenigen, die oben beschrieben sind) in die Wirtszelle zusammen mit dem interessierenden Gen eingesetzt. Diese Marker können beispielsweise in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene nicht funktionell sind, beispielsweise durch Deletion durch herkömmliche Verfahren. Darüber hinaus können Nukleinsäuremoleküle, die einen Selektionsmarker kodieren, in eine Wirtszelle auf dem gleichen Vektor eingebracht werden, der die Sequenz umfasst, die die erfindungsgemäßen Polypeptide kodiert, oder in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, oder ansonsten in einem gesonderten Vektor. Zellen, die stabil mit der eingebrachten Nukleinsäure transfiziert wurden, können beispielsweise durch Selektion identifiziert werden (beispielsweise Zellen, die den Selektionsmarker integriert haben, überleben, wohingegen andere Zellen sterben).
  • Da die Markergene, insbesondere Gene für die Resistenz gegen Antibiotika und Herbizide, in der transgenen Wirtszelle nicht länger erforderlich sind oder ungewünscht sind, sobald die Nukleinsäuren erfolgreich eingebracht worden sind, setzt das erfindungsgemäße Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäuren erfolgreich Techniken ein, die die Entfernung oder Abspaltung dieser Markergene ermöglichen. Ein solches Verfahren wird als Cotransformation bezeichnet. Die Cotransformation setzt 2 Vektoren ein, die simultan zur Transformation eingesetzt werden, wobei ein Vektor die erfindungsgemäße Nukleinsäure trägt und der zweite das oder die Markergene trägt. Ein großer Anteil der Transformanten erhält, oder umfasst bei Pflanzen (bis zu 40% oder mehr Transformanten) beide Vektoren. Bei der Transformation mit Agrobakterien, erhalten die Transformanten gewöhnlich nur einen Teil des Vektors, d. h. die Sequenz, die von der T-DNA flankiert wird, die gewöhnlich die Expressions-Kassette veranschaulicht. Die Markergene können anschließend aus der transformierten Pflanze durch Kreuzungen entfernt werden. Bei einem anderen Verfahren werden die in ein Transposon integrierten Markergene zur Transformation zusammen mit der gewünschten Nukleinsäure verwendet (was als Ac/Ds-Technologie bekannt ist). Die Transformanten können mit einer Quelle für Transposase gekreuzt werden, oder die Transformanten werden mit einem Nukleinsäure-Konstrukt transformiert, das die transiente oder stabile Expression einer Transposase vermittelt. In einigen Fällen (etwa 10%) springt das Transposon aus dem Genom der Wirtszelle, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, und geht verloren. Bei einer weiteren Anzahl von Fällen, springt das Transposon an eine andere Stelle. In diesen Fällen muss das Markergen mit Hilfe von Kreuzungen eliminiert werden. In der Mikrobiologie wurden Techniken entwickelt, die den Nachweis solcher Ereignisse ermöglichen oder erleichtern. Ein weiteres vorteilhaftes Verfahren beruht auf sogenannten Rekombinationssystemen, deren Vorteil ist, dass auf die Eliminierung durch Kreuzung verzichtet werden kann. Das am besten bekannte System dieser Art ist als Cre/Iox-System bekannt. Cre1 ist eine Rekombinase, die die zwischen den IoxP-Sequenzen befindlichen Sequenzen entfernt. Ist der Marker zwischen den IoxP-Sequenzen integriert, wird er durch Expression der Rekombinase entfernt, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat. Weitere Rekombinationssysteme sind das HIN/HIX-, FLP/FRT- und REP/STB-System (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255–22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553–566). Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen können stellenspezifisch in das Pflanzengenom integriert werden. Natürlich können diese Verfahren auch auf Mikroorganismen angewendet werden, wie Hefe, Pilze oder Bakterien.
  • Transgen/transgen/rekombinant
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet ”transgen”, ”Transgen” oder ”rekombinant” eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette, ein Genkonstrukt oder einen Vektor, der die Nukleinsäuresequenz umfasst, oder einen Organismus, der mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten oder Vektoren transformiert ist, wobei alle diese Konstrukte mittels rekombinanter Verfahren entstehen, in denen entweder
    • (a) die Nukleinsäuresequenzen, die Proteine kodieren, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, oder
    • (b) genetische Kontrollsequenz(en) in funktionsfähiger Verknüpfung mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz, zum Beispiel einem Promotor, oder
    • (c) a) und b)
  • sich nicht in ihrer natürlichen genetischen Umgebung befinden oder durch rekombinante Verfahren modifiziert worden sind, wobei es sich bei der Modifikation zum Beispiel um eine Substitution, Addition, Deletion, Inversion oder Insertion von einem oder mehreren Nukleotidresten handeln kann. Unter der natürlichen genetischen Umgebung versteht man den natürlichen genomischen oder chromosomalen Locus in der Ursprungspflanze oder das Vorhandensein in einer genomischen Bank. Bei einer genomischen Bank wird die natürliche genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz vorzugsweise zumindest teilweise beibehalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz zumindest auf einer Seite und weist eine Sequenzlänge von mindestens 50 Bp, vorzugsweise mindestens 500 Bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 Bp, am stärksten bevorzugt mindestens 5000 Bp, auf. Eine natürlich vorkommende Expressionskassette – zum Beispiel die natürlich vorkommende Kombination des natürlichen Promotors der Nukleinsäuresequenzen mit der entsprechenden Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid kodiert, das bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet ist, wie oben definiert – wird zu einer transgenen Expressionskassette, wenn diese Expressionskassette durch unnatürliche, synthetische (”künstliche”) Verfahren wie zum Beispiel mutagene Behandlung modifiziert wird. Geeignete Verfahren sind zum Beispiel in US 5,565,350 oder WO 00/15815 beschrieben.
  • Unter einen transgenen Pflanze versteht man für erfindungsgemäße Zwecke wie oben, dass die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrem natürlichen Locus im Genom dieser Pflanze vorliegen, wobei die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden können. Wie erwähnt bedeutet transgen jedoch auch, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die Nukleinsäuren, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, zwar in ihrer natürlichen Position im Genom einer Pflanze vorliegen, die Sequenz jedoch in Bezug auf die natürliche Sequenz modifiziert worden ist und/oder dass die Regulationssequenzen der natürlichen Sequenzen modifiziert worden sind. Transgen bedeutet vorzugsweise die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an einem unnatürlichen Locus in dem Genom, d. h. dass eine homologe, oder vorzugsweise, heterologe Expression der Nukleinsäuren stattfindet. Bevorzugte transgene Pflanzen werden im vorliegenden Text erwähnt.
  • Transformation
  • Der Begriff ”Einführung” oder ”Transformation” umfasst im vorliegenden Zusammenhang den Transfer eines Fremdpolynukleotids in eine Wirtszelle, und zwar unabhängig von dem für den Transfer eingesetzten Verfahren. Pflanzengewebe, das entweder durch Organogenese oder Embryogenese zu einer anschließenden klonalen Vermehrung befähigt ist, kann mit einem erfindungsgemäßen Genkonstrukt transformiert werden, und daraus kann eine ganze Pflanze regeneriert werden. Das jeweils ausgewählte Gewebe hängt von den jeweiligen klonalen Vermehrungssytemen ab, die für die jeweilige zu transformierende Art verfügbar und am besten geeignet sind. Zu Zielgeweben gehören zum Beispiel Blattscheiben, Pollen, Embryonen, Kotyledonen, Hypokotyle, Megagametophyten, Kallusgewebe, existierendes Meristemgewebe (z. B. Apikalmeristem, Achselknospen und Wurzelmeristeme) und induziertes Meristemgewebe (z. B. Kotyledonenmeristem und Hypokotylmeristem). Das Polynukleotid kann in eine Wirtszelle transient oder stabil eingeführt werden und kann in nichtintegrierter Form, zum Beispiel als Plasmid, aufrechterhalten werden. Es kann jedoch auch in das Wirtsgenom integriert werden. Mit den erhaltenen transformierten Pflanzenzellen kann man dann eine transformierte Pflanze auf dem Fachmann bekannte Art und Weise regenerieren.
  • Der Transfer von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Die Transformation von Pflanzenarten ist eine Technik, die heutzutage relativ routinemäßig erfolgt. Um das interessierende Gen in eine geeignete Vorfahrenzelle einzuführen, kann vorteilhafterweise irgendeine von verschiedenen Transformationsmethoden eingesetzt werden. Die für die Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen beschriebenen Methoden können für die transiente oder für die stabile Transformation eingesetzt werden. Zu Transformationsmethoden gehören die Verwendung von Liposomen, die Elektroporation, Chemikalien, die die freie DNA-Aufnahme verstärken, die Injektion der DNA direkt in die Pflanze, der Teilchenkanonenbeschuss, die Transformation mit Viren oder Pollen und die Mikroprojektion. Die Verfahren können aus den folgenden ausgewählt werden: Calcium/Polyethylenglycol-Methode für Protoplasten (Krens, F. A. et al., (1982), Nature 296, 72–74; Negrutiu I et al., (1987), Plant Mol. Biol. 8: 363–373); Elektroporation von Protoplasten (Shillito R. D. et al., (1985), Bio/Technol. 3, 1099–1102); Mikroinjektion in Pflanzenmaterial (Crossway A et al., (1986), Mol. Gen. Genet. 202: 179–185); Beschuss mit DNA- oder RNA-beschichteten Partikeln (Klein TM et al., (1987), Nature 327: 70), Infektion mit (nichtintegrierenden) Viren und dergleichen. Transgene Pflanzen, darunter auch transgene Kulturpflanzen, werden vorzugsweise mittels Agrobacterium-vermittelter Transformation erzeugt. Eine vorteilhafte Transformationsmethode ist die Transformation in die Pflanze. Zu diesem Zweck kann man zum Beispiel die Agrobakterien auf Pflanzensamen einwirken lassen oder das Pflanzenmeristem mit Agrobakterien beimpfen. Erfindungsgemäß hat sich besonders günstig erwiesen, eine Suspension von transformierten Agrobakterien auf die intakte Pflanze oder zumindest die Blütenprimordien einwirken zu lassen. Die Pflanze wird anschließend weiter herangezogen, bis man die Samen der behandelten Pflanze erhält (Clough und Bent, Plant J. (1998), 16, 735–743). Zu den Verfahren für die Agrobacterium-vermittelte Transformation des Reises gehören gut bekannte Verfahren für die Reistransformation, wie diejenigen, die in einer der folgenden Schriften beschrieben sind: Europäische Patentanmeldung EP 1198985 A1 , Aldemita und Hodges (Planta 199: 612–617, 1996); Chan et al., (Plant Mol. Biol. 22 (3): 491–506, 1993), Hiei et al., (Plant J. 6 (2): 271–282, 1994), die hiermit vollinhaltlich durch Bezugnahme aufgenommen sind. Bei der Transformation von Mais ist das bevorzugte Verfahren entweder wie bei Ishida et al., (Nat. Biotechnol. 14 (6): 745–50, 1996) oder bei Frame et al. (Plant Physiol. 129 (1): 13–22, 2002) beschrieben, die hiermit vollinhaltlich durch Bezugnahme aufgenommen sind. Diese Verfahren sind weiterhin zum Beispiel bei B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143 und in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205–225) beschrieben. Die zu exprimierenden Nukleinsäuren bzw. das zu exprimierende Konstrukt werden/wird vorzugsweise in einen Vektor kloniert, der sich für die Transformation von Agrobacterium tumefaciens eignet, zum Beispiel pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Agrobakterien, die mit solch einem Vektor transformiert wurden, können dann auf bekannte Weise für die Transformation von Pflanzen eingesetzt werden, wie Pflanzen, die als Modell verwendet werden, wie Arabidopsis (Arabidopsis thaliana wird innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung nicht als Kulturpflanze angesehen), oder Kulturpflanzen, wie zum Beispiel Tabakpflanzen, und zwar zum Beispiel dadurch, dass man verletzte Blätter oder zerkleinerte Blätter in eine Agrobakterienlösung taucht und sie dann in geeigneten Medien kultiviert. Die Transformation von Pflanzen mittels Agrobacterium tumefaciens wird zum Beispiel bei Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988), 16, 9877 beschrieben oder ist unter anderem aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S.D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38 bekannt.
  • Zusätzlich zu der Transformation von somatischen Zellen, die dann zu intakten Pflanzen regeneriert werden müssen, kann man auch Zellen von pflanzlichen Meristemen transformieren, insbesondere solche Zellen, die sich zu Gameten entwickeln. In diesem Fall folgen die transformierten Gameten der natürlichen Pflanzenentwicklung und ergeben transgene Pflanzen. So werden zum Beispiel Samen von Arabidopsis mit Agrobakterien behandelt, und man erhält von den sich entwickelnden Pflanzen, von denen ein gewisser Teil transformiert und daher transgen ist, Samen [Feldman, KA und Marks MD (1987). Mol. Gen. Genet. 208: 274–289; Feldmann K (1992). In: C Koncz, N-H Chua und J Shell, Hrsg., Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, S. 274–289]. Alternative Verfahren beruhen auf der wiederholten Entfernung der Infloreszenzen und Inkubation der Exzisionsstelle in der Mitte der Rosette mit transformierten Agrobakterien, wodurch ebenfalls später transformierte Samen erhalten werden können (Chang (1994). Plant J. 5: 551–558; Katavic (1994). Mol. Gen. Genet., 245: 363–370). Ein besonders wirksames Verfahren ist jedoch die Vakuuminfiltrationsmethode mit ihren Modifikationen, wie der ”floral dip”-Methode. Bei der Vakuuminfiltration von Arabidopsis werden intakte Pflanzen unter verringertem Druck mit einer Agrobakteriensuspension behandelt [Bechthold, N (1993). C. R. Acad. Sci. Paris Life Sci., 316: 1194–1199], während bei der ”floral dip”-Methode das sich entwickelnde Blütengewebe kurz mit einer mit Tensid behandelten Agrobakteriensuspension inkubiert wird [Clough, SJ und Bent AF (1998), The Plant J. 16, 735–743]. Ein gewisser Anteil transgener Samen wird in beiden Fällen geerntet, und diese Samen lassen sich von nichttransgenen Samen dadurch unterscheiden, dass man sie unter den oben beschriebenen Selektionsbedingungen heranzieht. Außerdem ist die stabile Transformation von Plastiden vorteilhaft, da Plastide bei den meisten Kulturpflanzen mütterlich vererbt werden, wodurch die Gefahr des Transgenflusses durch Pollen reduziert oder eliminiert wird. Die Transformation des Chloroplastengenoms erfolgt im Allgemeinen durch ein Verfahren, das schematisch bei Klaus et al., 2004, [Nature Biotechnology 22 (2), 225–229] gezeigt wurde. Kurz gesagt werden die zu transformierenden Sequenzen gemeinsam mit einem Selektionsmarkergen zwischen flankierende Sequenzen, die zu dem Chloroplastengenom homolog sind, kloniert. Diese homologen flankierenden Sequenzen steuern die ortsgerichtete Integration in das Plastom. Die Plastidentransformation ist für viele unterschiedliche Pflanzenarten beschrieben worden, und eine Übersicht findet sich bei Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J. Mol. Biol. 2001 Sept. 21; 312 (3): 425–38 oder Maliga, P (2003), Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20–28. Über einen weiteren Fortschritt in der Biotechnologie wurde in jüngster Zeit in Form von markerfreien Plastidentransformanten, die durch ein transientes cointegriertes Markergen erzeugt werden können, berichtet (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22 (2), 225–229).
  • T-DNA-Aktivierungstagging
  • T-DNA-Aktivierungstagging (Hayashi et al. Science (1992) 1350–1353) beinhaltet die Einführung von T-DNA, die gewöhnlich einen Promotor (es kann auch ein Translations-Enhancer oder ein Intron sein) in der genomischen Region des interessierenden Gens oder 10 kb stromaufwärts oder stromabwärts der kodierenden Region eines Gens in einer solchen Konfiguration enthält, dass der Promotor die Expression des angezielten Gens steuert. Die Regulation der Expression des angezielten Gens durch seinen natürlichen Promotor wird gewöhnlich unterbrochen und das Gen gerät unter die Kontrolle des neu eingeführten Promotors. Der Promotor ist gewöhnlich in eine T-DNA eingebettet. Diese T-DNA wird statistisch in das Pflanzengenom eingeführt, beispielsweise durch Agrobacterium Infektion und führt zu modifizierter Expression der Gene nahe der eingeführten T-DNA. Die resultierenden transgenen Pflanzen zeigen dominante Phänotypen aufgrund der modifizierten Expression der Gene nahe dem eingeführten Promotor.
  • TILLING
  • Der Begriff TILLING ist eine Abkürzung für ”Targeted Induced Local Lesions In Genomes” und steht für eine Mutagenesetechnologie, die sich dazu eignet, Nukleinsäuren, die Proteine mit modifizierter Expression und/oder Aktivität kodieren, zu erzeugen und/oder zu identifizieren. TILLING ermöglicht auch die Selektion von Pflanzen, die solche Mutantenvarianten tragen. Diese Mutantenvarianten können eine modifizierte Expression aufweisen, und zwar entweder bezüglich der Stärke oder der Lokalisierung oder des Zeitpunkts (wenn die Mutationen zum Beispiel den Promotor betreffen). Diese Mutantenvarianten können eine höhere Aktivität aufweisen als diejenige des Gens in seiner natürlichen Form. Beim TILLING wird Mutagenese in hoher Dichte mit Screening-Methoden mit hohem Durchsatz kombiniert. Die Schritte, die beim TILLING gewöhnlich erfolgen, sind: (a) EMS-Mutagenese (Redei GP und Koncz C (1992), In Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, Hrsg. Singapur, World Scientific Publishing Co, S. 16–82; Feldmann et al., (1994) In Meyerowitz EM, Somerville CR, Hrsg, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, NY, S. 137–172; Lightner J und Caspar T (1998), In J Martinez-Zapater, J Salinas, Hrsg., Methods an Molecular Biology, Band 82. Humana Press, Totowa, NJ, S. 91–104); (b) DNA-Herstellung und Poolen von Individuen; (c) PCR-Amplifikation einer interessierenden Region; (d) Denaturieren und Annealing, um die Bildung von Heteroduplices zu ermöglichen; (e) DHPLC, wo das Vorhandensein eines Heteroduplex in einem Pool als zusätzlicher Peak im Chromatogramm nachgewiesen wird; (f) Identifizieren des mutierten Individuums; und (g) Sequenzieren des PCR-Produkts der Mutante. TILLING-Methoden sind im Stand der Technik bestens bekannt (McCallum et al., (2000), Nat. Biotechnol. 18: 455–457; in einem Übersichtsartikel von Stemple (2004), Nat. Rev. Genet. 5 (2): 145–50) erwähnt.
  • Homologe Rekombination
  • Homologe Rekombination ermöglicht die Einführung einer ausgewählten Nukleinsäure in ein Genom, an einer definierten ausgewählten Position. Die homologe Rekombination ist eine Standard-Technik, die routinemäßig in den biologischen Wissenschaften für niedere Organismen verwendet wird, wie Hefe und das Moos Physcomitrella. Verfahren zur Durchführung der homologen Rekombination in Pflanzen wurden nicht nur für Pflanzenmodelle beschrieben (Offringa et al. (1990) EMBO J 9 (10): 3077–84) sondern auch für Kulturpflanzen, wie beispielsweise Reis (Terada et al. (2002) Nat Biotech 20 (10): 1030–4; Iida and Terada (2004) Curr Opin Biotech 15 (2): 132–8), und es gibt Ansätze, die gewöhnlich anwendbar sind, ungeachtet des Zielorganismus (Miller et al, Nature Biotechnol. 25, 778–785, 2007).
  • Ertrag
  • Der Begriff ”Ertrag” bedeutet im Allgemeinen ein messbares Produkt von wirtschaftlichem Wert, das gewöhnlich mit einer bezeichneten Kulturpflanze, einem Ort und einem Zeitraum einher geht. Die einzelnen Pflanzenteile tragen aufgrund ihrer Anzahl, Größe und/oder ihres Gewichts direkt zum Ertrag bei, oder der tatsächliche Ertrag ist derjenige Ertrag pro m2 für eine Kulturpflanze und ein Jahr, der dadurch bestimmt wird, dass man die Gesamtproduktion (was sowohl geerntete als auch geschätzte Produktion beinhaltet) durch die bewirtschafteten m2 dividiert. Der Begriff ”Ertrag” einer Pflanze kann die vegetative Biomasse (Wurzel und/oder Spross-Biomasse), Fortpflanzungsorgane und/oder Verbreitungseinheiten (wie Samen) dieser Pflanze betreffen.
  • Jungpflanzenvitalität
  • ”Jungpflanzenvitalität” steht für das aktive gesunde gut balancierte Wachstum, insbesondere während früher Stadien des Pflanzenwachstums, und kann sich aus einer gesteigerten Pflanzen-Fitness ergeben, beispielsweise wenn die Pflanzen besser an ihre Umgebung angepasst sind (d. h. durch Optimierung der Verwendung von Energiequellen und der Verteilung zwischen Spross und Wurzel). Pflanzen mit eine Jungpflanzenvitalität zeigen auch ein gesteigertes Überleben des Keimlings und eine bessere Entwicklung der Kulturpflanze, was häufig zu sehr einheitlichen Feldern (wobei die Kulturpflanze einheitlich wächst, d. h. die Mehrheit der Pflanzen erreicht im Wesentlichen gleichzeitig verschiedene Entwicklungsstadien) und oft einem besseren und höheren Ertrag führt. Daher kann die Jungpflanzenvitalität durch Messen verschiedener Faktoren bestimmt werden, wie Tausendkorngewicht, Prozent Keimung, Prozent Auflaufen, Wachstum des Keimlings, Höhe des Keimlings, Wurzellänge, Biomasse von Wurzel und Spross und vielen anderen.
  • Erhöhen/Verbessern/Fördern
  • Die Begriffe ”erhöhen”, ”verbessern” oder ”fördern” sind untereinander austauschbar und sollen im Rahmen der vorliegenden Erfindung mindestens 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% oder 10%, vorzugsweise mindestens 15% oder 20%, stärker bevorzugt 25%, 30%, 35% oder 40% mehr Ertrag und/oder Wachstum im Vergleich zu Kontrollpflanzen wie im vorliegenden Text definiert bedeuten.
  • Samenertrag
  • Ein erhöhter Samenertrag kann sich als eine oder mehrere der folgenden Erscheinungen äußern: a) Erhöhung der Samenbiomasse (Samengesamtgewicht), entweder auf Grundlage der einzelnen Samen und/oder pro Pflanze und/oder oder pro m2; b) erhöhte Anzahl Blüten pro Pflanze; c) erhöhte Anzahl (gefüllter) Samen; d) erhöhte Samenfüllungsrate (die als Verhältnis zwischen der Anzahl gefüllter Samen, dividiert durch die Gesamtzahl Samen, ausgedrückt wird); e) erhöhter Harvest Index, der als Verhältnis des Ertrags von Erntegut wie Samen, dividiert durch die Gesamtbiomasse, ausgedrückt wird; sowie f) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKG), das aufgrund der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihres Gesamtgewichts extrapoliert wird. Ein erhöhtes TKG kann das Ergebnis einer erhöhten Samengröße und/oder eines erhöhten Samengewichts sein und kann auch das Ergebnis einer Erhöhung der Embryo- und/oder Endospermgröße sein.
  • Eine Erhöhung des Samenertrags kann sich auch als Erhöhung der Samengröße und/oder des Samenvolumens äußern. Eine Erhöhung des Samenertrags kann sich auch als Vergrößerung der Samenfläche und/oder Samenlänge und/oder Samenbreite und/oder des Samenumfangs äußern. Ein erhöhter Ertrag kann auch zu einer modifizierten Architektur führen oder kann aufgrund einer modifizierten Architektur vorliegen.
  • Greenness Index
  • Der ”Greenness Index”, wie hier verwendet, wird aus digitalen Bildern von Pflanzen berechnet. Für jeden zu dem Pflanzenobjekt auf dem Bild gehörigen Pixel wird das Verhältnis des Grünwertes gegenüber dem Rotwert (im RGB-Modell für Farbkodierung) berechnet. Der Greenness Index wird ausgedrückt als Prozent der Pixel, für die das Grün:Rot-Verhältnis eine bestimmte Schwelle überschreitet. Unter normalen Wachstumsbedingungen, unter Salzstress-Wachstumsbedingungen, und unter den Wachstumsbedingungen einer reduzierten Nährstoffverfügbarkeit wird der Greenness Index der Pflanzen bei der letzten Bildnahme vor dem Blühen gemessen. Unter Trockenstress-Wachstumsbedingungen, wird der Greenness Index der Pflanzen in der erste Bildnahme nach dem Trockenstress gemessen.
  • Pflanze
  • Der Begriff ”Pflanze” umfasst im vorliegenden Zusammenhang ganze Pflanzen, Vorfahren und Nachfahren der Pflanzen und Pflanzenteile, wozu Samen, Sprosse, Stängel, Blätter, Wurzeln (einschließlich Knollen), Blüten und Gewebe und Organe gehören, wobei jedes der genannten Objekte das interessierende Gen bzw. die interessierende Nukleinsäure umfasst. Der Begriff ”Pflanze” umfasst auch Pflanzenzellen, Suspensionskulturen, Kallusgewebe, Embryonen, meristematische Regionen, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen, wobei wiederum jedes der genannten Objekte das interessierende Gen bzw. die interessierende Nukleinsäure umfasst.
  • Zu Pflanzen, die sich für die erfindungsgemäßen Verfahren besonders eignen, gehören all diejenigen Pflanzen, die zu der Überfamilie Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, darunter Futterleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelpflanzen, Bäume oder Sträucher aus der Liste, die unter Anderem die folgenden Pflanzen umfasst: Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (bspw. Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (bspw. Brassica napus, Brassica rage ssp. [Canola-Raps, normaler Raps, Rübsen]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (bspw. Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (bspw. Glycine max, Soja hispida oder Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (bspw. Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (bspw. Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (bspw. Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (bspw. Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (bspw. Solanum tuberosum, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (bspw. Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum oder Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp.
  • Eingehende Beschreibung der Erfindung
  • Es wurde jetzt überraschenderweise gefunden, dass die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodiert, in einer Pflanze zu Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen führt. In einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung der Ertragsmerkmale in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, umfassend das Modulieren der Expression der Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodiert, in einer Pflanze.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodiert, besteht darin, dass man eine Nukleinsäure, die für ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze einbringt und exprimiert.
  • Wird in einer Ausführungsform auf ein ”Protein, das für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” Bezug genommen, soll darunter ein bHLH6-ähnliches Polypeptid, wie im vorliegenden Text definiert, verstanden werden. Wird in der gleichen Ausführungsform auf eine ”Nukleinsäure, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” Bezug genommen, soll dies eine Nukleinsäure bedeuten, die ein solches bHLH6-ähnliches Polypeptid kodieren kann. In einer Ausführungsform ist die Nukleinsäure, die in eine Pflanze eingeführt werden soll (und daher zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist), jede Nukleinsäure, die für den Typ Protein kodiert, der im Folgenden beschrieben wird, und sie wird im Folgenden auch als ”bHLH6-ähnliche Nukleinsäure” oder ”bHLH6-ähnliches Gen” bezeichnet.
  • Ein ”bHLH6-ähnliches Polypeptid” wie im vorliegenden Text definiert, steht für ein Polypeptid, umfassend eine basische Domäne und anschließend eine HLH-Domäne (HMMPFam PF00010, ProfileScan PS50888, SMART SM00353), wodurch eine basische Helix-Loop-Helix Domäne erhalten wird (Interpro IPR001092). Das bHLH6-ähnliche Polypeptid umfasst vorzugsweise mindestens ein, vorzugsweise zwei, stärker bevorzugt drei oder mehrere der folgenden Motive:
    Motiv 1 (SEQ ID NO: 3): L(G/E/T)WX(D/E)(G/S)X(Y/F)(K/N)G(E/D)
    wobei X an Position 4 eine beliebige Aminosäure sein kann, vorzugsweise eine Turn-ähnliche Aminosäure, stärker bevorzugt eine von G, R, K, T, und S; und wobei X an Position 7 eine beliebige Aminosäure sein kann, vorzugsweise eine hydrophobe oder polare Aminosäure, stärker bevorzugt eine von Y, F, N, und H.
    Motiv 2 (SEQ ID NO: 4):
    G(V/I)(V/I/L)E(V/L/I)(G/A)(S/V/T/A)(T/L/S)(E/D/S)
    Motiv 3 (SEQ ID NO: 5): (D/E)K(A/V/I)S(L/I/V)L(G/D/E/A)
    Motiv 4 (SEQ ID NO: 6): (T/N/S)LQ(Q/H)RLQ
    Motiv 5 (SEQ ID NO: 7):
    (K/F)(I/F/V)(I/L/V/M/S)G(W/L/R/N/E)(E/D)AM(I/V)(G/R)(V/I)(Q/N/E/Y)
    Motiv 6 (SEQ ID NO: 8):
    (H/Y)(A/S)(S/N)(V/C/M/L/T)(S/Q)(V/C/S)(V/MF)(K/N/S)(D/C/E)(L/Q/F/M)(M/R/L)(I/F/L)(Q/D/H)(Q/D/V)
  • Das Homologon eines bHLH6-ähnlichen Protein hat in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99% Gesamt-Sequenzidentität zu der in SEQ ID NO: 2 veranschaulichten Aminosäure, vorausgesetzt das homologe Protein umfasst die konservierten Motive wie oben erwähnt. Die Gesamtsequenzidentität wird bestimmt mit einem allgemeinen Alignment-Algorithmus, wie dem Algorithmus von Needleman Wunsch in dem Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Default-Parametern. Verglichen mit der Gesamt-Sequenzidentität ist die Sequenzidentität im Allgemeinen höher, wenn nur konservierte Domänen oder Motive berücksichtigt werden. Die Sequenzkonservierung ist viel höher in dem Bereich der bHLH-Domäne (siehe Tabelle B2 in Beispiel 3 und 2). Daher ist die bHLH-Domäne ein gutes Kriterium zur Definition der Gruppe der bHLH6-ähnlichen Proteine. Das bHLH6-ähnliche Polypeptid umfasst vorzugsweise die Sequenz von Motiv 7 (SEQ ID NO: 9): PKKRGRKPANGREEPLNHVEAERQRREKLNQRFYALRAVVPNVSKMDKASLLGDAIAYINELKSKVVKTE oder eine Sequenz, die in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 9 aufweist. Die HLH-Domäne wie durch SMART bestimmt, überspannt den Rest 454 bis 503 in SEQ ID NO: 2 und ist in Motiv 7 enthalten.
  • Die Polypeptid-Sequenz, die bei der Verwendung in der Konstruktion eines Stammbaums verwendet wird, wie er in der 6 in Li et al. (2006) veranschaulicht ist, bildet vorzugsweise eher in der Subgruppe N (die die in SEQ ID NO: 2 veranschaulichte Aminosäuresequenz umfasst) Cluster, als mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Die genomische DNA-Sequenz, die das bHLH6-ähnliche Polypeptid codiert, umfasst vorzugsweise keine Introns.
  • Die Begriffe ”Domäne”, ”Signatur” und ”Motiv” sind im vorliegenden Text in dem Abschnitt ”Definitionen” definiert. Für die Identifikation von Domänen gibt es Spezialdatenbanken, zum Beispiel SMART (Schultz et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al. (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244, InterPro (Mulder et al. (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315–318, Prosite (Sucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences motifs und its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAIPress, Menlo Park; Hubo et al., Nucl. Acids Res. 32: D134–D137, (2004), oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30 (1): 276–280 (2002). Ein Satz Werkzeuge für die In-silico-Analyse von Proteinsequenzen findet sich auf dem ExPASY-Proteomics-Server (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003)). Domänen oder Motive können auch unter Verwendung von Routinetechniken, wie Sequenz-Alignment, identifiziert werden.
  • Verfahren für das Alignment von Sequenzen für Vergleichszwecke sind in der Fachwelt gut bekannt, dazu zählen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA. Bei GAP wird der Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453) verwendet, um das globale Alignment (d. h. das Alignment, das sich über die vollständigen Sequenzen erstreckt) von zwei Sequenzen zufinden, das die Anzahl der ”matches” maximiert und die Anzahl der ”gaps” minimiert. Beim BLAST-Algorithmus (Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10) wird die Sequenzidentität in Prozent berechnet, und es wird eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen durchgeführt. Die Software für die Durchführung einer BLAST-Analyse ist der Öffentlichkeit über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) zugänglich. Homologa können leicht unter Verwendung von zum Beispiel dem multiplen Sequenz-Alignment-Algorithmus ClustalW (Version 1.83) identifiziert werden, und zwar mit den Default-Parametern für paarweises Alignment und einer Scoring-Methode in Prozent. Die Gesamtprozentsätze der Ähnlichkeit und der Identität können auch unter Verwendung von einer der in dem MatGAT-Software-Paket verfügbaren Methoden bestimmt werden (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003, Juli 10; 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences.). Für eine Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven können, wie es dem Fachmann ersichtlich wird, kleine manuelle Veränderungen vorgenommen werden. Darüber hinaus können statt Volllängensequenzen für die Identifikation von Homologa auch spezifische Domänen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können mit den oben erwähnten Programmen unter Einstellung der Default-Parameter über die gesamte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz oder über ausgewählte Domänen oder konservierte Motiv(e) bestimmt werden. Für lokale Alignments ist der Smith-Waterman-Algorithmus besonders geeignet (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147 (1); 195–7).
  • Die bHLH6-ähnlichen Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) haben zudem gewöhnlich DNA-Bindungsaktivität. Werkzeuge und Techniken zum Messen der DNA-Bindungsaktivität sind im Stand der Technik bestens bekannt. Zudem ergibt wie erfindungsgemäß gezeigt ein bHLH6-ähnliches Protein, wie SEQ ID NO: 2, bei Überexpression in Reis, Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere Auflaufvitalität und/oder eine gesteigerte Anzahl Blüten pro Rispe. Andere Bioassays sind in Dombrecht et al. (Plant Cell 19, 2225–2245, 2007) angegeben. Weitere Einzelheiten sind im Abschnitt Beispiele gezeigt.
  • Die vorliegende Erfindung wird anhand der Transformation von Pflanzen mit der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Nukleinsäuresequenz, die die Polypeptidsequenz von SEQ ID NO: 2 kodiert, veranschaulicht. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt; die erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhafterweise durch Verwendung einer beliebigen bHLH6-ähnlichen kodierenden Nukleinsäure oder eines bHLH6-ähnlichen Polypeptids, wie hier definiert durchgeführt werden.
  • Beispiele für Nukleinsäuren, die bHLH6-ähnliche Polypeptide kodieren, sind in der Tabelle A1 von Beispiel 1 hierin beschrieben. Solche Nukleinsäuresequenzen eignen sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Die in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen sind Beispiel-Sequenzen für Orthologa und Paraloga des durch SEQ ID NO: 2 veranschaulichten bHLH6-ähnlichen Polypeptids, wobei die Begriffe ”Orthologa” und ”Paraloga” die hier definierte Bedeutung haben. Weitere Orthologa und Paraloga können leicht durch Durchführen einer so genannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. Dies beinhaltet typischerweise einen ersten BLAST, bei der mit einer Abfragesequenz (zum Beispiel eine der in Tabelle A1 von Beispiel 1 aufgeführten Sequenzen) ein ”BLASTing” gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird. BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) werden im Allgemeinen dann verwendet, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein Rück-BLASTing (zweiter BLAST) gegen Sequenzen des Organismus, von dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (ist die Abfragesequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2, dann wäre das zweite BLASTing daher gegen Arabidopsis thaliana-Sequenzen). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing werden dann verglichen. Ein Paralogon wird dann identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit von dem ersten BLASTing von der gleichen Art ist, von der die Abfragesequenz stammt, in diesem Fall führt ein Rück-BLASTing idealerweise zu der Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits; ein Orthologon wird dann identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit in dem ersten BLASTing nicht von der gleichen Art wie derjenigen, von der die Abfragesequenz stammt, ist, und führt vorzugsweise beim Rück-BLASTing dazu, dass die Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits ist.
  • Hochrangige Hits sind solche mit niedrigem E-Wert. Je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der ”Score” (oder, anders ausgedrückt, desto niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Hit durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist im Stand der Technik bekannt. Außer durch die E-Werte werden die Vergleiche auch anhand der Prozent Identität bewertet. Prozent Identität bezieht sich auf die Anzahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. Bei großen Familien kann man ClustalW und anschließend einen Neighbour-Joining-Stammbaum dazu verwenden, Cluster verwandter Gene leichter sichtbar zu machen und Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
  • Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren können auch Nukleinsäurevarianten geeignet sein. Zu solchen Varianten zählen beispielsweise Nukleinsäuren, die Homologe und Derivate von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen kodieren, wobei die Begriffe ”Homolog” und ”Derivat” wie hier definiert sind. Für die erfindungsgemäßen Verfahren sind auch Nukleinsäuren geeignet, die Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen kodieren. Homologe und Derivate, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische und funktionelle Aktivität auf wie das unmodifizierte Protein, von dem sie stammen.
  • Zu weiteren Nukleinsäurevarianten, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, zählen Abschnitte von Nukleinsäuren, die bHLH6-ähnliche Polypeptide kodieren, Nukleinsäuren, die mit Nukleinsäuren hybridisieren, die bHLH6-ähnliche Polypeptide kodieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuren, die bHLH6-ähnliche Polypeptide kodieren, allelische Varianten von Nukleinsäuren, die bHLH6-ähnliche Polypeptide kodieren, und Varianten von Nukleinsäuren, die bHLH6-ähnlichePolypeptide kodieren, die mittels ”gene shuffling” erhalten wurden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Spleißvariante, allelische Variante und ”gene shuffling” sind wie hier definiert.
  • Nukleinsäuren, die bHLH6-ähnliche Polypeptide kodieren, müssen keine Volllängen-Nukleinsäuren sein, da die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf die Verwendung von Volllängen-Nukleinsäuresequenzen angewiesen ist. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze einen Abschnitt von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Ein Abschnitt einer Nukleinsäure kann zum Beispiel dadurch hergestellt werden, dass man eine oder mehrere Deletionen an der Nukleinsäure durchführt. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder können an andere kodierende (oder nichtkodierende) Sequenzen fusioniert werden, um zum Beispiel ein Protein herzustellen, das mehrere Aktivitäten in sich vereinigt. Wenn es an andere kodierende Sequenzen fusioniert ist, kann das so erhaltene, nach der Translation hergestellte Polypeptid größer sein als für den Proteinabschnitt vorhergesagt wurde.
  • Abschnitte, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren ein bHLH6-ähnliches Polypeptid, wie hier definiert, und haben im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Nukleinsäuren oder um einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen kodiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt mindestens 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200; 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200 aufeinander folgende Nukleotide lang, wobei es sich bei den aufeinander folgenden Nukleotiden um eine beliebige der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Nukleinsäuresequenzen oder um eine Nukleinsäure handelt, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen kodiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1. Vorzugsweise kodiert der Abschnitt ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 6 in Li et al. (2006) dargestellten, verwendet wird, Cluster eher innerhalb der Subgruppe N (die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfasst) als mit irgendeiner anderen Gruppe bildet.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Nukleinsäure, die unter Bedingungen einer verringerten Stringenz, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, mit einer Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, oder mit einem Abschnitt, wie hier definiert, hybridisieren kann.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die mit einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren hybridisieren kann, einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure hybridisieren kann, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Nukleinsäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Hybridisierende Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren ein bHLH6-ähnliches Polypeptid, wie hier definiert, das im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität aufweist, wie die in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise kann die hybridisierende Sequenz mit einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Nukleinsäuren oder mit einem Abschnitt von einer dieser Sequenzen hybridisieren, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder die hybridisierende Sequenz kann mit einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen kodiert, hybridisieren. Am stärksten bevorzugt kann die hybridisierende Sequenz mit einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1 oder einem Abschnitt davon hybridisieren.
  • Vorzugsweise kodiert die hybridisierende Sequenz ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie eine Volllängensequenz ist und zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 6 in Li et al. (2006) dargestellten, verwendet wird, Cluster eher innerhalb der Subgruppe N (die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfasst) als mit irgendeiner anderen Gruppe bildet.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Spleißvariante, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, wobei eine Spleißvariante wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Spleißvariante von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Bei bevorzugten Spleißvarianten handelt es sich um Spleißvarianten einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog der SEQ ID NO: 2 kodiert. Vorzugsweise bildet die Aminosäuresequenz, die von der Spleißvariante kodiert wird, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 6 in Li et al. (2006) dargestellten, verwendet wird, Cluster eher innerhalb der Subgruppe N (die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfasst) als mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, wobei eine allelische Variante wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine allelische Variante von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Die Polypeptide, die von allelischen Varianten kodiert werden, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, haben im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie das bHLH6-ähnliche Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2 und irgendeine der in Tabelle A1 von Beispiel 1 dargestellten Aminosäuren. Allelische Varianten kommen in der Natur vor und von den erfindungsgemäßen Verfahren wird die Verwendung dieser natürlichen Allele mit umfasst. Vorzugsweise handelt es sich bei der allelischen Variante um eine allelische Variante gemäß SEQ ID NO: 1 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog der SEQ ID NO: 2 kodiert. Vorzugsweise bildet die Aminosäuresequenz, die von der allelischen Variante kodiert wird, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 6 in Li et al. (2006) dargestellten, verwendet wird, Cluster eher innerhalb der Subgruppe N (die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfasst) als mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • ”Gene shuffling” oder gerichtete Evolution kann ebenfalls dazu verwendet werden, Varianten von Nukleinsäuren herzustellen, die bHLH6-ähnliche Polypeptide, wie oben definiert, kodieren, wobei der Begriff ”gene shuffling” wie hier definiert ist. Pattanaik et al. (BBA1759, 308–318, 2006) geben ein Beispiel für eine Optimierung von bHLH-Proteinen. Dieser Ansatz kann zur Selektion optimierter bHLH6-ähnlicher Proteine verwendet werden, die zur Verstärkung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen verwendbar sind.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert, wobei die Nukleinsäurevariante mittels ”gene shuffling” erhalten wird.
  • Vorzugsweise bildet die Aminosäuresequenz, die von der durch gene shuffling erhaltenen Nukleinsäurevariante kodiert wird, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 6 in Li et al. (2006) dargestellten, verwendet wird, Cluster eher innerhalb der Subgruppe N (die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfasst) als mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Nukleinsäurevarianten können weiterhin auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Zur Erzielung einer ortsgerichteten Mutagenese stehen mehrere Verfahren zur Verfügung, von denen die üblichsten Verfahren auf PCR-Basis sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Hrsg.).
  • Nukleinsäuren, die bHLH6-ähnliche Polypeptide kodieren, können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle stammen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form in ihrer Zusammensetzung und/oder genomischen Umgebung durch gezielte Manipulation durch den Menschen modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, weiterhin bevorzugt aus einer zweikeimblättrigen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Arabidopsis thaliana.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen. Insbesondere führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” sind hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Werden hier verbesserte Ertragsmerkmale erwähnt, so soll dies eine Erhöhung der Biomasse (des Gewichts) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, was oberirdische (erntbare) Teile und/oder (erntbare) unterirdische Teile beinhalten kann. Insbesondere sind solche erntbaren Teile Samen, und die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu dem Samenertrag von Kontrollpflanzen. Es sollte beachtet werden, dass die erhöhten Ertragsmerkmale keine erhöhte Resistenz gegenüber osmotischem Stress, erhöhte Resistenz gegen oxidativen Stress oder erhöhte Resistenz gegen Insekten beinhalten.
  • Wählt man Mais als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung als eines oder mehrere der folgenden Merkmale äußern: Unter anderem eine erhöhte Anzahl an Pflanzen, die pro Quadratmeter wachsen, eine Erhöhung der Anzahl an Ähren pro Pflanze, eine Erhöhung der Anzahl an Reihen, der Anzahl an Körnern pro Reihe, des Korngewichts, des Tausendkorngewichts, der Ährenlänge/des Ährendurchmessers, eine Erhöhung der Samenfüllungsrate (d. h. der Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl der Samen und multipliziert mit 100). Wählt man Reis als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung als eine Erhöhung eines oder mehrerer der folgenden Merkmale ausdrücken: Unter anderem Anzahl der Pflanzen pro Quadratmeter, Anzahl der Rispen pro Pflanze, Anzahl der Ährchen pro Rispe, Anzahl der Blüten (Einzelblüten) pro Rispe (ausgedrückt als Verhältnis der Anzahl an gefüllten Samen zu der Anzahl an Primärrispen), erhöhte Samenfüllungsrate (d. h. erhöhte Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100), erhöhtes Tausendkorngewicht.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, insbesondere des Samenertrags von Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, moduliert.
  • Weil die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen einen erhöhten Ertrag aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen (zumindest während eines Teils ihres Lebenszyklus) eine höhere Wachstumsrate aufweisen als Kontrollpflanzen in einem entsprechenden Stadium ihres Lebenszyklus.
  • Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (darunter Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen in der ganzen Pflanze stattfinden. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Unter dem Lebenszyklus einer Pflanze kann man diejenige Zeit verstehen, die die Pflanze benötigt, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, in dem die Pflanze trockene reife Samen ähnlich dem Ausgangsmaterial produziert hat. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren, wie Jungpflanzenvitalität, Wachstumsrate, ”Greenness index”, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung, beeinflusst werden. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann in einem Stadium oder in mehreren Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Lebenszyklus der Pflanze erfolgen. Eine erhöhte Wachstumsrate während der Frühstadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann verbesserte Vitalität widerspiegeln. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, so dass die Pflanzen später gesät werden können und/oder früher geerntet werden können als dies sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt lässt sich mit einer früheren Blütezeit erzielen). Ist die Wachstumsrate ausreichend erhöht, kann dies weiteres Aussäen von Samen derselben Pflanzenart ermöglichen (zum Beispiel Aussäen und Ernten von Reispflanzen und anschließendes Aussäen und Ernten von weiteren Reispflanzen sogar innerhalb einer herkömmlichen Wachstumsperiode). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, kann dies ebenso das weitere Aussäen von Samen anderer Pflanzenarten ermöglichen (zum Beispiel das Aussäen und Ernten von Maispflanzen und anschließend zum Beispiel Aussäen und gegebenenfalls Ernten von Sojabohne, Kartoffel oder einer anderen geeigneten Pflanze). Auch mehrmalige weitere Ernten von demselben Wurzelstock können bei einigen Kulturpflanzen möglich sein. Eine Veränderung des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Quadratmeter führen (weil man eine bestimmte Pflanze öfter (z. B. pro Jahr) heranziehen und ernten kann). Eine erhöhte Wachstumsrate kann auch dazu führen, dass man transgene Pflanzen in einem breiteren geographischen Bereich als ihre Wildtyp-Gegenstücke anbauen kann, da die räumlichen Beschränkungen für den Anbau einer Kultur häufig von ungünstigen Umweltbedingungen entweder während der Pflanzzeit (früh in der Saison) oder während der Erntezeit (spät in der Saison) bestimmt werden. Solche ungünstigen Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt ist. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten verschiedener Parameter aus Wachstumskurven bestimmt werden, wobei die Parameter u. a. folgende sein können: T-Mid (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 50% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und T-90 (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 90% ihrer Maximalgröße zu erreichen).
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit einer im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Wachstumsrate. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, moduliert.
  • Eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate tritt unabhängig davon auf, ob die Pflanze unter Nichtstressbedingungen steht oder ob die Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen verschiedenen Stressbedingungen unterworfen wird. Üblicherweise reagieren Pflanzen auf Stress dadurch, dass sie langsamer wachsen. Unter starken Stressbedingungen kann die Pflanze sogar ihr Wachstum völlig einstellen. Leichter Stress ist dagegen hier als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist und der nicht dazu führt, dass die Pflanze völlig aufhört zu wachsen, ohne dass sie die Fähigkeit besitzt, ihr Wachstum wieder aufzunehmen. Leichter Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, stärker bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger im Vergleich zu der Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Aufgrund von Fortschritten bei den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerung, Düngung, Pestizidbehandlungen) findet man bei angebauten Kulturpflanzen nicht oft starke Stressbedingungen. Infolgedessen ist das durch leichten Stress induzierte geschwächte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal in der Landwirtschaft. Leichte Stressbedingungen sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (Umwelt-)Stressbedingungen, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotische Stressbedingungen können durch Trockenheit oder Wasserüberschuss, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Gefriertemperaturen verursacht werden. Bei dem abiotischen Stress kann es sich um einen osmotischen Stress handeln, der durch Wasserstress (insbesondere aufgrund von Trockenheit), Salzstress, oxidativen Stress oder ionenbedingten Stress verursacht wird. Unter biotischem Stress versteht man gewöhnlich Stressbedingungen, die durch Pathogene, wie Bakterien, Viren, Pilze, Nematoden und Insekten, verursacht werden.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren können insbesondere unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen durchgeführt werden, wobei man Pflanzen erhält, deren Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöht ist. Wie von Wang et al. (Planta (2003), 218: 1–14) beschrieben, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenproduktivität negativ beeinflussen. Es ist bekannt, dass Trockenheit, Salinität, extreme Temperaturen und oxidativer Stress miteinander in Verbindung stehen und über ähnliche Mechanismen Wachstums- und Zellschäden induzieren können. Rabbani et al., (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767) beschreiben ein besonders hohes Ausmaß an gegenseitiger Beeinflussung (”Cross-Talk”) von Trockenheitsstress und durch hohe Salinität verursachtem Stress. Zum Beispiel äußern sich Trockenheit und/oder Versalzung in erster Linie als osmotischer Stress, was zu einer Störung der Homöostase und der Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, der häufig hohe oder niedrige Temperaturen, Salinität oder Trockenheitsstress begleitet, kann zur Denaturierung von funktionellen und strukturellen Proteinen führen. Infolgedessen aktivieren diese verschiedenen Umweltstressbedingungen häufig ähnliche Zellsignalwege und Zellreaktionen, wie die Produktion von Stressproteinen, die Hinaufregulation von Antioxidantien, die Akkumulation von kompatiblen gelösten Stoffen und ein Einstellen des Wachstums. Der Begriff ”Nichtstress”-Bedingungen, wie hier verwendet, steht für diejenigen Umweltbedingungen, die ein optimales Wachstum von Pflanzen gestatten. Der Fachmann ist mit normalen Bodenbedingungen und Klimabedingungen für einen bestimmten Standort vertraut.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verleiht Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen herangezogen werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags bei Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen herangezogen werden, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren die Expression einer Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodiert, in einer Pflanze moduliert.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verleiht Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, herangezogen werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags bei Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen herangezogen werden, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren die Expression einer Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodiert, in einer Pflanze moduliert. Ein Nährstoffmangel kann durch ein Fehlen von Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, hervorgerufen werden.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (einschließlich Samen), die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon umfassen ein Nukleinsäuretransgen, das ein bHLH6-ähnliches Polypeptid, wie oben definiert, kodiert.
  • Die Erfindung stellt auch Genkonstrukte und Vektoren bereit, um die Einführung und/oder Expression von Nukleinsäuren, die bHLH6-ähnliche Polypeptide kodieren, in Pflanzen zu erleichtern. Die Genkonstrukte können in Vektoren eingefügt werden, die im Handel erhältlich sein können und für die Transformation in Pflanzen und für die Expression des interessierenden Gens in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines Genkonstrukts, wie hier definiert, bei den erfindungsgemäßen Verfahren bereit.
  • Genauer gesagt, stellt die vorliegende Erfindung ein Konstrukt bereit, das Folgendes umfasst:
    • (a) eine Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodiert, wie oben definiert;
    • (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz unter (a) vorantreiben können, und gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  • Vorzugsweise ist die Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodiert, wie vorstehend definiert. Die Begriffe ”Kontrollsequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hier definiert.
  • Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der eine der oben beschriebenen Nukleinsäuren umfasst. Der Fachmann kennt die genetischen Elemente, die in einem Vektor vorhanden sein müssen, damit Wirtszellen, die die interessierende Sequenz enthalten, erfolgreich transformiert, selektiert und vermehrt werden können. Die interessierende Sequenz ist mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen (mindestens mit einem Promoter) funktionsfähig verbunden.
  • Jede Art von Promoter, ob natürlich oder synthetisch, kann vorteilhaft für das Vorantreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz verwendet werden. Ein konstitutiver Promoter pflanzlichen Ursprungs ist für die Verfahren besonders geeignet. Vorzugsweise ist der konstitutive Promotor außerdem ein ubiquitärer Promotor. Die Definitionen der verschiedenen Promotertypen siehe hier im Abschnitt ”Definitionen”. Der konstitutive pflanzliche Promotor ist vorzugsweise ein Promotor mittlerer Stärke und weniger stark als der 35S-Promotor des CaMV.
  • Es sollte selbstverständlich sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung weder auf die erfindungsgemäße, ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodierende Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1 noch auf die Expression einer ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodierenden Nukleinsäure, wenn sie von einem konstitutiven Promotor angetrieben wird, beschränkt ist.
  • Der konstitutive Promotor ist vorzugsweise ein GOS2-Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor aus Reis. Weiterhin bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen der SEQ ID NO: 12 gleicht, am stärksten bevorzugt wird der Protomotor durch die SEQ ID NO: 12 wiedergegeben. Weitere Beispiele für konstitutive Promotoren siehe hier in Tabelle 2a im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Gegebenenfalls kann/können eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem Konstrukt, das in eine Pflanze eingeführt wird, verwendet werden. Vorzugsweise umfasst das Konstrukt eine Expressionskassette, die im Wesentlichen ähnlich oder identisch zu der SEQ ID NO 56 ist, die den GOS2-Promotor und die Nukleinsäure, die das bHLH6-ähnliche Polypeptid kodiert, umfasst.
  • Weitere Regulationselemente können u. a. Transkriptionsenhancer und Translationsenhancer sein. Der Fachmann ist mit Terminator- und Enhancersequenzen vertraut, die für die Verwendung bei der Durchführung der Erfindung geeignet sein können. Es kann auch eine Intronsequenz zu der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder der kodierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge an reifer Botschaft, die im Cytosol akkumuliert, zu erhöhen, wie im Abschnitt Definitionen beschrieben ist. Weitere Kontrollsequenzen (neben Promotor-, Enhancer-, Silencer-, Intronsequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Solche Sequenzen sind dem Fachmann bekannt oder können von ihm leicht erhalten werden.
  • Die erfindungsgemäßen Genkonstrukte können weiterhin eine Replikationsursprungssequenz beinhalten, die für die Aufrechterhaltung und/oder die Replikation in einem bestimmten Zelltyp erforderlich ist. Ein Beispiel ist, wenn ein Genkonstrukt in einer Bakterienzelle als episomales genetisches Element (z. B. ein Plasmid- oder Cosmidmolekül) aufrechterhalten werden muss. Bevorzugte Replikationsursprünge sind u. a. der f1-ori und colE1, sie sind jedoch nicht hierauf beschränkt.
  • Für den Nachweis eines erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie sie bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, und/oder für die Selektion transgener Pflanzen, die diese Nukleinsäuren umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (oder Reportergene) zu verwenden. Daher kann das Genkonstrukt gegebenenfalls ein Selektionsmarkergen umfassen. Selektionsmarker sind hier im Abschnitt ”Definitionen” eingehender beschrieben. Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder ausgeschnitten werden, wenn sie nicht mehr benötigt werden. Techniken zur Entfernung von Markern sind im Stand der Technik bekannt, geeignete Techniken sind vorstehend im Abschnitt Definitionen beschrieben.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodiert, wie hier vorstehend definiert, einführt und exprimiert.
  • Genauer gesagt, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhten verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere erhöhter Auflaufvitalität und/oder erhöhtem Samenertrag bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    • (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze oder Pflanzenzelle und
    • (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung fördern.
  • Bei der Nukleinsäure unter (i) kann es sich um eine der Nukleinsäuren handeln, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid, wie hier definiert, kodieren können.
  • Die Nukleinsäure kann direkt in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst eingeführt werden (was das Einführen in ein Gewebe, Organ oder einen irgendeinen anderen Teil einer Pflanze beinhaltet). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure vorzugsweise mittels Transformation in eine Pflanze eingeführt. Der Begriff ”Transformation” ist hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können durch alle Verfahren regeneriert werden, mit denen der Fachmann vertraut ist. Geeignete Verfahren finden sich in den oben genannten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
  • Im Allgemeinen werden nach der Transformation die Pflanzenzellen oder Zellgruppierungen hinsichtlich des Vorhandenseins von einem oder mehreren Markern selektiert, die von Genen kodiert werden, die in Pflanzen exprimierbar sind und die mit dem interessierenden Gen co-transferiert wurden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Für die Selektion von transformierten Pflanzen wird das bei der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial in der Regel derartigen Selektionsbedingungen unterworfen, dass man transformierte Pflanzen von untransformierten Pflanzen unterscheiden kann. So können zum Beispiel Samen, die auf die oben beschriebene Weise erhalten wurden, ausgepflanzt werden und nach einer anfänglichen Wachstumsphase einer geeigneten Selektion durch Spritzen unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass man die Samen, gegebenenfalls nach Sterilisieren, auf Agarplatten unter Verwendung eines geeigneten Selektionsmittels heranzieht, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ wird das Vorhandensein eines Selektionsmarkers, wie die oben beschriebenen, in den transformierten Pflanzen mittels Screening ermittelt.
  • Nach DNA-Transfer und Regeneration können mutmaßlich transformierte Pflanzen auch zum Beispiel unter Verwendung der Southern-Analyse hinsichtlich des Vorhandenseins des interessierenden Gens, der Kopienzahl und/oder der Genomorganisation untersucht werden. Alternativ oder zusätzlich können die Expressionsniveaus der neu eingeführten DNA unter Verwendung von Northern- und/oder Western-Analyse verfolgt werden, wobei beide Techniken dem Durchschnittsfachmann bekannt sind.
  • Die erzeugten transformierten Pflanzen können durch eine Vielzahl von Mitteln vermehrt werden, wie durch klonale Vermehrung oder klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (T1-Pflanze) geselbstet werden, und homozygote Transformanten der zweiten Generation (T2-Pflanzen) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann unter Verwendung klassischer Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten transformierten Organismen können in einer Vielzahl von Formen vorliegen. So kann es sich zum Beispiel um Chimären von transformierten Zellen und untransformierten Zellen, klonale Transformanten (z. B. dass alle Zellen so transformiert wurden, dass sie die Expressionskassette enthalten), Pfropfmaterial von transformiertem und untransformiertem Gewebe (z. B. bei Pflanzen ein transformierter Wurzelstock, der auf ein untransformiertes Edelreis gepfropft wurde) handeln.
  • Die vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf jede Pflanzenzelle oder Pflanze, die durch eines der hier beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, und auf alle Pflanzenteile und sämtliches Vermehrungsmaterial davon. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Nachkommenschaft eine(r/s) primär transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, die/das durch eines der oben genannten Verfahren hergestellt wurde, wobei die einzige Voraussetzung ist, dass die Nachkommenschaft dasselbe/dieselben genotypische(n) und/oder phänotypische(n) Merkmal(e) aufweist, wie es/sie der Elter bei den erfindungsgemäßen Verfahren zeigt.
  • Die Erfindung beinhaltet auch Wirtszellen, die eine isolierte Nukleinsäure enthalten, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die Nukleinsäuren oder den Vektor, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor sind im Prinzip vorteilhafterweise alle Pflanzen, welche die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide synthetisieren können.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich vorteilhafterweise auf jede beliebige Pflanze anwenden. Zu den Pflanzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren besonders geeignet sind, gehören alle Pflanzen, die zur Superfamilie der Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, einschließlich Futter- oder Weidepflanzenleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelkulturen, Bäume oder Sträucher. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze. Beispiele für Kulturpflanzen sind zum Beispiel u. a. Sojabohne, Sonnenblume, Canola, Luzerne, Raps, Lein, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiterhin bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um eine monokotyle Pflanze. Beispiele für monokotyle Pflanzen sind zum Beispiel u. a. Zuckerrohr. Stärker bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um ein Getreide. Beispiele für Getreide sind zum Beispiel u. a. Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Zwerghirse, Mohrenhirse und Hafer.
  • Die Erfindung erstreckt sich auch auf erntbare Teile einer Pflanze, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Wurzeln, Rhizome, Knollen und Zwiebeln. Die Erfindung betrifft weiterhin Produkte, die, vorzugsweise direkt, von einem erntbaren Teil einer solchen Pflanze stammen, wie trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der Erfindung handelt es sich bei der modulierten Expression um erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuren oder Genen oder Genprodukten sind im Stand der Technik beschrieben und Beispiele werden im Abschnitt Definitionen gegeben.
  • Wie vorstehend erwähnt, ist ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodiert, durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze; die Wirkungen der Durchführung des Verfahrens, d. h. das Verbessern von Ertragsmerkmalen, können jedoch auch unter Verwendung anderer bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken findet sich im Abschnitt Definitionen.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nukleinsäuren, die bHLH6-ähnliche Polypeptide, wie hier beschrieben, kodieren, und die Verwendung dieser bHLH6-ähnlichen Polypeptide zur Verbesserung eines der oben genannten Ertragsmerkmale in Pflanzen.
  • Hier beschriebene Nukleinsäuren, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodieren, oder die bHLH6-ähnlichen Polypeptide selbst können Verwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der mit einem Gen, das ein bHLH6-ähnliches Polpeptid kodiert, genetisch verknüpft sein kann. Die Nukleinsäuren/Gene oder die bHLH6- ähnlichen Polypeptide selbst können dazu verwendet werden, einen molekularen Marker zu bestimmen. Dieser DNA- oder Protein-Marker kann dann in Züchtungsprogrammen zur Selektion von Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen verwendet werden, wie hier vorstehend bei den erfindungsgemäßen Verfahren definiert.
  • Allelische Varianten einer Nukleinsäure/eines Gens, die/das ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodiert, können ebenfalls Verwendung in Marker-unterstützten Züchtungsprogrammen finden. Bei solchen Züchtungsprogrammen ist manchmal das Einführen von allelischer Variation durch Mutagenbehandlung der Pflanzen erforderlich, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese verwendet wird; alternativ kann das Programm von einer Sammlung von allelischen Varianten so genannten ”natürlichen” Ursprungs ausgehen, die nicht mit Absicht hervorgerufen wurden. Dann erfolgt die Identifikation allelischer Varianten, zum Beispiel mittels PCR. Darauf folgt ein Schritt zur Selektion besserer allelischer Varianten der in Frage kommenden Sequenz, die bessere Erträge liefern. Die Selektion wird gewöhnlich durchgeführt, indem man die Wachstumsleistung von Pflanzen verfolgt, die verschiedene allelische Varianten der in Frage kommenden Sequenz enthalten. Die Wachstumsleistung kann im Gewächshaus oder auf dem Feld verfolgt werden. Weitere Schritte sind gegebenenfalls u. a. das Kreuzen der Pflanzen, in denen die bessere allelische Variante identifiziert wurde, mit einer anderen Pflanze. Dies kann zum Beispiel zur Herstellung einer Kombination interessanter phänotypischer Merkmale verwendet werden.
  • Nukleinsäuren, die bHLH6-ähnliche Polypeptide kodieren, können auch als Sonden zur genetischen und physikalischen Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, und als Marker für Merkmale, die mit diesen Genen verknüpft sind, verwendet werden. Diese Information kann für die Pflanzenzüchtung nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwickeln. Eine solche Verwendung von Nukleinsäuren, die bHLH6-ähnliche Polypeptide kodieren, erfordert nur eine Nukleinsäuresequenz mit einer Länge von mindestens 15 Nukleotiden. Die Nukleinsäuren, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodieren, können als Marker für Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J, Fritsch EF und Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laborstory Manual) von restriktionsgespaltener genomischer Pflanzen-DNA können mit den Nukleinsäuren, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodieren, sondiert werden. Die erhaltenen Bandenmuster können dann genetischen Analysen unter Verwendung von Computerprogrammen, wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181), unterworfen werden, wodurch eine Genkarte erstellt wird. Außerdem können die Nukleinsäuren zum Sondieren von Southern-Blots verwendet werden, die restriktionsendonukelasebehandelte genomische DNAs von einem Satz von Individuen enthalten, die den Elter und die Nachkommen einer bestimmten genetischen Kreuzung darstellen. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird ermittelt und dazu verwendet, die Position der Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodiert, in der zuvor unter Verwendung dieser Population erhaltenen Genkarte zu berechnen (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
  • Die Herstellung und Verwendung von Sonden, die von Pflanzengenen stammen, für die Verwendung bei der genetischen Kartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung spezifischer cDNA-Klone, wobei die vorstehend erläuterte Methodik oder Varianten davon verwendet werden. Für die Kartierung können zum Beispiel F2-Inzuchtpopulationen, Rückkreuzungspopulationen, zufallsgemäß gepaarte Populationen, nahezu isogene Linien und andere Sätze von Individuen verwendet werden. Diese Methodik ist dem Fachmann bekannt.
  • Die Nukleinsäuresonden können auch zur physikalischen Kartierung (d. h. zum Anordnen von Sequenzen in physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346 und darin genannte Bezugsstellen) verwendet werden.
  • In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden bei der Kartierung mittels direkter Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154) verwendet werden. Zwar bevorzugen derzeitige FISH-Kartierungsverfahren die Verwendung großer Klone (mehrere kb bis mehrere Hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20), aber durch Verbesserungen in der Empfindlichkeit kann die FISH-Kartierung auch unter Verwendung kürzerer Sonden durchgeführt werden.
  • Eine Reihe von Verfahren auf Basis von Nukleinsäureamplifikation für die genetische und physikalische Kartierung kann unter Verwendung der Nukleinsäuren durchgeführt werden. Beispiele sind u. a. die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), Polymorphismus PCR-amplifizierter Fragmente (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotidverlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Radiation-Hybrid-Kartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy-Kartierung (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Bei diesen Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäure dazu verwendet, Primer-Paare zu gestalten und herzustellen, die bei der Amplifikationsreaktion oder bei Primerverlängerungsreaktionen verwendet werden. Die Gestaltung dieser Primer ist dem Fachmann bekannt. Bei Verfahren, die eine genetische Kartierung auf PCR-Basis einsetzen, kann es notwendig sein, dass man DNA-Sequenz-Unterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in dem Bereich identifiziert, welcher der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch für Kartierungsverfahren nicht allgemein erforderlich.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren führen zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, wie hier vorstehend beschrieben. Diese Merkmale können auch mit anderen ökonomisch vorteilhaften Merkmalen, wie weiteren Ertragsmerkmalen, Toleranz gegenüber anderen abiotischen und biotischen Stressbedingungen, Merkmalen, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemische und/oder physiologische Merkmale modifizieren, kombiniert werden.
  • In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung einen wie folgt zusammengefassten Gegenstand:
    • Punkt 1: Ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodiert, moduliert, wobei das bHLH6-ähnliche Polypeptid eine HLH-Domäne umfasst.
    • Punkt 2: Ein Verfahren gemäß Punkt 1, wobei das bHLH6-ähnliche Polypeptid ein oder mehrere der folgenden Motive umfasst: Motiv 1 (SEQ ID NO: 3), Motiv 2 (SEQ ID NO: 4), Motiv 3: (SEQ ID NO: 5) Motiv 7 (SEQ ID NO: 9) oder eine Sequenz, die mindestens 80% Sequenzidentität mit der SEQ ID NO: 9 besitzt.
    • Punkt 3: Verfahren nach Punkt 1 oder 2, wobei die modulierte Expression dadurch erreicht wird, dass man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodiert, einführt und exprimiert.
    • Punkt 4: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei die Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodiert, eines der in Tabelle A1 aufgelisteten Proteine kodiert oder ein Abschnitt einer solchen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure, die mit einer solchen Nukleinsäure hybridisieren kann, ist.
    • Punkt 5: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle A1 angegebenen Proteine kodiert.
    • Punkt 6: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale erhöhten Ertrag, vorzugsweise erhöhte Auflaufvitalität und/oder erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
    • Punkt 7: Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 6, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
    • Punkt 8: Verfahren nach einem der Punkte 3 bis 7, wobei die Nukleinsäure mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt einem GOS2-Promotor aus Reis, funktionsfähig verbunden ist.
    • Punkt 9: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei die Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze stammt, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, am stärksten bevorzugt aus Arabidopsis thaliana.
    • Punkt 10: Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die durch ein Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt erhältlich sind, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodiert.
    • Punkt 11: Konstrukt, umfassend:
    • (a) eine Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodiert, nach den Punkten 1 oder 2;
    • (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz unter (a) vorantreiben können; und gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
    • Punkt 12: Konstrukt nach Punkt 11, wobei eine der Kontrollsequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis, ist.
    • Punkt 13: Verwendung eines Konstrukts nach Punkt 11 oder 12 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigerter Auflaufvitalität und/oder gesteigertem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • Punkt 14: Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die mit einem Konstrukt nach Punkt 10 oder 11 transformiert sind.
    • Punkt 15: Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend:
    • (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid nach Punkt 1 oder 2 kodiert, in eine(r) Pflanze; und
    • (ii) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze fördern.
    • Punkt 16: Transgene Pflanze mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, der aus einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid nach Punkt 1 oder 2 kodiert, resultiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die von der transgenen Pflanze stammt.
    • Punkt 17: Transgene Pflanze nach Punkt 10, 14 oder 16 oder eine daraus stammende transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Zwerghirse, Mohrenhirse und Hafer, ist.
    • Punkt 18: Erntbare Teile einer Pflanze nach Punkt 17, wobei die erntbaren Teile vorzugsweise die Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
    • Punkt 19: Produkte, die von einer Pflanze nach Punkt 17 und/oder von erntbaren Teilen einer Pflanze nach Punkt 19 stammen.
    • Punkt 20: Verwendung einer Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodiert, zur Steigerung des Ertrags, insbesondere zur Steigerung des Samenertrags und/oder der Sprossbiomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wurde jetzt gefunden, dass die Modulation der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze, wobei es sich bei dem GRP-Polypeptid um ein RrmJ/FtsJ-Ribosomen-RNA-Methyltransferase- Polypeptid handelt, zu Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen führt. In einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei man die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, wobei es sich bei dem GRP-Polypeptid um ein RrmJ/FtsJ-Ribosomen-RNA-Methyltransferase-Polypeptid (RrmJ/FtsJ-Polypeptid) handelt, in einer Pflanze moduliert.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, besteht darin, dass man eine Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, in eine Pflanze einbringt und in dieser exprimiert.
  • In einer Ausführungsform soll jede Bezugnahme im folgenden Text auf ein ”Protein, das für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” so aufgefasst werden, dass damit ein GRP-Polypeptid, wie hier definiert, gemeint ist. In derselben Ausführungsform soll jede Bezugnahme im folgenden Text auf eine ”Nukleinsäure, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” so aufgefasst werden, dass dies eine Nukleinsäuresequenz bedeutet, die ein solches GRP-Polypeptid kodieren kann. In einer Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz, die in eine Pflanze eingeführt werden soll (und die daher zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist), jede beliebige Nukleinsäuresequenz, welche den Typ Protein kodiert, der im Folgenden beschrieben wird, und wird im Folgenden auch als ”GRP-Nukleinsäure” oder ”GRP-Gen” bezeichnet.
  • In einer Ausführungsform betrifft ein ”GRP-Polypeptid”, wie hier definiert, die Proteine, die durch SEQ ID NO: 58, durch SEQ ID NO: 60 wiedergegeben werden, und Homologe (Orthologe und Paraloge) dieser Proteine. In Tabelle A2 von Beispiel 1 sind solche Orthologe und Paraloge dargestellt.
  • Vorzugsweise haben die Homologe der SEQ ID NO: 58 oder der SEQ ID NO: 60 eine Ribosomen-RNA-Methyltransferase-RrmJ/FtsJ-Domäne (InterPro-Einträge IPR002877 und IPR015507; Pfam-Eintrag PF01728; PANTHER-Eintrag PTHR10920).
  • Alternativ oder zusätzlich betrifft ein ”GRP-Polypeptid”, wie hier definiert, ein beliebiges Polypeptid, das in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Polypeptidsequenzidentität mit dem GRP-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 58 oder gemäß SEQ ID NO: 60 oder mit einer der hier in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen aufweist.
  • In einer Ausführungsform nutzen die erfindungsgemäßen Verfahren ein partielles GRP-Polypeptid, wobei das Polypeptid ein RrmJ/FtsJ-Polypeptid ist. GRP-Polypeptide können anhand des Vorhandenseins von einem oder mehreren bekannten Merkmalen (siehe oben) identifiziert werden. Nach der Identifikation eines GRP-Polypeptids kann ein Fachmann leicht unter Verwendung von Routinetechniken eine entsprechende partielle GRP-kodierende Nukleotidsequenz ableiten, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist.
  • Der Begriff ”Domäne” und ”Motiv” wird hier im Abschnitt ”Definitionen” definiert. Für die Identifikation von Domänen gibt es Spezialdatenbanken, zum Beispiel SMART (Schultz et al., (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al., (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244, InterPro (Mulder et al., (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315–318, Prosite (Sucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences motifs und its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53-61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids Res. 32: D134–D137, (2004)) oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30 (1): 276–280 (2002). Ein Satz von Werkzeugen für die In-silico-Analyse von Proteinsequenzen ist auf dem ExPASY-Proteomics-Server verfügbar (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003)). Domänen oder Motive können auch unter Verwendung von Routinetechniken, wie Sequenz-Alignment, identifiziert werden.
  • Verfahren für das Alignment von Sequenzen für Vergleichszwecke sind im Stand der Technik bekannt, dazu zählen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA. Bei GAP wird der Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453) dazu verwendet, das globale Alignment (d. h. das Alignment, das sich über die vollständigen Sequenzen erstreckt) von zwei Sequenzen zu finden, das die Anzahl der Übereinstimmungen (”matches”) maximiert und die Anzahl der Lücken (”gaps”) minimiert. Beim BLAST-Algorithmus (Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10) wird die Sequenzidentität in Prozent berechnet, und es wird eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen durchgeführt. Die Software für die Durchführung einer BLAST-Analyse ist über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) öffentlich zugänglich. Homologe können zum Beispiel unter Verwendung des multiplen Sequenz-Alignment-Algorithmus ClustalW (Version 1.83) leicht identifiziert werden, und zwar mit den Default-Parametern für paarweises Alignment und einer Scoring-Methode in Prozent. Die Gesamtprozent an Ähnlichkeit und Identität können auch unter Verwendung eines der im MatGAT-Software-Paket verfügbaren Verfahren bestimmt werden (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003, Juli 10; 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences.). Für eine Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven können kleinere Änderungen per Hand vorgenommen werden, wie dem Fachmann klar ist. Weiterhin können anstelle von Volllängensequenzen auch spezifische Domänen für die Identifikation von Homologen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können mit den oben erwähnten Programmen unter Verwendung der Default-Parameter über die gesamte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz oder über ausgewählte Domänen oder (ein) konservierte(s) Motiv(e) bestimmt werden.
  • Außerdem können GRP-Polypeptide, soweit sie der SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60 und ihren Homologen entsprechen, üblicherweise die Fähigkeit besitzen, 23 S-Ribosomen-RNA an der Position U2552 an der Aminoacyl-(A)1-Stelle des Ribosoms zu methylieren, jedoch nur, wenn die 23 S-rRNA in 50 S-Ribosomenuntereinheiten vorliegt. Werkzeuge und Techniken zur Untersuchung der rRNA-Methyltransferase-Aktivität sind im Stand der Technik bekannt, siehe zum Beispiel Hager et al. (2004) J Bacteriol 186 (19): 6634–6642.
  • Die vorliegende Erfindung wird dadurch veranschaulicht, dass man Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 57, welche die Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 58 kodiert, transformiert. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhaft unter Verwendung jeder beliebigen Nukleinsäure, die ein GRP-Polypeptid kodiert, oder des GRP-Polypeptids, wie hier definiert, durchgeführt werden.
  • Beispiele für Nukleinsäuren, die GRP-Polypeptide kodieren, können in im Stand der Technik bekannten Datenbanken gefunden werden. Solche Nukleinsäuren eignen sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Orthologe und Paraloge, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind, können leicht mittels Durchführen eines so genannten reziproken Blasting identifiziert werden. Dies beinhaltet üblicherweise ein erstes BLASTing, bei dem mit einer Abfragesequenz (zum Beispiel mit der SEQ ID NO: 58 oder SEQ ID NO: 60) ein BLASTing gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird. BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) werden im Allgemeinen verwendet, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein zweites BLASTing gegen Sequenzen des Organismus, aus dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (ist die Abfragesequenz die SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 oder SEQ ID NO: 60, dann wäre das zweite BLASTing daher gegen Sequenzen aus Nicotiana tabacum). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit von dem ersten BLASTing aus derselben Art stammt wie die Abfragesequenz, in diesem Fall führt ein zweites BLASTing idealerweise zu der Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit in dem ersten BLASTing nicht von derselben Art stammt wie die Abfragesequenz, und führt vorzugsweise beim zweiten BLASTing dazu, dass die Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits ist.
  • Hochrangige Hits sind solche mit niedrigem E-Wert. Je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der ”Score” (anders ausgedrückt, desto niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Hit durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist im Stand der Technik bekannt. Das ”Scoring” der Vergleiche erfolgt nicht nur mittels E-Werten, sondern auch anhand der Prozent Identität. Prozent Identität bezieht sich auf die Anzahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. Bei großen Familien kann man ClustalW und anschließend einen Neighbour-Joining-Stammbaum dazu verwenden, Cluster verwandter Gene leichter sichtbar zu machen und Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
  • Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren können auch Nukleinsäurevarianten, die Homologe und Derivate der SEQ ID NO: 58 oder SEQ ID NO: 60 kodieren, geeignet sein, wobei die Begriffe ”Homolog” und ”Derivat” wie hier definiert sind. Für die erfindungsgemäßen Verfahren sind auch Nukleinsäuren geeignet, die Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen der SEQ ID NO: 58 oder SEQ ID NO: 60 kodieren. Homologe und Derivate, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische und funktionelle Aktivität auf wie das unmodifizierte Protein, von dem sie stammen.
  • Zu weiteren Nukleinsäuresequenzvarianten, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, zählen Abschnitte von Nukleinsäuren, die GRP-Polypeptide kodieren, Nukleinsäuren, die mit Nukleinsäuren, die GRP-Polypeptide kodieren, hybridisieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuren, die GRP-Polypeptide kodieren, allelische Varianten von Nukleinsäuren, die GRP-Polypeptide kodieren, und Varianten von Nukleinsäuren, die GRP-Polypeptide kodieren, die mittels ”gene shuffling” erhalten wurden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Spleißvariante, allelische Variante und ”gene shuffling” sind wie hier beschrieben.
  • Nukleinsäuren, die GRP-Polypeptide kodieren, müssen keine Volllängen-Nukleinsäuren sein, da die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf die Verwendung von Volllängen-Nukleinsäuresequenzen angewiesen ist. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze einen Abschnitt der SEQ ID NO: 57 oder einen Abschnitt der SEQ ID NO: 59 oder einen Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog der SEQ ID NO: 60 kodiert, einführt und exprimiert.
  • Ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz kann zum Beispiel dadurch hergestellt werden, dass man eine oder mehrere Deletionen an der Nukleinsäure durchführt. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder können an andere kodierende (oder nichtkodierende) Sequenzen fusioniert werden, um zum Beispiel ein Protein herzustellen, das mehrere Aktivitäten in sich vereinigt. Wenn es an andere kodierende Sequenzen fusioniert ist, kann das so erhaltene, nach der Translation hergestellte Polypeptid größer sein als für den Proteinabschnitt vorhergesagt wurde.
  • Abschnitte, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren ein GRP-Polypeptid, wie hier definiert, und haben im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in SEQ ID NO: 58 oder SEQ ID NO: 60 angegebenen Polypeptidsequenzen. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt der in SEQ ID NO: 57 oder SEQ ID NO: 59 genannten Nukleinsäure oder um einen Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog der in SEQ ID NO: 58 oder SEQ ID NO: 60 genannten Polypeptidsequenzen kodiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt mindestens 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750 aufeinander folgende Nukleotide lang, wobei es sich bei den aufeinander folgenden Nukleotiden um die SEQ ID NO: 57 oder die SEQ ID NO: 59 oder um eine Nukleinsäuresequenz handelt, die ein Ortholog oder Paralog der SEQ ID NO: 58 oder der SEQ ID NO: 60 kodiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 57 oder SEQ ID NO: 59.
  • Eine andere Nukleinsäuresequenzvariante, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Nukleinsäuresequenz, die unter Bedingungen einer verringerten Stringenz, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, mit einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, oder mit einem Abschnitt, wie hier definiert, hybridisieren kann.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäuresequenz, die mit der SEQ ID NO: 57 oder der SEQ ID NO: 59 hybridisieren kann, einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäuresequenz, die mit einer Nukleinsäuresequenz hybridisieren kann, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog der SEQ ID NO: 58 oder der SEQ ID NO: 60 kodiert, einführt und exprimiert.
  • Hybridisierende Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren ein GRP-Polypeptid, wie hier definiert, das im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in SEQ ID NO: 58 genannten Polypeptidsequenzen aufweist. Vorzugsweise kann die hybridisierende Sequenz mit der SEQ ID NO: 57 oder der SEQ ID NO: 59 oder mit einem Abschnitt von einer dieser Sequenzen hybridisieren, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder die hybridisierende Sequenz kann mit einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog der SEQ ID NO: 58 oder der SEQ ID NO: 60 kodiert, hybridisieren.
  • Eine andere Nukleinsäuresequenzvariante, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Spleißvariante, die ein GRP-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, wobei eine Spleißvariante wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Spleißvariante der SEQ ID NO: 57 oder der SEQ ID NO: 59 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog der SEQ ID NO: 58 oder der SEQ ID NO: 60 kodiert, einführt und exprimiert.
  • Eine andere Nukleinsäuresequenzvariante, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, wobei eine allelische Variante wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine allelische Variante der SEQ ID NO: 57 oder der SEQ ID NO: 59 einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog einer der Polypeptidsequenzen gemäß SEQ ID NO: 58 oder SEQ ID NO: 60 kodiert, einführt und exprimiert.
  • Die allelischen Varianten, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, haben im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie das GRP-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 58 oder SEQ ID NO: 60. Allelische Varianten kommen in der Natur vor und von den erfindungsgemäßen Verfahren wird die Verwendung dieser natürlichen Allele mit umfasst. ”Gene shuffling” oder gerichtete Evolution kann ebenfalls dazu verwendet werden, Varianten von Nukleinsäuren herzustellen, die GRP-Polypeptide, wie oben definiert, kodieren, wobei der Begriff ”gene shuffling” wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante der SEQ ID NO: 57 oder der SEQ ID NO: 59 einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog der SEQ ID NO: 58 oder der SEQ ID NO: 60 kodiert, einführt und exprimiert, wobei die Nukleinsäurevariante mittels ”gene shuffling” erhalten wird.
  • Nukleinsäuresequenzvarianten können weiterhin auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Zur Erzielung einer ortsgerichteten Mutagenese stehen mehrere Verfahren zur Verfügung, von denen die üblichsten Verfahren auf PCR-Basis sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Hrsg.).
  • Nukleinsäuren, die GRP-Polypeptide kodieren, können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle stammen. Die Nukleinsäuresequenz kann von ihrer nativen Form in ihrer Zusammensetzung und/oder genomischen Umgebung durch gezielte Manipulation durch den Menschen modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze. Im Fall der SEQ ID NO: 57 oder der SEQ ID NO: 59 stammt die ein GRP-Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz vorzugsweise aus einer zweikeimblättrigen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Solanaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäuresequenz aus Nicotiana tabacum.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen. Insbesondere führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit erhöhter Jungpflanzenvitalität und erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” sind hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Werden hier verbesserte Ertragsmerkmale erwähnt, so soll dies eine Erhöhung der Jungpflanzenvitalität und/oder der Biomasse (des Gewichts) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, was oberirdische (erntbare) Teile und/oder (erntbare) unterirdische Teile beinhalten kann. Insbesondere sind solche erntbaren Teile die Biomasse und/oder die Samen, und die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit erhöhter Jungpflanzenvitalität, Biomasse und/oder Samenausbeute im Vergleich zu der Jungpflanzenvitalität, Biomasse oder Samenausbeute von Kontrollpflanzen.
  • Wählt man Mais als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung als eines oder mehrere der folgenden Merkmale äußern: Unter anderem erhöhte Anzahl an Pflanzen, die pro Hektar oder Acre wachsen, eine Erhöhung der Anzahl an Ähren pro Pflanze, eine Erhöhung der Anzahl an Reihen, der Anzahl an Körnern pro Reihe, des Korngewichts, Tausendkorngewichts, der Ährenlänge/des Ährendurchmessers, eine Erhöhung der Samenfüllungsrate (d. h. der Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl der Samen und multipliziert mit 100). Wählt man Reis als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung als eine Erhöhung eines oder mehrere der folgenden Merkmale ausdrücken: Unter anderem Anzahl der Pflanzen pro Hektar oder Acre, Anzahl der Rispen pro Pflanze, Anzahl der Ährchen pro Rispe, Anzahl der Blüten (Einzelblüten) pro Rispe (ausgedrückt als Verhältnis der Anzahl an gefüllten Samen zu der Anzahl an Primärrispen), erhöhte Samenfüllungsrate (d. h. erhöhte Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100), erhöhtes Tausendkorngewicht.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erhöhung von Ertragsmerkmalen, insbesondere der Biomasse und/oder des Samenertrags von Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht.
  • Weil die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen verbesserte Ertragsmerkmale aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen (zumindest während eines Teils ihres Lebenszyklus) eine erhöhte Wachstumsrate aufweisen als Kontrollpflanzen in einem entsprechenden Stadium ihres Lebenszyklus.
  • Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (darunter Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen in der ganzen Pflanze stattfinden. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Unter dem Lebenszyklus einer Pflanze kann man diejenige Zeit verstehen, die die Pflanze benötigt, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, in dem die Pflanze trockene reife Samen ähnlich dem Ausgangsmaterial produziert hat. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren, wie Jungpflanzenvitalität, Wachstumsrate, ”Greenness Index”, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung, beeinflusst werden. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann in einem Stadium oder in mehreren Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Lebenszyklus der Pflanze erfolgen. Eine erhöhte Wachstumsrate während der Frühstadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann verbesserte Vitalität widerspiegeln. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, so dass die Pflanzen später gesät werden können und/oder früher geerntet werden können als dies sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt lässt sich mit einer früheren Blütezeit erzielen). Ist die Wachstumsrate ausreichend erhöht, kann dies weiteres Aussäen von Samen derselben Pflanzenart ermöglichen (zum Beispiel Aussäen und Ernten von Reispflanzen und anschließendes Aussäen und Ernten von weiteren Reispflanzen sogar innerhalb einer herkömmlichen Wachstumsperiode). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, kann dies ebenso das weitere Aussäen von Samen anderer Pflanzenarten ermöglichen (zum Beispiel das Aussäen und Ernten von Maispflanzen und anschließend zum Beispiel Aussäen und gegebenenfalls Ernten von Sojabohne, Kartoffel oder einer anderen geeigneten Pflanze). Auch mehrmalige weitere Ernten von demselben Wurzelstock können bei einigen Kulturpflanzen möglich sein. Eine Veränderung des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Acre führen (weil man eine bestimmte Pflanze öfter (z. B. pro Jahr) heranziehen und ernten kann). Eine erhöhte Wachstumsrate kann auch dazu führen, dass man transgene Pflanzen in einem breiteren geographischen Bereich als ihre Wildtyp-Gegenstücke anbauen kann, da die räumlichen Beschränkungen für den Anbau einer Kultur häufig von ungünstigen Umweltbedingungen entweder während der Pflanzzeit (früh in der Saison) oder während der Erntezeit (spät in der Saison) bestimmt werden. Solche ungünstigen Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt ist. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten verschiedener Parameter aus Wachstumskurven bestimmt werden, wobei die Parameter u. a. folgende sein können: T-Mid (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 50% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und T-90 (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 90% ihrer Maximalgröße zu erreichen).
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit einer im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Wachstumsrate. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht.
  • Eine Erhöhung von Ertragsmerkmalen (eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate) tritt unabhängig davon auf, ob die Pflanze unter Nichtstressbedingungen steht oder ob die Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen verschiedenen Stressbedingungen unterworfen wird. Üblicherweise reagieren Pflanzen auf Stress dadurch, dass sie langsamer wachsen. Unter starken Stressbedingungen kann die Pflanze sogar ihr Wachstum völlig einstellen. Leichter Stress ist dagegen hier als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist und der nicht dazu führt, dass die Pflanze völlig aufhört zu wachsen, ohne dass sie die Fähigkeit besitzt, ihr Wachstum wieder aufzunehmen. Leichter Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, stärker bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger im Vergleich zu der Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Aufgrund von Fortschritten bei den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerung, Düngung, Pestizidbehandlungen) findet man bei angebauten Kulturpflanzen nicht oft starke Stressbedingungen. Infolgedessen ist das durch leichten Stress induzierte geschwächte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal in der Landwirtschaft. Leichte Stressbedingungen sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (Umwelt-)Stressbedingungen, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotischer Stress kann durch Trockenheit oder Wasserüberschuss, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Gefriertemperaturen verursacht werden. Bei dem abiotischen Stress kann es sich um einen osmotischen Stress handeln, der durch Wasserstress (insbesondere aufgrund von Trockenheit), Salzstress, oxidativen Stress oder ionenbedingten Stress verursacht wird. Unter biotischem Stress versteht man gewöhnlich Stressbedingungen, die durch Pathogene, wie Bakterien, Viren, Pilze und Insekten, verursacht werden. Der Begriff ”Nichtstress”-Bedingungen, wie hier verwendet, bezieht sich auf solche Umweltbedingungen, die ein optimales Pflanzenwachstum gestatten. Der Fachmann kennt die normalen Bodenbedingungen und Klimabedingungen für einen gegebenen Standort.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verleiht Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen herangezogen werden, verbesserte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen herangezogen werden, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen, die unter abiotischen Stressbedingungen herangezogen werden, die im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Stressbedingungen herangezogen werden, erhöhte Ertragsmerkmale, vorzugsweise erhöhte Samenertragsmerkmale, aufweisen. Wie von Wang et al. (Planta (2003), 218: 1–14) beschrieben, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenproduktivität negativ beeinflussen. Es ist bekannt, dass Trockenheit, Salinität, extreme Temperaturen und oxidativer Stress miteinander in Verbindung stehen und über ähnliche Mechanismen Wachstums- und Zellschäden induzieren können. Rabbani et al., (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767) beschreiben ein besonders hohes Ausmaß an gegenseitiger Beeinflussung (”Cross-Talk”) von Trockenheitsstress und durch hohe Salinität verursachtem Stress. Zum Beispiel äußern sich Trockenheit und/oder Versalzung in erster Linie als osmotischer Stress, was zur Störung der Homöostase und der Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, der häufig hohe oder niedrige Temperaturen, Salinität oder Trockenheitsstress begleitet, kann zur Denaturierung von funktionellen und strukturellen Proteinen führen. Infolgedessen aktivieren diese verschiedenen Umweltstressbedingungen häufig ähnliche Zellsignalwege und Zellreaktionen, wie die Produktion von Stressproteinen, die Hinaufregulation von Antioxidantien, die Akkumulation von kompatiblen gelösten Stoffen und ein Einstellen des Wachstums. Weil verschiedene Umweltstressbedingungen ähnliche Wege aktivieren, soll das erfindungsgemäße Beispiel des Trockenheitsstress nicht als eine Beschränkung auf Trockenheitsstress betrachtet werden, sondern eher als eine Projektion, die die Beteiligung der GRP-Polypeptide, wie vorstehend definiert, an der Verbesserung von Ertragsmerkmalen, vorzugsweise an der Verbesserung von Samenertragsmerkmalen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Stressbedingungen herangezogen werden, unter abiotischen Stressbedingungen im Allgemeinen verdeutlichen soll.
  • Der Begriff ”abiotischer Stress”, wie hier definiert, soll eine oder mehrere der folgenden Stressbedingungen bedeuten: Wasserstress (aufgrund von Trockenheit oder Wasserüberschuss), anaerober Stress, Salzstress, Temperaturstress (aufgrund heißer, kalter oder Gefriertemperaturen), Stress durch chemische Toxizität und oxidativer Stress. Unter einem Aspekt der Erfindung handelt es sich bei dem abiotischen Stress um einen osmotischen Stress, der aus Wasserstress, Salzstress, oxidativem Stress und ionenbedingtem Stress ausgewählt ist. Vorzugsweise ist der Wasserstress ein Trockenheitsstress. Der Begriff Salzstress ist nicht auf Kochsalz (NaCl) beschränkt, sondern kann jeder Stress sein, der u. a. durch eines oder mehrere der folgenden Salze hervorgerufen wird: NaCl, KCl, LiCl, MgCl2, CaCl2.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen, vorzugsweise erhöhten Samenertragsmerkmalen, unter abiotischen Stressbedingungen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Stressbedingungen herangezogen werden. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung von Ertragsmerkmalen, vorzugsweise zur Erhöhung von Samenertragsmerkmalen, bei Pflanzen, die unter abiotischen Stressbedingungen herangezogen werden, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze moduliert. Unter einem Aspekt der Erfindung ist der abiotische Stress ein osmotischer Stress, der aus einer oder mehreren der folgenden Stressbedingungen ausgewählt ist: Wasserstress, Salzstress, oxidativer Stress und ionenbedingter Stress.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verleiht Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, herangezogen werden, erhöhte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen herangezogen werden, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze moduliert, vorzugsweise erhöht. Ein Nährstoffmangel kann durch ein Fehlen von Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor hervorgerufen werden.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen, Teile davon (einschließlich Samen) oder Pflanzenzellen, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. Die Pflanzen, die Teile davon oder die Pflanzenzellen umfassen ein Nukleinsäuretransgen, das ein GRP-Polypeptid, wie oben definiert, kodiert.
  • Die Erfindung stellt auch Genkonstrukte und Vektoren bereit, um die Einführung und/oder Expression von Nukleinsäuren, die GRP-Polypeptide kodieren, in Pflanzen zu erleichtern. Die Genkonstrukte können in Vektoren eingefügt werden, die im Handel erhältlich sein können und für die Transformation in Pflanzen und für die Expression des interessierenden Gens in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines Genkonstrukts, wie hier definiert, bei den erfindungsgemäßen Verfahren bereit.
  • Genauer gesagt, stellt die vorliegende Erfindung ein Konstrukt bereit, das Folgendes umfasst:
    • (a) eine Nukleinsäure, die ein GRP-Polypeptid, wie oben definiert, kodiert;
    • (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz unter (a) vorantreiben können, und gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  • Vorzugsweise ist die Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, wie vorstehend definiert. Die Begriffe ”Kontrollsequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hier definiert.
  • Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der eine der oben beschriebenen Nukleinsäuren umfasst. Der Fachmann kennt die genetischen Elemente, die in einem Vektor vorhanden sein müssen, damit Wirtszellen, die die interessierende Sequenz enthalten, erfolgreich transformiert, selektiert und vermehrt werden können. Die interessierende Sequenz ist mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen (mindestens mit einem Promoter) funktionsfähig verbunden.
  • Jede Art von Promoter, ob natürlich oder synthetisch, kann vorteilhaft für das Vorantreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz verwendet werden. Ein samenspezifischer Promoter ist für die erfindungsgemäßen Verfahren besonders geeignet. Die Definitionen der verschiedenen Promotertypen siehe hier im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Es sollte selbstverständlich sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung weder auf die durch SEQ ID NO: 57 oder SEQ ID NO: 59 dargestellte, ein GRP-Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz noch auf die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, wenn sie von einem samenspezifischen Promotor angetrieben wird, beschränkt ist.
  • Der samenspezifische Promotor ist vorzugsweise ein Oleosin-Promotor, vorzugsweise ein Oleosin-Promotor aus Reis. Weiterhin bevorzugt wird der Oleosin-Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz dargestellt, die im Wesentlichen der SEQ ID NO: 91 gleicht, am stärksten bevorzugt ist der Oleosin-Promotor wie durch SEQ ID NO: 91 dargestellt. Weitere Beispiele für samenspezifische Promotoren siehe hier in Tabelle 2b im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Gegebenenfalls kann/können eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem Konstrukt, das in eine Pflanze eingeführt wird, verwendet werden. Weitere Regulationselemente können u. a. Transkriptionsenhancer und Translationsenhancer sein. Der Fachmann ist mit Terminator- und Enhancersequenzen vertraut, die für die Durchführung der Erfindung geeignet sein können. Es kann auch eine Intronsequenz zu der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder der kodierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge an reifer Botschaft, die im Cytosol akkumuliert, zu erhöhen, wie im Abschnitt Definitionen beschrieben ist. Weitere Kontrollsequenzen (neben Promotor-, Enhancer-, Silencer-, Intronsequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Solche Sequenzen sind dem Fachmann bekannt oder können von ihm leicht erhalten werden.
  • Die erfindungsgemäßen Genkonstrukte können weiterhin eine Replikationsursprungssequenz beinhalten, die für die Aufrechterhaltung und/oder die Replikation in einem bestimmten Zelltyp erforderlich ist. Ein Beispiel ist, wenn ein Genkonstrukt in einer Bakterienzelle als episomales genetisches Element (z. B. ein Plasmid- oder Cosmidmolekül) aufrechterhalten werden muss. Bevorzugte Replikationsursprünge sind u. a. der f1-ori und colE1, sie sind jedoch nicht hierauf beschränkt.
  • Für den Nachweis eines erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie sie bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, und/oder für die Selektion transgener Pflanzen, die diese Nukleinsäuren umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (oder Reportergene) zu verwenden. Daher kann das Genkonstrukt gegebenenfalls ein Selektionsmarkergen umfassen. Selektionsmarker sind hier im Abschnitt ”Definitionen” eingehender beschrieben. Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder ausgeschnitten werden, wenn sie nicht mehr benötigt werden. Techniken zur Entfernung von Markern sind im Stand der Technik bekannt, geeignete Techniken sind vorstehend im Abschnitt Definitionen beschrieben.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in eine(r) Pflanze eine beliebige Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, einführt und exprimiert.
  • Genauer gesagt, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung transgener Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    • (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze, eine(n/m) Pflanzenteil oder eine(r) Pflanzenzelle und
    • (ii) Kultivieren der Pflanze, des Pflanzenteils oder der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung fördern.
  • Bei der Nukleinsäure unter (i) kann es sich um eine der Nukleinsäuren handeln, die ein GRP-Polypeptid, wie hier definiert, kodieren können.
  • Die Nukleinsäuresequenz kann direkt in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst eingeführt werden (was das Einführen in ein Gewebe, ein Organ oder einen anderen Teil einer Pflanze beinhaltet). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäuresequenz vorzugsweise mittels Transformation in eine Pflanze eingeführt. Der Begriff ”Transformation” ist hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können durch alle Verfahren regeneriert werden, mit denen der Fachmann vertraut ist. Geeignete Verfahren finden sich in den oben genannten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
  • Im Allgemeinen werden nach der Transformation die Pflanzenzellen oder Zellgruppierungen hinsichtlich des Vorhandenseins von einem oder mehreren Markern selektiert, die von Genen kodiert werden, die in Pflanzen exprimierbar sind und die mit dem interessierenden Gen co-transferiert wurden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Für die Selektion von transformierten Pflanzen wird das bei der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial in der Regel derartigen Selektionsbedingungen unterworfen, dass man transformierte Pflanzen von untransformierten Pflanzen unterscheiden kann. So können zum Beispiel Samen, die auf die oben beschriebene Weise erhalten wurden, ausgepflanzt werden und nach einer anfänglichen Wachstumsphase einer geeigneten Selektion durch Spritzen unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass man die Samen, gegebenenfalls nach Sterilisieren, auf Agarplatten unter Verwendung eines geeigneten Selektionsmittels heranzieht, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ wird das Vorhandensein eines Selektionsmarkers, wie die oben beschriebenen, in den transformierten Pflanzen mittels Screening ermittelt.
  • Nach DNA-Transfer und Regeneration können mutmaßlich transformierte Pflanzen auch zum Beispiel unter Verwendung der Southern-Analyse hinsichtlich des Vorhandenseins des interessierenden Gens, der Kopienzahl und/oder der Genomorganisation untersucht werden. Alternativ oder zusätzlich können die Expressionsniveaus der neu eingeführten DNA unter Verwendung von Northern- und/oder Western-Analyse verfolgt werden, wobei beide Techniken dem Durchschnittsfachmann bekannt sind.
  • Die erzeugten transformierten Pflanzen können durch eine Vielzahl von Mitteln vermehrt werden, wie durch klonale Vermehrung oder klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (T1-Pflanze) geselbstet werden, und homozygote Transformanten der zweiten Generation (T2-Pflanzen) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann unter Verwendung klassischer Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten transformierten Organismen können in einer Vielzahl von Formen vorliegen. So kann es sich zum Beispiel um Chimären von transformierten Zellen und untransformierten Zellen, klonale Transformanten (z. B. dass alle Zellen so transformiert wurden, dass sie die Expressionskassette enthalten), Pfropfmaterial von transformiertem und untransformiertem Gewebe (z. B. bei Pflanzen ein transformierter Wurzelstock, der auf ein untransformiertes Edelreis gepfropft wurde) handeln.
  • Die vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf jede Pflanzenzelle oder Pflanze, die durch eines der hier beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, und auf alle Pflanzenteile und sämtliches Vermehrungsmaterial davon. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Nachkommenschaft eine(r/s) primär transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, die/das durch eines der oben genannten Verfahren hergestellt wurde, wobei die einzige Voraussetzung ist, dass die Nachkommenschaft dasselbe/dieselben genotypische(n) und/oder phänotypische(n) Merkmal(e) aufweist, wie es/sie der Elter bei den erfindungsgemäßen Verfahren zeigt.
  • Die Erfindung beinhaltet auch Wirtszellen, die eine isolierte Nukleinsäuresequenz enthalten, die ein GRP-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die Nukleinsäuren oder den Vektor, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor sind im Prinzip vorteilhafterweise alle Pflanzen, welche die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide synthetisieren können.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich vorteilhaft auf jede beliebige Pflanze anwenden. Zu den Pflanzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren besonders geeignet sind, gehören alle Pflanzen, die zur Superfamilie der Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, einschließlich Futter- oder Weidepflanzenleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelkulturen, Bäume oder Sträucher. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze. Beispiele für Kulturpflanzen sind zum Beispiel u. a. Sojabohne, Sonnenblume, Canola, Luzerne, Raps, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiterhin bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um eine monokotyle Pflanze. Beispiele für monokotyle Pflanzen sind zum Beispiel u. a. Zuckerrohr. Stärker bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um ein Getreide. Beispiele für Getreide sind zum Beispiel u. a. Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer.
  • Die Erfindung erstreckt sich auch auf erntbare Teile einer Pflanze, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Wurzeln, Rhizome, Knollen und Zwiebeln. Die Erfindung betrifft weiterhin Produkte, die, vorzugsweise direkt, von einem erntbaren Teil einer solchen Pflanze stammen, wie trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der Erfindung handelt es sich bei der modulierten Expression um erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuren oder Genen oder Genprodukten sind im Stand der Technik bekannt und Beispiele werden im Abschnitt Definitionen gegeben.
  • Wie vorstehend erwähnt, ist ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze; die Wirkungen der Durchführung des Verfahrens, d. h. das Erhöhen der Ertragsmerkmale, können jedoch auch unter Verwendung anderer bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken findet sich im Abschnitt Definitionen.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nukleinsäuren, die GRP-Polypeptide, wie hier beschrieben, kodieren, und die Verwendung dieser GRP-Polypeptide zur Verbesserung eines der oben genannten Ertragsmerkmale in Pflanzen.
  • Hier beschriebene Nukleinsäuren, die ein GRP-Polypeptid kodieren, oder die GRP-Polypeptide selbst können Verwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der mit einem Gen, das ein GRP-Polpeptid kodiert, genetisch verknüpft sein kann. Die Nukleinsäuren/Gene oder die GRP-Polypeptide selbst können dazu verwendet werden, einen molekularen Marker zu bestimmen. Dieser DNA- oder Protein-Marker kann dann in Züchtungsprogrammen zur Selektion von Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen verwendet werden, wie hier vorstehend bei den erfindungsgemäßen Verfahren definiert.
  • Allelische Varianten einer Nukleinsäure/eines Gens, die/das ein GRP-Polypeptid kodiert, können auch Verwendung in Marker-unterstützten Züchtungsprogrammen finden. Bei solchen Züchtungsprogrammen ist manchmal das Einführen von allelischer Variation durch Mutagenbehandlung der Pflanzen erforderlich, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese verwendet wird; alternativ kann das Programm von einer Sammlung von allelischen Varianten so genannten ”natürlichen” Ursprungs ausgehen, die nicht mit Absicht hervorgerufen wurden. Dann erfolgt die Identifikation allelischer Varianten, zum Beispiel mittels PCR. Darauf folgt ein Schritt zur Selektion besserer allelischer Varianten der in Frage kommenden Sequenz, die erhöhte Ertragsmerkmale liefern. Die Selektion wird gewöhnlich durchgeführt, indem man die Wachstumsleistung von Pflanzen verfolgt, die verschiedene allelische Varianten der in Frage kommenden Sequenz enthalten. Die Wachstumsleistung kann im Gewächshaus oder auf dem Feld verfolgt werden. Weitere Schritte sind gegebenenfalls u. a. das Kreuzen der Pflanzen, in denen die bessere allelische Variante identifiziert wurde, mit einer anderen Pflanze. Dies kann zum Beispiel zur Herstellung einer Kombination interessanter phänotypischer Merkmale verwendet werden.
  • Nukleinsäuren, die GRP-Polypeptide kodieren, können auch als Sonden zur genetischen und physikalischen Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, und als Marker für Merkmale, die mit diesen Genen verknüpft sind, verwendet werden. Diese Information kann für die Pflanzenzüchtung nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwickeln. Eine solche Verwendung von Nukleinsäuren, die ein GRP-Polypeptid kodieren, erfordert nur eine Nukleinsäuresequenz mit einer Länge von mindestens 15 Nukleotiden. Die Nukleinsäuren, die ein GRP-Polypeptid kodieren, können als Marker für Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J, Fritsch EF und Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laborstory Manual) von restriktionsgespaltener genomischer Pflanzen-DNA können mit den GRP kodierenden Nukleinsäuren sondiert werden. Die erhaltenen Bandenmuster können dann genetischen Analysen unter Verwendung von Computerprogrammen, wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181), unterworfen werden, wodurch eine Genkarte erstellt wird. Außerdem können die Nukleinsäuren zum Sondieren von Southern-Blots verwendet werden, die restriktionsendonukelasebehandelte genomische DNAs von einem Satz von Individuen enthalten, die den Elter und die Nachkommen einer bestimmten genetischen Kreuzung darstellen. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird ermittelt und dazu verwendet, die Position der Nukleinsäure, die ein GRP-Polypeptid kodiert, in der zuvor unter Verwendung dieser Population erhaltenen Genkarte zu berechnen (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
  • Die Herstellung und Verwendung von Sonden, die von Pflanzengenen stammen, für die Verwendung bei der genetischen Kartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung spezifischer cDNA-Klone, wobei die vorstehend erläuterte Methodik oder Varianten davon verwendet werden. Für die Kartierung können zum Beispiel F2-Inzuchtpopulationen, Rückkreuzungspopulationen, zufallsgemäß gepaarte Populationen, nahezu isogene Linien und andere Sätze von Individuen verwendet werden. Diese Methodik ist dem Fachmann geläufig.
  • Die Nukleinsäuresequenzsonden können auch zur physikalischen Kartierung (d. h. zum Anordnen von Sequenzen in physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346 und darin genannte Bezugsstellen) verwendet werden.
  • In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresequenzsonden bei der Kartierung mittels direkter Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154) verwendet werden. Zwar bevorzugen derzeitige FISH-Kartierungsverfahren die Verwendung großer Klone (mehrere kb bis mehrere Hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20), aber durch Verbesserungen in der Empfindlichkeit kann die FISH-Kartierung auch unter Verwendung kürzerer Sonden durchgeführt werden.
  • Eine Reihe von Verfahren auf Basis von Nukleinsäuresequenzamplifikation für die genetische und physikalische Kartierung kann unter Verwendung der Nukleinsäuren durchgeführt werden. Beispiele sind u. a. die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), Polymorphismus PCR-amplifizierter Fragmente (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotidverlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Radiation-Hybrid-Kartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy-Kartierung (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Bei diesen Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäuresequenz dazu verwendet, Primer-Paare zu gestalten und herzustellen, die bei der Amplifikationsreaktion oder bei Primerverlängerungsreaktionen verwendet werden. Die Gestaltung dieser Primer ist dem Fachmann bekannt. Bei Verfahren, die eine genetische Kartierung auf PCR-Basis einsetzen, kann es notwendig sein, dass man DNA-Sequenz-Unterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in dem Bereich identifiziert, welcher der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch für Kartierungsverfahren nicht allgemein erforderlich.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren führen zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, wie hier vorstehend beschrieben. Diese Merkmale können auch mit anderen ökonomisch vorteilhaften Merkmalen, wie weiteren Ertragsmerkmalen, Toleranz gegenüber anderen abiotischen und biotischen Stressbedingungen, Merkmalen, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemische und/oder physiologische Merkmale modifizieren, kombiniert werden.
  • Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle A2” soll so verstanden werden, dass er den Inhalt von Tabelle A2a und Tabelle A2b angibt. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle A2a” soll so verstanden werden, dass er den Inhalt von Tabelle A2a angibt. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle A2b” soll so verstanden werden, dass er den Inhalt von Tabelle A2b angibt. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle A2” ”Tabelle A2b”.
  • In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung den folgendermaßen zusammengefassten Gegenstand:
    • Punkt 21: Ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP kodiert, wobei das GRP ein RrmJ/FtsJ-Ribosomen-RNA-Methyltransferase-Polypeptid (RrmJ/FtsJ-Polypeptid) ist, moduliert und gegebenenfalls Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen selektiert.
    • Punkt 22: Verfahren nach Punkt 21, wobei das GRP-Polypeptid eine Ribosomen-RNA-Methyltransferase-RrmJ/FtsJ-Domäne (InterPro-Einträge IPR002877 und IPR015507; Pfam-Eintrag PF01728; PANTHER-Eintrag PTHR10920) aufweist.
    • Punkt 23: Verfahren nach 21 oder 22, wobei das GRP-Polypeptid in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Polypeptidsequenzidentität mit dem GRP-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 58 oder gemäß SEQ ID NO: 60 oder mit einem der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen aufweist.
    • Punkt 24: Verfahren nach einem der Punkte 21 bis 23, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, durch eine der in Tabelle A2 angegebenen Nukleinsäuresequenz-SEQ ID NO oder durch einen Abschnitt davon oder durch eine Sequenz, die mit einer der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz-SEQ ID NO hybridisieren kann, dargestellt wird.
    • Punkt 25: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei die modulierte Expression erzielt wird, indem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäuresequenz, die das GRP-Polypeptid kodiert, einbringt und exprimiert.
    • Punkt 26: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale erhöhten Samenertrag, erhöhte Anzahl gefüllter Samen, erhöhte Samenfüllungsrate und erhöhten Harvest Index im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
    • Punkt 27: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei es sich bei der modulierten Expression um erhöhte Expression handelt.
    • Punkt 28: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei die Nukleinsäuresequenz mit einem samenspezifischen Promotor, vorzugsweise mit einem Oleosin-Promotor, am stärksten bevorzugt mit einem Oleosin-Promotor aus Reis, funktionsfähig verbunden ist.
    • Punkt 29: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanzen, weiterhin bevorzugt aus der Familie Solanaceae, stärker bevorzugt aus Nicotiana tabacum, stammt.
    • Punkt 30: Eine isolierte Nukleinsäuresequenz, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die aus folgender Gruppe ausgewählt ist:
    • a) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das das in SEQ ID NO: 97, 99, 101 und/oder 103 und/oder Tabelle A2b dargestellte Polypeptid kodiert;
    • b) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, wie in SEQ ID NO: 96, 98, 100 und/oder 102 und/oder Tabelle A2b dargestellt;
    • c) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das infolge der Degeneration des genetischen Codes von einer in Tabelle A2 dargestellten Polypeptidsequenz abgeleitet werden kann und verbesserte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen verleiht;
    • d) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität mit der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, das das in Tabelle A2 dargestellte Nukleinsäuremolekül umfasst, aufweist und verbesserte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen verleiht;
    • e) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, das mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz des Polypeptids aufweist, das von dem Nukleinsäuremolekül unter (a) bis (c) kodiert wird, und verbesserte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen verleiht;
    • f) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül unter (a) bis (c) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und verbesserte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen verleiht;
    • g) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, das die Konsensussequenz oder ein oder mehrere Polypeptidmotive, wie in 5 dargestellt, aufweist und vorzugsweise die Aktivität, die durch ein Nukleinsäuremolekül, das ein Polynukleotid, wie in Tabelle A2 dargestellt, umfasst, dargestellt wird, aufweist;
    • h) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, das die Aktivität, die durch ein Protein, wie in Tabelle A2 gezeigt, dargestellt wird, aufweist und verbesserte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen verleiht; und
    • i) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das mittels Screening einer geeigneten Nukleinsäurebank unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, die eine komplementäre Sequenz zu einem Nukleinsäuremolekül unter (a) oder (b) umfasst, oder mit einem Fragment davon, das mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt eines Nukleinsäuremoleküls umfasst, das zu einer unter (a) bis (e) charakterisierten Nukleinsäuremolekülsequenz komplementär ist, erhältlich ist und ein Polypeptid kodiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein Protein dargestellt wird, das ein Polypeptid, wie in Tabelle A2 dargestellt, umfasst;
    wobei das Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (i) sich in mindestens einem oder mehreren Nukleotiden von der in Tabelle A2a dargestellten Sequenz unterscheidet und vorzugsweise ein Protein kodiert, das sich in mindestens einer oder mehreren Aminosäuren von den in Tabelle A2a dargestellten Proteinsequenzen unterscheidet.
    • Punkt 31: Pflanze, Teil davon (einschließlich Samen) oder Pflanzenzelle, die durch ein Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt erhältlich sind, wobei die Pflanze, der Teil davon oder die Pflanzenzelle ein Nukleinsäuretransgen umfassen, das ein GRP-Polypeptid, vorzugsweise gemäß Punkt 30, kodiert.
    • Punkt 32: Konstrukt, umfassend:
    • (i) eine Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid gemäß den Punkten 21 bis 24 kodiert, oder Nukleinsäuresequenz eines Polypeptids, das von einem Nukleinsäuremolekül gemäß Punkt 30 kodiert wird;
    • (ii) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz unter (i) antreiben können; und gegebenenfalls
    • (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
    • Punkt 33: Konstrukt nach Punkt 32, wobei eine der Kontrollsequenzen ein samenspezifischer Promotor, vorzugsweise ein Oleosin-Promotor, am stärksten bevorzugt ein Oleosin-Promotor aus Reis ist.
    • Punkt 34: Verwendung eines Konstrukts nach einem der Punkte 32 oder 33 oder eines Nukleinsäuremoleküls nach Punkt 30 bei einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, vorzugsweise gesteigertem Samenertrag, gesteigerter Anzahl an gefüllten Samen, gesteigerter Samenfüllungsrate und gesteigertem Harvest Index, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • Punkt 35: Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die mit einem Konstrukt nach einem der Punkte 32 oder 33 transformiert sind.
    • Punkt 36: Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend:
    • (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid nach den Punkten 21 bis 24 kodiert, oder einer Nukleinsäuresequenz eines Polypeptids, das von einem Nukleinsäuremolekül gemäß Punkt 30 kodiert wird, in eine(r) Pflanze, eine(n/m) Pflanzenteil oder eine(r) Pflanzenzelle; und
    • (ii) Züchten der Pflanze, des Pflanzenteils oder der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze fördern.
    • Punkt 37: Transgene Pflanze mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, insbesondere gesteigertem Samenertrag, gesteigerter Anzahl an gefüllten Samen, gesteigerter Samenfüllungsrate und gesteigertem Harvest Index, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die sich aus einer gesteigerten Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid nach den Punkten 21 bis 24 kodiert, oder einer Nukleinsäuresequenz eines Polypeptids, das von einem Nukleinsäuremolekül gemäß Punkt 30 kodiert wird, ergibt, oder eine transgene Pflanzenzelle, die von der transgenen Pflanze stammt.
    • Punkt 38: Transgene Pflanze nach Punkt 31, 35 oder 37 oder eine daraus stammende transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist.
    • Punkt 39: Erntbare Teile einer Pflanze, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, nach Punkt 38, wobei die erntbaren Teile vorzugsweise Samen sind.
    • Punkt 40: Produkte, die aus einer Pflanze nach Punkt 38 und/oder aus erntbaren Teilen einer Pflanze nach Punkt 39 stammen.
    • Punkt 41: Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, bei erhöhten Ertragsmerkmalen in Pflanzen, besonders zur Erhöhung von insbesondere gesteigertem Samenertrag, gesteigerter Anzahl an gefüllten Samen, gesteigerter Samenfüllungsrate und gesteigertem Harvest Index, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird auch ein isoliertes Polypeptid bereitgestellt, das eine Polypeptidsequenz umfasst, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:
    • (i) einer Aminosäuresequenz, die von einer der durch Punkt 30 dargestellten Nukleinsäuren kodiert wird;
    • (ii) einer Aminosäuresequenz, die in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz unter (i) aufweist;
    • (iii) Derivaten von einer der vorstehend unter (i) oder (ii) genannten Aminosäuresequenzen.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wurde jetzt herausgefunden, dass eine Modulation (vorzugsweise eine Erhöhung) der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, wobei das GRP-Polypeptid ein basisches Helix-Loop-Helix 4-(bHLH4-)Polypeptid ist, in einer Pflanze zu Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, vorzugsweise gesteigerten Samenertragsmerkmalen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen führt. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen, vorzugsweise erhöhten Samenertragsmerkmalen, in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, wobei das GRP-Polypeptid ein basisches Helix-Loop-Helix 4-(bHLH4-)Polypeptid ist, in einer Pflanze moduliert (vorzugsweise erhöht).
  • Ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, besteht darin, dass man eine Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, in eine Pflanze einbringt und in dieser exprimiert.
  • Jede Bezugnahme im folgenden Text auf ein ”Protein, das für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” soll so aufgefasst werden, dass damit ein GRP-Polypeptid, wie hier definiert, gemeint ist. Jede Bezugnahme im folgenden Text auf eine ”Nukleinsäuresequenz, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” soll so aufgefasst werden, dass dies eine Nukleinsäuresequenz bedeutet, die ein solches GRP-Polypeptid kodieren kann. Die Nukleinsäuresequenz, die in eine Pflanze eingeführt werden soll (und die daher zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist), ist jede beliebige Nukleinsäuresequenz, welche den Typ Protein kodiert, der im Folgenden beschrieben wird, und wird im Folgenden auch als ”GRP-Nukleinsäuresequenz” oder ”GRP-Gen” bezeichnet.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung betrifft ein ”GRP-Polypeptid”, wie hier definiert, die Proteine, die durch SEQ ID NO: 105 wiedergegeben werden, und Orthologe, Paraloge und Homologe dieser Proteine. Tabelle A3 von Beispiel 1 stellt hier solche Orthologe und Paraloge dar.
  • Vorzugsweise haben die Orthologe, Paraloge und Homologe gemäß SEQ ID NO: 105 eine basische Helix-Loop-Helix-Dimerisierungsregion mit dem InterPro-Eintrag IPR001092 und eine Helix-Loop-Helix-DNA-Bindungsdomäne mit dem InterPro-Eintrag IPR011598.
  • Alternativ oder zusätzlich betrifft ein ”GRP-Polypeptid”, wie hier definiert, ein beliebiges Polypeptid, das in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität mit dem GRP-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 105 oder mit einer der hier in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen aufweist.
  • Der Begriff ”Domäne” und ”Motiv” wird hier im Abschnitt ”Definitionen” definiert. Für die Identifikation von Domänen gibt es Spezialdatenbanken, zum Beispiel SMART (Schultz et al., (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al., (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244, InterPro (Mulder et al., (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315–318, Prosite (Sucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences motifs und its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids Res. 32: D134–D137, (2004)) oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30 (1): 276–280 (2002). Ein Satz von Werkzeugen für die In-silico-Analyse von Proteinsequenzen ist auf dem ExPASY-Proteomics-Server verfügbar (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003)). Domänen oder Motive können auch unter Verwendung von Routinetechniken, wie Sequenz-Alignment, identifiziert werden.
  • Verfahren für das Alignment von Sequenzen für Vergleichszwecke sind im Stand der Technik bekannt, dazu zählen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA. Bei GAP wird der Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453) dazu verwendet, das globale Alignment (d. h. das Alignment, das sich über die vollständigen Sequenzen erstreckt) von zwei Sequenzen zu finden, das die Anzahl der Übereinstimmungen (”matches”) maximiert und die Anzahl der Lücken (”gaps”) minimiert. Beim BLAST-Algorithmus (Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10) wird die Sequenzidentität in Prozent berechnet, und es wird eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen durchgeführt. Die Software für die Durchführung einer BLAST-Analyse ist über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) öffentlich zugänglich. Homologe können zum Beispiel unter Verwendung des multiplen Sequenz-Alignment-Algorithmus ClustalW (Version 1.83) leicht identifiziert werden, und zwar mit den Default-Parametern für paarweises Alignment und einer Scoring-Methode in Prozent. Die Gesamtprozent an Ähnlichkeit und Identität können auch unter Verwendung eines der im MatGAT-Software-Paket verfügbaren Verfahren bestimmt werden (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003, Juli 10; 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences.). Für eine Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven können kleinere Änderungen per Hand vorgenommen werden, wie dem Fachmann klar ist. Weiterhin können anstelle von Volllängensequenzen auch spezifische Domänen für die Identifikation von Homologen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können mit den oben erwähnten Programmen unter Verwendung der Default-Parameter über die gesamte Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz oder über ausgewählte Domänen oder (ein) konservierte(s) Motiv(e) bestimmt werden.
  • Außerdem können GRP-Polypeptide, soweit sie der SEQ ID NO: 105 und ihren Orthologen. Paralogen und Homologen entsprechen, üblicherweise die Fähigkeit besitzen, (zumindest in ihrer nativen Form) an DNA zu binden, haben aber nicht unbedingt eine Transkriptionsregulationsaktivität und die Fähigkeit, mit anderen Proteinen in Wechselwirkung zu treten. Deshalb können GRP-Polypeptide mit verringerter Transkriptionsregulationsaktivität, ohne Transkriptionsregulationsaktivität, mit verringerter Protein-Protein-Wechselwirkungsfähigkeit oder ohne Protein-Protein-Wechselwirkungsfähigkeit ebenfalls für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sein. Die DNA-Bindungsaktivität und Protein-Protein-Wechselwirkungen können in vitro oder in vivo leicht unter Verwendung von Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, (zum Beispiel in Current Protocols in Molecular Biology, Bände 1 und 2, Ausubel et al. (1994), Current Protocols) bestimmt werden. Zur Bestimmung der DNA-Bindungsaktivität von GRP-Polypeptiden stehen mehrere Assays zur Verfügung, wie DNA-Bindungs-Gelshift-Assays (oder Gelretardationsassays; Korfhage et al. (1994) Plant C6: 695–708), In-vitro-DNA-Bindungsassays (Schindler et al. (1993) Plant J 4 (1): 137–150) oder die Transkriptionsaktivierung von GRP-Polypeptiden in Hefe-, Tier- und Pflanzenzellen. GRP-Polypeptide binden gewöhnlich an eine Konsensussequenz, CANNTG, die als E-Box bezeichnet wird. Die kanonische E-Box lautet CACGTG (ein Palindrom), aber einige bHLH4-Transkriptionsfaktoren binden an andere Sequenzen, die oft der E-Box ähneln. Spezifische DNA-Bindungssequenzen können unter Verwendung der Selektionstechnik mit zufallsgenerierten Oligonukleotiden (Viola & Gonzalez (26. Mai 2007) Biochemistry) bestimmt werden.
  • Die vorliegende Erfindung wird dadurch veranschaulicht, dass man Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 104, welche die Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 105 kodiert, transformiert. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhaft unter Verwendung jeder beliebigen GRP-kodierenden Nukleinsäure oder des GRP-Polypeptids, wie hier definiert, durchgeführt werden.
  • Beispiele für Nukleinsäuresequenzen, die GRP-Polypeptide kodieren, können in im Stand der Technik bekannten Datenbanken gefunden werden. Solche Nukleinsäuresequenzen eignen sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Orthologe und Paraloge, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind, können leicht mittels Durchführen einer so genannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. Dies beinhaltet üblicherweise ein erstes BLASTing, bei dem mit einer Abfragesequenz (zum Beispiel mit der SEQ ID NO: 105) ein BLASTing gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird. BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) werden im Allgemeinen verwendet, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein zweites BLASTing gegen Sequenzen des Organismus, aus dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (ist die Abfragesequenz die SEQ ID NO: 104 oder SEQ ID NO: 105, dann wäre das zweite BLASTing daher gegen Sequenzen aus Arabidopsis thaliana). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit von dem ersten BLASTing aus derselben Art stammt wie die Abfragesequenz, in diesem Fall führt ein zweites BLASTing idealerweise zu der Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit in dem ersten BLASTing nicht von derselben Art stammt wie die Abfragesequenz, und führt vorzugsweise beim zweiten BLASTing dazu, dass die Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits ist.
  • Hochrangige Hits sind solche mit niedrigem E-Wert. Je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der ”Score” (anders ausgedrückt, desto niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Hit durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist in der Fachwelt gut bekannt. Das ”Scoring” der Vergleiche erfolgt nicht nur mittels E-Werten, sondern auch anhand der Prozent Identität. Prozent Identität bezieht sich auf die Anzahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. Bei großen Familien kann man ClustalW und anschließend einen Neighbour-Joining-Tree verwenden, um die Bildung von Clustern verwandter Gene leichter sichtbar zu machen und Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
  • Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren können auch Nukleinsäuresequenzvarianten geeignet sein, die für Homologe und Derivate von SEQ ID NO: 105 kodieren, wobei die Begriffe ”Homolog” und ”Derivat” wie hier definiert sind. Für die erfindungsgemäßen Verfahren sind auch Nukleinsäuresequenzen geeignet, die Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen von SEQ ID NO: 105 kodieren. Homologe und Derivate, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische und funktionelle Aktivität auf wie das unmodifizierte Protein, von dem sie stammen.
  • Zu weiteren Nukleinsäurevarianten, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, zählen Abschnitte von Nukleinsäuresequenzen, die für GRP-Polypeptide kodieren, Nukleinsäuresequenzen, die mit Nukleinsäuresequenzen, die für GRP- Polypeptide kodieren, hybridisieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuresequenzen, die für GRP-Polypeptide kodieren, allelische Varianten von Nukleinsäuresequenzen, die für GRP-Polypeptide kodieren, und Varianten von Nukleinsäuresequenzen, die für GRP-Polypeptide kodieren, die mittels ”gene shuffling” erhalten wurden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Spleißvariante, allelische Variante und ”gene shuffling” sind wie hier definiert.
  • Nukleinsäuresequenzen, die GRP-Polypeptide kodieren, müssen keine Volllängen-Nukleinsäuresequenzen sein, da die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf die Verwendung von Volllängen-Nukleinsäuresequenzen angewiesen ist. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen, vorzugsweise zur Verbesserung von Samenertragsmerkmalen, bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze einen Abschnitt von SEQ ID NO: 104 oder einen Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von SEQ ID NO: 105 kodiert, einführt und exprimiert.
  • Ein Abschnitt einer Nukleinsäure kann zum Beispiel dadurch hergestellt werden, dass man eine oder mehrere Deletionen an der Nukleinsäuresequenz durchführt. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden, oder können an andere kodierende (oder nichtkodierende) Sequenzen fusioniert werden, um zum Beispiel ein Protein herzustellen, das mehrere Aktivitäten in sich vereinigt. Wenn es an andere kodierende Sequenzen fusioniert ist, kann das so erhaltene, nach der Translation hergestellte Polypeptid größer sein als für den Proteinabschnitt vorhergesagt wurde.
  • Abschnitte, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren ein GRP-Polypeptid, wie hier definiert, und haben im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in SEQ ID NO: 105 angegebene Polypeptid-Sequenz. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt von der in SEQ ID NO: 104 angegebenen Nukleinsäuresequenz oder um einen Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von der in SEQ ID NO: 105 angegebenen Polypeptid-Sequenz kodiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt mindestens 500, 600, 700, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750 oder mehr aufeinander folgende Nukleotide lang, wobei es sich bei den aufeinander folgenden Nukleotiden um SEQ ID NO: 104 oder um eine Nukleinsäuresequenz handelt, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NO: 105 kodiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 104.
  • Eine andere Nukleinsäuresequenzvariante, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Nukleinsäuresequenz, die unter Bedingungen einer verringerten Stringenz, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, mit einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, oder mit einem Abschnitt, wie hier definiert, hybridisieren kann.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen, vorzugsweise verbesserten Samenertragsmerkmalen, bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäuresequenz, die mit SEQ ID NO: 104 hybridisieren kann, einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäuresequenz, die mit einer Nukleinsäuresequenz hybridisieren kann, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von SEQ ID NO: 105 kodiert, einführt und exprimiert.
  • Hybridisierende Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren ein GRP-Polypeptid, wie hier definiert, und weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in SEQ ID NO: 105 genannte Polypeptid-Sequenz auf. Vorzugsweise kann die hybridisierende Sequenz mit SEQ ID NO: 104 oder mit einem Abschnitt dieser Sequenz hybridisieren, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder wobei die hybridisierende Sequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NO: 105 kodiert, hybridisieren kann.
  • Eine andere Nukleinsäuresequenzvariante, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Spleißvariante, die ein GRP-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, wobei eine Spleißvariante wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen, vorzugsweise Verbesserung von Samenertragsmerkmalen, bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Spleißvariante von SEQ ID NO: 104 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von SEQ ID NO: 105 kodiert, einführt und exprimiert.
  • Eine andere Nukleinsäuresequenzvariante, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, wobei eine allelische Variante wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen, vorzugsweise verbesserten Samenertragsmerkmalen, bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine allelische Variante von SEQ ID NO: 104 einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von der in SEQ ID NO: 105 genannten Polypeptid-Sequenz kodiert, einführt und exprimiert.
  • Die allelischen Varianten, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, haben im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie das GRP-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 105. Allelische Varianten kommen in der Natur vor und von den erfindungsgemäßen Verfahren wird die Verwendung dieser natürlichen Allele mit umfasst. ”Gene shuffling” oder gerichtete Evolution kann ebenfalls dazu verwendet werden, Varianten von Nukleinsäuresequenzen herzustellen, die GRP-Polypeptide, wie oben definiert, kodieren, wobei der Begriff ”gene shuffling” wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen, vorzugsweise verbesserten Samenertragsmerkmalen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäuresequenz-Variante von SEQ ID NO: 104 einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von SEQ ID NO: 105 kodiert, einführt und exprimiert, wobei die Nukleinsäurevariante mittels ”gene shuffling” erhalten wird.
  • Nukleinsäurevarianten können weiterhin auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Zur Erzielung einer ortsgerichteten Mutagenese stehen mehrere Verfahren zur Verfügung, von denen die üblichsten Verfahren auf PCR-Basis sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Hrsg.).
  • Nukleinsäuresequenzen, die GRP-Polypeptide kodieren, können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle stammen. Die Nukleinsäuresequenz kann von ihrer nativen Form in ihrer Zusammensetzung und/oder genomischen Umgebung durch gezielte Manipulation durch den Menschen modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die Nukleinsäure, die ein GRP-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, weiterhin bevorzugt aus einer dikotylen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Arabidopsis thaliana.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere verbesserten Samenertragsmerkmalen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” sind hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Werden hier verbesserte Ertragsmerkmale erwähnt, so soll dies eine Erhöhung der Jungpflanzenvitalität und/oder der Biomasse (des Gewichts) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, was oberirdische (erntbare) Teile und/oder unterirdische (erntbare) Teile beinhalten kann. Insbesondere sind solche oberirdischen erntbaren Teile die Biomasse und/oder Samen, und die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit erhöhter Jungpflanzenvitalität, Biomasse und/oder Samenertrag im Vergleich zu der Jungpflanzenvitalität, Biomasse und dem Samenertrag von Kontrollpflanzen.
  • Wählt man Mais als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung als eines oder mehrere der folgenden Merkmale äußern: Unter anderem erhöhte Anzahl an Pflanzen, die pro Hektar oder Acre wachsen, eine Erhöhung der Anzahl an Ähren pro Pflanze, eine Erhöhung der Anzahl an Reihen, der Anzahl an Körnern pro Reihe, des Korngewichts, Tausendkorngewichts, der Ährenlänge/des Ährendurchmessers, eine Erhöhung der Samenfüllungsrate (d. h. der Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl der Samen und multipliziert mit 100). Wählt man Reis als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung als eine Erhöhung eines oder mehrere der folgenden Merkmale ausdrücken: Unter anderem Anzahl der Pflanzen pro Hektar oder Acre, Anzahl der Rispen pro Pflanze, Anzahl der Ährchen pro Rispe, Anzahl der Blüten (Einzelblüten) pro Rispe (ausgedrückt als Verhältnis der Anzahl an gefüllten Samen zu der Anzahl an Primärrispen), erhöhte Samenfüllungsrate (d. h. Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100), erhöhtes Tausendkorngewicht Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen, insbesondere des Biomasse- und/oder Samenertrags von Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, moduliert (vorzugsweise erhöht).
  • Weil die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen verbesserte Ertragsmerkmale, vorzugsweise verbesserte Samenertragsmerkmale, aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen (zumindest während eines Teils ihres Lebenszyklus) eine höhere Wachstumsrate aufweisen als Kontrollpflanzen in einem entsprechenden Stadium ihres Lebenszyklus.
  • Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (darunter Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen in der ganzen Pflanze stattfinden. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Unter dem Lebenszyklus einer Pflanze kann man diejenige Zeit verstehen, die die Pflanze benötigt, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, in dem die Pflanze trockene reife Samen ähnlich dem Ausgangsmaterial produziert hat. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren, wie Jungpflanzenvitalität, Wachstumsrate, ”Greenness Index”, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung, beeinflusst werden. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann in einem Stadium oder in mehreren Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Lebenszyklus der Pflanze erfolgen. Eine erhöhte Wachstumsrate während der Frühstadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann verbesserte Vitalität widerspiegeln. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, so dass die Pflanzen später gesät werden können und/oder früher geerntet werden können als dies sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt lässt sich mit einer früheren Blütezeit erzielen). Ist die Wachstumsrate ausreichend erhöht, kann dies weiteres Aussäen von Samen derselben Pflanzenart ermöglichen (zum Beispiel Aussäen und Ernten von Reispflanzen und anschließendes Aussäen und Ernten von weiteren Reispflanzen sogar innerhalb einer herkömmlichen Wachstumsperiode). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, kann dies entsprechend das weitere Aussäen von Samen anderer Pflanzenarten ermöglichen (zum Beispiel das Aussäen und Ernten von Maispflanzen und anschließend zum Beispiel Aussäen und gegebenenfalls Ernten von Sojabohne, Kartoffel oder einer anderen geeigneten Pflanze). Auch mehrmalige weitere Ernten von demselben Wurzelstock können bei einigen Kulturpflanzen möglich sein. Eine Veränderung des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Acre führen (weil man eine bestimmte Pflanze öfter (z. B. pro Jahr) heranziehen und ernten kann). Eine erhöhte Wachstumsrate kann auch dazu führen, dass man transgene Pflanzen in einem breiteren geographischen Bereich als ihre Wildtyp-Gegenstücke anbauen kann, da die räumlichen Beschränkungen für den Anbau einer Kultur häufig von ungünstigen Umweltbedingungen entweder während der Pflanzzeit (Frühsaison) oder während der Erntezeit (Spätsaison) bestimmt werden. Solche ungünstigen Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt ist. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten verschiedener Parameter aus Wachstumskurven bestimmt werden, wobei die Parameter u. a. folgende sein können: T-Mid (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 50% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und T-90 (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 90% ihrer Maximalgröße zu erreichen).
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit einer im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Wachstumsrate. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, moduliert (vorzugsweise erhöht).
  • Eine Verbesserung der Ertragsmerkmale (eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate) tritt unabhängig davon auf, ob die Pflanze unter Nichtstressbedingungen steht oder ob die Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen verschiedenen Stressbedingungen unterworfen wird. Üblicherweise reagieren Pflanzen auf Stress dadurch, dass sie langsamer wachsen. Unter starken Stressbedingungen kann die Pflanze sogar ihr Wachstum völlig einstellen. Leichter Stress ist dagegen hier als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist und der nicht dazu führt, dass die Pflanze völlig aufhört zu wachsen, ohne dass sie die Fähigkeit besitzt, ihr Wachstum wieder aufzunehmen. Leichter Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, stärker bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger im Vergleich zu der Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Aufgrund von Fortschritten bei den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerung, Düngung, Pestizidbehandlungen) findet man bei angebauten Kulturpflanzen nicht oft starke Stressbedingungen. Infolgedessen ist das durch leichten Stress induzierte geschwächte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal in der Landwirtschaft. Leichte Stressbedingungen sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (Umwelt-)Stressbedingungen, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotischer Stress kann durch Trockenheit oder Wasserüberschuss, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Gefriertemperaturen verursacht werden. Bei dem abiotischen Stress kann es sich um einen osmotischen Stress handeln, der durch Wasserstress (insbesondere aufgrund von Trockenheit), Salzstress, oxidativen Stress oder ionenbedingten Stress verursacht wird. Unter biotischem Stress versteht man gewöhnlich Stressbedingungen, die durch Pathogene, wie Bakterien, Viren, Nematoden, Pilze und Insekten, verursacht werden. Unter dem Begriff ”Nichtstress”-Bedingungen, wie er hier verwendet wird, versteht man solche Umweltbedingungen, die ein optimales Pflanzenwachstum ermöglichen. Der Fachmann ist mit den normalen Bodenbedingungen und Klimabedingungen für einen bestimmten Standort vertraut.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren ergibt Pflanzen, die bei Wachstum unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Stressbedingungen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Stressbedingungen wachsen, verbesserte Ertragsmerkmale, vorzugsweise verbesserte Samenertragsmerkmale aufweisen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen, vorzugsweise verbesserten Samenertragsmerkmalen, von Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Stressbedingungen heranwachsen, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid wie oben definiert kodiert, moduliert (vorzugsweise erhöht).
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren ergibt unter abiotischen Stressbedingungen gewachsene Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, vorzugsweise verbesserten Samenertragsmerkmalen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Stressbedingungen gewachsen waren. Wie von Wang et al., (Planta (2003), 218: 1–14) beschrieben, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, die das Pflanzenwachstum und die Produktivität negativ beeinflussen. Trockenheit, Salinität, extreme Temperaturen und oxidativer Stress stehen bekanntlich miteinander in Verbindung und können über ähnliche Mechanismen Wachstums- und Zellschäden induzieren. Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767) beschreiben ein besonders hohes Ausmaß an gegenseitiger Beeinflussung von Trockenheitsstress und durch hohe Salinität verursachtem Stress. Trockenheit und/oder Versalzung äußern sich beispielsweise in erster Linie als osmotischer Stress, was zur Störung der Homöostase und der Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, der häufig Hoch- oder Niedertemperatur-, Salinitäts- oder Trockenheitsstress begleitet, kann zur Denaturierung funktioneller und struktureller Proteine führen. Demzufolge aktivieren diese verschiedenen Umweltstressfaktoren häufig ähnliche Signalleitungswege der Zelle und Zellreaktionen, wie die Produktion von Stressproteinen, die Aufwärtsregulation von Antioxidantien, die Anreicherung kompatibler gelöster Stoffe und ein Einstellen des Wachstums. Da verschiedene Umweltstressfaktoren ähnliche Stoffwechselwege aktivieren, sollten Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, vorzugsweise verbesserten Samenertragsmerkmalen, unter einer Art von abiotischen Stress-Wachstumsbedingungen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren abiotischen Stressbedingungen gewachsen waren, nicht als Einschränkung auf diese Art von abiotischen Stress-Wachstumsbedingungen angesehen werden, sondern es soll lediglich die Beteiligung der GRP-Polypeptide wie vorstehend definiert bei der Verbesserung der Ertragsmerkmale unter abiotischen Stress-Wachstumsbedingungen im Allgemeinen anzeigen.
  • Der Begriff „abiotischer Stress” wie im vorliegenden Text definiert soll einen oder mehrere der folgenden Stressfaktoren bedeuten: Wasserstress (aufgrund von Trockenheit oder Wasserüberschuss), anaerober Stress, Salzstress, Temperaturstress (aufgrund von Hitze, Kälte oder Gefriertemperaturen), chemischer Toxizitätsstress und oxidativer Stress. Gemäß einem Aspekt der Erfindung handelt es sich bei dem abiotischen Stress um einen osmotischen Stress, ausgewählt aus Wasserstress, Salzstress, oxidativem Stress und ionenbedingtem Stress. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Wasserstress um Trockenheitsstress. Der Begriff Salzstress ist nicht auf Natriumchlorid (NaCl) beschränkt, sondern es kann sich dabei unter Anderem um einen beliebigen Stress handeln, der durch eines oder mehrere der folgenden Salze verursacht wird: NaCl, KCl, LiCl, MgCl2, CaCl2.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren unter abiotischen Stress-Wachstumsbedingungen ergibt Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, vorzugsweise verbesserten Samenertragsmerkmalen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Stressbedingungen gewachsen waren. Daher wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale, vorzugsweise zur Verbesserung der Samenertragsmerkmale in Pflanzen, die unter abiotischen Stress-Wachstumsbedingungen gewachsen waren, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, moduliert (vorzugsweise erhöht). Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist der abiotische Stress ein osmotischer Stress, ausgewählt aus einem oder mehreren der Folgenden: Wasserstress, Salzstress, oxidativem Stress und ionenbedingtem Stress.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren ergibt Pflanzen, die bei Wachstum unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, verbesserte Ertragsmerkmale, vorzugsweise verbesserte Samenertragsmerkmale, im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen gezüchteten Kontrollpflanzen aufweisen. Daher wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale, vorzugsweise Verbesserung der Samenertragsmerkmale, bei Pflanzen bereitgestellt, die unter Nährstoffmangelbedingungen gezüchtet wurden, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, moduliert (vorzugsweise steigert). Nährstoffmangel kann sich unter Anderem aus einem Fehlen von Nährstoffen, wie Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, ergeben.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen, Teile davon (einschließlich Samen) oder Pflanzenzellen, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. Die Pflanzen, Teile davon oder Pflanzenzellen umfassen ein Nukleinsäuretransgen, das ein GRP-Polypeptid wie oben definiert, kodiert, vorzugsweise ein basisches Helix-Loop-Helix 4 (bHLH4)-Polypeptid.
  • Die Erfindung stellt auch Genkonstrukte und Vektoren bereit, um die Einführung und/oder Expression von Nukleinsäuresequenzen, die GRP-Polypeptide kodieren, in Pflanzen zu erleichtern. Die Genkonstrukte können in handelsübliche Vektoren eingeführt werden, die für die Transformation in Pflanzen und für die Expression des interessierenden Gens in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines wie im vorliegenden Text definierten Genkonstrukts in den erfindungsgemäßen Verfahren bereit.
  • Genauer ausgedrückt stellt die vorliegende Erfindung ein Konstrukt bereit, umfassend
    • (a) eine Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid, vorzugsweise ein basisches Helix-Loop-Helix 4 (bHLH4)-Polypeptid wie oben definiert kodiert;
    • (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz gemäß (a) modulieren, vorzugsweise steigern kann bzw. können; sowie gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  • Vorzugsweise ist die Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, wie oben definiert. Der Begriff ”Kontrollsequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hier definiert.
  • Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der eine der vorstehend beschriebenen Nukleinsäuresequenzen umfasst. Dem Fachmann sind die genetischen Elemente, die auf einem Vektor zur erfolgreichen Transformation, Selektion und Vermehrung der Wirtszellen, die die interessierende Sequenz enthalten, vorhanden sein müssen, geläufig. Die interessierende Sequenz ist funktionsfähig mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen (mindestens mit einem Promotor) verknüpft.
  • Jede Art von Promotor kann unabhängig davon, ob er natürlich oder synthetisch ist, vorteilhafterweise zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz, verwendet werden. Ein konstitutiver Promotor ist bei den Verfahren besonders geeignet. Siehe den Abschnitt ”Definitionen” für Definitionen der verschiedenen Promotortypen.
  • Es sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die GRP-Polypeptide-kodierende Nukleinsäuresequenz eingeschränkt ist, die durch SEQ ID NO: 104 veranschaulicht ist, entsprechend ist die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die Expression einer GRP-Polypeptid-kodierenden Nukleinsäuresequenz eingeschränkt, wenn sie durch einen konstitutiven Promotor gesteuert wird.
  • Der konstitutive Promotor ist vorzugsweise ein Hochmobilitäts-Promotor der Gruppe B (HMGB), vorzugsweise ein HMGB-Promotor aus Reis. Der HMGB-Promotor ist zudem vorzugsweise durch eine im Wesentlichen ähnliche Nukleinsäuresequenz wie SEQ ID NO: 106 veranschaulicht, am stärksten bevorzugt ist der HMGB-Promotor durch SEQ ID NO: 106 veranschaulicht. Siehe Tabelle 2 im Abschnitt ”Definitionen” für weitere Beispiel für konstitutive Promotoren.
  • Bei dem Konstrukt, das in eine Pflanze eingeführt wird, kann/können gegebenenfalls eine oder mehrere Terminatorsequenzen verwendet werden. Zusätzliche Regulationselemente können Transkriptionsenhancer sowie Translationsenhancer umfassen. Der Fachmann ist mit Terminator- und Enhancer-Sequenzen, die zur Durchführung der Erfindung geeignet sein können, vertraut. Zur Steigerung der Menge der reifen Botschaft, die sich im Cytosol anreichert, kann auch eine Intronsequenz zu der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder in der kodierenden Sequenz hinzugefügt werden, wie es im Abschnitt Definitionen beschrieben wurde. Andere Kontrollsequenzen (neben Promotor, Enhancer, Silencer, Intronsequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Solche Sequenzen sind dem Fachmann bekannt oder leicht zugänglich.
  • Die erfindungsgemäßen Genkonstrukte können weiterhin eine Replikationsursprungssequenz beinhalten, die zur Aufrechterhaltung und/oder die Replikation in einem bestimmten Zelltyp erforderlich ist. Ein Beispiel ist, wenn ein Genkonstrukt in einer Bakterienzelle als episomales genetisches Element aufrechterhalten werden muss (z. B. Plasmid- oder Cosmidmolekül). Zu bevorzugten Replikationsursprüngen gehören der f1-ori und colE1, sind jedoch nicht hierauf beschränkt.
  • Für den Nachweis des erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie sie bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wurden, und/oder für die Selektion der transgenen Pflanzen, die diese Nukleinsäuresequenzen umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (oder Reportergene) zu verwenden. Das Genkonstrukt kann daher gegebenenfalls ein Selektionsmarkergen umfassen. Selektionsmarker sind genauer im Abschnitt ”Definitionen” im vorliegenden Text beschrieben. Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder gespalten werden, sobald sie nicht mehr benötigt werden. Techniken zur Entfernung des Markergens sind im Stand der Technik bekannt, geeignete Techniken sind oben im Abschnitt Definitionen beschrieben.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Produktion von transgenen Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen vorzugsweise verbesserten Samenertragsmerkmalen gegenüber Kontrollpflanzen bereit, wobei eine Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid wie oben definiert, in eine(r) Pflanze eingeführt und exprimiert wird.
  • Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Produktion von transgenen Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, vorzugsweise verbesserten Samenertragsmerkmalen bereit, wobei das Verfahren umfasst:
    • (i) Einbringen und Exprimieren einer GRP-Polypeptid-kodierenden Nukleinsäuresequenz in eine(r) Pflanze, ein(em) Pflanzenteil oder eine(r) Pflanzenzelle; und
    • (ii) Züchten der Pflanze, des Pflanzenteils oder der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Entwicklung fördern.
  • Die Nukleinsäuresequenz von (i) kann eine beliebige Nukleinsäure sein, die ein GRP-Polypeptid wie hier definiert kodieren kann, wobei sie in einer Ausführungsform die Aktivität eines basischen Helix-Loop-Helix 4 (bHLH4) Polypeptids hat.
  • Die Nukleinsäure kann in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst direkt eingeführt werden (was das Einführen in ein Gewebe, Organ oder einen beliebigen anderen Teil einer Pflanze beinhaltet). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäuresequenz vorzugsweise mittels Transformation in eine Pflanze eingeführt. Der Begriff ”Transformation” wird im vorliegenden Text im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können nach allen Verfahren, mit denen der Fachmann vertraut ist, regeneriert werden. Geeignete Verfahren finden sich in den oben genannten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
  • Im Allgemeinen werden nach der Transformation die Pflanzenzellen oder Zellgruppen auf das Vorhandensein von einem oder mehreren Markern selektiert, die von den mit dem interessierenden Gen gemeinsam transferierten, in Pflanzen exprimierbaren Genen kodiert werden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Für die Selektion von transformierten Pflanzen wird das bei der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial im Allgemeinen Selektionsbedingungen unterworfen, so dass man transformierte Pflanzen von untransformierten Pflanzen unterscheiden kann. So können zum Beispiel Samen, die auf die oben beschriebene Art und Weise erhalten wurden, ausgepflanzt werden und nach einer anfänglichen Wachstumsphase durch Spritzen einer geeigneten Selektion unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass man die Samen, gegebenenfalls nach Sterilisieren, auf Agarplatten heranzieht, wobei man ein geeignetes Selektionsmittel verwendet, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ werden die transformierten Pflanzen auf das Vorhandensein eines Selektionsmarkers wie die oben beschriebenen gescreent.
  • Nach dem DNA-Transfer und der Regeneration können mutmaßlich transformierte Pflanzen auch zum Beispiel unter Verwendung der Southern-Analyse auf das Vorhandensein des interessierenden Gens, die Kopienzahl und/oder die Genomorganisation ausgewertet werden. Alternativ dazu oder zusätzlich können die Expressionsniveaus der neu eingeführten DNA mittels Northern- und/oder Western-Analyse überwacht werden; wobei beide Techniken dem Durchschnittsfachmann gut bekannt sind.
  • Die erzeugten transformierten Pflanzen können mit unterschiedlichen Mitteln vermehrt werden, wie durch klonale Vermehrung oder durch klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (T1-Pflanze) geselbstet werden, und homozygote Transformanten der zweiten Generation (T2-Pflanze) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann mit Hilfe von klassischen Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten transformierten Organismen können in verschiedener Form vorliegen. Sie können beispielsweise Chimären von transformierten Zellen und untransformierten Zellen sein; klonale Transformanten (z. B. alle Zellen wurden dahingehend transformiert, dass sie die Expressionskassette enthalten); Pfropfmaterial von transformiertem und untransformiertem Gewebe (z. B. bei Pflanzen ein transformierter Wurzelstock, der auf ein untransformiertes Edelreis gepfropft wurde).
  • Die vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf eine jede Pflanzenzelle oder Pflanze, die nach einem der hier beschriebenen Verfahren erzeugt wurde, und auf sämtliche Pflanzenteile und sämtliches Vermehrungsmaterial davon. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Nachkommenschaft einer/eines primär transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, die/das nach einem der oben genannten Verfahren erzeugt wurde, wobei die einzige Voraussetzung ist, dass die Nachkommenschaft dasselbe/dieselben genotypische(n) und/oder phänotypische(n) Merkmal(e) aufweist, wie es/sie von dem Elter bei den erfindungsgemäßen Verfahren gezeigt wird.
  • Die Erfindung beinhaltet auch Wirtszellen, die eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die ein wie oben definiertes GRP-Polypeptid kodiert, enthalten. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren oder den Vektor, für die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor, sind im Prinzip vorteilhafterweise alle Pflanzen, die die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide synthetisieren können.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich vorteilhaft auf jede beliebige Pflanze anwenden. Zu den Pflanzen, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren besonders geeignet sind, gehören alle Pflanzen, die zu der Superfamilie Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, einschließlich Futter- oder Weidepflanzenleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelkulturpflanzen, Bäume oder Sträucher. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze. Zu den Kulturpflanzen gehören zum Beispiel Sojabohne, Sonnenblume, Canola-Raps, Luzerne, Raps, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiter bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um eine monokotyle Pflanze. Zu den monokotylen Pflanzen gehört zum Beispiel Zuckerrohr. Weiter bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um ein Getreide. Zu den Getreiden gehören zum Beispiel Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer.
  • Die Erfindung betrifft auch erntefähige Teile einer Pflanze, wie zum Beispiel, jedoch nicht ausschließlich, Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Wurzeln, Rhizome, Knollen und Zwiebeln. Die Erfindung betrifft weiterhin Produkte, die von einem erntefähigen Teil einer solchen Pflanze abstammen, vorzugsweise direkt abstammen, wie trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der Erfindung handelt es sich bei der modulierten Expression um erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuren oder Genen oder Genprodukten, sind im Fachgebiet gut beschrieben; und Beispiele sind im Abschnitt Definitionen gegeben.
  • Wie vorstehend erwähnt, ist ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze; die Wirkungen der Durchführung des Verfahrens, d. h. das Verbessern der Ertragsmerkmale, vorzugsweise das Verbessern der Samenertragsmerkmale, können auch unter Verwendung anderer bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf T-DNA-Activation-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken findet sich im Abschnitt Definitionen.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen, die GRP-Polypeptide, wie hier beschrieben, kodieren, und die Verwendung dieser GRP-Polypeptide zur Verbesserung eines der oben genannten Ertragsmerkmale, vorzugsweise Samenertragsmerkmale, in Pflanzen.
  • Hier beschriebene Nukleinsäuresequenzen, die das GRP-Polypeptid kodieren, oder die GRP-Polypeptide selbst können Verwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der mit einem für ein GRP-Polpeptid kodierenden Gen genetisch verknüpft sein kann. Die Gene/Nukleinsäuresequenzen oder die GRP-Polypeptide selbst können dazu verwendet werden, einen molekularen Marker zu bestimmen. Dieser DNA- oder Protein-Marker kann dann in Züchtungsprogrammen zur Selektion von Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen, vorzugsweise erhöhten Samenertragsmerkmalen, verwendet werden, wie hier unter den erfindungsgemäßen Verfahren definiert.
  • Allelische Varianten einer Nukleinsäure/eines Gens, die/das ein GRP-Polypeptid kodiert, können auch Verwendung in Marker-unterstützten Züchtungsprogrammen finden. Bei solchen Züchtungsprogrammen ist manchmal das Einführen von allelischer Variation durch Mutagenbehandlung der Pflanzen erforderlich, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese verwendet wird; alternativ kann das Programm von einer Sammlung von allelischen Varianten so genannten ”natürlichen” Ursprungs ausgehen, die ohne Absicht hervorgerufen wurden. Dann erfolgt die Identifikation allelischer Varianten, zum Beispiel mittels PCR. Darauf folgt ein Schritt zur Selektion besserer allelischer Varianten der in Frage kommenden Sequenz, die bessere Ertragsmerkmale, vorzugsweise bessere Samenertragsmerkmale, liefern. Die Selektion wird gewöhnlich durchgeführt, indem man die Wachstumsleistung von Pflanzen verfolgt, die verschiedene allelische Varianten der in Frage kommenden Sequenz enthalten. Die Wachstumsleistung kann im Gewächshaus oder auf dem Feld verfolgt werden. Weitere Schritte sind gegebenenfalls u. a. das Kreuzen der Pflanzen, in denen die bessere allelische Variante identifiziert wurde, mit einer anderen Pflanze. Dies kann zum Beispiel zur Herstellung einer Kombination interessanter phänotypischer Merkmale verwendet werden.
  • GRP-Polypeptide kodierende Nukleinsäuresequenzen können auch als Sonden zur genetischen und physikalischen Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, und als Marker für Merkmale, die mit diesen Genen verknüpft sind, verwendet werden. Diese Information kann für die Pflanzenzüchtung nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwickeln. Eine solche Verwendung der GRP-Polypeptid-kodierenden Nukleinsäuresequenzen benötigt nur eine Nukleinsäuresequenz von mindestens 15 Nukleotiden Länge. Die GRP-Polypeptid-kodierenden Nukleinsäuresequenzen können als Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus(RFLP)-Marker verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laborstory Manual) von restriktions-gespaltener genomischer Pflanzen-DNA kann mit den GRP-kodierenden Nukleinsäuresequenzen sondiert werden. Die erhaltenen Bandenmuster können dann genetischen Analysen mit Computerprogrammen unterworfen werden, wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181), so dass man eine genetische Karte erhält. Die Nukleinsäuresequenzen können zudem zum Sondieren von Southern-Blots verwendet werden, die Restriktionsendonuklease behandelte genomische DNAs von einem Satz von Individuen enthalten, die die Eltern und die Nachfahren einer definierten genetischen Kreuzung repräsentieren. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird festgestellt und zur Berechnung der Position der GRP-Polypeptid-kodierenden Nukleinsäuresequenz in der genetischen Karte verwendet, die mit dieser Population vorher erhalten wurde (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
  • Die Herstellung und Verwendung von Sonden, die von Pflanzengenen stammen, für die Verwendung bei der genetischen Kartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung spezifischer cDNA-Klone, wobei die vorstehend erläuterte Methodik oder Varianten davon verwendet werden. Für die Kartierung können zum Beispiel F2-Inzuchtpopulationen, Rückkreuzungspopulationen, zufallsgemäß gepaarte Populationen, nahezu isogene Linien und andere Sätze von Individuen verwendet werden. Diese Verfahren sind dem Fachmann bestens bekannt.
  • Die Nukleinsäuresequenzsonden können auch zur physikalischen Kartierung (d. h. zum Anordnen von Sequenzen in physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346 und darin genannte Literaturstellen) verwendet werden.
  • In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden zur Kartierung durch direkte Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154) verwendet werden. Zwar bevorzugen derzeitige FISH-Kartierungsverfahren die Verwendung großer Klone (mehrere kb bis mehrere Hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20), aber durch Verbesserungen in der Empfindlichkeit kann die FISH-Kartierung auch unter Verwendung kürzerer Sonden durchgeführt werden.
  • Eine Reihe von Verfahren auf Basis von Nukleinsäuresequenzamplifikation für die genetische und physikalische Kartierung kann unter Verwendung der Nukleinsäuresequenzen durchgeführt werden. Beispiele sind u. a. die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), Polymorphismus PCR-amplifizierter Fragmente (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotidverlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Radiation-Hybrid-Kartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy-Kartierung (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Bei diesen Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäuresequenz dazu verwendet, Primer-Paare zu gestalten und zu erzeugen, die bei der Amplifikationsreaktion oder Primerverlängerungsreaktionen verwendet werden. Die Gestaltung dieser Primer ist dem Fachmann bekannt. Bei Verfahren, die eine genetische Kartierung auf PCR-Basis einsetzen, kann es notwendig sein, dass man DNA-Sequenz-Unterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in dem Bereich identifiziert, welcher der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch für Kartierungsverfahren nicht allgemein erforderlich.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren ergeben Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, vorzugsweise verbesserten Samenertragsmerkmalen, wie hier vorstehend beschrieben. Diese Merkmale können auch mit anderen ökonomisch vorteilhaften Merkmalen kombiniert werden, wie weiteren Ertragsmerkmalen, Toleranz gegenüber anderen abiotischen und biotischen Stressbedingungen, Merkmalen, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemisch und/oder physiologische Merkmale modifizieren.
  • Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle A3” soll den Inhalt der Tabelle A3a und A3b, angeben. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle A3a” soll den Inhalt der Tabelle A3a angeben. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle A3b” soll den Inhalt der Tabelle A3b angeben. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle A3” Tabelle A3b.
  • In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung die Aufgaben, die folgendermaßen zusammengefasst sind:
    • Punkt 42: Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale, vorzugsweise zur Verbesserung der Samenertragsmerkmale, in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren (vorzugsweise Steigern) der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze, wobei das GRP-Polypeptid ein basisches Helix-Loop-Helix 4 (bHLH4) Polypeptid nach SEQ ID NO: 2 ist, oder eines der in Tabelle A3 angegebenen Polypeptide, oder ein Orthologon, Paralogon oder Homologon davon und gegebenenfalls Selektieren auf Pflanzen, die verbesserte Ertragsmerkmale, vorzugsweise verbesserte Samenertragsmerkmale, aufweisen.
    • Punkt 43: Verfahren nach Punkt 42, wobei das GRP Polypeptid nach SEQ ID NO: 105 und ein Orthologon, Paralogon oder Homologon davon, eine basische Helix-Loop-Helix Dimerisierungsregion, mit einem InterPro Eintrag IPR001092, und Helix-Loop-Helix DNA-Bindung mit einem InterPro Eintrag IPR011598 aufweisen.
    • Punkt 44: Verfahren nach Punkt 42 oder 43, wobei das GRP-Polypeptid in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu dem GRP-Polypeptid nach SEQ ID NO: 105 oder zu einer der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptid-Sequenzen aufweist.
    • Punkt 45: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt 42 bis 44, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, durch die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 104 oder einen Abschnitt davon veranschaulicht wird, oder eine Sequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO: 104 oder einen Abschnitt davon hybridisieren kann, oder eine Sequenz, die mit einer der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NOs hybridisieren kann, die in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegeben sind.
    • Punkt 46: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt 42 bis 45, wobei die modulierte (vorzugsweise erhöhte) Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die das GRP-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze herbeigeführt wird.
    • Punkt 47: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt 42 bis 46, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale einen oder mehrere aus: erhöhter Jungpflanzenvitalität, erhöhtem Greenness Index, erhöhtem Gesamtsamenertrag pro Pflanze, erhöhter Anzahl gefüllter Samen, erhöhter Samenfüllrate und erhöhtem Harvest Index, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
    • Punkt 48: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt 42 bis 47, wobei die modulierte Expression eine erhöhte Expression ist.
    • Punkt 49: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt 42 bis 48, wobei die Nukleinsäuresequenz funktionsfähig an einen konstitutiven Promotor, vorzugsweise einen Hochmobilitätspromotor der Gruppe B (high mobility group B (HMGB) promoter), am stärksten bevorzugt an einen HMGB-Promotor aus Reis gebunden ist.
    • Punkt 50: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt 42 bis 49, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, stärker bevorzugt aus Arabidopsis thaliana, stammt.
    • Punkt 51: Pflanze, Teil davon (einschließlich Samen), oder Pflanzenzelle, erhältlich durch ein Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt 42 bis 45, wobei die Pflanze, das Teil davon oder die Pflanzenzelle ein Nukleinsäuretransgen umfasst, das ein GRP Polypeptid kodiert.
    • Punkt 52: Isolierte Nukleinsäuresequenz, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
    • (a) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das das Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 122, 124, 126, 128 und/oder 130 und/oder Tabelle A3b kodiert;
    • (b) einem isolierten Nukleinsäuremolekül gemäß SEQ ID NO: 121, 123, 125, 127 und/oder 129 und/oder Tabelle A3b;
    • (c) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das als Folge der Degeneration des genetischen Codes von einer in Tabelle A3 gezeigten Polypeptid-Sequenz hergeleitet werden kann und das im Vergleich zu Kontrollpflanzen verbesserte Samenertragsmerkmale verleiht;
    • (d) einem isolierten Nukleinsäuremolekül mit mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99% Sequenzidentität zu der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, das das in Tabelle A3 gezeigte Nukleinsäuremolekül umfasst und im Vergleich zu Kontrollpflanzen verbesserte Samenertragsmerkmale verleiht;
    • (e) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert mit mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz des Polypeptids, das von dem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) kodiert wird, und im Vergleich zu Kontrollpflanzen verbesserte Ertragsmerkmale verleiht;
    • (f) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert, und im Vergleich zu Kontrollpflanzen verbesserte Ertragsmerkmale verleiht;
    • (g) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, das die Konsensussequenz oder ein oder mehrere Polypeptid-Motive von 10 umfasst, und das vorzugsweise die Aktivität aufweist, das ein Nukleinsäuremolekül zeigt, welches ein Polynukleotid gemäß Tabelle A3, umfasst;
    • (h) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, welches die in Tabelle A3 gezeigte Aktivität zeigt, und das im Vergleich zu Kontrollpflanzen verbesserte Ertragsmerkmale verleiht; und
    • (i) einem Nukleinsäuremolekül, erhältlich durch Screening einer geeigneten Nukleinsäurebank unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, die eine komplementäre Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls von (a) oder (b) aufweist, oder mit einem Fragment davon, mit mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt eines Nukleinsäuremoleküls, das zu einem Nukleinsäuremolekül komplementär ist, das durch (a) bis (e) charakterisiert ist und das ein Polypeptid kodiert, das die Aktivität hat, die durch ein Protein veranschaulicht wird, das ein Polypeptid gemäß Tabelle A3 umfasst;
    wobei sich das Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (i) in mindestens ein oder mehreren Nukleotiden von der in Tabelle A3a gezeigten Sequenz unterscheidet, und das vorzugsweise ein Protein kodiert, das sich in mindestens einer oder mehreren Aminosäuren von den in Tabelle A3a gezeigten Proteinsequenzen unterscheidet.
    • Punkt 53: Konstrukt, umfassend:
    • (a) eine Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid nach Punkt 42 bis 44 oder 52 kodiert;
    • (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) steuern können; und gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
    • Punkt 54: Konstrukt nach Punkt 53, wobei eine der Kontrollsequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein HMGB-Promotor, am stärksten bevorzugt ein HMGB-Promotor aus Reis, ist.
    • Punkt 55: Verwendung eines Konstrukts nach einem der Punkte 53 bis 54 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere gesteigerter Jungpflanzenvitalität, gesteigertem Greenness Index, gesteigertem Gesamtsamenertrag pro Pflanze, gesteigerter Anzahl gefüllter Samen, gesteigerter Samenfüllrate, und gesteigertem Harvest Index, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • Punkt 56: Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, transformiert mit einem Konstrukt nach einem der Punkte 53 bis 54.
    • Punkt 57: Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend:
    • (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid gemäß den Punkten 42 bis 44 und 52 kodiert in eine(r) Pflanze, ein(em) Pflanzenteil oder eine(r) Pflanzenzelle; und
    • (ii) Züchten der Pflanze, des Pflanzenteils oder der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die -entwicklung fördern.
    • Punkt 58: Transgene Pflanze mit verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere gesteigerter Jungpflanzenvitalität, gesteigertem Greenness Index, gesteigertem Gesamtsamenertrag pro Pflanze, gesteigerter Anzahl gefüllter Samen, gesteigerter Samenfüllrate, und gesteigertem Harvest Index, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die durch eine erhöhte Expression einer Nukleinsäuresequenz hervorgehen, die ein GRP-Polypeptid nach den Punkten 42 bis 44 und 52 kodiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze stammt.
    • Punkt 59: Transgene Pflanze nach den Punkten 51, 56 und 58, oder eine daraus abstammende transgene Pflanzenzelle, wobei es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer handelt.
    • Punkt 60: Erntefähige Teile einer Pflanze, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, welche ein GRP-Polypeptid nach Punkt 59 kodiert, wobei es sich bei den erntefähigen Teilen vorzugsweise um Samen handelt.
    • Punkt 61: Produkte, hergeleitet von einer Pflanze nach Punkt 59 und/oder von erntefähigen Teilen einer Pflanze nach Punkt 60.
    • Punkt 62: Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, bei der Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen, insbesondere bei der Steigerung der Jungpflanzenvitalität, bei der Steigerung des Greenness Index, bei der Steigerung des Gesamtsamenertrags pro Pflanze, bei der Steigerung der Anzahl gefüllter Samen, bei der Steigerung der Samenfüllrate, und bei der Steigerung des Harvest Index, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird deshalb ein isoliertes Polypeptid bereitgestellt, umfassend eine Polypeptidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
    • (i) einer Aminosäuresequenz, die von einer der Nukleinsäuren nach Punkt 52 kodiert wird;
    • (ii) einer Aminosäuresequenz, die in steigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität mit der in (i) angegebenen Aminosäuresequenz hat;
    • (iii) Derivate von einer der unter (i) oder (ii) oben angegebenen Aminosäuresequenzen.
  • In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wurde überraschend entdeckt, dass die Modulation (vorzugsweise Erhöhung) der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, wobei das GRP-Polypeptid ein Isopentenyltransferase(IPT)-Polypeptid ist, in einer Pflanze, Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, wobei das GRP-Polypeptid ein Isopentenyltransferase(IPT)-Polypeptid ist, in einer Pflanze moduliert (vorzugsweise erhöht) wird.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zur Modulation (vorzugsweise Steigerung) der Expression einer Nukleinsäure, die ein GRP-Polypeptid kodiert, erfolgt durch Einführen und Expression einer Nukleinsäure, die ein GRP-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze.
  • Jede Bezugnahme auf ein ”Protein, das sich in den erfindungsgemäßen Verfahren eignet” soll ein GRP-Polypeptid bedeuten, wie es hier definiert ist. Jede im erfindungsgemäßen Zusammenhang erfolgende Bezugnahme auf eine ”Nukleinsäuresequenz, die sich in den erfindungsgemäßen Verfahren eignet” soll eine Nukleinsäuresequenz bedeuten, die ein solches GRP-Polypeptid kodieren kann. Die in eine Pflanze einzubringende (und daher bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignete) Nukleinsäuresequenz ist eine beliebige Nukleinsäuresequenz, die den nachstehend beschriebenen Proteintyp kodiert, der auch als ”GRP-Nukleinsäuresequenz” oder ”GRP-Gen” bezeichnet wird.
  • Ein ”GRP-Polypeptid” wie es hier definiert ist, bezeichnet die in der SEQ ID NO: 132 dargestellten Polypeptide und Orthologa, Paraloga und Homologa davon oder eine der in Tabelle A4 von Beispiel 1 hier angegebenen Polypeptid-Sequenzen Die Orthologa, Paraloga und Homologa von SEQ ID NO: 132 gehören vorzugsweise zu der tRNA Isopentenyltransferase Familie mit den InterPro Einträgen IPR002627 und IPR011593.
  • Alternativ oder zusätzlich betrifft ein ”GRP-Polypeptid” wie es hier definiert ist ein Polypeptid, das in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenz-Identität zu dem GRP-Polypeptid wie es in SEQ ID NO: 132 gezeigt ist, oder zu einer der in Tabelle A4 von Beispiel 1 hier angegebenen Polypeptid-Sequenzen aufweist.
  • Die Begriffe ”Domäne” und ”Motiv” sind im vorliegenden Text in dem Abschnitt ”Definitionen” definiert. Für die Identifikation von Domänen gibt es Spezialdatenbanken, zum Beispiel SMART (Schultz et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al. (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244, InterPro (Mulder et al. (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315–318, Prosite (Sucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences Motivs und its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAIPress, Menlo Park; Hubo et al., Nucl. Acids Res. 32: D134–D137, (2004), oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30 (1): 276–280 (2002). Ein Satz Werkzeuge für die In-silico-Analyse von Proteinsequenzen findet sich auf dem ExPASY-Proteomics-Server (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003)). Domänen oder Motive können auch unter Verwendung von Routinetechniken, wie Sequenz-Alignment, identifiziert werden.
  • Verfahren für das Alignment von Sequenzen für Vergleichszwecke sind in der Fachwelt gut bekannt, dazu zählen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA. Bei GAP wird der Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453) verwendet, um das globale Alignment (d. h. das Alignment, das sich über die vollständigen Sequenzen erstreckt) von zwei Sequenzen, das die Anzahl der ”matches” maximiert und die Anzahl der ”gaps” minimiert. Beim BLAST-Algorithmus (Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10) wird die Sequenzidentität in Prozent berechnet, und es wird eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen durchgeführt. Die Software für die Durchführung einer BLAST-Analyse ist der Öffentlichkeit über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) zugänglich. Homologa können leicht unter Verwendung von zum Beispiel dem multiplen Sequenz-Alignment-Algorithmus ClustalW (Version 1.83) identifiziert werden, und zwar mit den Default-Parametern für paarweises Alignment und einer Scoring-Methode in Prozent. Die Gesamtprozentsätze der Ähnlichkeit und der Identität können auch unter Verwendung von einer der in dem MatGAT-Software-Paket verfügbaren Methoden bestimmt werden (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003, Juli, 10; 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences.). Für eine Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven können, wie es dem Fachmann ersichtlich wird, kleine manuelle Veränderungen vorgenommen werden. Darüber hinaus können statt Volllängensequenzen für die Identifikation von Homologa auch spezifische Domänen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können mit den oben erwähnten Programmen unter Einstellung der Default-Parameter über die gesamte Nukleinsäure- oder Polypeptid-Sequenz oder über ausgewählte Domänen oder konservierte Motiv(e) bestimmt werden.
  • Cytokinine, die zentrale Regulatoren der Zellteilung und Differenzierung in Pflanzen sind, sind Adenin-Derivate, die eine Isopentenyl-Seitenkette tragen, die hydroxyliert werden muss. Pflanzen besitzen zwei Klassen von Isopentenyltransferasen (IPTs), die auf die Adenin-Einheit einwirken: ATP/ADP-Isopentenyltransferasen (in Arabidopsis thaliana, AtIPT1, 3, 4–8) und tRNA IPTs (in Arabidopsis, AtIPT2 und 9; Miyawaki et al. (2006) Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44): 16598–16603.). Wie vorstehend beschrieben ist die Isopentenylierung von ATP und ADP, durch/ADP IPTs, der Schlüsselschritt bei der Biosynthese von Cytokininen des iP- und tZ-Typs. GRP-Polypeptide, insofern als SEQ ID NO: 2 und seine Orthologa, Paraloga und Homologa betroffen sind, sind gewöhnlich für die Isopentenylierung von ATP und ADP bei der Biosynthese der Cytokinine des iP- und tZ-Typs verantwortlich. Die Messung dieser Enzymaktivität ist im Stand der Technik bestens bekannt (beispielsweise Miyawaki et al., siehe oben).
  • Die vorliegende Erfindung wird anhand der Transformation von Pflanzen mit der in SEQ ID NO: 131 gezeigten Nukleinsäuresequenz, die die Polypeptidsequenz von SEQ ID NO: 132 kodiert, veranschaulicht. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt; die erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhafterweise durch Verwendung einer beliebigen GRP-kodierenden Nukleinsäure oder eines GRP-Polypeptids, wie hier definiert durchgeführt werden.
  • Beispiele für Nukleinsäuren, die GRP-Polypeptide kodieren, können in Datenbanken gefunden, die man im Stand der Technik kennt. Solche Nukleinsäuresequenzen eignen sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Orthologa und Paraloga, wobei die Begriffe ”Orthologa” und ”Paraloga” die hier definierte Bedeutung haben, können leicht durch Durchführen einer so genannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. Dies beinhaltet typischerweise einen ersten BLAST, bei der mit einer Abfragesequenz (zum Beispiel mittels SEQ ID NO: 132) ein ”BLASTing” gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird. BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) werden im Allgemeinen dann verwendet, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein Rück-BLASTing (zweiter BLAST) gegen Sequenzen des Organismus, von dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (ist die Abfragesequenz SEQ ID NO: 131 oder SEQ ID NO: 132, dann wäre das zweite BLASTing daher gegen Arabidopsis thaliana-Sequenzen). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing werden dann verglichen. Ein Paralogon wird dann identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit von dem ersten BLASTing von der gleichen Art ist, von der die Abfragesequenz stammt, in diesem Fall führt ein Rück-BLASTing idealerweise zu der Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits; ein Orthologon wird dann identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit in dem ersten BLASTing nicht von der gleichen Art wie derjenigen, von der die Abfragesequenz stammt, ist, und führt vorzugsweise beim Rück-BLASTing dazu, dass die Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits ist.
  • Hochrangige Hits sind solche mit niedrigem E-Wert. Je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der ”Score” (anders ausgedrückt, desto niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Hit durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist in der Fachwelt gut bekannt. Das ”Scoring” der Vergleiche erfolgt nicht nur mittels E-Werten, sondern auch anhand der Prozent Identität. Prozent Identität bezieht sich auf die Anzahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. Bei großen Familien kann man ClustalW und anschließend einen Neighbour-Joining-Tree verwenden, um die Bildung von Clustern verwandter Gene leichter sichtbar zu machen und Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
  • Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren können auch Nukleinsäuresequenzvarianten geeignet sein, die Homologe und Derivate von SEQ ID NO: 132 kodieren, wobei die Begriffe ”Homolog” und ”Derivat” wie hier definiert sind. Für die erfindungsgemäßen Verfahren sind auch Nukleinsäuresequenzen geeignet, die Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen von SEQ ID NO: 132 oder einer der in Tabelle A4 von Beispiel 1 genannten Polypeptid-Sequenzen kodieren. Homologe und Derivate, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische und funktionelle Aktivität auf wie das unmodifizierte Protein, von dem sie stammen.
  • Zu weiteren Nukleinsäurevarianten, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, zählen Abschnitte von Nukleinsäuresequenzen, die GRP Polypeptide kodieren, Nukleinsäuresequenzen, die mit Nukleinsäuresequenzen hybridisieren, die GRP Polypeptide kodieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuresequenzen, die GRP Polypeptide kodieren, allelische Varianten von Nukleinsäuresequenzen, die GRP Polypeptide kodieren, und Varianten von Nukleinsäuresequenzen, die GRP Polypeptide kodieren, die mittels ”gene shuffling” erhalten wurden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Spleißvariante, allelische Variante und ”gene shuffling” sind wie hier definiert.
  • Nukleinsäuresequenzen, die GRP Polypeptide kodieren, müssen keine Volllängen-Nukleinsäuren sein, da die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf die Verwendung von Volllängen-Nukleinsäuresequenzen angewiesen ist. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze einen Abschnitt von SEQ ID NO: 131 oder einen Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von SEQ ID NO: 132 kodiert, einführt und exprimiert.
  • Ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz kann zum Beispiel dadurch hergestellt werden, dass man eine oder mehrere Deletionen an der Nukleinsäure durchführt. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder können an andere kodierende (oder nichtkodierende) Sequenzen fusioniert werden, um zum Beispiel ein Protein herzustellen, das mehrere Aktivitäten in sich vereinigt. Wenn es an andere kodierende Sequenzen fusioniert ist, kann das so erhaltene, nach der Translation hergestellte Polypeptid größer sein als für den Proteinabschnitt vorhergesagt wurde.
  • Abschnitte, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren ein GRP-Polypeptid, wie hier definiert, und haben im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in SEQ ID NO: 132 angegebenen Polypeptid-Sequenzen oder wie eine der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptid-Sequenzen. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt von der in SEQ ID NO: 131 genannten Nukleinsäuresequenzen oder um einen Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von der in SEQ ID NO: 132 genannten Polypeptid-Sequenz kodiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt mindestens 300, 400, 500, 600, 700, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, oder mehr aufeinander folgende Nukleotide lang, wobei es sich bei den aufeinander folgenden Nukleotiden um SEQ ID NO: 131 oder um eine Nukleinsäuresequenz handelt, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NO: 132 kodiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 131.
  • Eine andere Nukleinsäuresequenzvariante, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Nukleinsäuresequenz, die unter Bedingungen einer verringerten Stringenz, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, mit einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, oder mit einem Abschnitt, wie hier definiert, hybridisieren kann.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäuresequenz, die mit SEQ ID NO: 131 hybridisieren kann, einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäuresequenz, die mit einer Nukleinsäuresequenz hybridisieren kann, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von SEQ ID NO: 132, oder eine der in in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Polypeptid-Sequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Hybridisierende Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren ein GRP-Polypeptid, wie hier definiert, und weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in SEQ ID NO: 132 genannte Polypeptid-Sequenz auf. Vorzugsweise kann die hybridisierende Sequenz mit SEQ ID NO: 131 oder mit einem Abschnitt dieser Sequenz hybridisieren, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder wobei die hybridisierende Sequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NO: 132 oder einen Abschnitt davon oder eine der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Polypeptid-Sequenzen kodiert, hybridisieren kann.
  • Eine andere Nukleinsäuresequenzvariante, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Spleißvariante, die ein GRP-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, wobei eine Spleißvariante wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen, bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Spleißvariante von SEQ ID NO: 131 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von SEQ ID NO: 132 kodiert, einführt und exprimiert.
  • Eine andere Nukleinsäuresequenzvariante, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, wobei eine allelische Variante wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine allelische Variante von SEQ ID NO: 131 einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von der in SEQ ID NO: 132 genannten Polypeptid-Sequenz kodiert, einführt und exprimiert.
  • Die allelischen Varianten, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, haben im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie das GRP-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 132. Allelische Varianten kommen in der Natur vor und von den erfindungsgemäßen Verfahren wird die Verwendung dieser natürlichen Allele mit umfasst. ”Gene shuffling” oder gerichtete Evolution kann ebenfalls dazu verwendet werden, Varianten von Nukleinsäuresequenzen herzustellen, die GRP-Polypeptide, wie oben definiert, kodieren, wobei der Begriff ”gene shuffling” wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäuresequenzvariante von SEQ ID NO: 131 einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von SEQ ID NO: 132 kodiert, einführt und exprimiert, wobei die Nukleinsäuresequenzvariante mittels ”gene shuffling” erhalten wird.
  • Nukleinsäuresequenzvarianten können weiterhin auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Zur Erzielung einer ortsgerichteten Mutagenese stehen mehrere Verfahren zur Verfügung, von denen die üblichsten Verfahren auf PCR-Basis sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Hrsg.).
  • Nukleinsäuresequenzen, die GRP-Polypeptide kodieren, können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle stammen. Die Nukleinsäuresequenz kann von ihrer nativen Form in ihrer Zusammensetzung und/oder genomischen Umgebung durch gezielte Manipulation durch den Menschen modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die Nukleinsäure, die ein GRP-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze. Im Falle der SEQ ID NO: 131 ist die GRP-Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäuresequenz aus Arabidopsis thaliana.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, vorzugsweise verbesserten Samenertragsmerkmalen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” sind hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Werden hier verbesserte Ertragsmerkmale erwähnt, so soll dies eine Erhöhung der Jungpflanzenvitalität und/oder der Biomasse (des Gewichts) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, was oberirdische (erntbare) Teile und/oder unterirdische (erntbare) Teile beinhalten kann. Insbesondere sind solche oberirdischen erntbaren Teile die Biomasse und/oder Samen, und die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit erhöhter Jungpflanzenvitalität, Biomasse und/oder Samenertrag im Vergleich zu der Jungpflanzenvitalität, Biomasse und dem Samenertrag von Kontrollpflanzen.
  • Wählt man Mais als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung als eines oder mehrere der folgenden Merkmale äußern: Unter anderem erhöhte Anzahl an Pflanzen, die pro Hektar oder Acre wachsen, eine Erhöhung der Anzahl an Ähren pro Pflanze, eine Erhöhung der Anzahl an Reihen, der Anzahl an Körnern pro Reihe, des Korngewichts, Tausendkorngewichts, der Ährenlänge/des Ährendurchmessers, eine Erhöhung der Samenfüllungsrate (d. h. der Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl der Samen und multipliziert mit 100). Wählt man Reis als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung als eine Erhöhung eines oder mehrerer der folgenden Merkmale ausdrücken: Unter anderem Anzahl der Pflanzen pro Hektar oder Acre, Anzahl der Rispen pro Pflanze, Anzahl der Ährchen pro Rispe, Anzahl der Blüten (Einzelblüten) pro Rispe (ausgedrückt als Verhältnis der Anzahl an gefüllten Samen zu der Anzahl an Primärrispen), erhöhte Samenfüllungsrate (d. h. Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100), erhöhtes Tausendkorngewicht.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen, insbesondere des Biomasse- und/oder Samenertrags von Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, moduliert (vorzugsweise erhöht).
  • Weil die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen verbesserte Ertragsmerkmale, aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen (zumindest während eines Teils ihres Lebenszyklus) eine höhere Wachstumsrate aufweisen als Kontrollpflanzen in einem entsprechenden Stadium ihres Lebenszyklus.
  • Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (darunter Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen in der ganzen Pflanze stattfinden. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Unter dem Lebenszyklus einer Pflanze kann man diejenige Zeit verstehen, die die Pflanze benötigt, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, in dem die Pflanze trockene reife Samen ähnlich dem Ausgangsmaterial produziert hat. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren, wie Jungpflanzenvitalität, Wachstumsrate, ”Greenness Index”, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung, beeinflusst werden. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann in einem Stadium oder in mehreren Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Lebenszyklus der Pflanze erfolgen. Eine erhöhte Wachstumsrate während der Frühstadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann verbesserte Vitalität widerspiegeln. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, so dass die Pflanzen später gesät werden können und/oder früher geerntet werden können als dies sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt lässt sich mit einer früheren Blütezeit erzielen). Ist die Wachstumsrate ausreichend erhöht, kann dies weiteres Aussäen von Samen derselben Pflanzenart ermöglichen (zum Beispiel Aussäen und Ernten von Reispflanzen und anschließendes Aussäen und Ernten von weiteren Reispflanzen sogar innerhalb einer herkömmlichen Wachstumsperiode). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, kann dies entsprechend das weitere Aussäen von Samen anderer Pflanzenarten ermöglichen (zum Beispiel das Aussäen und Ernten von Maispflanzen und anschließend zum Beispiel Aussäen und gegebenenfalls Ernten von Sojabohne, Kartoffel oder einer anderen geeigneten Pflanze). Auch mehrmalige weitere Ernten von demselben Wurzelstock können bei einigen Kulturpflanzen möglich sein. Eine Veränderung des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Acre führen (weil man eine bestimmte Pflanze öfter (z. B. pro Jahr) heranziehen und ernten kann). Eine erhöhte Wachstumsrate kann auch dazu führen, dass man transgene Pflanzen in einem breiteren geographischen Bereich als ihre Wildtyp-Gegenstücke anbauen kann, da die räumlichen Beschränkungen für den Anbau einer Kultur häufig von ungünstigen Umweltbedingungen entweder während der Pflanzzeit (Frühsaison) oder während der Erntezeit (Spätsaison) bestimmt werden. Solche ungünstigen Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt ist. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten verschiedener Parameter aus Wachstumskurven bestimmt werden, wobei die Parameter u. a. folgende sein können: T-Mid (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 50% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und T-90 (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 90% ihrer Maximalgröße zu erreichen).
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit einer im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Wachstumsrate. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, moduliert (vorzugsweise erhöht).
  • Eine Verbesserung der Ertragsmerkmale (eine Erhöhung des Samenertrags und/oder der Wachstumsrate) tritt unabhängig davon auf, ob die Pflanze unter Nichtstressbedingungen steht oder ob die Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen verschiedenen Stressbedingungen unterworfen wird. Üblicherweise reagieren Pflanzen auf Stress dadurch, dass sie langsamer wachsen. Unter starken Stressbedingungen kann die Pflanze sogar ihr Wachstum völlig einstellen. Leichter Stress ist dagegen hier als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist und der nicht dazu führt, dass die Pflanze völlig aufhört zu wachsen, ohne dass sie die Fähigkeit besitzt, ihr Wachstum wieder aufzunehmen. Leichter Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, stärker bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger im Vergleich zu der Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Aufgrund von Fortschritten bei den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerung, Düngung, Pestizidbehandlungen) findet man bei angebauten Kulturpflanzen nicht oft starke Stressbedingungen. Infolgedessen ist das durch leichten Stress induzierte geschwächte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal in der Landwirtschaft. Leichte Stressbedingungen sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (Umwelt-)Stressbedingungen, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotischer Stress kann durch Trockenheit oder Wasserüberschuss, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Gefriertemperaturen verursacht werden. Bei dem abiotischen Stress kann es sich um einen osmotischen Stress handeln, der durch Wasserstress (insbesondere aufgrund von Trockenheit), Salzstress, oxidativen Stress oder ionenbedingten Stress verursacht wird. Unter biotischem Stress versteht man gewöhnlich Stressbedingungen, die durch Pathogene, wie Bakterien, Viren, Nematoden, Pilze und Insekten, verursacht werden. Unter dem Begriff ”Nichtstress”-Bedingungen, wie er hier verwendet wird, versteht man solche Umweltbedingungen, die ein optimales Pflanzenwachstum ermöglichen. Der Fachmann ist mit den normalen Bodenbedingungen und Klimabedingungen für einen bestimmten Standort vertraut.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren ergibt Pflanzen, die bei Wachstum unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Stressbedingungen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Stressbedingungen wachsen, verbesserte Ertragsmerkmale aufweisen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen, von Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Stressbedingungen heranwachsen, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid wie oben definiert kodiert, moduliert (vorzugsweise erhöht).
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren ergibt unter abiotischen Stressbedingungen gewachsene Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Stressbedingungen gewachsen waren. Wie von Wang et al., (Planta (2003), 218: 1–14) beschrieben, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, die das Pflanzenwachstum und die Produktivität negativ beeinflussen. Trockenheit, Salinität, extreme Temperaturen und oxidativer Stress stehen bekanntlich miteinander in Verbindung und können über ähnliche Mechanismen Wachstums- und Zellschäden induzieren. Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767) beschreiben ein besonders hohes Ausmaß an gegenseitiger Beeinflussung von Trockenheitsstress und durch hohe Salinität verursachtem Stress. Trockenheit und/oder Versalzung äußern sich beispielsweise in erster Linie als osmotischer Stress, was zur Störung der Homöostase und der Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, der häufig Hoch- oder Niedertemperatur-, Salinitäts- oder Trockenheitsstress begleitet, kann zur Denaturierung funktioneller und struktureller Proteine führen. Demzufolge aktivieren diese verschiedenen Umweltstressfaktoren häufig ähnliche Signalleitungswege der Zelle und Zellreaktionen, wie die Produktion von Stressproteinen, die Aufwärtsregulation von Antioxidantien, die Anreicherung kompatibler gelöster Stoffe und ein Einstellen des Wachstums. Da verschiedene Umweltstressfaktoren ähnliche Stoffwechselwege aktivieren, sollten Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, vorzugsweise verbesserten Samenertragsmerkmalen, unter einer Art von abiotischen Stress-Wachstumsbedingungen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren abiotischen Stressbedingungen gewachsen waren, nicht als Einschränkung auf diese Art von abiotischen Stress-Wachstumsbedingungen angesehen werden, sondern es soll lediglich die Beteiligung der GRP-Polypeptide wie vorstehend definiert bei der Verbesserung der Ertragsmerkmale unter abiotischen Stress-Wachstumsbedingungen im Allgemeinen anzeigen.
  • Der Begriff „abiotischer Stress” wie im vorliegenden Text definiert soll einen oder mehrere der folgenden Stressfaktoren bedeuten: Wasserstress (aufgrund von Trockenheit oder Wasserüberschuss), anaerober Stress, Salzstress, Temperaturstress (aufgrund von Hitze, Kälte oder Gefriertemperaturen), chemischer Toxizitätsstress und oxidativer Stress. Gemäß einem Aspekt der Erfindung handelt es sich bei dem abiotischen Stress um einen osmotischen Stress, ausgewählt aus Wasserstress, Salzstress, oxidativem Stress und ionenbedingtem Stress. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Wasserstress um Trockenheitsstress. Der Begriff Salzstress ist nicht auf Natriumchlorid (NaCl) beschränkt, sondern es kann sich dabei unter Anderem um einen beliebigen Stress handeln, der durch eines oder mehrere der folgenden Salze verursacht wird: NaCl, KCl, LiCl, MgCl2, CaCl2.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren unter abiotischen Stresswachstumsbedingungen ergibt Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Stressbedingungen gewachsen waren. Daher wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale bei Pflanzen, die unter abiotischen Stresswachstumsbedingungen gewachsen waren, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, moduliert (vorzugsweise erhöht). Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist der abiotische Stress ein osmotischer Stress, ausgewählt aus einem oder mehreren der Folgenden: Wasserstress, Salzstress, oxidativem Stress und ionenbedingtem Stress.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren ergibt Pflanzen, die bei Wachstum unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, verbesserte Ertragsmerkmale, im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen gezüchteten Kontrollpflanzen aufweisen. Daher wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale bei Pflanzen bereitgestellt, die unter Nährstoffmangelbedingungen gezüchtet wurden, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, moduliert, vorzugsweise steigert. Nährstoffmangel kann sich unter Anderem aus einem Fehlen von Nährstoffen, wie Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, ergeben.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen, Teile davon (einschließlich Samen) oder Pflanzenzellen, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. Die Pflanzen, Teile davon oder Pflanzenzellen umfassen ein Nukleinsäuretransgen, das ein GRP-Polypeptid wie oben definiert, kodiert, vorzugsweise ein Isopentenyltransferase (IPT) Polypeptid.
  • Die Erfindung stellt auch Genkonstrukte und Vektoren bereit, um die Einführung und/oder Expression von Nukleinsäuresequenzen, die GRP-Polypeptide kodieren, in Pflanzen zu erleichtern. Die Genkonstrukte können in handelsübliche Vektoren eingeführt werden, die für die Transformation in Pflanzen und für die Expression des interessierenden Gens in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines wie im vorliegenden Text definierten Genkonstrukts in den erfindungsgemäßen Verfahren bereit.
  • Genauer ausgedrückt stellt die vorliegende Erfindung ein Konstrukt bereit, umfassend
    • (i) eine Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid wie oben definiert, vorzugsweise ein Isopentenyltransferase(IPT)-Polypeptid kodiert;
    • (ii) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz gemäß (a) vorantreiben sowie gegebenenfalls
    • (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  • Vorzugsweise ist die Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, wie oben definiert. Der Begriff ”Kontrollsequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hier definiert.
  • Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der eine der vorstehend beschriebenen Nukleinsäuresequenzen umfasst. Dem Fachmann sind die genetischen Elemente, die auf einem Vektor zur erfolgreichen Transformation, Selektion und Vermehrung der Wirtszellen, die die interessierende Sequenz enthalten, vorhanden sein müssen, geläufig. Die interessierende Sequenz ist funktionsfähig mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen (mindestens mit einem Promotor) verknüpft.
  • Jede Art von Promotor kann unabhängig davon, ob er natürlich oder synthetisch ist, vorteilhafterweise zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz verwendet werden. Ein samenspezifischer Promotor ist bei den Verfahren besonders geeignet. Siehe den Abschnitt ”Definitionen” für Definitionen der verschiedenen Promotortypen.
  • Es sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die GRP-Polypeptid-kodierende Nukleinsäuresequenz eingeschränkt ist, die durch SEQ ID NO: 131 veranschaulicht ist, entsprechend ist die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die Expression einer GRP-Polypeptid-kodierenden Nukleinsäuresequenz eingeschränkt, wenn sie durch einen samenspezifischen Promotor gesteuert wird.
  • Der samenspezifische Promotor ist vorzugsweise ein Prolamin-Promotor, vorzugsweise ein Prolamin-Promotor aus Reis. Der Prolamin-Promotor ist zudem vorzugsweise durch eine im Wesentlichen ähnliche Nukleinsäuresequenz wie SEQ ID NO: 133 veranschaulicht, am stärksten bevorzugt ist der Prolamin-Promotor durch SEQ ID NO: 133 veranschaulicht. Siehe Tabelle 2 im Abschnitt ”Definitionen” für weitere Beispiele für samenspezifische Promotoren.
  • Bei dem Konstrukt, das in eine Pflanze eingeführt wird, kann/können gegebenenfalls eine oder mehrere Terminatorsequenzen verwendet werden. Zusätzliche Regulationselemente können Transkriptionsenhancer sowie Translationsenhancer umfassen. Der Fachmann ist mit Terminator- und Enhancer-Sequenzen, die zur Durchführung der Erfindung geeignet sein können, vertraut. Zur Steigerung der Menge der reifen Botschaft, die sich im Cytosol anreichert, kann auch eine Intronsequenz zu der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder in der kodierenden Sequenz hinzugefügt werden, wie es im Abschnitt Definitionen beschrieben wurde. Andere Kontrollsequenzen (neben Promotor, Enhancer, Silencer, Intronsequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Solche Sequenzen sind dem Fachmann bekannt oder leicht zugänglich.
  • Die erfindungsgemäßen Genkonstrukte können weiterhin eine Replikationsursprungssequenz beinhalten, die zur Aufrechterhaltung und/oder die Replikation in einem bestimmten Zelltyp erforderlich ist. Ein Beispiel ist, wenn ein Genkonstrukt in einer Bakterienzelle als episomales genetisches Element aufrechterhalten werden muss (z. B. Plasmid- oder Cosmidmolekül). Zu bevorzugten Replikationsursprüngen gehören der f1-ori und colE1, sind jedoch nicht hierauf beschränkt.
  • Für den Nachweis des erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie sie bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wurden, und/oder für die Selektion der transgenen Pflanzen, die diese Nukleinsäuresequenzen umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (oder Reportergene) zu verwenden. Das Genkonstrukt kann daher gegebenenfalls ein Selektionsmarkergen umfassen. Selektionsmarker sind genauer im Abschnitt ”Definitionen” im vorliegenden Text beschrieben. Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder gespalten werden, sobald sie nicht mehr benötigt werden. Techniken zur Entfernung des Markergens sind im Stand der Technik bekannt, geeignete Techniken sind oben im Abschnitt Definitionen beschrieben.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Produktion von transgenen Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei eine Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid wie oben definiert, vorzugsweise ein Isopentenyltransferase (IPT) Polypeptid, in eine(r) Pflanze eingeführt und exprimiert wird.
  • Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Produktion von transgenen Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen bereit, wobei das Verfahren umfasst:
    • (i) Einbringen und Exprimieren einer GRP-Polypeptid-kodierenden Nukleinsäuresequenz in eine(r) Pflanze, ein(em) Pflanzenteil oder eine(r) Pflanzenzelle; und
    • (ii) Züchten der Pflanze, des Pflanzenteils oder der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Entwicklung fördern.
  • Die Nukleinsäuresequenz von (i) kann eine beliebige Nukleinsäuresequenz sein, die ein GRP-Polypeptid wie hier definiert kodieren kann.
  • Die Nukleinsäuresequenz kann in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst direkt eingeführt werden (was das Einführen in ein Gewebe, Organ oder einen beliebigen anderen Teil einer Pflanze beinhaltet). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäuresequenz vorzugsweise mittels Transformation in eine Pflanze eingeführt. Der Begriff ”Transformation” wird im vorliegenden Text im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können nach allen Verfahren, mit denen der Fachmann vertraut ist, regeneriert werden. Geeignete Verfahren finden sich in den oben genannten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
  • Im Allgemeinen werden nach der Transformation die Pflanzenzellen oder Zellgruppen auf das Vorhandensein von einem oder mehreren Markern selektiert, die von den mit dem interessierenden Gen gemeinsam transferierten, in Pflanzen exprimierbaren Genen kodiert werden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Für die Selektion von transformierten Pflanzen wird das bei der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial im Allgemeinen Selektionsbedingungen unterworfen, so dass man transformierte Pflanzen von untransformierten Pflanzen unterscheiden kann. So können zum Beispiel Samen, die auf die oben beschriebene Art und Weise erhalten wurden, ausgepflanzt werden und nach einer anfänglichen Wachstumsphase durch Spritzen einer geeigneten Selektion unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass man die Samen, gegebenenfalls nach Sterilisieren, auf Agarplatten heranzieht, wobei man ein geeignetes Selektionsmittel verwendet, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ werden die transformierten Pflanzen auf das Vorhandensein eines Selektionsmarkers wie die oben beschriebenen gescreent.
  • Nach dem DNA-Transfer und der Regeneration können mutmaßlich transformierte Pflanzen auch zum Beispiel unter Verwendung der Southern-Analyse auf das Vorhandensein des interessierenden Gens, die Kopienzahl und/oder die Genomorganisation ausgewertet werden. Alternativ dazu oder zusätzlich können die Expressionsniveaus der neu eingeführten DNA mittels Northern- und/oder Western-Analyse überwacht werden; wobei beide Techniken dem Durchschnittsfachmann gut bekannt sind.
  • Die erzeugten transformierten Pflanzen können mit unterschiedlichen Mitteln vermehrt werden, wie durch klonale Vermehrung oder durch klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (T1-Pflanze) geselbstet werden, und homozygote Transformanten der zweiten Generation (T2-Pflanze) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann mit Hilfe von klassischen Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten transformierten Organismen können in verschiedener Form vorliegen. Sie können beispielsweise Chimären von transformierten Zellen und untransformierten Zellen sein; klonale Transformanten (z. B. alle Zellen wurden dahingehend transformiert, dass sie die Expressionskassette enthalten); Pfropfmaterial von transformiertem und untransformiertem Gewebe (z. B. bei Pflanzen ein transformierter Wurzelstock, der auf ein untransformiertes Edelreis gepfropft wurde).
  • Die Erfindung beinhaltet auch Wirtszellen, die eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die ein wie oben definiertes GRP-Polypeptid kodiert, enthalten. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuretransgen oder den Vektor, für die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor, sind im Prinzip vorteilhafterweise alle Pflanzen, die die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide synthetisieren können.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich vorteilhaft auf jede beliebige Pflanze anwenden. Zu den Pflanzen, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren besonders geeignet sind, gehören alle Pflanzen, die zu der Superfamilie Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, einschließlich Futter- oder Weidepflanzenleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelkulturpflanzen, Bäume oder Sträucher. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze. Zu den Kulturpflanzen gehören zum Beispiel Sojabohne, Sonnenblume, Canola-Raps, Luzerne, Raps, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiter bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um eine monokotyle Pflanze. Zu den monokotylen Pflanzen gehört zum Beispiel Zuckerrohr. Weiter bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um ein Getreide. Zu den Getreiden gehören zum Beispiel Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer.
  • Die Erfindung betrifft auch erntefähige Teile einer Pflanze, wie zum Beispiel, jedoch nicht ausschließlich, Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Wurzeln, Rhizome, Knollen und Zwiebeln. Die Erfindung betrifft weiterhin Produkte, die von einem erntefähigen Teil einer solchen Pflanze abstammen, vorzugsweise direkt abstammen, wie trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der Erfindung handelt es sich bei der modulierten Expression um erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuresequenzen oder Genen oder Genprodukten, sind im Fachgebiet gut beschrieben; und Beispiele sind im Abschnitt Definitionen gegeben.
  • Wie vorstehend erwähnt, ist ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze; die Wirkungen der Durchführung des Verfahrens, d. h. das Verbessern der Ertragsmerkmale, können auch unter Verwendung anderer bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf T-DNA-Activation-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken findet sich im Abschnitt Definitionen.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen, die GRP-Polypeptide, wie hier beschrieben, kodieren, und die Verwendung dieser GRP-Polypeptide zur Verbesserung eines der oben genannten Ertragsmerkmale, in Pflanzen.
  • Hier beschriebene Nukleinsäuresequenzen, die das GRP-Polypeptid kodieren, oder die GRP-Polypeptide selbst können Verwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der mit einem für ein GRP-Polpeptid kodierenden Gen genetisch verknüpft sein kann. Die Gene/Nukleinsäuresequenzen oder die GRP-Polypeptide selbst können dazu verwendet werden, einen molekularen Marker zu bestimmen. Dieser DNA- oder Protein-Marker kann dann in Züchtungsprogrammen zur Selektion von Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen, vorzugsweise erhöhten Samenertragsmerkmalen, verwendet werden, wie hier unter den erfindungsgemäßen Verfahren definiert.
  • Allelische Varianten einer Nukleinsäuresequenz/eines Gens, die/das ein GRP-Polypeptid kodiert, können auch Verwendung in Marker-unterstützten Züchtungsprogrammen finden. Bei solchen Züchtungsprogrammen ist manchmal das Einführen von allelischer Variation durch Mutagenbehandlung der Pflanzen erforderlich, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese verwendet wird; alternativ kann das Programm von einer Sammlung von allelischen Varianten so genannten ”natürlichen” Ursprungs ausgehen, die ohne Absicht hervorgerufen wurden. Dann erfolgt die Identifikation allelischer Varianten, zum Beispiel mittels PCR. Darauf folgt ein Schritt zur Selektion besserer allelischer Varianten der in Frage kommenden Sequenz, die bessere Ertragsmerkmale liefern. Die Selektion wird gewöhnlich durchgeführt, indem man die Wachstumsleistung von Pflanzen verfolgt, die verschiedene allelische Varianten der in Frage kommenden Sequenz enthalten. Die Wachstumsleistung kann im Gewächshaus oder auf dem Feld verfolgt werden. Weitere Schritte sind gegebenenfalls u. a. das Kreuzen der Pflanzen, in denen die bessere allelische Variante identifiziert wurde, mit einer anderen Pflanze. Dies kann zum Beispiel zur Herstellung einer Kombination interessanter phänotypischer Merkmale verwendet werden.
  • GRP-Polypeptide kodierende Nukleinsäuresequenzen können auch als Sonden zur genetischen und physikalischen Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, und als Marker für Merkmale, die mit diesen Genen verknüpft sind, verwendet werden. Diese Information kann für die Pflanzenzüchtung nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwickeln. Eine solche Verwendung der GRP-Polypeptid-kodierenden Nukleinsäuresequenzen benötigt nur eine Nukleinsäuresequenz von mindestens 15 Nukleotiden Länge. Die GRP-Polypeptid-kodierenden Nukleinsäuresequenzen können als Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus(RFLP)-Marker verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laborstory Manual) von restriktions-gespaltener genomischer Pflanzen-DNA kann mit den GRP-kodierenden Nukleinsäuresequenzen sondiert werden. Die erhaltenen Bandenmuster können dann genetischen Analysen mit Computerprogrammen unterworfen werden, wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181), so dass man eine genetische Karte erhält. Die Nukleinsäuresequenzen können zudem zum Sondieren von Southern-Blots verwendet werden, die Restriktionsendonuklease behandelte genomische DNAs von einem Satz von Individuen enthalten, die die Eltern und die Nachfahren einer definierten genetischen Kreuzung repräsentieren. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird festgestellt und zur Berechnung der Position der GRP-Polypeptid-kodierenden Nukleinsäuresequenz in der genetischen Karte verwendet, die mit dieser Population erhalten wurde (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
  • Die Herstellung und Verwendung von Sonden, die von Pflanzengenen stammen, für die Verwendung bei der genetischen Kartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung spezifischer cDNA-Klone, wobei die vorstehend erläuterte Methodik oder Varianten davon verwendet werden. Für die Kartierung können zum Beispiel F2-Inzuchtpopulationen, Rückkreuzungspopulationen, zufallsgemäß gepaarte Populationen, nahezu isogene Linien und andere Sätze von Individuen verwendet werden. Diese Verfahren sind dem Fachmann bestens bekannt.
  • Die Nukleinsäuresequenzsonden können auch zur physikalischen Kartierung (d. h. zum Anordnen von Sequenzen in physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346 und darin genannte Literaturstellen) verwendet werden.
  • In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden zur Kartierung durch direkte Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154) verwendet werden. Zwar bevorzugen derzeitige FISH-Kartierungsverfahren die Verwendung großer Klone (mehrere kb bis mehrere Hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20), aber durch Verbesserungen in der Empfindlichkeit kann die FISH-Kartierung auch unter Verwendung kürzerer Sonden durchgeführt werden.
  • Eine Reihe von Verfahren auf Basis von Nukleinsäuresequenzamplifikation für die genetische und physikalische Kartierung kann unter Verwendung der Nukleinsäuresequenzen durchgeführt werden. Beispiele sind u. a. die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), Polymorphismus PCR-amplifizierter Fragmente (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotidverlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Radiation-Hybrid-Kartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy-Kartierung (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Bei diesen Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäuresequenz dazu verwendet, Primer-Paare zu gestalten und zu erzeugen, die bei der Amplifikationsreaktion oder Primerverlängerungsreaktionen verwendet werden. Die Gestaltung dieser Primer ist dem Fachmann bekannt. Bei Verfahren, die eine genetische Kartierung auf PCR-Basis einsetzen, kann es notwendig sein, dass man DNA-Sequenz-Unterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in dem Bereich identifiziert, welcher der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch für Kartierungsverfahren nicht allgemein erforderlich.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren ergeben Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, wie hier vorstehend beschrieben. Diese Merkmale können auch mit anderen ökonomisch vorteilhaften Merkmalen kombiniert werden, wie weiteren Ertragsmerkmalen, Toleranz gegenüber anderen abiotischen und biotischen Stressbedingungen, Merkmalen, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemisch und/oder physiologische Merkmale modifizieren.
  • In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung die Aufgaben, die folgendermaßen zusammengefasst sind:
    • Punkt 63: Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale in Pflanzen, umfassend das Modulieren (vorzugsweise Steigern) der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze, wobei das GRP-Polypeptid ein Isopentenyltransferase (IPT) Polypeptid nach SEQ ID NO: 132 ist, oder ein Orthologon, Paralogon oder Homologon davon und gegebenenfalls Selektieren auf Pflanzen, die verbesserte Ertragsmerkmale aufweisen.
    • Punkt 64: Verfahren nach Punkt 63, wobei das GRP-Polypeptid nach SEQ ID NO: 132 und ein Orthologon, Paralogon oder Homologon davon zur Isopentenyltransferase-Familie mit den InterPro Einträgen IPR002627 and IPR011593 gehören, oder eine Domäne oder ein Motiv nach der Konsensussequenz in 13 aufweisen.
    • Punkt 65: Verfahren nach Punkt 63 oder 64, wobei das GRP-Polypeptid in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu dem GRP-Polypeptid nach SEQ ID NO: 132 oder zu einer der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptid-Sequenzen aufweist.
    • Punkt 66: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt 63 bis 65, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, durch die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 131 oder einen Abschnitt davon veranschaulicht wird, oder eine Sequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO: 131 oder einen Abschnitt davon hybridisieren kann, oder eine Sequenz, die mit einer der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NOs hybridisieren kann, die in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegeben sind.
    • Punkt 67: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt 63 bis 66, wobei die modulierte (vorzugsweise erhöhte) Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die das GRP-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze herbeigeführt wird.
    • Punkt 68: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt 63 bis 67, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale einen oder mehrere aus: erhöhtem Gesamtsamenertrag pro Pflanze, erhöhter Anzahl gefüllter Samen, erhöhter Gesamtzahl Samen und erhöhtem Harvest Index, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
    • Punkt 69: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt 63 bis 68, wobei die modulierte Expression eine erhöhte Expression ist.
    • Punkt 70: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt 63 bis 69, wobei die Nukleinsäuresequenz funktionsfähig an einen samenspezifischen Promotor, vorzugsweise einen Prolamin-Promotor, am stärksten bevorzugt an einen Prolamin-Promotor aus Reis gebunden ist.
    • Punkt 71: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt 63 bis 70, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, stärker bevorzugt aus Arabidopsis thaliana stammt.
    • Punkt 72: Pflanze, Teil davon (einschließlich Samen), oder Pflanzenzelle, erhältlich durch ein Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt 63 bis 71, wobei die Pflanze, das Teil davon oder die Pflanzenzelle ein Nukleinsäuretransgen umfasst, dass ein GRP Polypeptid kodiert.
    • Punkt 73: Konstrukt, umfassend:
    • (a) eine Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid nach Punkt 63 bis 65 kodiert;
    • (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) steuern können; und gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
    • Punkt 74: Konstrukt nach Punkt 73, wobei eine der Kontrollsequenzen ein samenspezifischer Promotor, vorzugsweise ein Prolamin-Promotor, am stärksten bevorzugt ein Prolamin-Promotor aus Reis ist.
    • Punkt 75: Verwendung eines Konstrukts nach einem der Punkte 73 bis 75 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere gesteigertem Gesamtsamenertrag pro Pflanze, gesteigerter Anzahl gefüllter Samen, gesteigerter Gesamtanzahl Samen, und gesteigertem Harvest Index, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • Punkt 76: Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, transformiert mit einem Konstrukt nach einem der Punkte 74 bis 75.
    • Punkt 77: Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend:
    • (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid gemäß den Punkten 63 bis 65 kodiert in eine(r) Pflanze, ein(em) Pflanzenteil oder eine(r) Pflanzenzelle, und
    • (ii) Züchten der Pflanze, des Pflanzenteils oder der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die -entwicklung fördern.
    • Punkt 78: Transgene Pflanze mit verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere gesteigertem Gesamtsamenertrag pro Pflanze, gesteigerter Anzahl gefüllter Samen, gesteigerter Gesamtanzahl Samen und gesteigertem Harvest Index, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die durch eine erhöhte Expression einer Nukleinsäuresequenz hervorgehen, die ein GRP-Polypeptid nach den Punkten 63 bis 65 kodiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze stammt.
    • Punkt 79: Transgene Pflanze nach den Punkten 72, 76 oder 78, oder eine daraus abstammende transgene Pflanzenzelle, wobei es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer handelt.
    • Punkt 80: Erntefähige Teile einer Pflanze, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, welche ein GRP-Polypeptid nach Punkt 79 kodiert, wobei es sich bei den erntefähigen Teilen vorzugsweise um Samen handelt.
    • Punkt 81: Produkte, hergeleitet von einer Pflanze nach Punkt 79 und/oder von erntefähigen Teilen einer Pflanze nach Punkt 80.
    • Punkt 82: Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, bei der Verbesserung von Ertragsmerkmalen, insbesondere bei der Steigerung des Gesamtsamenertrags pro Pflanze, bei der Steigerung der Anzahl gefüllter Samen, bei der Steigerung der Gesamtanzahl Samen, und bei der Steigerung des Harvest Index, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wurde überraschend entdeckt, dass die Modulation (vorzugsweise Erhöhung) der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein STO-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze, Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem die Expression einer Nukleinsäure, die ein STO-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze moduliert wird.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zur Modulation (vorzugsweise Steigerung) der Expression einer Nukleinsäure, die ein STO-Polypeptid kodiert, erfolgt durch Einführen und Expression einer Nukleinsäure, die ein STO-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze.
  • Jede Bezugnahme auf ein ”Protein, das sich in den erfindungsgemäßen Verfahren eignet” soll ein STO-Polypeptid bedeuten, wie es hier definiert ist. Jede im erfindungsgemäßen Zusammenhang erfolgende Bezugnahme auf eine ”Nukleinsäure, die sich in den erfindungsgemäßen Verfahren eignet” soll eine Nukleinsäure bedeuten, die ein solches STO-Polypeptid kodieren kann. Die in eine Pflanze einzubringende (und daher bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignete) Nukleinsäure ist eine beliebige Nukleinsäure, die den nachstehend beschriebenen Proteintyp kodiert, der auch als ”STO-Nukleinsäure” oder ”STO-Gen” bezeichnet wird.
  • Ein ”STO-Polypeptid” wie es hier definiert ist, betrifft ein beliebiges Polypeptid, das mindestens ein B-Box-Domäne umfasst. Die B-Box-Domäne ist eine Aminosäuredomäne, die in Proteinen verschiedenen Ursprungs, wie auch bei prokaryotischen und eukaryotischen Organismen, konserviert ist. Die B-Box-Domäne ist etwa 40 Aminosäuren lang und umfasst konservierte Cystein- und Histidin-Reste an Schlüsselpositionen, so dass die Domäne in einer Tertiärstruktur ähnlich den Zinkfingern liegen kann, die an der Koordination von Zinkionen beteiligt sind. Die NMR-Analyse ergibt, dass die B-Box-Struktur zwei Betastränge, zwei Helix- Turns und drei Extended Loop-Regionen aufweist, die sich von jedem anderen Zinkbindemotiv unterscheiden (Borden et al. 1995 EMBO J. 1995 Dec 1; 14 (23): 5947–56).
  • Proteine, die B-Box-Domänen umfassen, können in speziellen Datenbanken wie Pfam und Interpro aufgefunden werden. Die Zugangsnummer der B-Box-Domäne in der Version 15.1 der Interpro Datenbank ist IPR000315, und PF00643 in der Pfam Version 21.0.
  • Auf der Basis von Sequenzvergleichen der B-Box-Domänen, die man in verschiedenen Proteinen findet, kann man Konsensussequenzen ableiten, die die B-Box-Domänen darstellen. Beispielsweise Reymond et al. (EMBO J. 2001 May 1; 20 (9): 2140–51) konnten Konsensussequenzen den beiden B-Box-Domänen zuordnen, die in den TRIM Proteinen von Homo sapiens vorhanden sind, wie beispielsweise CXX(C/D)X(7-12)CXXCXXXXCXX(C/H)X(3-4)HX(4-9)H für B-box1 und CXXHX(7-9)CXX(C/D/E/H)XXXXCXXCX(3-6)H(X-4)(H/C) für B-box2. Eine in den B-Box-Domänen vieler STO-Proteine pflanzlichen Ursprungs gefundene Konsensus-Sequenz ist durch SEQ ID NO: 221 (CX2CX16CX2C) veranschaulicht. Eine für alle B-Box-Domänen charakteristische Signatur ist das Vorhandensein von mindestens 4 Aminosäureresten, gewöhnlich Cystein- und/oder Histidin-Resten mit der mutmaßlichen Kapazität zur Bindung von Zinkionen.
  • Die in den erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten bevorzugten STO-Polypeptide umfassen mindestens eine, stärker bevorzugt zwei B-Box-Domänen mit der Konsensussequenz CX2CX16CX2C (SEQ ID NO: 221).
  • Die in der SEQ ID NO: 169 gefundenen B-Box-Domänen sind veranschaulicht durch SEQ ID NO: 219 und SEQ ID NO: 220. Weiter bevorzugte STO-Polypeptide, die sich in den erfindungsgemäßen Verfahren eignen, umfassen mindestens eine, stärker bevorzugt zwei B-Box-Domänen mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 219 oder SEQ ID NO: 220.
  • Alternativ kann eine B-Box-Domäne in einem STO-Polypeptid identifiziert werden, indem man einen Sequenzvergleich mit bekannten Polypeptiden ausführt, die eine B-Box-Domäne enthalten, und die Ähnlichkeit in der Region der B-Box-Domäne ermittelt. Die Sequenzen können mit beliebigen Verfahren des Standes der Technik einem Alignment unterworfen werden. Die Wahrscheinlichkeit, dass ein Alignment in einer bestimmten Sequenz erfolgt, wird als Basis zur Identifikation ähnlicher Polypeptide verwendet. Ein Parameter, der gewöhnlich verwendet wird, um eine solche Wahrscheinlichkeit darzustellen, wird als E-Wert bezeichnet. Der E-Wert ist ein Maß für die Verlässlichkeit des S-Scores. Der S-Score ist ein Maß für die Ähnlichkeit der Abfragesequenz zur gezeigten Sequenz. Der E-Wert beschreibt, wie oft ein bestimmter S-Score den Erwartungen zufolge zufallsgemäß vorkommt. Die E-Wert-Ausschlussgrenze kann sogar 1,0 betragen. Der übliche Schwellenwert für einen zuverlässigen E-Wert aus einem Output einer BLAST-Suche mit einem STO-Polypeptid als Abfragesequenz ist niedriger als 1.e–5 1.e–10, 1.e–15, 1.e–20, 1.e–25, 1.e–50, 1.e–75, 1.e–100, 1.e–200, 1.e–300, 1.e–400, 1.e–500, 1.e–600, 1.e–700 und 1.e–800. Bevorzugte STO-Polypeptide, die sich in den erfindungsgemäßen Verfahren eignen, umfassen mindestens eine, stärker bevorzugt zwei B-Box-Domänen, deren Sequenz in steigender Reihenfolge der Präferenz einen E-Wert unter e–5(=10–5), 1.e–10, 1.e–15, 1.e–20, 1.e–25, 1.e–50, 1.e–75, 1.e–100, 1.e–200, 1.e–300, 1.e–400, 1.e–500, 1.e–600 1.e–700 und 1.e–800 in einem Alignment mit SEQ ID NO: 219 oder SEQ ID NO: 220 oder irgend einer B-Box-Domäne aufweist, wie er in einem bekannten STO-Polypeptid gefunden wird, wie diejenigen in der Tabelle A.
  • Die in den erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten STO-Polypeptid-Sequenzen bildet bei Verwendung beim Aufbau eines Stammbaums wie er in der 16 gezeigt ist, eher Cluster mit der Gruppe der STO-Polypeptide, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 169 (OS04g0540200 in der Figur) umfassen, als mit irgend einer anderen Gruppe.
  • Alternativ oder zusätzlich betrifft ein ”STO-Polypeptid” wie es hier definiert ist ein Polypeptid, das in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Polypeptid-Sequenz-Identität zu dem STO-Polypeptid wie es in SEQ ID NO: 169 oder SEQ ID NO: 171 gezeigt ist, oder zu einer der in Tabelle A5 von Beispiel 1 hier angegebenen Polypeptid-Sequenzen aufweist.
  • Die Begriffe ”Domäne” und ”Motiv” sind im vorliegenden Text in dem Abschnitt ”Definitionen” definiert. Für die Identifikation von Domänen gibt es Spezialdatenbanken, zum Beispiel SMART (Schultz et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al. (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244, InterPro (Mulder et al. (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315–318, Prosite (Sucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences Motivs und its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAIPress, Menlo Park; Hubo et al., Nucl. Acids Res. 32: D134–D137, (2004), oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30 (1): 276–280 (2002). Ein Satz Werkzeuge für die In-silico-Analyse von Proteinsequenzen findet sich auf dem ExPASY-Proteomics-Server (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003)). Domänen oder Motive können auch unter Verwendung von Routinetechniken, wie Sequenz-Alignment, identifiziert werden.
  • Verfahren für das Alignment von Sequenzen für Vergleichszwecke sind in der Fachwelt gut bekannt, dazu zählen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA. Bei GAP wird der Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453) verwendet, um das globale Alignment (d. h. das Alignment, das sich über die vollständigen Sequenzen erstreckt) von zwei Sequenzen, das die Anzahl der ”matches” maximiert und die Anzahl der ”gaps” minimiert. Beim BLAST-Algorithmus (Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10) wird die Sequenzidentität in Prozent berechnet, und es wird eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen durchgeführt. Die Software für die Durchführung einer BLAST-Analyse ist der Öffentlichkeit über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) zugänglich. Homologa können leicht unter Verwendung von zum Beispiel dem multiplen Sequenz-Alignment-Algorithmus ClustalW (Version 1.83) identifiziert werden, und zwar mit den Default-Parametern für paarweises Alignment und einer Scoring-Methode in Prozent. Die Gesamtprozentsätze der Ähnlichkeit und der Identität können auch unter Verwendung von einer der in dem MatGAT-Software-Paket verfügbaren Methoden bestimmt werden (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003, Juli, 10; 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences.). Für eine Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven können, wie es dem Fachmann ersichtlich wird, kleine manuelle Veränderungen vorgenommen werden. Darüber hinaus können statt Volllängensequenzen für die Identifikation von Homologa auch spezifische Domänen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können mit den oben erwähnten Programmen unter Einstellung der Default-Parameter über die gesamte Nukleinsäure- oder Polypeptid-Sequenz oder über ausgewählte Domänen oder konservierte Motiv(e) bestimmt werden.
  • Außerdem können STO-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form), wenn sie in einer transgenen Pflanze, vorzugsweise Reis, unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors exprimiert werden, zu einer Modulation der Blütezeit, vorzugsweise zu einer Verkürzung der Blütezeit, führen. Werkzeuge und Techniken zur Herstellung transgener Pflanzen und zur Messung der Blütezeit sind im Stand der Technik bekannt. Weitere Einzelheiten sind im Abschnitt Beispiele zu finden.
  • Die vorliegende Erfindung wird dadurch veranschaulicht, dass man Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 168, welche die Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 169 kodiert, transformiert. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhaft unter Verwendung jeder beliebigen Nukleinsäure, die ein STO-Polypeptid kodiert, oder des STO-Polypeptids, wie hier definiert, durchgeführt werden.
  • Beispiele für Nukleinsäuren, die STO-Polypeptide kodieren, sind hier in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegeben. Solche Nukleinsäuren eignen sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Die in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen für Orthologe und Paraloge des STO-Polypeptids gemäß SEQ ID NO: 169, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht identifiziert werden, indem man eine so genannte reziproke Blast-Suche durchführt. Dies beinhaltet üblicherweise ein erstes BLASTing, bei dem mit einer Abfragesequenz (zum Beispiel mit einer der in Tabelle A5 von Beispiel 1 aufgelisteten Sequenzen) ein BLASTing gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird. BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) werden im Allgemeinen verwendet, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein zweites BLASTing gegen Sequenzen des Organismus, aus dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (ist die Abfragesequenz die SEQ ID NO: 168 oder SEQ ID NO: 169, dann wäre das zweite BLASTing daher gegen Sequenzen aus Reis). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit von dem ersten BLASTing aus derselben Art stammt wie die Abfragesequenz, in diesem Fall führt ein zweites BLASTing idealerweise zu der Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit in dem ersten BLASTing nicht von derselben Art stammt wie die Abfragesequenz, und führt vorzugsweise beim zweiten BLASTing dazu, dass die Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits ist.
  • Bevorzugte Homologe
  • Hochrangige Hits sind solche mit niedrigem E-Wert. Je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der ”Score” (anders ausgedrückt, desto niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Hit durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist im Stand der Technik bekannt. Das ”Scoring” der Vergleiche erfolgt nicht nur mittels E-Werten, sondern auch anhand der Prozent Identität. Prozent Identität bezieht sich auf die Anzahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. Bei großen Familien kann man ClustalW und anschließend einen Neighbour-Joining-Stammbaum dazu verwenden, Cluster verwandter Gene leichter sichtbar zu machen und Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
  • Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren können auch Nukleinsäurevarianten geeignet sein. Beispiele für solche Varianten sind u. a. Nukleinsäuren, die Homologe und Derivate von einer der in Tabelle A5 von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen kodieren, wobei die Begriffe ”Homolog” und ”Derivat” wie hier definiert sind. Für die erfindungsgemäßen Verfahren sind auch Nukleinsäuren geeignet, die Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen von einer der in Tabelle A5 von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen kodieren. Homologe und Derivate, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische und funktionelle Aktivität auf wie das unmodifizierte Protein, von dem sie stammen.
  • Zu weiteren Nukleinsäurevarianten, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, zählen Abschnitte von Nukleinsäuren, die STO-Polypeptide kodieren, Nukleinsäuren, die mit Nukleinsäuren, die STO-Polypeptide kodieren, hybridisieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuren, die STO-Polypeptide kodieren, allelische Varianten von Nukleinsäuren, die STO-Polypeptide kodieren, und Varianten von Nukleinsäuren, die STO-Polypeptide kodieren, die mittels ”gene shuffling” erhalten wurden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Spleißvariante, allelische Variante und ”gene shuffling” sind wie hier beschrieben.
  • Nukleinsäuren, die STO-Polypeptide kodieren, müssen keine Volllängen-Nukleinsäuren sein, da die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf die Verwendung von Volllängen-Nukleinsäuresequenzen angewiesen ist. Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze einen Abschnitt von einer der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Ein Abschnitt einer Nukleinsäure kann zum Beispiel dadurch hergestellt werden, dass man eine oder mehrere Deletionen an der Nukleinsäure durchführt. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder können an andere kodierende (oder nichtkodierende) Sequenzen fusioniert werden, um zum Beispiel ein Protein herzustellen, das mehrere Aktivitäten in sich vereinigt. Wenn es an andere kodierende Sequenzen fusioniert ist, kann das so erhaltene, nach der Translation hergestellte Polypeptid größer sein als für den Proteinabschnitt vorhergesagt wurde.
  • Abschnitte, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren ein STO-Polypeptid, wie hier definiert, und haben im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren oder um einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle A5 von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen kodiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt mindestens 100, 200, 300, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 aufeinander folgende Nukleotide lang, wobei es sich bei den aufeinander folgenden Nukleotiden um eine der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder um eine Nukleinsäure handelt, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen kodiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 168. Vorzugsweise kodiert der Abschnitt eine Aminosäuresequenz, die, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 16 dargestellten, verwendet wird, Vorzugsweise bildet die STO-Polypeptidsequenz, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 16 dargestellten, verwendet wird, Cluster eher mit der Gruppe der STO-Polypeptide, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 169 umfasst, (OS04g0540200 in der Figur) als mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Nukleinsäure, die unter Bedingungen einer verringerten Stringenz, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, mit einer Nukleinsäure, die ein STO-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, oder mit einem Abschnitt, wie hier definiert, hybridisieren kann.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die mit einer der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren hybridisieren kann, einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure hybridisieren kann, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Hybridisierende Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren ein STO-Polypeptid, wie hier definiert, das im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen aufweist. Vorzugsweise kann die hybridisierende Sequenz mit einer der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren oder mit einem Abschnitt von einer dieser Sequenzen hybridisieren, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder die hybridisierende Sequenz kann mit einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen kodiert, hybridisieren. Am stärksten bevorzugt kann die hybridisierende Sequenz mit der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 168 oder mit einem Abschnitt davon hybridisieren.
  • Vorzugsweise kodiert die hybridisierende Sequenz ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie eine Volllängensequenz ist und zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 16 dargestellten, verwendet wird, Cluster eher mit der Gruppe der STO-Polypeptide, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 169 umfasst, (OS04g0540200 in der Figur) als mit irgendeiner anderen Gruppe bildet.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Spleißvariante, die ein STO-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, wobei eine Spleißvariante wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Spleißvariante von einer der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Bevorzugte Spleißvarianten sind Spleißvarianten einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 168 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog der SEQ ID NO: 169 kodiert. Vorzugsweise bildet die von der Spleißvariante kodierte Aminosäuresequenz, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 16 dargestellten, verwendet wird, Cluster eher mit der Gruppe der STO-Polypeptide, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 169 umfasst, (OS04g0540200 in der Figur) als mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein STO-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, wobei eine allelische Variante wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine allelische Variante von einer der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Die allelischen Varianten, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, haben im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie das STO-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 169 und jede der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuren. Allelische Varianten kommen in der Natur vor und von den erfindungsgemäßen Verfahren wird die Verwendung dieser natürlichen Allele mit umfasst. Bei der allelischen Variante handelt es sich vorzugsweise um eine allelische Variante der SEQ ID NO: 168 oder um eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog der SEQ ID NO: 169 kodiert. Die von der allelischen Variante kodierte Aminosäuresequenz bildet vorzugsweise, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 16 dargestellten, verwendet wird, Cluster eher mit der Gruppe der STO-Polypeptide, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 169 umfasst, (OS04g0540200 in der Figur) als mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • ”Gene shuffling” oder gerichtete Evolution kann ebenfalls dazu verwendet werden, Varianten von Nukleinsäuren herzustellen, die STO-Polypeptide, wie oben definiert, kodieren, wobei der Begriff ”gene shuffling” wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante von einer der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert, wobei die Nukleinsäurevariante mittels ”gene shuffling” erhalten wird.
  • Die von der Nukleinsäurevariante kodierte Aminosäuresequenz, die direkt oder indirekt mittels gene shuffling erhalten wird, bildet vorzugsweise, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 16 dargestellten, verwendet wird, Cluster eher mit der Gruppe der STO-Polypeptide, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 169 umfasst, (OS04g0540200 in der Figur) als mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Nukleinsäuresequenzvarianten können weiterhin auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Zur Erzielung einer ortsgerichteten Mutagenese stehen mehrere Verfahren zur Verfügung, von denen die üblichsten Verfahren auf PCR-Basis sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Hrsg.).
  • Nukleinsäuren, die STO-Polypeptide kodieren, können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle stammen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form in ihrer Zusammensetzung und/oder genomischen Umgebung durch gezielte Manipulation durch den Menschen modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die Nukleinsäure, die ein STO-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, weiterhin bevorzugt aus einer monokotylen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Poaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Oryza sativa.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen. Insbesondere führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” sind hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Werden hier verbesserte Ertragsmerkmale erwähnt, so soll dies eine Erhöhung der Jungpflanzen-(Keimling-)vitalität und eine veränderte Blütezeit, genauer gesagt, eine kürzere Blütezeit, im Vergleich zu Kontrollpflanzen bedeuten. Vorzugsweise beträgt die Verkürzung der Blütezeit mindestens 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 oder 25 Tage oder um mindestens 5%, 10%, 15%, 20% oder 25% der Zeit im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • Wählt man Mais als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung als eines oder mehrere der folgenden Merkmale äußern: Unter anderem erhöhte Anzahl an Pflanzen, die pro Hektar oder Acre wachsen, eine Erhöhung der Anzahl an Ähren pro Pflanze, eine Erhöhung der Anzahl an Reihen, der Anzahl an Körnern pro Reihe, des Korngewichts, Tausendkorngewichts, der Ährenlänge/des Ährendurchmessers, eine Erhöhung der Samenfüllungsrate (d. h. der Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl der Samen und multipliziert mit 100). Wählt man Reis als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung als eine Erhöhung eines oder mehrere der folgenden Merkmale ausdrücken: Unter anderem Anzahl der Pflanzen pro Hektar oder Acre, Anzahl der Rispen pro Pflanze, Anzahl der Ährchen pro Rispe, Anzahl der Blüten (Einzelblüten) pro Rispe (ausgedrückt als Verhältnis der Anzahl an gefüllten Samen zu der Anzahl an Primärrispen), erhöhte Samenfüllungsrate (d. h. erhöhte Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100), erhöhtes Tausendkorngewicht.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erhöhung der Jungpflanzen-(Keimling-)vitalität und zur Veränderung der Blütezeit, insbesondere zur Verkürzung der Blütezeit von Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein STO-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht.
  • Weil die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen einen verbesserten Ertrag aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen (zumindest während eines Teils ihres Lebenszyklus) eine erhöhte Wachstumsrate aufweisen als Kontrollpflanzen in einem entsprechenden Stadium ihres Lebenszyklus.
  • Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (darunter Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen in der ganzen Pflanze stattfinden. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Unter dem Lebenszyklus einer Pflanze kann man diejenige Zeit verstehen, die die Pflanze benötigt, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, in dem die Pflanze trockene reife Samen ähnlich dem Ausgangsmaterial produziert hat. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren, wie Jungpflanzenvitalität, Wachstumsrate, ”Greenness Index”, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung, beeinflusst werden. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann in einem Stadium oder in mehreren Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Lebenszyklus der Pflanze erfolgen. Eine erhöhte Wachstumsrate während der Frühstadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann verbesserte Vitalität widerspiegeln. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, so dass die Pflanzen später gesät werden können und/oder früher geerntet werden können als dies sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt lässt sich mit einer früheren Blütezeit erzielen). Ist die Wachstumsrate ausreichend erhöht, kann dies weiteres Aussäen von Samen derselben Pflanzenart ermöglichen (zum Beispiel Aussäen und Ernten von Reispflanzen und anschließendes Aussäen und Ernten von weiteren Reispflanzen sogar innerhalb einer herkömmlichen Wachstumsperiode). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, kann dies ebenso das weitere Aussäen von Samen anderer Pflanzenarten ermöglichen (zum Beispiel das Aussäen und Ernten von Maispflanzen und anschließend zum Beispiel Aussäen und gegebenenfalls Ernten von Sojabohne, Kartoffel oder einer anderen geeigneten Pflanze). Auch mehrmalige weitere Ernten von demselben Wurzelstock können bei einigen Kulturpflanzen möglich sein. Eine Veränderung des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Acre führen (weil man eine bestimmte Pflanze öfter (z. B. pro Jahr) heranziehen und ernten kann). Eine erhöhte Wachstumsrate kann auch dazu führen, dass man transgene Pflanzen in einem breiteren geographischen Bereich als ihre Wildtyp-Gegenstücke anbauen kann, da die räumlichen Beschränkungen für den Anbau einer Kultur häufig von ungünstigen Umweltbedingungen entweder während der Pflanzzeit (früh in der Saison) oder während der Erntezeit (spät in der Saison) bestimmt werden. Solche ungünstigen Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt ist. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten verschiedener Parameter aus Wachstumskurven bestimmt werden, wobei die Parameter u. a. folgende sein können: T-Mid (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 50% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und T-90 (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 90% ihrer Maximalgröße zu erreichen).
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit einer im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Wachstumsrate. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein STO-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht.
  • Eine Erhöhung des Ertrags oder der Wachstumsrate tritt unabhängig davon auf, ob die Pflanze unter Nichtstressbedingungen steht oder ob die Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen verschiedenen Stressbedingungen unterworfen wird. Üblicherweise reagieren Pflanzen auf Stress dadurch, dass sie langsamer wachsen. Unter starken Stressbedingungen kann die Pflanze sogar ihr Wachstum völlig einstellen. Leichter Stress ist dagegen hier als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist und der nicht dazu führt, dass die Pflanze völlig aufhört zu wachsen, ohne dass sie die Fähigkeit besitzt, ihr Wachstum wieder aufzunehmen. Leichter Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, stärker bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger im Vergleich zu der Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Aufgrund von Fortschritten bei den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerung, Düngung, Pestizidbehandlungen) findet man bei angebauten Kulturpflanzen nicht oft starke Stressbedingungen. Infolgedessen ist das durch leichten Stress induzierte geschwächte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal in der Landwirtschaft. Leichte Stressbedingungen sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (Umwelt-)Stressbedingungen, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotischer Stress kann durch Trockenheit oder Wasserüberschuss, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Gefriertemperaturen verursacht werden. Bei dem abiotischen Stress kann es sich um einen osmotischen Stress handeln, der durch Wasserstress (insbesondere aufgrund von Trockenheit), Salzstress, oxidativen Stress oder ionenbedingten Stress verursacht wird. Unter biotischem Stress versteht man gewöhnlich Stressbedingungen, die durch Pathogene, wie Bakterien, Viren, Pilze und Insekten, verursacht werden.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren können insbesondere unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen durchgeführt werden, wobei Pflanzen erhalten werden, die im Vergleich zu Kontrollpflanzen einen höheren Ertrag aufweisen. Wie von Wang et al. (Planta (2003), 218: 1–14) beschrieben, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenproduktivität negativ beeinflussen. Es ist bekannt, dass Trockenheit, Salinität, extreme Temperaturen und oxidativer Stress miteinander in Verbindung stehen und über ähnliche Mechanismen Wachstums- und Zellschäden induzieren können. Rabbani et al., (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767) beschreiben ein besonders hohes Ausmaß an gegenseitiger Beeinflussung (”Cross-Talk”) von Trockenheitsstress und durch hohe Salinität verursachtem Stress. Zum Beispiel äußern sich Trockenheit und/oder Versalzung in erster Linie als osmotischer Stress, was zur Störung der Homöostase und der Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, der häufig hohe oder niedrige Temperaturen, Salinität oder Trockenheitsstress begleitet, kann zur Denaturierung von funktionellen und strukturellen Proteinen führen. Infolgedessen aktivieren diese verschiedenen Umweltstressbedingungen häufig ähnliche Zellsignalwege und Zellreaktionen, wie die Produktion von Stressproteinen, die Hinaufregulation von Antioxidantien, die Akkumulation von kompatiblen gelösten Stoffen und ein Einstellen des Wachstums. Der Begriff ”Nichtstress”-Bedingungen, wie hier verwendet, bezieht sich auf solche Umweltbedingungen, die ein optimales Pflanzenwachstum gestatten. Der Fachmann kennt die normalen Bodenbedingungen und Klimabedingungen für einen gegebenen Standort.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verleiht Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen herangezogen werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags bei Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen herangezogen werden, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein STO-Polypeptid kodiert, erhöht.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verleiht Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, herangezogen werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags bei Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen herangezogen werden, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren die Expression einer Nukleinsäure, die ein STO-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze erhöht. Ein Nährstoffmangel kann durch ein Fehlen von Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor hervorgerufen werden.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen, Teile davon (einschließlich Samen) oder Pflanzenzellen, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. Die Pflanzen oder die Teile davon umfassen ein Nukleinsäuretransgen, das ein STO-Polypeptid, wie oben definiert, kodiert.
  • Die Erfindung stellt auch Genkonstrukte und Vektoren bereit, um die Einführung und/oder Expression von Nukleinsäuren, die STO-Polypeptide kodieren, in Pflanzen zu erleichtern. Die Genkonstrukte können in Vektoren eingefügt werden, die im Handel erhältlich sein können und für die Transformation in Pflanzen und für die Expression des interessierenden Gens in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines Genkonstrukts, wie hier definiert, bei den erfindungsgemäßen Verfahren bereit.
  • Genauer gesagt, stellt die vorliegende Erfindung ein Konstrukt bereit, das Folgendes umfasst:
    • (a) eine Nukleinsäure, die ein STO-Polypeptid, wie oben definiert, kodiert;
    • (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz unter (a) vorantreiben können, und gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  • Vorzugsweise ist die Nukleinsäuresequenz, die ein STO-Polypeptid kodiert, wie vorstehend definiert. Die Begriffe ”Kontrollsequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hier definiert.
  • Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der eine der oben beschriebenen Nukleinsäuren umfasst. Der Fachmann kennt die genetischen Elemente, die in einem Vektor vorhanden sein müssen, damit Wirtszellen, die die interessierende Sequenz enthalten, erfolgreich transformiert, selektiert und vermehrt werden können. Die interessierende Sequenz ist mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen (mindestens mit einem Promoter) funktionsfähig verbunden.
  • Jede Art von Promoter, ob natürlich oder synthetisch, kann vorteilhaft für das Vorantreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz verwendet werden. Ein konstitutiver Promoter ist für die Verfahren besonders geeignet. Die Definitionen der verschiedenen Promotertypen siehe hier im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Es sollte selbstverständlich sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung weder auf die durch SEQ ID NO: 168 dargestellte, ein STO-Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz noch auf die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein STO-Polypeptid kodiert, wenn sie von einem konstitutiven Promotor angetrieben wird, beschränkt ist.
  • Der konstitutive Promotor ist vorzugsweise ein GOS2-Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor aus Reis. Weiterhin bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz dargestellt, die im Wesentlichen der SEQ ID NO: 218 gleicht, am stärksten bevorzugt ist der konstitutive Promotor wie durch SEQ ID NO: 218 dargestellt. Weitere Beispiele für konstitutive Promotoren siehe hier in Tabelle 2 im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Gegebenenfalls kann/können eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem Konstrukt, das in eine Pflanze eingeführt wird, verwendet werden. Weitere Regulationselemente können u. a. Transkriptionsenhancer und Translationsenhancer sein. Der Fachmann ist mit Terminator- und Enhancersequenzen vertraut, die für die Durchführung der Erfindung geeignet sein können. Es kann auch eine Intronsequenz zu der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder der kodierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge an reifer Botschaft, die im Cytosol akkumuliert, zu erhöhen, wie im Abschnitt Definitionen beschrieben ist. Weitere Kontrollsequenzen (neben Promotor-, Enhancer-, Silencer-, Intronsequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Solche Sequenzen sind dem Fachmann bekannt oder können von ihm leicht erhalten werden.
  • Die erfindungsgemäßen Genkonstrukte können weiterhin eine Replikationsursprungssequenz beinhalten, die für die Aufrechterhaltung und/oder die Replikation in einem bestimmten Zelltyp erforderlich ist. Ein Beispiel ist, wenn ein Genkonstrukt in einer Bakterienzelle als episomales genetisches Element (z. B. ein Plasmid- oder Cosmidmolekül) aufrechterhalten werden muss.
  • Bevorzugte Replikationsursprünge sind u. a. der f1-ori und colE1, sie sind jedoch nicht hierauf beschränkt.
  • Für den Nachweis eines erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie sie bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, und/oder für die Selektion transgener Pflanzen, die diese Nukleinsäuren umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (oder Reportergene) zu verwenden. Daher kann das Genkonstrukt gegebenenfalls ein Selektionsmarkergen umfassen. Selektionsmarker sind hier im Abschnitt ”Definitionen” eingehender beschrieben. Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder ausgeschnitten werden, wenn sie nicht mehr benötigt werden. Techniken zur Entfernung von Markern sind im Stand der Technik bekannt, geeignete Techniken sind vorstehend im Abschnitt Definitionen beschrieben.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in eine(r) Pflanze eine beliebige Nukleinsäuresequenz, die ein STO-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, einführt und exprimiert.
  • Genauer gesagt, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung transgener Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere erhöhter Jungpflanzen-(Keimling-)vitalität und/oder veränderter Blütezeit, genauer gesagt kürzerer Blütezeit von Pflanzen, bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    • (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein STO-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze oder Pflanzenzelle und
    • (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung fördern.
  • Bei der Nukleinsäure unter (i) kann es sich um eine der Nukleinsäuren handeln, die ein STO-Polypeptid, wie hier definiert, kodieren können.
  • Die Nukleinsäuresequenz kann direkt in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst eingeführt werden (was das Einführen in ein Gewebe, ein Organ oder einen anderen Teil einer Pflanze beinhaltet). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäuresequenz vorzugsweise mittels Transformation in eine Pflanze eingeführt. Der Begriff ”Transformation” ist hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können durch alle Verfahren regeneriert werden, mit denen der Fachmann vertraut ist. Geeignete Verfahren finden sich in den oben genannten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
  • Im Allgemeinen werden nach der Transformation die Pflanzenzellen oder Zellgruppierungen hinsichtlich des Vorhandenseins von einem oder mehreren Markern selektiert, die von Genen kodiert werden, die in Pflanzen exprimierbar sind und die mit dem interessierenden Gen co-transferiert wurden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Für die Selektion von transformierten Pflanzen wird das bei der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial in der Regel derartigen Selektionsbedingungen unterworfen, dass man transformierte Pflanzen von untransformierten Pflanzen unterscheiden kann. So können zum Beispiel Samen, die auf die oben beschriebene Weise erhalten wurden, ausgepflanzt werden und nach einer anfänglichen Wachstumsphase einer geeigneten Selektion durch Spritzen unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass man die Samen, gegebenenfalls nach Sterilisieren, auf Agarplatten unter Verwendung eines geeigneten Selektionsmittels heranzieht, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ wird das Vorhandensein eines Selektionsmarkers, wie die oben beschriebenen, in den transformierten Pflanzen mittels Screening ermittelt.
  • Nach DNA-Transfer und Regeneration können mutmaßlich transformierte Pflanzen auch zum Beispiel unter Verwendung der Southern-Analyse hinsichtlich des Vorhandenseins des interessierenden Gens, der Kopienzahl und/oder der Genomorganisation untersucht werden. Alternativ oder zusätzlich können die Expressionsniveaus der neu eingeführten DNA unter Verwendung von Northern- und/oder Western-Analyse verfolgt werden, wobei beide Techniken dem Durchschnittsfachmann bekannt sind.
  • Die erzeugten transformierten Pflanzen können durch eine Vielzahl von Mitteln vermehrt werden, wie durch klonale Vermehrung oder klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (T1-Pflanze) geselbstet werden, und homozygote Transformanten der zweiten Generation (T2-Pflanzen) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann unter Verwendung klassischer Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten transformierten Organismen können in einer Vielzahl von Formen vorliegen. So kann es sich zum Beispiel um Chimären von transformierten Zellen und untransformierten Zellen, klonale Transformanten (z. B. dass alle Zellen so transformiert wurden, dass sie die Expressionskassette enthalten), Pfropfmaterial von transformiertem und untransformiertem Gewebe (z. B. bei Pflanzen ein transformierter Wurzelstock, der auf ein untransformiertes Edelreis gepfropft wurde) handeln.
  • Die vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf jede Pflanzenzelle oder Pflanze, die durch eines der hier beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, und auf alle Pflanzenteile und sämtliches Vermehrungsmaterial davon. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Nachkommenschaft eine(r/s) primär transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, die/das durch eines der oben genannten Verfahren hergestellt wurde, wobei die einzige Voraussetzung ist, dass die Nachkommenschaft dasselbe/dieselben genotypische(n) und/oder phänotypische(n) Merkmal(e) aufweist, wie es/sie der Elter bei den erfindungsgemäßen Verfahren zeigt.
  • Die Erfindung beinhaltet auch Wirtszellen, die eine isolierte Nukleinsäure enthalten, die ein STO-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die Nukleinsäuren oder den Vektor, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor sind im Prinzip vorteilhafterweise alle Pflanzen, welche die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide synthetisieren können.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich vorteilhaft auf jede beliebige Pflanze anwenden. Zu den Pflanzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren besonders geeignet sind, gehören alle Pflanzen, die zur Superfamilie der Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, einschließlich Futter- oder Weidepflanzenleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelkulturen, Bäume oder Sträucher. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze. Beispiele für Kulturpflanzen sind zum Beispiel u. a. Sojabohne, Sonnenblume, Canola, Luzerne, Raps, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiterhin bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um eine monokotyle Pflanze. Beispiele für monokotyle Pflanzen sind zum Beispiel u. a. Zuckerrohr. Stärker bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um ein Getreide. Beispiele für Getreide sind zum Beispiel u. a. Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer.
  • Die Erfindung erstreckt sich auch auf erntbare Teile einer Pflanze, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Wurzeln, Rhizome, Knollen und Zwiebeln. Die Erfindung betrifft weiterhin Produkte, die, vorzugsweise direkt, von einem erntbaren Teil einer solchen Pflanze stammen, wie trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der Erfindung handelt es sich bei der modulierten Expression um erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuren oder Genen oder Genprodukten sind im Stand der Technik bekannt und Beispiele werden im Abschnitt Definitionen gegeben.
  • Wie vorstehend erwähnt, ist ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die ein STO-Polypeptid kodiert, durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein STO-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze; die Wirkungen der Durchführung des Verfahrens, d. h. das Erhöhen der Ertragsmerkmale, können jedoch auch unter Verwendung anderer bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken findet sich im Abschnitt Definitionen.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nukleinsäuren, die STO-Polypeptide, wie hier beschrieben, kodieren, und die Verwendung dieser STO-Polypeptide zur Verbesserung eines der oben genannten Ertragsmerkmale in Pflanzen.
  • Hier beschriebene Nukleinsäuren, die ein STO-Polypeptid kodieren, oder die STO-Polypeptide selbst können Verwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der mit einem Gen, das ein STO-Polpeptid kodiert, genetisch verknüpft sein kann. Die Nukleinsäuren/Gene oder die STO-Polypeptide selbst können dazu verwendet werden, einen molekularen Marker zu bestimmen. Dieser DNA- oder Protein-Marker kann dann in Züchtungsprogrammen zur Selektion von Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen verwendet werden, wie hier vorstehend bei den erfindungsgemäßen Verfahren definiert.
  • Allelische Varianten einer Nukleinsäure/eines Gens, die/das ein STO-Polypeptid kodiert, können auch Verwendung in Marker-unterstützten Züchtungsprogrammen finden. Bei solchen Züchtungsprogrammen ist manchmal das Einführen von allelischer Variation durch Mutagenbehandlung der Pflanzen erforderlich, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese verwendet wird; alternativ kann das Programm von einer Sammlung von allelischen Varianten so genannten ”natürlichen” Ursprungs ausgehen, die nicht mit Absicht hervorgerufen wurden. Dann erfolgt die Identifikation allelischer Varianten, zum Beispiel mittels PCR. Darauf folgt ein Schritt zur Selektion besserer allelischer Varianten der in Frage kommenden Sequenz, die einen erhöhten Ertrag liefern. Die Selektion wird gewöhnlich durchgeführt, indem man die Wachstumsleistung von Pflanzen verfolgt, die verschiedene allelische Varianten der in Frage kommenden Sequenz enthalten. Die Wachstumsleistung kann im Gewächshaus oder auf dem Feld verfolgt werden. Weitere Schritte sind gegebenenfalls u. a. das Kreuzen der Pflanzen, in denen die bessere allelische Variante identifiziert wurde, mit einer anderen Pflanze. Dies kann zum Beispiel zur Herstellung einer Kombination interessanter phänotypischer Merkmale verwendet werden.
  • Nukleinsäuren, die STO-Polypeptide kodieren, können auch als Sonden zur genetischen und physikalischen Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, und als Marker für Merkmale, die mit diesen Genen verknüpft sind, verwendet werden. Diese Information kann für die Pflanzenzüchtung nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwickeln. Eine solche Verwendung von Nukleinsäuren, die ein STO-Polypeptid kodieren, erfordert nur eine Nukleinsäuresequenz mit einer Länge von mindestens 15 Nukleotiden. Die Nukleinsäuren, die ein STO-Polypeptid kodieren, können als Marker für Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J, Fritsch EF und Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laborstory Manual) von restriktionsgespaltener genomischer Pflanzen-DNA können mit den STO kodierenden Nukleinsäuren sondiert werden. Die erhaltenen Bandenmuster können dann genetischen Analysen unter Verwendung von Computerprogrammen, wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181), unterworfen werden, wodurch eine Genkarte erstellt wird. Außerdem können die Nukleinsäuren zum Sondieren von Southern-Blots verwendet werden, die restriktionsendonukelasebehandelte genomische DNAs von einem Satz von Individuen enthalten, die den Elter und die Nachkommen einer bestimmten genetischen Kreuzung darstellen. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird ermittelt und dazu verwendet, die Position der Nukleinsäure, die ein STO-Polypeptid kodiert, in der zuvor unter Verwendung dieser Population erhaltenen Genkarte zu berechnen (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
  • Die Herstellung und Verwendung von Sonden, die von Pflanzengenen stammen, für die Verwendung bei der genetischen Kartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung spezifischer cDNA-Klone, wobei die vorstehend erläuterte Methodik oder Varianten davon verwendet werden. Für die Kartierung können zum Beispiel F2-Inzuchtpopulationen, Rückkreuzungspopulationen, zufallsgemäß gepaarte Populationen, nahezu isogene Linien und andere Sätze von Individuen verwendet werden. Diese Methodik ist dem Fachmann geläufig.
  • Die Nukleinsäuresequenzsonden können auch zur physikalischen Kartierung (d. h. zum Anordnen von Sequenzen in physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346 und darin genannte Bezugsstellen) verwendet werden.
  • In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresequenzsonden bei der Kartierung mittels direkter Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154) verwendet werden. Zwar bevorzugen derzeitige FISH-Kartierungsverfahren die Verwendung großer Klone (mehrere kb bis mehrere Hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20), aber durch Verbesserungen in der Empfindlichkeit kann die FISH-Kartierung auch unter Verwendung kürzerer Sonden durchgeführt werden.
  • Eine Reihe von Verfahren auf Basis von Nukleinsäuresequenzamplifikation für die genetische und physikalische Kartierung kann unter Verwendung der Nukleinsäuren durchgeführt werden. Beispiele sind u. a. die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), Polymorphismus PCR-amplifizierter Fragmente (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotidverlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Radiation-Hybrid-Kartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy-Kartierung (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Bei diesen Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäuresequenz dazu verwendet, Primer-Paare zu gestalten und herzustellen, die bei der Amplifikationsreaktion oder bei Primerverlängerungsreaktionen verwendet werden. Die Gestaltung dieser Primer ist dem Fachmann bekannt. Bei Verfahren, die eine genetische Kartierung auf PCR-Basis einsetzen, kann es notwendig sein, dass man DNA-Sequenz-Unterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in dem Bereich identifiziert, welcher der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch für Kartierungsverfahren nicht allgemein erforderlich.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren führen zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, wie hier vorstehend beschrieben. Diese Merkmale können auch mit anderen ökonomisch vorteilhaften Merkmalen, wie weiteren Ertragsmerkmalen, Toleranz gegenüber anderen abiotischen und biotischen Stressbedingungen, Merkmalen, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemische und/oder physiologische Merkmale modifizieren, kombiniert werden.
  • Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle A5” soll so verstanden werden, dass er den Inhalt von Tabelle A5a und Tabelle A5b angibt. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle A5a” soll so verstanden werden, dass er den Inhalt von Tabelle A5a angibt.
  • Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle A5b” soll so verstanden werden, dass er den Inhalt von Tabelle A5b angibt. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle A5” ”Tabelle A5b”.
  • In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung den folgendermaßen zusammengefassten Gegenstand:
    • Punkt 82: Ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein STO-Polypeptid kodiert, moduliert, wobei das STO-Polypeptid eine B-Box-Domäne umfasst.
    • Punkt 83: Verfahren nach Punkt 82, wobei die B-Box-Domäne eine Konsensussequenz gemäß SEQ ID NO: 221 umfasst.
    • Punkt 84: Verfahren nach den Punkten 82 oder 83, wobei die STO-Polypeptide eine B-Box-Domäne mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität mit der SEQ ID NO: 219 oder SEQ ID NO: 220 umfasst.
    • Punkt 85: Verfahren nach einem der Punkte 82 bis 84, wobei die modulierte Expression dadurch erreicht wird, dass man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die ein STO-Polypeptid kodiert, einführt und exprimiert.
    • Punkt 86: Verfahren nach einem der Punkte 82 bis 85, wobei die Nukleinsäure, die ein STO-Polypeptid kodiert, eines der in Tabelle A5 aufgelisteten Proteine kodiert oder ein Abschnitt einer solchen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure, die mit einer solchen Nukleinsäure hybridisieren kann, ist.
    • Punkt 87: Verfahren nach einem der Punkte 82 bis 86, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle A5 angegebenen Proteine kodiert.
    • Punkt 88: Verfahren nach einem der Punkte 82 bis 87, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale eine erhöhte Keimlingvitalität und/oder eine veränderte Blütezeit, vorzugsweise eine kürzere Blütezeit, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
    • Punkt 89: Verfahren nach einem der Punkte 82 bis 88, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
    • Punkt 90: Verfahren nach einem der Punkte 85 bis 89, wobei die Nukleinsäure mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt einem GOS2-Promotor aus Reis, funktionsfähig verbunden ist.
    • Punkt 91: Verfahren nach einem der Punkte 82 bis 90, wobei die Nukleinsäure, die ein STO-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, vorzugsweise aus einer monokotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Poaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Oryza, am stärksten bevorzugt aus Oryza sativa, stammt.
    • Punkt 92: Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die durch ein Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt erhältlich sind, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein STO-Polypeptid kodiert.
    • Punkt 93: Eine isolierte Nukleinsäuresequenz, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die aus folgender Gruppe ausgewählt ist:
    • (a) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das das in SEQ ID NO: 223 und/oder Tabelle A5b dargestellte Polypeptid kodiert;
    • (b) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, wie in SEQ ID NO: 222 und/oder Tabelle A5b dargestellt;
    • (c) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das infolge der Degeneration des genetischen Codes von einer in Tabelle A5 dargestellten Polypeptidsequenz abgeleitet werden kann und verbesserte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen verleiht A5;
    • (d) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität mit der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, das das in Tabelle A5 dargestellte Nukleinsäuremolekül umfasst, aufweist und verbesserte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen verleiht;
    • (e) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, das mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz des Polypeptids aufweist, das von dem Nukleinsäuremolekül unter (a) bis (c) kodiert wird, und verbesserte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen verleiht;
    • (f) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül unter (a) bis (c) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und verbesserte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen verleiht;
    • (g) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, das die Konsensussequenz oder ein oder mehrere Polypeptidmotive, wie in 15 dargestellt, aufweist und vorzugsweise die Aktivität, die durch ein Nukleinsäuremolekül, das ein Polynukleotid, wie in Tabelle A5 dargestellt, umfasst, dargestellt wird, aufweist;
    • (h) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, das die Aktivität, die durch ein Protein, wie in Tabelle A5 gezeigt, dargestellt wird, aufweist und verbesserte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen verleiht A5; und
    • (i) einem Nukleinsäuremolekül, das mittels Screening einer geeigneten Nukleinsäurebank unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, die eine komplementäre Sequenz zu einem Nukleinsäuremolekül unter (a) oder (b) umfasst, oder mit einem Fragment davon, das mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt eines Nukleinsäuremoleküls umfasst, das zu einer unter (a) bis (e) charakterisierten Nukleinsäuremolekülsequenz komplementär ist, erhältlich ist und ein Polypeptid kodiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein Protein dargestellt wird, das ein Polypeptid, wie in Tabelle A5 dargestellt, umfasst;
    wobei das Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (i) sich in mindestens einem oder mehreren Nukleotiden von der in Tabelle A5a dargestellten Sequenz unterscheidet und vorzugsweise ein Protein kodiert, das sich in mindestens einer oder mehreren Aminosäuren von den in Tabelle A5a dargestellten Proteinsequenzen unterscheidet.
    • Punkt 94: Konstrukt, umfassend:
    • (a) eine Nukleinsäure, die ein STO-Polypeptid gemäß den Punkten 82 bis 84 und 93 kodiert;
    • (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz unter (a) antreiben können; und gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
    • Punkt 95: Konstrukt nach Punkt 94, wobei eine der Kontrollsequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis, ist.
    • Punkt 96: Verwendung eines Konstrukts nach einem der Punkte 94 bis 95 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, insbesondere gesteigerter Keimlingvitalität und/oder veränderter Blütezeit, insbesondere kürzerer Blütezeit, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • Punkt 97: Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die mit einem Konstrukt nach einem der Punkte 94 bis 95 transformiert sind.
    • Punkt 98: Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, insbesondere gesteigerter Keimlingvitalität und/oder veränderter Blütezeit, insbesondere kürzerer Blütezeit, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend:
    • (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein STO-Polypeptid nach einem der Punkte 82 bis 84 und 93 kodiert, in eine(r) Pflanze; und
    • (ii) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze fördern.
    • Punkt 99: Transgene Pflanze mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, insbesondere gesteigerter Keimlingvitalität und/oder veränderter Blütezeit, insbesondere kürzerer Blütezeit, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die aus einer erhöhten Expression einer Nukleinsäure, die ein STO-Polypeptid nach einem der Punkte 82 bis 84 und 93 kodiert, resultieren, oder eine transgene Pflanzenzelle, die von der transgenen Pflanze stammt.
    • Punkt 100: Transgene Pflanze nach Punkt 92, 97 oder 99 oder eine daraus stammende transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer, ist.
    • Punkt 101: Erntbare Teile einer Pflanze nach Punkt 100, wobei die erntbaren Teile vorzugsweise die Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
    • Punkt 102: Produkte, die von einer Pflanze nach Punkt 100 und/oder von erntbaren Teilen einer Pflanze nach Punkt 101 stammen.
    • Punkt 103: Verwendung einer Nukleinsäure, die ein STO-Polypeptid kodiert, zur Steigerung der Keimlingvitalität und/oder zur Veränderung der Blütezeit, insbesondere zur Verkürzung der Blütezeit, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird auch ein isoliertes Polypeptid bereitgestellt, das eine Polypeptidsequenz umfasst, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:
    • (i) einer Aminosäuresequenz, die von einer der durch Punkt 93 dargestellten Nukleinsäuren kodiert wird;
    • (ii) einer Aminosäuresequenz, die in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz unter (i) aufweist;
    • (iii) Derivaten von einer der vorstehend unter (i) oder (ii) genannten Aminosäuresequenzen.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wurde jetzt herausgefunden, dass eine Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein UGE-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze zu Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, vorzugsweise gesteigerten Samenertragsmerkmalen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen führt. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man die Expression einer Nukleinsäure, die ein UGE-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze moduliert.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die ein UGE-Polypeptid kodiert, besteht darin, dass man eine Nukleinsäure, die ein UGE-Polypeptid kodiert, in eine Pflanze einbringt und in dieser exprimiert.
  • Jede Bezugnahme im folgenden Text auf ein ”Protein, das für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” soll so aufgefasst werden, dass damit ein UGE-Polypeptid gemeint ist. Jede Bezugnahme im folgenden Text auf eine ”Nukleinsäure, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” soll so aufgefasst werden, dass dies eine Nukleinsäure bedeutet, die ein solches UGE-Polypeptid kodieren kann. Die Nukleinsäure, die in eine Pflanze eingeführt werden soll (und die daher zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist), ist jede beliebige Nukleinsäure, welche den Typ Protein kodiert, der im Folgenden beschrieben wird, und wird im Folgenden auch als ”UGE-Nukleinsäuresequenz” oder ”UGE-Gen” bezeichnet. UGE-Polypeptide und UGE-Nukleinsäurensind zuvor beschrieben worden (Maxwell und Robichon-Szulmajster (1960); J. Biol. Chem. 235 (1960) 308–312; Wilson, D. B. und Hogness, D. S. (1964). J. Biol. Chem. 239 2469–2481; Übersichtsartikel von Frey FASEB J. 1996 Mar; 10 (4): 461–70; Thoden et al. (1997). Biochemistry 36: 6294–6304; Dormann und Benning 1998; Shaw et al. 2003. Mol. Biochem. Parasitol. 126, 173–180; Barber et al. 2006).
  • Ein ”UGE-Polypeptid” umfasst eine Epimerase-Domäne und hat üblicherweise eine UDP-Glucose-4-Epimerase-Aktivität. Epimerase-Domäne bezieht sich auf eine Sequenz variabler Länge, durchschnittlich etwa 200 Aminosäuren lang, die bei den Epimerasen konserviert ist (InterPro-Bezugsnr. IPR005886; Pfam-Bezugsnr.: PF01370).
  • UGE-Polypeptide lassen sich durch Suchen in speziellen Datenbanken finden, wie Pfam (Finn et al. Nucleic Acids Research (2006) Database Issue 34: D247–D251). Pfam listet eine große Sammlung an mehrfachen Sequenz-Alignments und Hidden-Markov-Modellen (HMM) auf, die viele häufige Proteindomänen und -familien abdeckt, und ist über das Sanger Institute im vereinigten Königreich verfügbar. Als zuverlässige Übereinstimmungen gelten in der Pfam-Datenbank solche Sequenzen, deren Score über der Erfassungsausschlussgrenze liegt. Die Erfassungsausschlussgrenze für die Epimerase-Domäne beträgt beim Pfam HMM_fs-Verfahren –46,3 und beim Pfam HMM_Is-Verfahren 16,7. Mögliche Übereinstimmungen, die echte Epimerase-Domänen umfassen, können jedoch unter den Erfassungsausschluss fallen. Vorzugsweise ist ein UGE-Polypeptid, das für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ein Protein mit einer oder mehreren Domänen in seiner Sequenz, welche den Erfassungsausschluss der Pfam-Proteindomänenfamilie PF01370, die als Epimerase-Domäne oder Domäne der Familie der NAD-abhängigen Epimerasen/Dehydratasen bekannt ist, überschreiten.
  • Alternativ kann eine Epimerase-Domäne in einem Polypeptid identifiziert werden, indem man einen Sequenzvergleich mit bekannten Polypeptiden, die eine Epimerase-Domäne umfassen, durchführt und die Ähnlichkeit im Bereich der Epimerase-Domäne feststellt. Für das Alignment der Sequenzen kann man jedes im Stand der Technik bekannte Verfahrens, wie Blast-Algorithmen, verwenden. Die Wahrscheinlichkeit, dass ein Alignment mit einer gegebenen Sequenz auftritt, wird als Basis für die Identifikation ähnlicher Polypeptide verwendet. Ein Parameter, der üblicherweise dazu verwendet wird, diese Wahrscheinlichkeit darzustellen, wird als e-Wert bezeichnet. Der E-Wert ist ein Maß für die Zuverlässigkeit des S-Score. Der S-Score ist ein Maß für die Ähnlichkeit der Abfragesequenz mit der gezeigten Sequenz. Der e-Wert beschreibt, wie oft das zufallsgemäße Auftreten eines bestimmten S-Score erwartet wird. Die e-Wert-Ausschlussgrenze kann bis zu 1,0 betragen. Die übliche Grenze für einen zuverlässigen e-Wert bei der Ausgabe einer BLAST-Suche, bei der ein Epimerase-Polypeptid als Abfragesequenz verwendet wird, kann kleiner als e5 (= 10-5), 1.e-10, 1.e-15, 1.e-20, 1.e-25, 1.e-50, 1.e-75, 1.e-100, 1.e-200, 1.e-300, 1.e-400, 1.e-500, 1.e-600, 1.e-700 und 1.e-800 sein. UGE-Polypeptide, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, umfassen vorzugsweise eine Sequenz mit einem e-Wert von, in steigender Reihenfolge der Präferenz, unter e-5 (= 10-5), 1.e-10, 1.e-15, 1.e-20, 1.e-25, 1.e-50, 1.e-75, 1.e-100, 1.e-200, 1.e-300, 1.e-400, 1.e-500, 1.e-600, 1.e-700 und 1.e-800 bei einem Alignment mit einer Epimerase-Domäne, die man in einem bekannten UGE-Polypeptid, wie zum Beispiel SEQ ID NO: 225, findet.
  • Ein bevorzugtes UGE-Polypeptid, das für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, betrifft ein Polypeptid, das eine Epimerase-Domäne umfasst, wobei diese Domäne, in steigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% oder mehr Sequenzidentität mit der SEQ ID NO: 275 (der Sequenz, welche die in SEQ ID NO: 225 umfasste Epimerase-Domäne darstellt) aufweist.
  • Beispiele für UGE-Polypeptide, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, sind in Tabelle A6 angegeben. Die Aminosäurekoordinaten der Epimerase-Domäne in dem beispielhaften UGE-Protein, wie es durch SEQ ID NO: 225 dargestellt wird, sind in Tabelle C angegeben. Die Sequenz der Epimerase-Domäne, die von SEQ ID NO: 225 umfasst wird, ist in SEQ ID NO: 275 angegeben.
  • Bevorzugte erfindungsgemäße UGE-Polypeptide, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, sind solche, die, in steigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%; 98% oder mehr Sequenzidentität mit einem der in Tabelle A6 angegebenen Polypeptiden aufweisen.
  • UGE-Polypeptide umfassen in der Regel konservierte Motive, die für ihre enzymatische Aktivität relevant sind, wie i) Motiv 8, das an der Bindung des UGE-Proteins an den Cofaktor NAD+ beteiligt ist und durch GXXGXXG (SEQ ID NO: 276) wiedergegeben wird und ii) Motiv 9, das sich im aktiven Zentrum befindet und durch YGRT/S (SEQ ID NO: 277) dargestellt wird, wobei das G durch eine beliebige andere unpolare Aminosäure und das R durch eine andere polare Aminosäure ersetzt werden kann.
  • Zusätzlich zu der Epimerase-Domäne können UGE-Polypeptide eines oder mehrere der folgenden konservierten Motive umfassen: (i) Motiv 10 gemäß SEQ ID NO: 278, welches das NAD+-Bindungsmotiv umfasst, (ii) Motiv 11 gemäß SEQ ID NO: 279 und iii) Motiv 12 gemäß SEQ ID: 280. 19 zeigt die konservierten Motive Motiv 8 bis Motiv 12 und ihre relative Position in der UGE-Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 225.
  • Daher umfassen bevorzugte UGE-Polypeptide, die für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind, zusätzlich zu der Epimerase-Domäne eines oder mehrere der folgenden konservierten Motive:
    • (i) Motiv 8 gemäß SEQ ID NO: 276;
    • (ii) Motiv 9 gemäß SEQ ID NO: 277, wobei das G durch eine beliebige andere unpolare Aminosäure und das R durch eine andere polare Aminosäure ersetzt werden kann;
    • (iii) Motiv 10 gemäß SEQ ID NO: 278, wobei 1, 2, 3 oder 4 Fehlpaarungen erlaubt sind;
    • (iv) Motiv 11 gemäß SEQ ID NO: 279,
    • (v) Motiv 12 gemäß SEQ ID NO: 280, wobei 1, 2, 3 oder 4 Fehlpaarungen erlaubt sind.
  • Die Polarität der 20 essenziellen Aminosäuren ist in Table 3 angegeben. Am häufigsten sind die in Polypeptiden enthaltenen Aminosäuren alpha-Aminosäuren mit einer Amino- und einer Carboxylgruppe, die an das gleiche Kohlenstoffatom gebunden sind, wobei die Aminosäuremoleküle oft eine Seitenkette umfassen, die an das alpha-Kohlenstoffatom gebunden ist. Tabelle 3 zeigt die Einteilung von Aminosäuren auf der Basis der physikalischen und biochemischen Eigenschaften der Seitenkette. Table 3: Einteilung von Aminosäuren anhand der Seitenketteneigenschaften.
    Aminosäure 3-Buchstaben 1-Buchstaben Seitenkettenpolarität Seitenkettenazidität oder basizität Hydropathie-Index
    Arginin Arg R polar basisch –4,5
    Asparagin Asn N polar neutral –3,5
    Asparaginsäure Asp D polar sauer –3,5
    Cystein Cys C polar neutral 2,5
    Glutaminsäure Glu E polar sauer –3,5
    Glutamin Gln Q polar neutral –3,5
    Histidin His H polar basisch –3,2
    Lysin Lys K polar basisch –3,9
    Serin Ser S polar neutral –0,8
    Threonin Thr T polar neutral –0,7
    Tyrosin Tyr Y polar neutral –1,3
    Alanin Ala A unpolar neutral 1,8
    Glycin Gly G unpolar neutral –0,4
    Isoleucin Ile I unpolar neutral 4,5
    Leucin Leu L unpolar neutral 3,8
    Methionin Met M unpolar neutral 1,9
    Phenylalanin Phe F unpolar neutral 2,8
    Prolin Pro P unpolar neutral –1,6
    Tryptophan Trp W unpolar neutral –0,9
    Valin Val V unpolar neutral 4,2
  • Beispiele für UGE-Polypeptide, die eines oder mehrere der konservierten Motive Motiv 8 bis Motiv 12 umfassen, werden in Beispiel 1 genannt. 20 zeigt die Position der konservierten Motive in diesen UGE-Polypeptiden.
  • UGE-Polypeptid können außerdem ein Signalpolypeptid umfassen, das eine Funktion bei der subzellulären Lokalisierung des Proteins in einer Zelle ausübt. Zum Beispiel umfasst die SEQ ID NO: 225 ein putatives Signalpeptid für den sekretorischen Weg, das sich zwischen den Aminosäuren 13 und 37 befindet und eine putative Spaltstelle zwischen den Aminosäuren 36 and 37 besitzt.
  • UGE-Polypeptide können in der Zelle, beispielsweise durch Abspaltung von Signalpeptiden, weiter modifiziert werden, so dass ein so genanntes reifes UGE-Polypeptid erzeugt wird. Ein bevorzugtes Derivat eines UGE-Polypeptids, das für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist dasjenige, das aus der Entfernung des Signalpeptids resultiert und dem reifen UGE-Polypeptid entspricht.
  • Vorzugsweise bildet die Polypeptidsequenz, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 21 dargestellten, verwendet wird, Cluster mit der Gruppe, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 225 (Os_UGE2) umfasst, oder bildet alternativ, wenn sie in einem Stammbaum, wie demjenigen der 1 in Rosti et al. 2007 (The Plant Cell 19: 1565–1579), verwendet wird, Cluster mit der Gruppe, die AtUGE2 umfasst.
  • Der Begriff ”Domäne” und ”Motiv” wird hier im Abschnitt ”Definitionen” definiert. Für die Identifikation von Domänen gibt es Spezialdatenbanken, zum Beispiel SMART (Schultz et al., (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al., (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244, InterPro (Mulder et al., (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315–318, Prosite (Sucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences motifs und its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAI Press, Menlo Park; Hubo et al., Nucl. Acids Res. 32: D134–D137, (2004)) oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30 (1): 276–280 (2002). Ein Satz von Werkzeugen für die In-silico-Analyse von Proteinsequenzen ist auf dem ExPASY-Proteomics-Server verfügbar (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003)). Domänen oder Motive können auch unter Verwendung von Routinetechniken, wie Sequenz-Alignment, identifiziert werden.
  • Verfahren für das Alignment von Sequenzen für Vergleichszwecke sind im Stand der Technik bekannt, dazu zählen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA. Bei GAP wird der Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453) dazu verwendet, das globale Alignment (d. h. das Alignment, das sich über die vollständigen Sequenzen erstreckt) von zwei Sequenzen zu finden, das die Anzahl der Übereinstimmungen (”matches”) maximiert und die Anzahl der Lücken (”gaps”) minimiert. Beim BLAST-Algorithmus (Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10) wird die Sequenzidentität in Prozent berechnet, und es wird eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen durchgeführt. Die Software für die Durchführung einer BLAST-Analyse ist über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) öffentlich zugänglich. Homologe können zum Beispiel unter Verwendung des multiplen Sequenz-Alignment-Algorithmus ClustalW (Version 1.83) leicht identifiziert werden, und zwar mit den Default-Parametern für paarweises Alignment und einer Scoring-Methode in Prozent. Die Gesamtprozent an Ähnlichkeit und Identität können auch unter Verwendung eines der im MatGAT-Software-Paket verfügbaren Verfahren bestimmt werden (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003, Juli 10; 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences.). Für eine Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven können kleinere Änderungen per Hand vorgenommen werden, wie dem Fachmann klar ist. Weiterhin können anstelle von Volllängensequenzen auch spezifische Domänen für die Identifikation von Homologen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können mit den oben erwähnten Programmen unter Verwendung der Default-Parameter über die gesamte Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz oder über ausgewählte Domänen oder (ein) konservierte(s) Motiv(e) bestimmt werden.
  • Die UGE-Polypeptide haben außerdem (zumindest in ihrer nativen Form) in der Regel UDP-Glucose 4-Epimerase- oder UDP-Galactose 4-Epimerase-Aktivität. Weiterhin können UGE-Polypeptide, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, auch enzymatisch inaktiv sein. Werkzeuge und Techniken zum Messen der UDP-Glucose 4-Epimerase- oder UDP-Galactose 4-Epimerase-Aktivität sind im Stand der Technik bekannt. Weitere Einzelheiten zu den Reaktionseigenschaften oder der Aktivität sowie Beispiele für UGE-Polypeptide sind im Stand der Technik bekannt und sind in speziellen Datenbanken, wie BRENDA (The Comprehensive Enzyme Information System), die an der Universität Köln (Deutschland) entwickelt wurde und gehalten wird, zu finden. Zu den In-vivo-Assays zählen die Komplementation einer defizienten UDP-Glucose 4-Epimerase-Aktivität in Mikroorganismen, die Mutationen in Genen tragen, die UGE-Polypeptide kodieren, z. B. der Saccharomyces cerevisiae-Stamm mit einer Defizienz in dem Gen, das das GAL10-Protein kodiert (Dormann und Benning. 1996. Arch Biochem Biophys. 327 (1): 27–34). Verfahren für die Reinigung von UGE-Polypeptiden und die Messung der Epimerase-Aktivität in vitro sind ebenfalls beschrieben worden (Barber 2006).
  • Die vorliegende Erfindung wird dadurch veranschaulicht, dass man Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 224, welche die Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 225 kodiert, transformiert. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhaft unter Verwendung jeder beliebigen Nukleinsäure, die ein UGE-Polypeptid kodiert, oder des UGE-Polypeptids, wie hier definiert, durchgeführt werden.
  • Beispiele für Nukleinsäuren, die UGE-Polypeptide kodieren, sind hier in Tabelle A6 von Beispiel 1 genannt. Solche Nukleinsäuren eignen sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Die in Tabelle A6 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen für Orthologe und Paraloge des UGE-Polypeptids gemäß SEQ ID NO: 225, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht mittels Durchführen einer so genannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. Dies beinhaltet üblicherweise ein erstes BLASTing, bei dem mit einer Abfragesequenz (zum Beispiel unter Verwendung einer der in Tabelle A6 von Beispiel 1 aufgelisteten Sequenzen) ein BLASTing gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird. BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) werden im Allgemeinen verwendet, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein zweites BLASTing gegen Sequenzen des Organismus, aus dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (ist die Abfragesequenz die SEQ ID NO: 224 oder SEQ ID NO: 225, dann wäre das zweite BLASTing daher gegen Sequenzen aus Reis). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit von dem ersten BLASTing aus derselben Art stammt wie die Abfragesequenz, in diesem Fall führt ein zweites BLASTing idealerweise zu der Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit in dem ersten BLASTing nicht von derselben Art stammt wie die Abfragesequenz, und führt vorzugsweise beim zweiten BLASTing dazu, dass die Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits ist.
  • Hochrangige Hits sind solche mit niedrigem E-Wert. Je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der ”Score” (anders ausgedrückt, desto niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Hit durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist im Stand der Technik bekannt. Das ”Scoring” der Vergleiche erfolgt nicht nur mittels E-Werten, sondern auch anhand der Prozent Identität. Prozent Identität bezieht sich auf die Anzahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. Bei großen Familien kann man ClustalW und anschließend einen Neighbour-Joining-Stammbaum dazu verwenden, Cluster verwandter Gene leichter sichtbar zu machen und Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
  • Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren können auch Nukleinsäurevarianten geeignet sein. Beispiele für solche Varianten sind u. a. Nukleinsäuren, die Homologe und Derivate von einer der in Tabelle A6 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen kodieren, wobei die Begriffe ”Homolog” und ”Derivat” wie hier definiert sind. Für die erfindungsgemäßen Verfahren sind auch Nukleinsäuren geeignet, die Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen von einer der in Tabelle A6 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen kodieren. Homologe und Derivate, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische und funktionelle Aktivität auf wie das unmodifizierte Protein, von dem sie stammen.
  • Zu weiteren Nukleinsäurevarianten, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, zählen Abschnitte von Nukleinsäuren, die UGE-Polypeptide kodieren, Nukleinsäuren, die mit Nukleinsäuren, die UGE-Polypeptide kodieren, hybridisieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuren, die UGE-Polypeptide kodieren, allelische Varianten von Nukleinsäuren, die UGE-Polypeptide kodieren, und Varianten von Nukleinsäuren, die UGE-Polypeptide kodieren, die mittels ”gene shuffling” erhalten wurden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Spleißvariante, allelische Variante und ”gene shuffling” sind wie hier beschrieben.
  • Nukleinsäuren, die UGE-Polypeptide kodieren, müssen keine Volllängen-Nukleinsäuren sein, da die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf die Verwendung von Volllängen-Nukleinsäuresequenzen angewiesen ist. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze einen Abschnitt von einer der in Tabelle A6 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A6 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz kann zum Beispiel dadurch hergestellt werden, dass man eine oder mehrere Deletionen an der Nukleinsäure durchführt. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder können an andere kodierende (oder nichtkodierende) Sequenzen fusioniert werden, um zum Beispiel ein Protein herzustellen, das mehrere Aktivitäten in sich vereinigt. Wenn es an andere kodierende Sequenzen fusioniert ist, kann das so erhaltene, nach der Translation hergestellte Polypeptid größer sein als für den Proteinabschnitt vorhergesagt wurde.
  • Abschnitte, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren ein UGE-Polypeptid, wie hier definiert, und haben im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in Tabelle A6 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren oder um einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle A6 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen kodiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt mindestens 250, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 aufeinander folgende Nukleotide lang, wobei es sich bei den aufeinander folgenden Nukleotiden um eine der in Tabelle A6 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder um eine Nukleinsäure handelt, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle A6 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen kodiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 224. Vorzugsweise kodiert der Abschnitt eine Aminosäuresequenz, die, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 21 dargestellten, verwendet wird, Cluster mit der Gruppe, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 225 (Os_UGE2) umfasst, bildet oder alternativ, wenn sie in einem Stammbaum, wie demjenigen der 1 in Rosti et al. 2007 (The Plant Cell 19: 1565–1579), verwendet wird, Cluster mit der Gruppe, die AtUGE2 umfasst, bildet.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Nukleinsäure, die unter Bedingungen einer verringerten Stringenz, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, mit einer Nukleinsäure, die ein UGE-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, oder mit einem Abschnitt, wie hier definiert, hybridisieren kann.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die mit einer der in Tabelle A6 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren hybridisieren kann, einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure hybridisieren kann, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A6 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Hybridisierende Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren ein UGE-Polypeptid, wie hier definiert, das im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in Tabelle A6 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen aufweist. Vorzugsweise kann die hybridisierende Sequenz mit der in Tabelle A6 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren oder mit einem Abschnitt von einer dieser Sequenzen hybridisieren, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder die hybridisierende Sequenz kann mit einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle A6 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen kodiert, hybridisieren. Am stärksten bevorzugt kann die hybridisierende Sequenz an die Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 224 oder einen Teil davon hybridisieren.
  • Vorzugsweise kodiert die hybridisierende Sequenz ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 21 dargestellten, verwendet wird, Cluster mit der Gruppe, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 225 (Os_UGE2) umfasst, bildet oder alternativ, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie demjenigen der 1 in Rosti et al. 2007 (The Plant Cell 19: 1565–1579), verwendet wird, Cluster mit der Gruppe, die AtUGE2 umfasst, bildet.
  • Eine andere Nukleinsäuresequenzvariante, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Spleißvariante, die ein UGE-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, wobei eine Spleißvariante wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Spleißvariante von einer der in Tabelle A6 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A6 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Bevorzugte Spleißvarianten sind Spleißvarianten einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 224 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog der SEQ ID NO: 225 kodiert. Vorzugsweise bildet die von der Spleißvariante kodierte Aminosäuresequenz, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 21 dargestellten, verwendet wird, Cluster mit der Gruppe, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 225 (Os_UGE2) umfasst, oder bildet alternativ, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie demjenigen der 1 in Rosti et al. 2007 (The Plant Cell 19: 1565–1579), verwendet wird, Cluster mit der Gruppe, die AtUGE2 umfasst.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein UGE-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, wobei eine allelische Variante wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine allelische Variante von einer der in Tabelle A6 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A6 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Die allelischen Varianten, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, haben im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie das UGE-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 225 und eine beliebige der in Tabelle A6 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuren. Allelische Varianten kommen in der Natur vor und von den erfindungsgemäßen Verfahren wird die Verwendung dieser natürlichen Allele mit umfasst. Vorzugsweise handelt es sich bei der allelischen Variante um eine allelische Variante gemäß SEQ ID NO: 224 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog der SEQ ID NO: 225 kodiert. Vorzugsweise bildet die von der allelischen Variante kodierte Aminosäuresequenz, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 21 dargestellten, verwendet wird, Cluster mit der Gruppe, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 225 (Os_UGE2) umfasst, oder bildet alternativ, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie demjenigen der 1 in Rosti et al. 2007 (The Plant Cell 19: 1565–1579), verwendet wird, Cluster mit der Gruppe, die AtUGE2 umfasst.
  • ”Gene shuffling” oder gerichtete Evolution kann ebenfalls dazu verwendet werden, Varianten von Nukleinsäuren herzustellen, die UGE-Polypeptide, wie oben definiert, kodieren, wobei der Begriff ”gene shuffling” wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante von einer der in Tabelle A6 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A6 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert, wobei die Nukleinsäurevariante mittels ”gene shuffling” erhalten wird.
  • Vorzugsweise bildet die Aminosäuresequenz, die von der durch gene shuffling erhaltenen Nukleinsäurevariante kodiert wird, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 21 dargestellten, verwendet wird, Cluster mit der Gruppe, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 225 (Os_UGE2) umfasst, oder bildet alternativ, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie demjenigen der 1 in Rosti et al. 2007 (The Plant Cell 19: 1565–1579), verwendet wird, Cluster mit der Gruppe, die AtUGE2 umfasst.
  • Nukleinsäurevarianten können weiterhin auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Zur Erzielung einer ortsgerichteten Mutagenese stehen mehrere Verfahren zur Verfügung, von denen die üblichsten Verfahren auf PCR-Basis sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Hrsg.).
  • Nukleinsäuren, die UGE-Polypeptide kodieren, können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle stammen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form in ihrer Zusammensetzung und/oder genomischen Umgebung durch gezielte Manipulation durch den Menschen modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die Nukleinsäure, die ein UGE-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, weiterhin bevorzugt aus einer monokotylen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Poaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Oryza sativa.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen. Insbesondere führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” sind hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Werden hier verbesserte Ertragsmerkmale erwähnt, so soll dies eine Erhöhung der Biomasse (des Gewichts) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, was oberirdische (erntbare) Teile und/oder (erntbare) unterirdische Teile beinhalten kann. Insbesondere sind solche erntbaren Teile Samen, und die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu dem Samenertrag von Kontrollpflanzen.
  • Wählt man Mais als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung als eines oder mehrere der folgenden Merkmale äußern: Unter anderem erhöhte Anzahl an Pflanzen, die pro Hektar oder Acre wachsen, eine Erhöhung der Anzahl an Ähren pro Pflanze, eine Erhöhung der Anzahl an Reihen, der Anzahl an Körnern pro Reihe, des Korngewichts, Tausendkorngewichts, der Ährenlänge/des Ährendurchmessers, eine Erhöhung der Samenfüllungsrate (d. h. der Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl der Samen und multipliziert mit 100). Wählt man Reis als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung als eine Erhöhung eines oder mehrere der folgenden Merkmale ausdrücken: Unter anderem Anzahl der Pflanzen pro Hektar oder Acre, Anzahl der Rispen pro Pflanze, Anzahl der Ährchen pro Rispe, Anzahl der Blüten (Einzelblüten) pro Rispe (ausgedrückt als Verhältnis der Anzahl an gefüllten Samen zu der Anzahl an Primärrispen), erhöhte Samenfüllungsrate (d. h. erhöhte Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100), erhöhtes Tausendkorngewicht.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, insbesondere des Samenertrags von Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein UGE-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht.
  • Weil die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen einen erhöhten Ertrag aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen (zumindest während eines Teils ihres Lebenszyklus) eine erhöhte Wachstumsrate aufweisen als Kontrollpflanzen in einem entsprechenden Stadium ihres Lebenszyklus.
  • Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (darunter Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen in der ganzen Pflanze stattfinden. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Unter dem Lebenszyklus einer Pflanze kann man diejenige Zeit verstehen, die die Pflanze benötigt, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, in dem die Pflanze trockene reife Samen ähnlich dem Ausgangsmaterial produziert hat. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren, wie Jungpflanzenvitalität, Wachstumsrate, ”Greenness Index”, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung, beeinflusst werden. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann in einem Stadium oder in mehreren Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Lebenszyklus der Pflanze erfolgen. Eine erhöhte Wachstumsrate während der Frühstadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann verbesserte Vitalität widerspiegeln. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, so dass die Pflanzen später gesät werden können und/oder früher geerntet werden können als dies sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt lässt sich mit einer früheren Blütezeit erzielen). Ist die Wachstumsrate ausreichend erhöht, kann dies weiteres Aussäen von Samen derselben Pflanzenart ermöglichen (zum Beispiel Aussäen und Ernten von Reispflanzen und anschließendes Aussäen und Ernten von weiteren Reispflanzen sogar innerhalb einer herkömmlichen Wachstumsperiode). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, kann dies ebenso das weitere Aussäen von Samen anderer Pflanzenarten ermöglichen (zum Beispiel das Aussäen und Ernten von Maispflanzen und anschließend zum Beispiel Aussäen und gegebenenfalls Ernten von Sojabohne, Kartoffel oder einer anderen geeigneten Pflanze). Auch mehrmalige weitere Ernten von demselben Wurzelstock können bei einigen Kulturpflanzen möglich sein. Eine Veränderung des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Acre führen (weil man eine bestimmte Pflanze öfter (z. B. pro Jahr) heranziehen und ernten kann). Eine erhöhte Wachstumsrate kann auch dazu führen, dass man transgene Pflanzen in einem breiteren geographischen Bereich als ihre Wildtyp-Gegenstücke anbauen kann, da die räumlichen Beschränkungen für den Anbau einer Kultur häufig von ungünstigen Umweltbedingungen entweder während der Pflanzzeit (früh in der Saison) oder während der Erntezeit (spät in der Saison) bestimmt werden. Solche ungünstigen Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt ist. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten verschiedener Parameter aus Wachstumskurven bestimmt werden, wobei die Parameter u. a. folgende sein können: T-Mid (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 50% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und T-90 (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 90% ihrer Maximalgröße zu erreichen).
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit einer im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Wachstumsrate. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein UGE-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht.
  • Eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate tritt unabhängig davon auf, ob die Pflanze unter Nichtstressbedingungen steht oder ob die Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen verschiedenen Stressbedingungen unterworfen wird. Üblicherweise reagieren Pflanzen auf Stress dadurch, dass sie langsamer wachsen. Unter starken Stressbedingungen kann die Pflanze sogar ihr Wachstum völlig einstellen. Leichter Stress ist dagegen hier als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist und der nicht dazu führt, dass die Pflanze völlig aufhört zu wachsen, ohne dass sie die Fähigkeit besitzt, ihr Wachstum wieder aufzunehmen. Leichter Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, stärker bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger im Vergleich zu der Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Aufgrund von Fortschritten bei den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerung, Düngung, Pestizidbehandlungen) findet man bei angebauten Kulturpflanzen nicht oft starke Stressbedingungen. Infolgedessen ist das durch leichten Stress induzierte geschwächte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal in der Landwirtschaft. Leichte Stressbedingungen sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (Umwelt-)Stressbedingungen, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotischer Stress kann durch Trockenheit oder Wasserüberschuss, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Gefriertemperaturen verursacht werden. Bei dem abiotischen Stress kann es sich um einen osmotischen Stress handeln, der durch Wasserstress (insbesondere aufgrund von Trockenheit), Salzstress, oxidativen Stress oder ionenbedingten Stress verursacht wird. Unter biotischem Stress versteht man gewöhnlich Stressbedingungen, die durch Pathogene, wie Bakterien, Viren, Pilze und Insekten, verursacht werden.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren können insbesondere unter Nichtstressbedingungen oder unter Bedingungen einer leichten Trockenheit durchgeführt werden, wobei Pflanzen erhalten werden, die einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Wie von Wang et al. (Planta (2003), 218: 1–14) beschrieben, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenproduktivität negativ beeinflussen. Es ist bekannt, dass Trockenheit, Salinität, extreme Temperaturen und oxidativer Stress miteinander in Verbindung stehen und über ähnliche Mechanismen Wachstums- und Zellschäden induzieren können. Rabbani et al., (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767) beschreiben ein besonders hohes Ausmaß an gegenseitiger Beeinflussung (”Cross-Talk”) von Trockenheitsstress und durch hohe Salinität verursachtem Stress. Zum Beispiel äußern sich Trockenheit und/oder Versalzung in erster Linie als osmotischer Stress, was zur Störung der Homöostase und der Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, der häufig hohe oder niedrige Temperaturen, Salinität oder Trockenheitsstress begleitet, kann zur Denaturierung von funktionellen und strukturellen Proteinen führen. Infolgedessen aktivieren diese verschiedenen Umweltstressbedingungen häufig ähnliche Zellsignalwege und Zellreaktionen, wie die Produktion von Stressproteinen, die Hinaufregulation von Antioxidantien, die Akkumulation von kompatiblen gelösten Stoffen und ein Einstellen des Wachstums. Der Begriff ”Nichtstress”-Bedingungen, wie hier verwendet, bezieht sich auf solche Umweltbedingungen, die ein optimales Pflanzenwachstum gestatten. Der Fachmann kennt die normalen Bodenbedingungen und Klimabedingungen für einen gegebenen Standort.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verleiht Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter Bedingungen einer leichten Trockenheit herangezogen werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags bei Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter Bedingungen einer leichten Trockenheit herangezogen werden, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren die Expression einer Nukleinsäure, die ein UGE-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze erhöht.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verleiht Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, herangezogen werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags bei Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen herangezogen werden, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren die Expression einer Nukleinsäure, die ein UGE-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze erhöht. Ein Nährstoffmangel kann durch ein Fehlen von Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor hervorgerufen werden.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (einschließlich Samen), die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. Die Pflanzen oder die Teile davon umfassen ein Nukleinsäuretransgen, das ein UGE-Polypeptid, wie oben definiert, kodiert.
  • Die Erfindung stellt auch Genkonstrukte und Vektoren bereit, um die Einführung und/oder Expression von Nukleinsäuren, die UGE-Polypeptide kodieren, in Pflanzen zu erleichtern. Die Genkonstrukte können in Vektoren eingefügt werden, die im Handel erhältlich sein können und für die Transformation in Pflanzen und für die Expression des interessierenden Gens in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines Genkonstrukts, wie hier definiert, bei den erfindungsgemäßen Verfahren bereit.
  • Genauer gesagt, stellt die vorliegende Erfindung ein Konstrukt bereit, das Folgendes umfasst:
    • (a) eine Nukleinsäure, die ein UGE-Polypeptid, wie oben definiert, kodiert;
    • (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz unter (a) vorantreiben können, und gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  • Vorzugsweise ist die Nukleinsäure, die ein UGE-Polypeptid kodiert, wie vorstehend definiert. Die Begriffe ”Kontrollsequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hier definiert.
  • Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der eine der oben beschriebenen Nukleinsäuren umfasst. Der Fachmann kennt die genetischen Elemente, die in einem Vektor vorhanden sein müssen, damit Wirtszellen, die die interessierende Sequenz enthalten, erfolgreich transformiert, selektiert und vermehrt werden können. Die interessierende Sequenz ist mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen (mindestens mit einem Promoter) funktionsfähig verbunden.
  • Jede Art von Promoter, ob natürlich oder synthetisch, kann vorteilhaft für das Vorantreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz verwendet werden. Ein konstitutiver Promoter ist für die erfindungsgemäßen Verfahren besonders geeignet. Die Definitionen der verschiedenen Promotertypen siehe hier im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Es sollte selbstverständlich sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung weder auf die durch SEQ ID NO: 1 dargestellte, ein UGE-Polypeptid kodierende Nukleinsäure noch auf die Expression einer Nukleinsäure, die ein UGE-Polypeptid kodiert, wenn sie von einem konstitutiven Promotor angetrieben wird oder wenn sie von einem wurzelspezifischen Promotor angetrieben wird, beschränkt ist.
  • Der konstitutive Promotor ist vorzugsweise ein GOS2-Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor aus Reis. Weiterhin bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen der SEQ ID NO: 270 gleicht, am stärksten bevorzugt wird der Protomotor durch die SEQ ID NO: 270 wiedergegeben. Weitere Beispiele für konstitutive Promotoren siehe hier in Tabelle 2 im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Gegebenenfalls kann/können eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem Konstrukt, das in eine Pflanze eingeführt wird, verwendet werden. Weitere Regulationselemente können u. a. Transkriptionsenhancer und Translationsenhancer sein. Der Fachmann ist mit Terminator- und Enhancersequenzen vertraut, die für die Durchführung der Erfindung geeignet sein können. Es kann auch eine Intronsequenz zu der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder der kodierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge an reifer Botschaft, die im Cytosol akkumuliert, zu erhöhen, wie im Abschnitt Definitionen beschrieben ist. Weitere Kontrollsequenzen (neben Promotor-, Enhancer-, Silencer-, Intronsequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Solche Sequenzen sind dem Fachmann bekannt oder können von ihm leicht erhalten werden.
  • Die erfindungsgemäßen Genkonstrukte können weiterhin eine Replikationsursprungssequenz beinhalten, die für die Aufrechterhaltung und/oder die Replikation in einem bestimmten Zelltyp erforderlich ist. Ein Beispiel ist, wenn ein Genkonstrukt in einer Bakterienzelle als episomales genetisches Element (z. B. ein Plasmid- oder Cosmidmolekül) aufrechterhalten werden muss. Bevorzugte Replikationsursprünge sind u. a. der f1-ori und colE1, sie sind jedoch nicht hierauf beschränkt.
  • Für den Nachweis eines erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie sie bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, und/oder für die Selektion transgener Pflanzen, die diese Nukleinsäuren umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (oder Reportergene) zu verwenden. Daher kann das Genkonstrukt gegebenenfalls ein Selektionsmarkergen umfassen. Selektionsmarker sind hier im Abschnitt ”Definitionen” eingehender beschrieben. Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder ausgeschnitten werden, wenn sie nicht mehr benötigt werden. Techniken zur Entfernung von Markern sind im Stand der Technik bekannt, geeignete Techniken sind vorstehend im Abschnitt Definitionen beschrieben.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in eine(r) Pflanze eine beliebige Nukleinsäure, die ein UGE-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, einführt und exprimiert.
  • Genauer gesagt, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung transgener Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere erhöhtem (Samen-)Ertrag, bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    • (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein UGE-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze oder eine(r) Pflanzenzelle und
    • (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung fördern.
  • Bei der Nukleinsäure unter (i) kann es sich um eine der Nukleinsäuren handeln, die ein UGE-Polypeptid, wie hier definiert, kodieren können.
  • Die Nukleinsäure kann direkt in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst eingeführt werden (was das Einführen in ein Gewebe, ein Organ oder einen anderen Teil einer Pflanze beinhaltet). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure vorzugsweise mittels Transformation in eine Pflanze eingeführt. Der Begriff ”Transformation” ist hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können durch alle Verfahren regeneriert werden, mit denen der Fachmann vertraut ist. Geeignete Verfahren finden sich in den oben genannten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
  • Im Allgemeinen werden nach der Transformation die Pflanzenzellen oder Zellgruppierungen hinsichtlich des Vorhandenseins von einem oder mehreren Markern selektiert, die von Genen kodiert werden, die in Pflanzen exprimierbar sind und die mit dem interessierenden Gen co-transferiert wurden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Für die Selektion von transformierten Pflanzen wird das bei der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial in der Regel derartigen Selektionsbedingungen unterworfen, dass man transformierte Pflanzen von untransformierten Pflanzen unterscheiden kann. So können zum Beispiel Samen, die auf die oben beschriebene Weise erhalten wurden, ausgepflanzt werden und nach einer anfänglichen Wachstumsphase einer geeigneten Selektion durch Spritzen unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass man die Samen, gegebenenfalls nach Sterilisieren, auf Agarplatten unter Verwendung eines geeigneten Selektionsmittels heranzieht, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ wird das Vorhandensein eines Selektionsmarkers, wie die oben beschriebenen, in den transformierten Pflanzen mittels Screening ermittelt.
  • Nach DNA-Transfer und Regeneration können mutmaßlich transformierte Pflanzen auch zum Beispiel unter Verwendung der Southern-Analyse hinsichtlich des Vorhandenseins des interessierenden Gens, der Kopienzahl und/oder der Genomorganisation untersucht werden. Alternativ oder zusätzlich können die Expressionsniveaus der neu eingeführten DNA unter Verwendung von Northern- und/oder Western-Analyse verfolgt werden, wobei beide Techniken dem Durchschnittsfachmann bekannt sind.
  • Die erzeugten transformierten Pflanzen können durch eine Vielzahl von Mitteln vermehrt werden, wie durch klonale Vermehrung oder klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (T1-Pflanze) geselbstet werden, und homozygote Transformanten der zweiten Generation (T2-Pflanzen) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann unter Verwendung klassischer Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten transformierten Organismen können in einer Vielzahl von Formen vorliegen. So kann es sich zum Beispiel um Chimären von transformierten Zellen und untransformierten Zellen, klonale Transformanten (z. B. dass alle Zellen so transformiert wurden, dass sie die Expressionskassette enthalten), Pfropfmaterial von transformiertem und untransformiertem Gewebe (z. B. bei Pflanzen ein transformierter Wurzelstock, der auf ein untransformiertes Edelreis gepfropft wurde) handeln.
  • Die vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf jede Pflanzenzelle oder Pflanze, die durch eines der hier beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, und auf alle Pflanzenteile und sämtliches Vermehrungsmaterial davon. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Nachkommenschaft eine(r/s) primär transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, die/das durch eines der oben genannten Verfahren hergestellt wurde, wobei die einzige Voraussetzung ist, dass die Nachkommenschaft dasselbe/dieselben genotypische(n) und/oder phänotypische(n) Merkmal(e) aufweist, wie es/sie der Elter bei den erfindungsgemäßen Verfahren zeigt.
  • Die Erfindung beinhaltet auch Wirtszellen, die eine isolierte Nukleinsäure enthalten, die ein UGE-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die Nukleinsäuren oder den Vektor, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor sind im Prinzip vorteilhafterweise alle Pflanzen, welche die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide synthetisieren können.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich vorteilhaft auf jede beliebige Pflanze anwenden. Zu den Pflanzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren besonders geeignet sind, gehören alle Pflanzen, die zur Superfamilie der Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, einschließlich Futter- oder Weidepflanzenleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelkulturen, Bäume oder Sträucher. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze. Beispiele für Kulturpflanzen sind zum Beispiel u. a. Sojabohne, Sonnenblume, Canola, Luzerne, Raps, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiterhin bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um eine monokotyle Pflanze. Beispiele für monokotyle Pflanzen sind zum Beispiel u. a. Zuckerrohr. Stärker bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um ein Getreide. Beispiele für Getreide sind zum Beispiel u. a. Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer.
  • Die Erfindung erstreckt sich auch auf erntbare Teile einer Pflanze, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Wurzeln, Rhizome, Knollen und Zwiebeln. Die Erfindung betrifft weiterhin Produkte, die, vorzugsweise direkt, von einem erntbaren Teil einer solchen Pflanze stammen, wie trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der Erfindung handelt es sich bei der modulierten Expression um erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuren oder Genen oder Genprodukten sind im Stand der Technik bekannt und Beispiele werden im Abschnitt Definitionen gegeben.
  • Wie vorstehend erwähnt, ist ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die ein UGE-Polypeptid kodiert, durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein UGE-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze; die Wirkungen der Durchführung des Verfahrens, d. h. das Erhöhen der Ertragsmerkmale, können jedoch auch unter Verwendung anderer bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken findet sich im Abschnitt Definitionen.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nukleinsäuren, die UGE-Polypeptide, wie hier beschrieben, kodieren, und die Verwendung dieser UGE-Polypeptide zur Verbesserung eines der oben genannten Ertragsmerkmale in Pflanzen.
  • Hier beschriebene Nukleinsäuren, die ein UGE-Polypeptid kodieren, oder die UGE-Polypeptide selbst können Verwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der mit einem Gen, das ein UGE-Polpeptid kodiert, genetisch verknüpft sein kann. Die Nukleinsäuren/Gene oder die UGE-Polypeptide selbst können dazu verwendet werden, einen molekularen Marker zu bestimmen. Dieser DNA- oder Protein-Marker kann dann in Züchtungsprogrammen zur Selektion von Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen verwendet werden, wie hier vorstehend bei den erfindungsgemäßen Verfahren definiert.
  • Allelische Varianten einer Nukleinsäure/eines Gens, die/das ein UGE-Polypeptid kodiert, können auch Verwendung in Marker-unterstützten Züchtungsprogrammen finden. Bei solchen Züchtungsprogrammen ist manchmal das Einführen von allelischer Variation durch Mutagenbehandlung der Pflanzen erforderlich, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese verwendet wird; alternativ kann das Programm von einer Sammlung von allelischen Varianten so genannten ”natürlichen” Ursprungs ausgehen, die nicht mit Absicht hervorgerufen wurden. Dann erfolgt die Identifikation allelischer Varianten, zum Beispiel mittels PCR. Darauf folgt ein Schritt zur Selektion besserer allelischer Varianten der in Frage kommenden Sequenz, die erhöhte Ertragsmerkmale liefern. Die Selektion wird gewöhnlich durchgeführt, indem man die Wachstumsleistung von Pflanzen verfolgt, die verschiedene allelische Varianten der in Frage kommenden Sequenz enthalten. Die Wachstumsleistung kann im Gewächshaus oder auf dem Feld verfolgt werden. Weitere Schritte sind gegebenenfalls u. a. das Kreuzen der Pflanzen, in denen die bessere allelische Variante identifiziert wurde, mit einer anderen Pflanze. Dies kann zum Beispiel zur Herstellung einer Kombination interessanter phänotypischer Merkmale verwendet werden.
  • Nukleinsäuren, die UGE-Polypeptide kodieren, können auch als Sonden zur genetischen und physikalischen Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, und als Marker für Merkmale, die mit diesen Genen verknüpft sind, verwendet werden. Diese Information kann für die Pflanzenzüchtung nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwickeln. Eine solche Verwendung von Nukleinsäuren, die ein UGE-Polypeptid kodieren, erfordert nur eine Nukleinsäuresequenz mit einer Länge von mindestens 15 Nukleotiden. Die Nukleinsäuren, die ein UGE-Polypeptid kodieren, können als Marker für Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J, Fritsch EF und Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laborstory Manual) von restriktionsgespaltener genomischer Pflanzen-DNA können mit den UGE kodierenden Nukleinsäuren sondiert werden. Die erhaltenen Bandenmuster können dann genetischen Analysen unter Verwendung von Computerprogrammen, wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181), unterworfen werden, wodurch eine Genkarte erstellt wird. Außerdem können die Nukleinsäuren zum Sondieren von Southern-Blots verwendet werden, die restriktionsendonukelasebehandelte genomische DNAs von einem Satz von Individuen enthalten, die den Elter und die Nachkommen einer bestimmten genetischen Kreuzung darstellen. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird ermittelt und dazu verwendet, die Position der Nukleinsäure, die ein UGE-Polypeptid kodiert, in der zuvor unter Verwendung dieser Population erhaltenen Genkarte zu berechnen (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
  • Die Herstellung und Verwendung von Sonden, die von Pflanzengenen stammen, für die Verwendung bei der genetischen Kartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung spezifischer cDNA-Klone, wobei die vorstehend erläuterte Methodik oder Varianten davon verwendet werden. Für die Kartierung können zum Beispiel F2- Inzuchtpopulationen, Rückkreuzungspopulationen, zufallsgemäß gepaarte Populationen, nahezu isogene Linien und andere Sätze von Individuen verwendet werden. Diese Methodik ist dem Fachmann geläufig.
  • Die Nukleinsäuresequenzsonden können auch zur physikalischen Kartierung (d. h. zum Anordnen von Sequenzen in physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346 und darin genannte Bezugsstellen) verwendet werden.
  • In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresequenzsonden bei der Kartierung mittels direkter Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154) verwendet werden. Zwar bevorzugen derzeitige FISH-Kartierungsverfahren die Verwendung großer Klone (mehrere kb bis mehrere Hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20), aber durch Verbesserungen in der Empfindlichkeit kann die FISH-Kartierung auch unter Verwendung kürzerer Sonden durchgeführt werden.
  • Eine Reihe von Verfahren auf Basis von Nukleinsäuresequenzamplifikation für die genetische und physikalische Kartierung kann unter Verwendung der Nukleinsäuren durchgeführt werden. Beispiele sind u. a. die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), Polymorphismus PCR-amplifizierter Fragmente (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotidverlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Radiation-Hybrid-Kartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy-Kartierung (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Bei diesen Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäure dazu verwendet, Primer-Paare zu gestalten und herzustellen, die bei der Amplifikationsreaktion oder bei Primerverlängerungsreaktionen verwendet werden. Die Gestaltung dieser Primer ist dem Fachmann bekannt. Bei Verfahren, die eine genetische Kartierung auf PCR-Basis einsetzen, kann es notwendig sein, dass man DNA-Sequenz-Unterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in dem Bereich identifiziert, welcher der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch für Kartierungsverfahren nicht allgemein erforderlich.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren führen zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, wie hier vorstehend beschrieben. Diese Merkmale können auch mit anderen ökonomisch vorteilhaften Merkmalen, wie weiteren Ertragsmerkmalen, Toleranz gegenüber anderen abiotischen und biotischen Stressbedingungen, Merkmalen, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemische und/oder physiologische Merkmale modifizieren, kombiniert werden.
  • Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle A6” soll so verstanden werden, dass er den Inhalt von Tabelle A6a und Tabelle A6b angibt. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle A6a” soll so verstanden werden, dass er den Inhalt von Tabelle A6a angibt. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle A6b” soll so verstanden werden, dass er den Inhalt von Tabelle A6b angibt. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle A6” ”Tabelle A6b”.
  • In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung den folgendermaßen zusammengefassten Gegenstand:
    • Punkt 104: Ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein UGE-Polypeptid kodiert, moduliert.
    • Punkt 105: Verfahren nach Punkt 104, wobei das UGE-Polypeptid eine Epimerase-Domäne mit, in steigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% oder mehr Sequenzidentität mit der SEQ ID NO: 275 aufweist.
    • Punkt 106: Verfahren nach Punkt 104 oder 105, wobei das UGE-Polypeptid eines oder mehrere der folgenden Motive umfasst: Motiv 8 gemäß SEQ ID NO: 276; Motiv 9 gemäß SEQ ID NO: 277, wobei das G durch eine beliebige andere unpolare Aminosäure und das R durch eine andere polare Aminosäure ersetzt werden kann; Motiv 10 gemäß SEQ ID NO: 278, wobei 1, 2, 3 oder 4 Fehlpaarungen erlaubt sind; Motiv 11 gemäß SEQ ID NO: 279, Motiv 12 gemäß SEQ ID NO: 280, wobei 1, 2, 3 oder 4 Fehlpaarungen erlaubt sind.
    • Punkt 107: Verfahren nach Punkt 104 bis 106, wobei die modulierte Expression dadurch erreicht wird, dass man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die ein UGE-Polypeptid kodiert, einführt und exprimiert.
    • Punkt 108: Verfahren nach einem der Punkte 104 bis 107, wobei die Nukleinsäure, die ein UGE-Polypeptid kodiert, eines der in Tabelle A6 aufgelisteten Proteine kodiert oder ein Abschnitt einer solchen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure, die mit einer solchen Nukleinsäure hybridisieren kann, ist.
    • Punkt 109: Verfahren nach einem der Punkte 104 bis 108, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle A6 angegebenen Proteine kodiert.
    • Punkt 110: Verfahren nach einem der Punkte 104 bis 109, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale erhöhten Ertrag, vorzugsweise erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
    • Punkt 111: Verfahren nach einem der Punkte 104 bis 110, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
    • Punkt 112: Verfahren nach einem der Punkte 104 bis 111, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Trockenheitsstressbedingungen erhalten werden.
    • Punkt 113: Verfahren nach einem der Punkte 104 bis 112, wobei die Nukleinsäure mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt einem GOS2-Promotor aus Reis, funktionsfähig verbunden ist.
    • Punkt 114: Verfahren nach einem der Punkte 104 bis 113, wobei die Nukleinsäure, die ein UGE-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze stammt, vorzugsweise aus einer monokotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Poaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Oryza, am stärksten bevorzugt aus Oryza sativa.
    • Punkt 115: Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die durch ein Verfahren nach einem der Punkte 104 bis 114 erhältlich sind, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein UGE-Polypeptid kodiert.
    • Punkt 116: Eine isolierte Nukleinsäuresequenz, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die aus folgender Gruppe ausgewählt ist:
    • (a) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das das in SEQ ID NO: 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318 und/oder 320 und/oder Tabelle A6b dargestellte Polypeptid kodiert;
    • (b) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, wie in SEQ ID NO: 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317 und/oder 319 und/oder Tabelle A6b dargestellt;
    • (c) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das infolge der Degeneration des genetischen Codes von einer in Tabelle A6 dargestellten Polypeptidsequenz abgeleitet werden kann und verbesserte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen verleiht;
    • (d) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität mit der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, das das in Tabelle A6 dargestellte Nukleinsäuremolekül umfasst, aufweist und verbesserte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen verleiht;
    • (e) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, das mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz des Polypeptids aufweist, das von dem Nukleinsäuremolekül unter (a) bis (c) kodiert wird, und verbesserte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen verleiht;
    • (f) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül unter (a) bis (c) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und verbesserte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen verleiht;
    • (g) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, das die Konsensussequenz oder ein oder mehrere Polypeptidmotive, wie in 20 dargestellt, aufweist und vorzugsweise die Aktivität, die durch ein Nukleinsäuremolekül, das ein Polynukleotid, wie in Tabelle A6 dargestellt, umfasst, dargestellt wird, aufweist;
    • (h) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, das die Aktivität, die durch ein Protein, wie in Tabelle A6 gezeigt, dargestellt wird, aufweist und verbesserte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen verleiht; und
    • (i) einem Nukleinsäuremolekül, das mittels Screening einer geeigneten Nukleinsäurebank unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, die eine komplementäre Sequenz zu einem Nukleinsäuremolekül unter (a) oder (b) umfasst, oder mit einem Fragment davon, das mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt eines Nukleinsäuremoleküls umfasst, das zu einer unter (a) bis (e) charakterisierten Nukleinsäuremolekülsequenz komplementär ist, erhältlich ist und ein Polypeptid kodiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein Protein dargestellt wird, das ein Polypeptid, wie in Tabelle A6 dargestellt, umfasst;
    wobei das Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (i) sich in mindestens einem oder mehreren Nukleotiden von der in Tabelle A6a dargestellten Sequenz unterscheidet und vorzugsweise ein Protein kodiert, das sich in mindestens einer oder mehreren Aminosäuren von den in Tabelle A6a dargestellten Proteinsequenzen unterscheidet.
    • Punkt 117: Konstrukt, umfassend:
    • (a) eine Nukleinsäure, die ein UGE-Polypeptid gemäß den Punkten 104 bis 106 oder 116 kodiert;
    • (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz unter (a) antreiben können; und gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
    • Punkt 118: Konstrukt gemäß Punkt 117, wobei eine der Kontrollsequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis, ist.
    • Punkt 119: Verwendung eines Konstrukts nach einem der Punkte 117 bis 118 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit gesteigertem Ertragsmerkmalen, vorzugsweise gesteigertem Ertrag, stärker bevorzugt gesteigertem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • Punkt 120: Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die mit einem Konstrukt nach Punkt 117 oder 118 transformiert sind.
    • Punkt 121: Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigertem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend:
    • (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein UGE-Polypeptid nach den Punkten 104 bis 106 oder 116 kodiert, in eine(r) Pflanze; und
    • (ii) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze fördern.
    • Punkt 122: Transgene Pflanze mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigertem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, der aus einer erhöhten Expression einer Nukleinsäure, die ein UGE-Polypeptid nach den Punkten 104 bis 106 oder 116 kodiert, resultiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die von der transgenen Pflanze stammt.
    • Punkt 123: Transgene Pflanze nach Punkt 115, 120 oder 122 oder eine daraus stammende transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer, ist.
    • Punkt 124: Erntbare Teile einer Pflanze nach Punkt 123, wobei die erntbaren Teile vorzugsweise die Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
    • Punkt 125: Produkte, die von einer Pflanze nach Punkt 123 und/oder von erntbaren Teilen einer Pflanze nach Punkt 124 stammen.
    • Punkt 126: Verwendung einer Nukleinsäure, die ein UGE-Polypeptid kodiert und Ertragsmerkmale, vorzugsweise erhöhten Ertrag, stärker bevorzugt erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen verbessert.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird auch ein isoliertes Polypeptid bereitgestellt, das eine Polypeptidsequenz umfasst, die aus folgender Gruppe ausgewählt ist:
    • (i) einer Aminosäuresequenz, die von einer der durch Punkt 116 dargestellten Nukleinsäuren kodiert wird;
    • (ii) einer Aminosäuresequenz, die, in steigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz unter (i) aufweist;
    • (iii) Derivaten von einer der vorstehend unter (i) oder (ii) angegebenen Aminosäuresequenzen.
  • Beschreibung der Figuren
  • Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Figuren beschrieben.
  • Es zeigt:
  • 1 die Domänenstruktur von SEQ ID NO: 2 mit den konservierten Motiven, die durch Unterstreichung und ihre Zahl angegeben sind. Die HLH-Domäne, wie sie durch SMART bestimmt wird, ist fett unterstrichen gezeigt.
  • 2 ein mehrfaches Alignment einer Reihe von bHLH6-ähnlichen Proteinen. Ein Punkt veranschaulicht konservierte Reste, ein Komma veranschaulicht hochkonservierte Reste, und ein Sternchen steht für perfekt konservierte Reste. Der höchste Grad der Sequenzkonservierung befindet sich in der Region der bHLH-Domäne und in dem weiter N-terminal gelegenen Teil der Proteinsequenz.
  • 3 den binären Vektor für eine gesteigerte Expression in Oryza sativa einer bHLH6-ähnlichen-kodierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Reis-GOS2-Promotor (pGOS2).
  • 4 genaue Beispiele für Sequenzen, die sich bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • 5 ein mehrfaches CLUSTAL W (1; 83) Sequenzalignment von RrmJ/FtsJ-Polypeptiden aus Tabelle A2.
  • 6 den binären Vektor für eine gesteigerte Expression in Oryza sativa einer GRP-kodierenden Nukleinsäuresequenz (wobei das GRP-Polypeptid ein RrmJ/FtsJ-Polypeptid ist) unter der Kontrolle eines Reis-Oleosin-Promotors (pOleo::GRP).
  • 7 genaue Beispiele für Sequenzen, die sich bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • 8 den binären Vektor für eine gesteigerte Expression in Oryza sativa einer GRP-kodierenden Nukleinsäuresequenz (wobei das GRP-Polypeptid ein basisches Helix-Loop-Helix 4 (bHLH4) Polypeptid ist) unter der Kontrolle eines Reis-HMGB-Promotors (pHMGB::GRP)
  • 9 genaue Beispiele für Sequenzen, die sich bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • 10 ein mehrfaches Alignment von GRP-Polypeptiden (wobei das GRP-Polypeptid ein basisches Helix-Loop-Helix 4 (bHLH4) Polypeptid ist). Es sind eine Konsensussequenz, Domänen und Motive angegeben, die bHLH4-Polypeptide veranschaulichen. In der Konsensussequenz sind die hochkonservierten Aminosäuren angegeben; leere Stellen dazwischen stehen für eine beliebige Aminosäure.
  • 11 den binären Vektor für eine gesteigerte Expression in Oryza sativa einer GRP-kodierenden Nukleinsäuresequenz (wobei das GRP-Polypeptid ein Isopentenyltransferase (IPT) Polypeptid unter der Kontrolle eines Reis-Prolamin-Promotors ist (pProl::GRP).
  • 12 genaue Beispiele für Sequenzen, die sich bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • 13 ein mehrfaches Alignment von GRP-Polypeptiden (wobei das GRP-Polypeptid ein Isopentenyltransferase (IPT) Polypeptid ist). Es sind eine Konsensussequenz, Domänen und Motive angegeben, die IPT-Polypeptide veranschaulichen. In der Konsensussequenz sind die hochkonservierten Aminosäuren angegeben; leere Stellen dazwischen stehen für eine beliebige Aminosäure.
  • 14 die Aminosäuresequenz und Domänenstruktur von SEQ ID NO: 169. Die beiden konservierten B-Box-Domänen in SEQ ID NO: 169 sind durch eine gepunktete Linie (B-Box-Domäne 1) und durch eine durchgehende Linie (B-Box-Domäne 2) angegeben. Die vier Cysteinreste in jeder B-Box-Domäne mit einem mutmaßlichen Potential zur Bindung von Zinkionen sind durch Kästen angegeben.
  • 15 ein mehrfaches Alignment von STO-Polypeptiden. Es sind die Position der konservierten Aminosäurereste und Domänen angegeben, die den in 14 beschriebenen entsprechen. Es ist eine Konsensussequenz angegeben, die die STO-Polypeptide veranschaulicht. In der Konsensussequenz sind die hochkonservierten Aminosäuren angegeben; leere Stellen dazwischen stehen für eine beliebige Aminosäure.
  • 16 den Stammbaum der STO-Polypeptide. In dem Stammbaum ist die SEQ ID NO: 169 durch Os04g0540200 veranschaulicht.
  • 17 den binären Vektor für eine gesteigerte Expression in Oryza sativa einer STO-kodierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Reis-GOS2-Promotors (pGOS2).
  • 18 genaue Beispiele für Sequenzen, die sich bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • 19 die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 225, wobei relevante funktionelle Domänen und konservierte Motive angegeben sind. Die Epimerase-Domäne (Region im Kasten), Motiv 8 (Großbuchstaben in fett, unterstrichen mit einer unterbrochenen Linie), Motiv 9 (kleine Buchstaben in fett), Motiv 10 (Großbuchstaben in fett), Motiv 11 (Großbuchstaben, gepunktet unterstrichen) und Motiv 12 (Großbuchstaben, durchgehend unterstrichen) sind angegeben.
  • 20 ein mehrfaches Proteinalignment der UGE-Polypeptide von Tabelle A6. Es ist eine Konsensussequenz angegeben. Die Position der konservierten Domäne und der Motive ist angegeben.
  • 21 einen Stammbaum der UGE-Polypeptide der Tabelle A6.
  • 22 den binären Vektor für eine gesteigerte Expression in Oryza sativa einer UGE-kodierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Reis-GOS2-Promotors (pGOS2).
  • 23 genaue Beispiele für Sequenzen, die sich bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele beschrieben, die lediglich beispielhaft sind. Die folgenden Beispiele sollen den Schutzbereich der Erfindung keinesfalls vollständig definieren oder ansonsten einschränken.
  • Die DNA-Manipulation: wenn nicht anders angegeben werden DNA-Rekombinationstechniken gemäß Standard-Protokollen durchgeführt, die beschrieben sind in (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laborstory Press, CSH, New York) oder in Bd. 1 und 2 von Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Standard-Materialien und Verfahren zur molekularen Arbeit an der Pflanze sind in Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R. D. D. Croy, veröffentlicht von BIOS Scientific Publications Ltd (UK) und Blackwell Scientific Publications (UK) beschrieben.
  • Beispiel 1: Identifikation von Sequenzen, die mit der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind
  • Sequenzen (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomische), die mit der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind, wurden unter den Sequenzen in der Entrez Nucleotides Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) unter Verwendung von Datenbanksequenzabfragewerkzeugen, wie dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al., (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402), identifiziert. Das Programm wird zum Auffinden von Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen verwendet, und zwar durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenz-Datenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz der Übereinstimmungen. Das Polypeptid, das durch die bei der vorliegenden Erfindung verwendete Nukleinsäure kodiert wird, wurde zum Beispiel für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, und zwar unter Ausschaltung der Default-Einstellungen und des Filters für die Nichtmiteinbeziehung von Sequenzen mit niedriger Komplexität. Der Output der Analyse wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet und anhand der Wahrscheinlichkeits-Wertung (E-Wert) in eine Reihenfolge gebracht, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass ein bestimmtes Alignment zufällig vorkommt (je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der Hit). Zusätzlich zu den E-Werten wurden die Vergleiche auch anhand der Prozent Identität gewertet. Prozent Identität bezieht sich auf die Anzahl identischer Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid)-Sequenzen über eine bestimmte Länge. In einigen Fällen können die Default-Parameter so eingestellt werden, dass die Stringenz der Suche eingestellt wird. Zum Beispiel kann man den E-Wert erhöhen, so dass weniger stringente Übereinstimmungen angezeigt werden. Auf diese Weise lassen sich kurze fast genaue Übereinstimmungen identifizieren.
  • Die Tabelle A stellt eine Liste der Nukleinsäuresequenzen bereit, die mit der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind. Tabelle A1: Beispiele für bHLH6-ähnliche Polypeptide:
    Ursprungspflanze Nukleinsäure SEQ ID NO: Protein SEQ ID NO:
    Arabidopsis thaliana 1 2
    Phaseolus vulgaris 13 14
    Catharanthus roseus 15 16
    Solanum tuberosum 17 18
    Pisum sativum 19 20
    Brassica oleracea 21 22
    Oryza sativa 23 24
    Rheum australe 25 26
    Zea mays 27 28
    Physcomitrella patens 29 30
    Lycopersicon esculentum 31 32
    Populus trichocarpa 33 34
    Triticum aestivum 35 36
    Populus sp 37 38
    Vitis vinifera 39 40
    Oryza sativa 41
    Tabelle A2a: Beispiele für GRP-Polypeptide, wobei die GRP-Polypeptide RrmJ/FtsJ-Polypeptide sind:
    Name Ursprungs-Organismus SEQ ID NO Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO Polypeptidsequenz Status Zugangsnummer der öffentlichen Datenbank
    Nicta_RrmJ/FtsJ partial Nicotiana tabacum 57 58 Partiell
    Nicta_RrmJ/FtsJ Nicotiana tabacum 59 60 Volllänge EB446219, EB448450.1
    Arath_RrmJ/FtsJ Arabidopsis thaliana 61 62 Volllänge AY087952.1
    Lyces_RrmJ/FtsJ Lycopersicon esculentum 63 64 Volllänge BT013964
    Medtr_RrmJ/FtsJ Medicago truncatula 65 66 Volllänge AC149135.2
    Orysa_RrmJ/FtsJ Oryza sativa 67 68 Volllänge AK103054
    Osta_RrmJ/FtsJ Ostreococcus lucimarinus CCE9901 69 70 Volllänge XM_001418019
    Poptr_RrmJ/FtsJ Populus tremuloides 71 72 Volllänge contig von CX183550.1 DT504907.1
    Sacof_RrmJ/FtsJ Saccharum officinarum 73 74 Volllänge contig von CA279558.1 CF576902.1
    Triae_RrmJ/FtsJ Triticum aestivum 75 76 Volllänge DR740715
    Apime_RrmJ/FtsJ Apis mellifera 77 78 Volllänge XM_392223
    Caeel_RrmJ/FtsJ Caenorhabditis elegans 79 80 Volllänge NM_065442
    Danre_RrmJ/FtsJ Danio rerio 81 82 Volllänge BC085449
    Homsa_RrmJ/FtsJ Homo sapiens 83 84 Volllänge AK024023
    Horvu_FtsJ Hordeum vulgare 92 93 Volllänge
    Sorbi_FtsJ Sorghum bicolor 94 95 Volllänge
    Tabelle A2b: Beispiele für GRP-Polypeptide, wobei die GRP-Polypeptide RrmJ/FtsJ-Polypeptide sind:
    Name Ursprungs-Organismus SEQ ID NO Nukleinsäure-Sequenz SEQ ID NO Polypeptid-Sequenz Status
    Brana_FtsJ Brassica napus 96 97 Volllänge
    Glyma_FtsJ Glycine max 98 99 Volllänge
    Zeama_FtsJ Zea mays 100 101 Volllänge
    Tager_FtsJ_partial Tagetes erecta Partiell
    Tabelle A3a: Beispiele für GRP-Polypeptide, wobei die GRP Polypeptide bHLH4-Polypeptide sind:
    Name Ursprungs-Organismus SEQ ID NO Nukleinsäure-Sequenz SEQ ID NO Polypeptid-Sequenz Zugangsnummer der öffentlichen Datenbank
    Arath_bHLH4 Arabidopsis thaliana 104 105
    Arath_bHLH4 II Arabidopsis thaliana 109 110
    Brana_bHLH4 II Brassica napus 111 112
    Lotja_bHLH4 Lotus japonicus 113 114
    Lyces_bHLH4 Lycopersicon esculentum 115 116
    Vitvi_bHLH4 Vitis vinifera 117 118 contig-ähnlich VV78X118066.5 AM475703.2
    Zeama_bHLH4 Zea mays 119 120 Vollängen-Nukleinsäuresequenz-contig von AF061107 und EE190449
    Tabelle A3b: Beispiele für GRP-Polypeptide, wobei die GRP-Polypeptide bHLH4-Polypeptide sind:
    Name Ursprungs-Organismus SEQ ID NO Nukleinsäure-Sequenz SEQ ID NO Polypeptid-Sequenz Zugangsnummer der öffentlichen Datenbank
    Brana_bHLH4 Brassica napus 121 122
    Glyma_bHLH4 Glycine max 123 124
    Glyma_bHLH4 II Glycine max 125 126
    Horvu_bHLH4 Hordeum vulgare 127 128
    Zeama_bHLH4 II Zea mays 129 130
    Tabelle A4: Beispiele für GRP-Polypeptide, wobei die GRP-Polypeptide IPT-Polypeptide sind:
    Name Ursprungs-Organismus SEQ ID NO Nukleinsäure-Sequenz SEQ ID NO Polypeptid-Sequenz
    Arath_IPT Arabidopsis thaliana 131 132
    Arath_IPT4 Arabidopsis thaliana 136 137
    Arath_IPT6 Arabidopsis thaliana 138 139
    Humlu_IPT ähnlich Humulus lupunus 140 141
    Lotja_IPT ähnlich Lotus japonica 142 143
    Medtr_IPT ähnlich Medicago truncatula 144 145
    Moral_IPT ähnlich Morus alba 146 147
    Orysa_IPT ähnlich Oryza sativa 148 149
    Pethy_IPT ähnlich Petunia hybrida 150 151
    Poptr_IPT ähnlich Populus tremuloides 152 153
    Poptr_IPT ähnlich II Populus tremuloides 154 155
    Poptr_IPT ähnlich III Populus tremuloides 156 157
    Poptr_IPT ähnlich IV Populus tremuloides 158 159
    Poptr_IPT ähnlich V Populus tremuloides 160 161
    Poptr_IPT ähnlich VI Populus tremuloides 162 163
    Vitvi_IPT ähnlich Vitis vinifera 164 165
    Zeama_IPT ähnlich Zea mays 166 167
    Tabelle A5a: Beispiele für STO-Nukleinsäuren und Polypeptide:
    Name Ursprungspflanze Nukleinsäure SEQ ID NO: Protein SEQ ID NO:
    Os04g0540200 cds3887 Oryza sativa 168 169
    Os01g0202500 Oryza sativa 170 171
    Os02g0606200 Oryza sativa 172 173
    Os02g0646200 Oryza sativa 174 175
    Os04g049300 Oryza sativa 176 177
    Os05g0204600 Oryza sativa 178 179
    Os06g0152200 Oryza sativa 180 181
    Os06g071300 Oryza sativa 182 183
    Os09g0527900 Oryza sativa 184 185
    Os12g0209200 Oryza sativa 186 187
    SO_STO Saccharum officinarum 188 189
    AT1G06040_Spleißvariante 1 Arabidopsis thaliana 190 191
    AT1G06040_Spleißvariante 2 Arabidopsis thaliana 192 193
    AT1G75540 Arabidopsis thaliana 194 195
    AT1G78600 Arabidopsis thaliana 196 197
    AT2G31380 Arabidopsis thaliana 198 199
    AT4G10240 Arabidopsis thaliana 200 201
    AT4G39070 Arabidopsis thaliana 202 203
    Mt_ABO84497 Medicago truncatula 204 205
    LE_gi|45544865 Lycopersicul esculentum 206 207
    ST_gi|76160970 Solanum tuberosum 208 209
    PP_STO LIKE populus trichoparcca 210 211
    W_CAN72879 Vitis vinifera 212 213
    GM_gi|78173056 Glycine max 214 215
    Tabelle A5b: Beispiele für STO-Nukleinsäuren und Polypeptide:
    Name Ursprungspflanze Nukleinsäure SEQ ID NO: Protein SEQ ID NO:
    Zeama_STO Zea mays 222 223
    Tabelle A6: Beispiele für UGE-Nukleinsäuren und Polypeptide:
    Name Ursprungsorganismus Nukleinsäure SEQ ID NO: Protein SEQ ID NO:
    OS_UGE2 Oryza sativa 224 225
    Os04g0618200 Oryza sativa 226 227
    Os05g0595100 Oryza sativa 228 229
    Os07g0139400 Oryza sativa 230 231
    Os08g0374800 Oryza sativa 232 233
    Os09g0323000 Oryza sativa 234 235
    Os09g0504000 Oryza sativa 236 237
    Os09g0526700 Oryza sativa 238 239
    AT1G12780_UGE1 Arabidopsis thaliana 240 241
    AT1G63180_UGE3 Arabidopsis thaliana 242 243
    AT1G64440_UGE4 Arabidopsis thaliana 244 245
    AT4G10960_UGE5 Arabidopsis thaliana 246 247
    AT4G23920_UGE2 Arabidopsis thaliana 248 249
    Pt_Icl|scaff_XVI.140 Populus trichocarpa 250 251
    Pt_Idl|scaff_XI.1329 Populus trichocarpa 252 253
    Pt_Icl|scaff_VI.203 Populus trichocarpa 254 255
    Pt_Icl|scaff_III.961 Populus trichocarpa 256 257
    Pt_Icl|scaff_III.1133 Populus trichocarpa 258 259
    Pt_Icl|scaff_I.773 Populus trichocarpa 260 261
    Pt_Icl|scaff_I.2996 Populus trichocarpa 262 263
    Pt_Icl|scaff_5422 Populus trichocarpa 264 265
    Ot08g015500 Ostreococcus tauri 266 267
    SC_GAL10_P04397 Ostreococcus tauri 268 269
    Ec_GALE_AAO37702 Escherichia coli 270 271
    Tabelle A6b: Beispiele für UGE-Nukleinsäuren und Polypeptide:
    Name Ursprungsorganismus Nukleinsäure SEQ ID NO: Protein SEQ ID NO:
    Brana_UGE I Brassica napus 281 282
    Brana_UGE II Brassica napus 283 284
    Zeama_UGE I Zea mays 285 286
    Zeama_UGE II Zea mays 287 288
    Zeama_UGE III Zea mays 289 290
    Zeama_UGE IV Zea mays 291 292
    Zeama_UGE V Zea mays 293 294
    Zeama_UGE VI Zea mays 295 296
    Zeama_UGE VII Zea mays 297 298
    Zeama_UGE VIII Zea mays 299 300
    Orysa_UGE Oryza sativa 301 302
    Glyma_UGE I Glycine max 303 304
    Glyma_UGE II Glycine max 305 306
    Glyma_UGE III Glycine max 307 308
    Glyma_UGE IV Glycine max 309 310
    Glyma_UGE V Glycine max 311 312
    Helan_UGE Helianthus annuus 313 314
    Zeama_UGE IX Zea mays 315 316
    Zeama_UGE X Zea mays 317 318
    Glyma_UGE VI Glycine max 319 320
  • In einigen Fällen sind zudem verwandte Sequenzen vorläufig zusammengebaut und durch Forschungsinstitutionen, wie The Institute for Genomic Research (TIGR), der Öffentlichkeit zugänglich gemacht worden. Die Eukaryotic Gene Orthologs (EGO) Datenbank kann zur Identifikation solcher verwandten Sequenzen verwendet werden, und zwar entweder über die Schlüsselwort-Suche oder unter Verwendung des BLAST-Algorithmus mit der interessierenden Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz. Einige der aufgelisteten Sequenzen sind partiell, es werden vorzugsweise Volllängensequenzen oder funktionell äquivalente Fragmente in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet. Wo nur partielle Sequenzen aus den Datenbanken verfügbar sind, können Standard-Klonierungstechniken vom Fachmann eingesetzt werden, um eine Vollängen-Gensequenz zu erhalten.
  • Beispiel 2: Alignment der erfindungsgemäßen Polypeptidsequenzen
  • Das Alignment von Polypeptidsequenzen erfolgte mit dem AlignX-Programm von dem Vector NTI (Invitrogen), das auf dem bekannten Clustal W-Algorithmus für progressives Alignment beruht (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497–3500). Die Default-Werte lauten: gap open penalty 10, gap extension penalty 0,1 und die gewählte ”weight matrix” ist Blosum 62 (wenn Polypeptide einem Alignment unterworfen werden). Um das Alignment weiter zu optimieren, können kleinere Veränderungen von Hand durchgeführt wurden.
  • Alignment von bHLH6-ähnlichen Polypeptidsequenzen
  • Die Sequenzkonservierung unter bHLH6-ähnlichen Polypeptiden ist im Wesentlichen in der N-terminalen Domäne und der C-terminalen bHLH-Domäne der Polypeptide, wobei der zentrale Teil variablere Sequenzlänge und Zusammensetzung aufweist. Die bHLH6-ähnlichen Polypeptide sind in 2 einem Alignment unterworfen.
  • Alignment von RrmJ/FtsJ-Polypeptidsequenzen
  • In der 5 ist ein mehrfaches CLUSTAL W (1; 83)-Sequenzalignment der RrmJ/FtsJ-Polypeptide aus Tabelle A2 gezeigt.
  • Eine Konsensussequenz von bHLH4-Polypeptiden mit hoch konservierten repräsentativen Aminosäuren an jeder Position ist angegeben; Leerstellen zwischen den angegebenen Aminosäuren in der Konsensussequenz stehen für eine beliebige Aminosäure.
  • Die bHLH4-Polypeptide sind in der 10 einem Alignment ausgesetzt.
  • Die Sequenzkonservierung unter den bHLH4-Polypeptiden wurde im Wesentlichen entlang der bHLH-Domäne gefunden. Die Konsensussequenz veranschaulicht hochkonservierte Aminosäurereste in den bHLH4-Polypeptiden; Leerstellen in der Konsensussequenz veranschaulichen hochvariable Regionen.
  • Alignment von IPT-Polypeptidsequenzen
  • Eine Konsensussequenz von IPT-Polypeptiden mit hoch konservierten repräsentativen Aminosäuren an jeder Position ist angegeben; Leerstellen zwischen den angegebenen Aminosäuren in der Konsensussequenz stehen für eine beliebige Aminosäure.
  • Die IPT-Polypeptide sind in der 13 einem Alignment ausgesetzt.
  • Die Konsensussequenz veranschaulicht hochkonservierte Aminosäurereste in den IPT-Polypeptiden; Leerstellen in der Konsensussequenz veranschaulichen hochvariable Regionen.
  • Ein Stammbaum der GRP-Polypeptide wird mit einem Neighbour-joining-Clustering-Algorithmus konstruiert, wie er in dem AlignX-Programm von Vector NTI (Invitrogen) bereitgestellt wird.
  • Die Sequenzkonservierung befindet sich unter den STO-Polypeptiden im Wesentlichen in der N-terminalen Region, die die beiden B-Box-Domänen umfasst. Die beiden B-Box-Domänen sind durch eine Linkerregion variabler Länge voneinander getrennt, die gewöhnlich 2 bis 20 Aminosäuren groß ist.
  • Ein Stammbaum der STO-Polypeptide (16) wurde mit einem Neighbour-joining-Clustering-Algorithmus berechnet, wie er in dem AlignX-Programm von Vector NTI (Invitrogen) bereitgestellt wird.
  • Eine Konsensussequenz der UGE-Polypeptide mit hochkonservierten repräsentativen Aminosäuren an jeder Position ist angegeben; Leerstellen zwischen den angegebenen Aminosäuren in der Konsensussequenz stehen für eine beliebige Aminosäure.
  • Die UGE-Polypeptide sind in der 20 einem Alignment ausgesetzt.
  • Die Sequenzkonservierung unter den UGE-Polypeptiden ist in der Region höher, die sich am N-Terminus der Epimerase-Domäne befindet. Regionen, wobei in der Konsensussequenz die angegebenen Aminosäuren definiert sind, veranschaulichen die Regionen mit hoher Ähnlichkeit; Leerstellen in der Konsensussequenz veranschaulichen hochvariable Regionen.
  • Ein Stammbaum der UGE-Polypeptide (21) wurde mit einem Neighbour-joining-Clustering-Algorithmus berechnet, wie er in dem AlignX-Programm von Vector NTI (Invitrogen) bereitgestellt wird.
  • Beispiel 3: Berechnung der Gesamtidentitätsprozent zwischen
  • Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind
  • Die Gesamtprozent für Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängenpolypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, wurden unter Verwendung von einer der in der Fachwelt verfügbaren Techniken, nämlich der MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; software hosted by Ledion Bitincka) bestimmt. Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeits-/Identitätsmatrizes für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein vorheriges Alignment der Daten erforderlich ist. Das Programm führt eine Reihe von paarweisen Alignments unter Verwendung des globalen Alignment-Algorithmus von Myers und Miller durch (gap opening penalty 12, und gap extension penalty 2), berechnet die Ähnlichkeit und Identität unter Verwendung von z. B. Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert dann die Ergebnisse in einer Abstandsmatrix. Die Sequenzähnlichkeit ist in der unteren Hälfte der Trennlinie und die Sequenzidentität in der oberen Hälfte der diagonalen Trennlinie dargestellt.
  • Bei den in dem Vergleich eingesetzten Parametern handelte es sich um:
    Scoring matrix: Blosum62
    First Gap: 12
    Extending gap: 2
  • Die Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B1 für die Gesamtähnlichkeit und -identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen dargestellt. Die Identitätsprozent sind über der Diagonale in fett, und die Ähnlichkeitsprozent unter der Diagonale angegeben (Normalschrift).
  • Die Identitätsprozent zwischen den bHLH6-ähnlichen Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kann nur 30% Aminosäureidentität im Vergleich zu SEQ ID NO: 2 (AAL55713) betragen. Wird jedoch das Alignment über die bHLH-Domäne durchgeführt, wird die Sequenzidentität viel höher unter den verschiedenen bHLH6-ähnlichen Proteinen. In der Tabelle B2 sind die Werte für die globale Ähnlichkeit und Identität zwischen Sequenzen aufgeführt, die mit SEQ ID NO: 9 (umfassend die bHLH-Domänen der bHLH6-ähnlichen Polypeptidsequenzen) einem Alignment unterworfen wurden sind. Die Sequenzidentität ist etwa 80% oder höher. Die verwendeten Peptidsequenzen sind: SEQ ID NO: 42, NP_001065478; SEQ ID NO: 43, EAY79619; SEQ ID NO: 44, AAD15818; SEQ ID NO: 45, AAB00686; SEQ ID NO: 46, ABD59338; SEQ ID NO: 47, Pt29.195#1; SEQ ID NO: 48, CAF74710; SEQ ID NO: 49, AAF04917; SEQ ID NO: 50, AAQ14332; SEQ ID NO: 51, AAY90122; SEQ ID NO: 52, AAL55713; SEQ ID NO: 53, ABD65632; SEQ ID NO: 54, ABK94979; SEQ ID NO: 55, EDQ81347. Tabelle B1: MatGAT Ergebnisse für die Gesamtähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen.
    1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
    1. AAB00686 66,5 59,1 56,6 58,3 28,2 49,1 48,4 48,0 43,7 47,8 31,9 30,5 62,6
    2. ABD59338 79,1 54,1 50,1 55,1 27,9 46,6 43,8 45,8 41,7 45,5 29,5 31,7 57,4
    3. AAQ14332 71,1 67,7 53,5 64,0 28,8 52,1 45,4 47,8 43,6 46,2 29,3 30,6 60,5
    4. AAL55713 70,7 68,3 67,2 52,0 24,7 46,3 47,6 47,2 42,6 45,8 33,6 33,2 55,4
    5. CAF74710 70,2 68,8 78,4 66,8 37,3 52,9 46,4 49,7 45,5 49,2 30,0 30,0 60,5
    6. AAF04917 34,9 34,4 35,1 32,4 40,9 26,0 27,8 23,3 24,4 24,2 23,2 20,7 29,5
    7. AAY90122 63,6 62,1 68,1 59,6 67,6 30,7 41,1 45,1 42,4 44,2 27,0 29,8 49,7
    8. ABD65632 66,8 61,8 60,2 66,8 59,1 34,3 54,2 39,3 36,8 40,0 33,5 32,2 49,2
    9. NP001065478 63,8 63,5 64,8 60,8 65,5 30,9 61,4 53,5 94,7 79,2 28,7 29,9 48,3
    10. EAY79619 62,0 61,2 59,8 58,7 61,4 32,3 57,9 52,6 94,8 75,3 27,9 27,9 43,2
    11. AAD15818 62,3 62,4 63,4 59,0 65,7 31,1 62,1 54,1 87,6 83,3 28,5 31,1 47,0
    12. ABK94979 48,6 45,4 45,2 52,6 44,9 35,8 42,6 52,2 42,9 42,8 42,7 27,3 30,4
    13. EDQ81347 50,3 49,4 47,1 50,6 48,7 31,4 46,7 53,2 45,9 44,6 45,6 48,1 32,2
    14. Pt29.195#1 76,8 72,6 74,5 71,6 73,4 36,9 64,0 66,2 63,7 61,5 61,8 47,9 48,8
    Tabelle B2: MatGAT Ergebnisse für die Gesamtähnlichkeit und Identität über die Polypeptid-Sequenzen entsprechend Motiv 7.
    1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
    1. AAL55713 88,6 88,6 88,6 90,0 90,0 87,1 92,9 90,0 91,4 90,0 90,0 81,4 82,9
    2. NP_001065478 94,3 100,0 98,6 92,9 94,3 92,9 92,9 90,0 92,9 91,4 91,4 80,0 84,3
    3. EAY79619 94,3 100,0 98,6 92,9 94,3 92,9 92,9 90,0 92,9 91,4 91,4 80,0 84,3
    4. AAD15818 94,3 100,0 100,0 92,9 94,3 94,3 92,9 90,0 92,9 91,4 91,4 80,0 84,3
    5. AAB00686 95,7 95,7 95,7 95,7 94,3 90,0 94,3 91,4 92,9 92,9 91,4 84,3 82,9
    6. ABD59338 94,3 95,7 95,7 95,7 94,3 92,9 95,7 92,9 95,7 94,3 94,3 81,4 85,7
    7. Pt29.195#1 95,7 95,7 95,7 95,7 94,3 95,7 92,9 90,0 92,9 91,4 92,9 77,1 85,7
    8. CAF74710 97,1 94,3 94,3 95,7 94,3 95,7 98,6 97,1 97,1 97,1 94,3 80,0 85,7
    9. AAF04917 97,1 94,3 94,3 95,7 94,3 95,7 98,6 100,0 94,3 94,3 94,3 77,1 82,9
    10. AAQ14332 97,1 94,3 94,3 95,7 94,3 95,7 97,1 98,6 98,6 94,3 95,7 81,4 85,7
    11. AAY90122 95,7 95,7 95,7 97,1 95,7 97,1 98,6 98,6 98,6 97,1 92,9 78,6 84,3
    12. ABD65632 97,1 94,3 94,3 94,3 95,7 95,7 97,1 97,1 97,1 97,1 97,1 80,0 87,1
    13. ABK94979 90,0 88,6 88,6 88,6 92,9 88,6 87,1 88,6 88,6 88,6 90,0 90,0 71,4
    14. EDQ81347 91,4 91,4 91,4 91,4 91,4 92,9 94,3 92,9 92,9 92,9 92,9 95,7 87,1
  • Die Prozent Identität zwischen den STO-Polypeptid-Sequenzen, die sich bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen, kann nur 15% Aminosäure-Identität im Vergleich zu SEQ ID NO: 2 (Os04g0540200) betragen. Tabelle B3: MatGAT-Ergebnisse für die Gesamtähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenz zwischen Reis-STO-Proteinen.
    1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
    1. Os04g0540200 29,4 32,3 63,1 33,8 28 29,2 39,3 28 37,2
    2. Os01g0202500 39,5 27,1 27,4 26,5 50,1 39,1 28,6 17,9 30,9
    3. Os02g0606200 49,1 38,4 30,3 61,2 26,4 29,6 31,8 26,6 29,6
    4. Os02g0646200 71,7 39,8 45,8 30,5 27 29,1 41,1 25,3 33,3
    5. Os04g0493000 48,2 37,5 71,6 43,9 28,2 30,4 34,6 25,7 31,7
    6. Os05g0204600 36,2 63 36,2 36 36 37,9 26,2 17,6 29,4
    7. Os06g0152200 40 54,4 42,5 39,2 40,3 54,2 28,8 21,1 28
    8. Os06g0713000 52,3 39,8 43,8 51,9 45,5 37 41,4 21,4 29,9
    9. Os09g0527900 39,2 27,5 34,3 35,3 41,6 25,7 30,3 32,5 25,1
    10. Os12g0209200 46,8 37,8 42,4 44,6 43,6 34,1 36,1 38,6 38,4
    Tabelle B4: MatGAT Ergebnisse für die Gesamtähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenz zwischen orthologen Sequenzen to SEQ ID NO: 2
    1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
    1. AT1G06040_Spleißvariante1 68,5 29,5 32 69,2 29,1 31,5 31,6 58,9 59,7 32,3 30 62,5
    2. AT1G06040_Spleißvariante2 69 26,2 30,1 47,4 38,3 30,6 32,9 49,4 49,8 30 39,3 48,6
    3. AT1G75540 43,2 35,6 29,5 28,4 23,4 35,6 32,3 30,5 30,2 51,5 25,5 29
    4. AT1G78600 48,2 40,1 45,9 32,1 28,2 29,7 28,9 32,1 32,1 30,9 30,5 30,6
    5. AT2G31380 82,7 60,9 40,5 44,5 29,5 34,6 32,6 58,2 58,2 32,2 29,6 58,3
    6. AT4G10240 41,9 57,6 32,9 36,5 42 30 31 31,4 29,3 23,8 39,9 30,3
    7. AT4G39070 50,4 43 47,7 43,5 48,3 40,9 46,8 30 30,4 38,7 29,6 30,9
    8. MS_ABO84497 49,2 49,1 46,5 41,8 49,2 44,6 60,7 32,6 30,8 37,5 35,1 30,6
    9. LE_AAS67368 69,4 57,1 41,4 45,2 70,6 45,9 47,1 51,9 98,3 33,4 33,2 65,8
    10. ST_ABA40448.1 69,8 57,1 40,8 45,5 71 45,1 47,1 48,5 99,1 33,1 32,8 66,7
    11. PP_STO 43,5 37,1 65,3 43,5 42,6 33,9 50,3 53,2 46,1 46,1 27,3 30,8
    12. VV-CAN72879.1 45,6 53,2 35,6 45,2 49,2 54,6 44,2 47,3 49,8 48,9 37,1 30,9
    13. GM_ABB29467 74,6 57,1 40,2 44,1 73,5 43,7 45 50 76,5 76,5 42,3 45,4
  • Die Prozent Identität zwischen den UGE-Polypeptid-Sequenzen, die sich bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen, kann nur 15% Aminosäure-Identität im Vergleich zu SEQ ID NO: 222 betragen. Tabelle B5: MatGAT Ergebnisse für die Gesamtähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen, die UGE-Isoformen in Reis veranschaulichen.
    UGE-Protein Name 1 2 3 4 5 6 7 8
    1. Os04g0618200 36,7 74,3 35,9 37 21,4 36,5 36,7
    2. Os05g0595100 51,7 36,2 65,8 72,2 21,1 58,6 99,7
    3. Os07g0139400 81,7 50,6 34,7 34,8 21,5 33,7 36
    4. Os08g0374800 51 75,7 50,6 74,4 21,7 53,4 65,8
    5. Os09g0323000 51,9 82,4 49,6 82,1 22,6 56,3 72,8
    6. Os09g0504000 36,7 33,1 38,8 34,5 35,7 21,4 21,6
    7. Os09g0526700 51,4 74 48,2 67,6 72,9 34,5 58,6
    8. OS_UGE2 51,7 100 50,6 75,5 82,9 33,5 73,5
    Tabelle B6: MatGAT Ergebnisse für die Gesamtähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen, die UGE-Isoformen veranschaulichen, die aus verschiedenen Organismen stammen.
    UGE-Protein Name 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
    1. AT1G12780_UGE 90,6 63,3 .4,6 .4,3 33,9 33,1 32,9 43,6 65,8 54,3 33,1 33,5 24,5 59,6 47,7 65,1
    2. AT1G63180_UGE 95,4 62,1 63,8 63,5 32,7 31,8 32,1 42,7 65,5 53,7 32 33,1 24 60,1 49,1 65,4
    3. AT1G64440_UGE 78,3 77,5 79,2 79,4 37,6 34,6 34,2 32,3 79,6 64,6 34,4 33,9 26,9 59,9 49,3 74,9
    4. AT4G10960_UGE 81,5 80,1 88 88,3 37,4 34,9 34,6 31 81,2 64,6 34,7 35,9 28,3 64,2 50,3 76,4
    5. AT4G23920_UGE 80,1 77,8 88 92,9 37,1 35,3 34,8 31,3 83,1 65,9 35,3 35,6 28,5 62,4 50,4 75,8
    6. Pt_Icl|scaff_XVI.140 53,2 51,3 55 54,5 54 75,3 82,7 21,1 36,8 32,9 73,2 22,5 19,6 36,1 35,2 36,1
    7. Pt_Icl|scaff_XI.1329 49,4 47,5 51,1 49,2 49,2 81,5 76,2 18,9 34,7 31 94,5 21,1 19,9 33,3 33,1 34,3
    8. Pt_Icl|scaff_VI.203 49,5 48 50 50,2 48,8 87,6 85,9 20,4 34,9 32,2 75,5 22 19,4 34,2 33 34,3
    9. Pt_Icl|scaff_III.961 47,9 46,4 42 41,9 42,6 33,3 30,9 31,7 33,1 29,9 19,6 18,2 15,2 30 25,4 31,8
    10. Pt_Icl|scaff_III.1133 79,8 78,3 88,2 90,3 90,3 52,9 48,7 47,8 43,4 73,1 34,4 34,7 27,2 62,5 50 78,2
    11. Pt_Icl|scaff_I.773 69,2 68,7 76,1 76,1 77,4 49,2 44,1 45,9 41,9 80,5 30,8 28,6 23,7 52 41,8 62,5
    12. Pt_Icl|scaff_I.2996 49,4 47,5 50,8 49,4 48,9 80,6 97,1 85,1 30,9 48,2 44,1 20,8 19,4 33,3 32,4 34
    13. Pt_Icl|scaff_5422 45 44,5 45,8 48,1 47,3 39,3 38,4 39,5 25 46,4 40,1 38,2 32,5 35,5 32,9 35
    14. Ot08g015500 34,9 34,5 35,5 37,1 36,8 28,9 29,8 29,8 20 36,3 32,2 29,8 45,8 26,2 24,5 26,9
    15. SC_GAL10_P04397 77,8 76,4 73,6 75,6 75,3 52,1 47 47,3 40,9 73,9 65,1 47,2 48,7 34,6 47,3 61,7
    UGE-Protein Name 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
    16. Ec_GALE_AAO37702 67,5 67,8 65,5 66,7 67,4 51,1 46,5 46,1 39,5 67,5 61,9 46,3 44,5 34,2 63,6 50
    17. OS_UGE2 80,2 79,9 83,9 87,3 86,7 55,6 50,6 50,2 42,1 87,6 74,3 50,4 45 37,5 73,2 67,8
  • Eine MATGAT Tabelle für lokales Alignment einer spezifischen Domäne oder Daten in Bezug auf % Identität/Ähnlichkeit zwischen spezifischen Domänen kann ebenfalls für die anderen erfindungsgemäßen Polypeptide (oder ein Teil davon) erzeugt werden.
  • Beispiel 4: Identifikation von Domänen in Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind
  • Bei der Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites (InterPro) Datenbank handelt es sich um eine integrierte Plattform für die häufig verwendeten Signatur-Datenbanken für Suchen auf Text- und Sequenzbasis. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, in denen unterschiedliche Methodiken und verschiedene Mengen an biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwendet werden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu den angeschlossenen Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Pfam ist eine große Sammlung multipler Sequenzalignments und versteckter Markov-Modelle, die viele gemeinsame Proteindomänen und Familien abdecken. Pfam wird am Sanger Institute Server im Vereinigten Königreich gehostet. InterPro wird von dem European Bioinformatics Institute im Vereinigten Königreich gehostet.
  • Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 sind in der Tabelle C1 angegeben. Die nachgewiesenen Domänen werden in die Interpro-Familien IPR001092 (Basische Helix-Loop-Helix Dimerisierungsregion bHLH) und IPR001092 (Basische Helix-Loop-Helix Dimerisierungsregion bHLH) eingeordnet. Tabelle C1: InterPro-Scan Ergebnisse (Haupt-Zugangsnummern) der Polypeptidsequenz nach SEQ ID NO: 2.
    Datenbank Zugangsnummer Zugangsname Aminosäurekoordinaten auf SEQ ID NO 2
    HMMPfam PF00010 HLH 449–498
    ProfileScan PS50888 HLH 438–498
    Superfamilie SSF47459 HLH_basic 451–522
  • Die Proteinsequenzen, die GRP (RrmJ/FtsJ-Polypeptid) veranschaulichen, werden als Abfragesequenz zum Durchsuchen der InterPro-Datenbank verwendet. Die GRP-Polypeptide, die sich bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen, haben eine ribosomale RNA-Methyltransferase RrmJ/FtsJ-Domäne (InterPro Einträge IPR002877 und IPR015507; Pfam Eintrag PF01728; PANTHER Eintrag PTHR10920).
  • Die GRP Polypeptid-(bHLH4 Polypeptid-)-Sequenzen werden als Abfragesequenz zum Durchsuchen der InterPro-Datenbank verwendet. Die GRP-Polypeptide, die sich bei den erfindungsgemäßen Verfahren eignen, stimmen mit zwei InterPro Einträgen überein: (i) IPR001092 basische Helix-Loop-Helix Dimerisierungsregion bHLH; und (ii) IPR011598 Helix-Loop-Helix DNA-Bindung. Tabelle C2:
    InterPro Zugangsnummer Integrierte Datenbank Name Integrierte Datenbank Zugangsnummer Integrierte Datenbank Zugangsname
    IPR001092 Basische Helix-Loop-Helix Dimerisierungsregion bHLH Pfam PF00010 HLH
    IPR001092 Basische Helix-Loop-Helix Dimerisierungsregion bHLH SMART SM00353 HLH
    IPR001092 Basische Helix-Loop-Helix Dimerisierungsregion bHLH Prosite PS50888 HLH
    IPR011598 Helix-Loop-Helix DNA-Bindung SSF47459 HLH_basic
    unintegriert Panther PTHR12565
    Panther PTHR12565 SF7
  • Die GRP Polypeptid-(IPT-Polypeptid-)-Sequenzen werden als Abfragesequenz zum Durchsuchen der InterPro-Datenbank verwendet. Die GRP-Polypeptide, die sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen, stimmen mit den folgenden InterPro Einträgen überein: (i) IPR002627; und (ii) IPR011593, wie in der nachstehenden Tabelle gezeigt: Table C3:
    InterPro Zugangsnummer Integrierte Datenbank Name Integrierte Datenbank Zugangsnummer Integrierte Datenbank Zugangsname
    IPR002627 Familie tRNA Isopentenyltransferase ProDom PD004674 Q6GHD2_STAAR_Q6GH D2
    Panther PTHR11088 TRNA DELTA(2)-ISOPENTENYLPYROPHOSPHATTRANSFERASE-VERWANDT
    Pfam PF01715 IPPT
    IPR011593 Domäne Isopentenyl transferase-ähnlich ProDom PD005388 Q9CA35_ARATH_Q9CA35
    Nicht IPR integriert Panther PTHR11088:SF20 CYTOKININSYNTHASE
  • Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz nach SEQ ID NO: 166 sind in der Tabelle C4 angegeben. Tabelle C4: InterPro-Scan Ergebnisse (Haupt-Zugangsnummern) der Polypeptidsequenz nach SEQ ID NO: 166.
    Interpro-Hit Zugangsnummer Zugangsnummer Name Zugangsnummer Aminosäure koordinaten der B-box1 Domäne E-Wert Aminosäure koordinaten der B-box1 Domäne E-Wert
    IPR000315 PFAM PF00643 zf-B_box [1–47] 1.20E-10 [58–105] 8.00E-12
    SMART SM00336 BBOX [1–47] 3.00E-11 [58–105] 4.80E-13
    PROFILE PS50119 ZF_BBOX [1–47] 9.84 [58–105] 10.04
    Tabelle C5: HMMs Aufbau-Parameter für die B-Box-Domäne in pfam.
    Pfam_Is [Download HMM] Pfam_fs [Download HMM]
    Gathering cutoff 15.3 15.3; 21.0 21.0
    Trusted cutoff 15.5 15.5; 21.0 21.0
    Noise cutoff 15.2 15.2; 20.8 20.8
    Aufbauverfahren von hmmbuild-FHMM_Is SEED hmmbuild-f-FHMM_fs SEED
    HMM hmmcalibrate-seed 0 HMM_Is hmmcalibrate-seed 0 HMM_fs
  • Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz nach SEQ ID NO: 222 sind in Tabelle C6 angegeben. Tabelle C6: InterPro-Scan Ergebnisse (Haupt-Zugangsnummern) der Polypeptidsequenz nach SEQ ID NO: 222.
    Datenbank Zugangsnummer Zugangsname Aminosäurekoordinaten bei SEQ ID NO 2 e-Wert
    INTERPRO IPR001509 NAD-abhängige Epimerase/Dehydratase [9–273] 4.20E-74
    PFAM PF01370 Epimerase [9–273] 4.20E-74
  • Beispiel 5: Topologie-Vorhersage der Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind
  • TargetP 1.1 bestimmt die subzelluläre Lokalisierung eukaryotischer Proteine. Die Zuordnung der Lokalisierung beruht auf der vorhergesagten Anwesenheit von einer der N-terminalen Präsequenzen: Chloroplasten-Transitpeptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Signalpeptid (SP) des sekretorischen Wegs. Die Werte, auf denen die endgültige Vorhersage beruht, sind keine echten Wahrscheinlichkeiten, und sie tragen auch nicht notwendigerweise zu einer bei. Die Lokalisierung mit dem höchsten Wert ist gemäß TargetP jedoch am wahrscheinlichsten, und das Verhältnis zwischen den Werten (die Verlässlichkeitsklasse) kann ein Anzeichen dafür sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Verlässlichkeitsklasse (RC) reicht von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage angibt. TargetP wird auf dem Server der Technischen Universität Dänemark gehalten.
  • Für die Sequenzen, die den Vorhersagen entsprechend eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann auch eine potentielle Spaltstelle vorhergesagt werden.
  • Es wurde eine Anzahl Parameter ausgewählt, wie Organismus-Gruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze), Ausschlussgrenz-Sätze (kein, vordefinierte Ausschlussgrenz-Sätze, oder verwenderspezifische Ausschlussgrenz-Sätze), und die Berechnung der Vorhersage der Spaltstellen (Ja oder Nein).
  • Die Ergebnisse der TargetP 1.1-Analyse der Polypeptidsequenz, wie sie durch SEQ ID NO: 2 veranschaulicht ist, sind in der Tabelle D veranschaulicht. Es wurde die Organismus-Gruppe ”Pflanze” gewählt, es wurden keine Ausschlussgrenzen definiert, und die vorhergesagte Länge des Transitpeptids abgefragt. Die subzelluläre Lokalisierung der Polypeptidsequenz nach SEQ ID NO: 2 kann das Cytoplasma oder der Kern sein, es wurde kein Transitpeptid vorhergesagt. Tabelle D1: TargetP 1.1 Analyse der Polypeptidsequenz nach SEQ ID NO: 2
    Länge (AA) 623
    Chloroplasten-Transitpeptid 0,155
    Mitochondriales Transitpeptid 0,143
    Signalpeptid des sekretorischen Wegs 0,099
    Anderes subzelluläres Ziel 0,816
    Vorhergesagte Lokalisierung /
    Verlässlichkeitsklasse 2
    Vorhergesagte Länge des Transitpeptids /
  • Nach der Analyse mit dem PredictNLS-Algorithmus, wird für SEQ ID NO: 2 eine Kernlokalisierung mit einer Wahrscheinlichkeit von 98% vorhergesagt:
    NLS Von Bis Signal Typ
    [KR][KR]x[KR][KR][KR]x[KR][KR] 433 441 KRPKKRGRK möglich
    NumWithNLS %NucProt
    54 98.14
  • Zur Durchführung solcher Analysen können viele andere Algorithmen verwendet werden, wie u. a.:
    • • ChloroP 1.1, das auf dem Server der Technischen Universität Dänemark gehostet wird;
    • • Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, das auf dem Server des Instituts für Molekulare Biowissenschaft, Universität Queensland, Brisbane, Australien, gehostet wird;
    • • PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, das auf dem Server der Universität von Alberts, Edmonton, Alberts, Canada gehostet wird;
    • • TMHMM, das auf dem Server der Technischen Universität Dänemark gehostet wird
  • Die Proteinsequenzen, die GRP veranschaulichen, werden zum Abfragen von TargetP 1.1 verwendet. Es wurde die Organismus-Gruppe ”Pflanze” gewählt, es wurden keine Ausschlussgrenzen definiert, und die vorhergesagte Länge des Transitpeptids abgefragt.
  • Die Ergebnisse der TargetP 1.1-Analyse der Polypeptidsequenz, wie sie durch SEQ ID NO: 225 veranschaulicht ist, sind in der Tabelle D veranschaulicht. Es wurde die Organismus-Gruppe ”Pflanze” gewählt, es wurden keine Ausschlussgrenzen definiert, und die vorhergesagte Länge des Transitpeptids abgefragt. Die Polypeptidsequenz nach SEQ ID NO: 225 kann durch den sekretorischen Weg zu ihrer endgültigen subzellulären Lokalisierung geschleust werden. Tabelle D2: TargetP 1.1 Analyse der Polypeptidsequenz nach SEQ ID NO: 222
    Länge (AA) 354
    Chloroplasten-Transitpeptid /
    Mitochondriales Transitpeptid 0,218
    Signalpeptid des sekretorischen Wegs 0,451
    Anderes subzelluläres Ziel 0,268
    Vorhergesagte Lokalisierung S*
    Verlässlichkeitsklasse 5
    Vorhergesagte Länge des Transitpeptids /
    • *S: sekretorischer Weg.
  • Beispiel 6: Funktioneller Test für das bHLH6-ähnliche Polypeptid
  • Ein DNA-Bindungstest für AtbHLH6 ist in Dombrecht et al. (2007) angegeben. Kurz gesagt wurde ein 1000-bp Fragment der AtbHLH6 kodierenden Sequenz, die die Codons 285 bis 623 umfasst, aus der genomischen DNA amplifiziert und in den NheI-BamHI-gespaltenen pTacLCELD6·His Vektor kloniert (Xue, Plant J. 41, 638–649, 2005). Das resultierende Konstrukt kodierte die letzten 338 Aminosäuren von AtbHLH6 (einschließlich der bHLH-Region) im Leseraster mit dem Reporterprotein CeID und einem 6 × His-Tag. Die korrekte Amplifikation und Klonierung wurden durch DNA-Sequenzierung verifiziert.
  • Die Bestimmung der Konsensussequenz des MYC2-DNA-Bindungsmotivs und die relative Bindungsaffinität dieser Stellen erfolgte gemäß Xue (2005), wobei eine Fusion eines DNA-Bindungsproteins (DBP) an 6 × His-tagged Cellulase D (CELD) sowohl als Mittel für eine Affinitätsreinigung des DBP-DNA Komplexes bei der Auswahl der Bindungsstellen aus einem Pool biotinylierter Oligonukleotide mit statistischer Sequenz als auch als Reporter zur Messung der DNA-Bindungsaktivität dienen kann. Zur Auswahl der Bindungsstellen mittels Cellulosepapier als Affinitätsmatrix wurde DBD-CELD bei Raumtemperatur für 1 Std. mit 20 ng eines Biotin-markierten Bio-RS-Oligo in 40 μl Bindungs-/Waschpuffer (oben beschrieben) mit 1 mM EDTA, 0,25 μg μl–1 poly d(AC-TG), 1 mg ml–1 BSA und 10% Glycerin inkubiert. Bei einer geeigneten Menge rohes DPD-GELD, das zur Selektion von Bindungsstellen verwendet wurde, wurden 20 bis 30% relative Cellulose-Bindungseffizienz (Prozent Cellulose-Aktivität, die nach dem Waschen an Cellullose band) erzielt. DBP-CELD/Bio-RS-Oligo Gemische wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen überführt, welche Whatman 1 Filterpapier (4 mm2) enthielten, das mit 10 μl Blockierungslösung [Bindungs-/Waschpuffer mit 0,5 μg μl–1 poly d(AC-TG) und 10% Glycerin] vorgetränkt wurde. Nach der Inkubation bei 0°C für 1 Std. unter leichtem Schütteln, wurde das Cellulosepapier sechsmal mit Bindungs-/Waschpuffer mit 1 mM EDTA und 0,1 mg ml–1 BSA gemischt. Die Verwendung von ausgiebigem Waschen bei der Auswahl der Zielstelle beruhte auf Beobachtungen der relativ hohen Stabilität des auf der festen Matrix immobilisierten DBP-Oligonukleotid-Komplexes. DBP-CELD tragende Ziel-Bindungsstellen wurden bei 40°C für 15 min mit 40 μl Cellulase-Elutionspuffer [10 mM HEPES, pH-Wert 7, 50 mM KCl, 0,2 mM EDTA, 4 mM Cellobiose, 0,05 mg ml–1 BSA und 10 μg ml–1 eines sense-sequenzspezifischen Primers SP-S] eluiert. Das Eluat wurde zur PCR- Amplifikation ausgewählter Oligonukleotide verwendet. Das PCR-Produkt (0,1 μl) ohne Reinigung wurde in der nächsten Runde der Stellenselektion verwendet.
  • Alternativ wurde 6·His tagged DBP-CELD (10–25 μg rohes Protein) in 60 μl PNT-Puffer (50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 8,0, 300 mM NaCl und 0,05% Tween 20) mit 10 mM Imidazol und 350 μg Ni-NTA Magnetagaroseperlen (Qiagen) bei Raumtemperatur für 45–60 min unter leichtem Schütteln in einem Mikro-Röhrchen-Mischer (Tomy Seiko Co., Tokyo, Japan) inkubiert. Die Ni-NTA Magnetperlen wurden auf der Seite der Röhrchen gesammelt, indem die Röhrchen in einem Magnet für 12 Röhrchen (Qiagen) untergebracht wurden. Ungebundene Proteine wurden durch zweimaliges Waschen mit 150–200 μl PNT mit 20 mM Imidazol und einmal mit 60 μl Bindungs-/Waschpuffer mit 2 mM MgCl2, 1 mg ml–1 BSA und 10% Glycerin entfernt. Die gewaschenen Perlen wurden in 40 μl of Bindungs-/Waschpuffer mit 2 mM MgCl2, 0,25 μg μl–1 poly d(AC-TG), 1 mg ml–1 BSA, 0,0025% Nonidet P-40, 10% Glycerin und biotinmarkierten Oligonukleotiden (50 ng Bio-RS-Oligo oder 1 μl PCR-Produkt, das aus vorher ausgewählten Oligonukleotiden amplifiziert wurde) resuspendiert. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur für 1,5 Std. unter leichtem Schütteln in dem Mikro-Röhrchen-Mischer inkubiert. Nach viermaligem Waschen (3–4 min bei jedem Waschvorgang) mit 150–200 μl Bindungs-/Waschpuffer mit 2 mM MgCl2, 0,1 mg ml–1 BSA und 0,0025% Nonidet P-40, wurden die Perlen, die das an der Zielstelle gebundene BDP-CELD tragen, in 8 μl 5 mM Tris-Cl (pH-Wert 8,0)/0,5 mM EDTA mit 5 μg ml–1 eines sense-sequenzspezifischen Primers (SP-S) resuspendiert, und die Suspension wurde in ein sauberes Röhrchen überführt und für die PCR-Amplifikation ausgewählter Oligonukleotide verwendet. Das PCR-Produkt (1 μl) wurde ohne Reinigung in der nächsten Runde der Stellenselektion verwendet.
  • Für EMSA Tests wurden 6·His-tagged DBP-CELD Proteine mit Ni-NTA Magnetagaroseperlen mit einem hochstringenten Bindungspuffer (50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 8,0, 1 M NaCl, 10% Glycerin, 1% Tween 20 und 10 mM Imidazol) gereinigt, und der Rest des Verfahrens folgte den Herstellangaben. Doppelsträngige synthetische Oligonukleotide (30–45 fmol), markiert mit Digoxigenin am 3'-Ende, wurde mit einem gereinigten DBP (30–75 ng) in 15 μl Bindungspuffer [25 mM HEPES/KOH, pH-Wert 7,0, 50 mM KCl, 0,5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 0,2 μg μl–1 poly d(AC-TG), 0,3 mg ml–1 BSA und 10% Glycerin] inkubiert. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur für 30 min, wurden die DBP/DNA-Komplexe von freien Sonden auf einem 6% Polyacrylamidgel in einem 40-mM Tris-Acetat-Puffer (pH-Wert 7,5) mit 5 mM Na-Acetat, 0,5 mM EDTA und 5% Glycerin getrennt. Die DBP/DNA-Komplexe und die freien Sonden in den Gelen nach der Elektrophorese wurden auf eine Hybond Np-Membran überführt. Alkalische Phosphatase-konjugierter Anti-Digoxigenin-Antikörper und ein chemilumineszierendes Substrat, CDP-Star (Roche Diagnostics) wurde zum Nachweisen von Digoxigenin gemäß den Herstellerangaben verwendet.
  • Weitere Einzelheiten sind in Xue (2005) angegeben.
  • Beispiel 7: Klonierung der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenz
  • Die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Nukleinsäuresequenz wurde durch PCR mit einer speziell angefertigten cDNA-Bank von Arabidopsis thaliana Keimlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, UK) als Matrize amplifiziert. Die PCR wurde mit Hifi Taq DNA-Polymerase in Standardbedingungen, mit 200 ng Matrize in einem 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren prm06515 (SEQ ID NO: 10; Sense, Start-Codon in fett):
    Figure 02120001
    und prm06516 (SEQ ID NO: 11; revers, komplementär):
    Figure 02120002
    die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination enthalten. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls mit Standardverfahren gereinigt. Der erste Schritt des Gateway-Verfahrens, die BP-Reaktion, wurde dann durchgeführt, bei der das PCR-Fragment in vivo mit dem Plasmid pDONR201 unter Bildung eines pbHLH6-ähnlichen – gemäß Gateway-Teminologie – ”entry clone” rekombinierte. Das Plasmid pDONR201 wurde käuflich von Invitrogen als Bestandteil der Gateway® Technik erworben.
  • Der SEQ ID NO: 1 enthaltende ”entry clone” wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor, der für die Transformation von Oryza sativa verwendet wird, verwendet. Dieser Vektor enthält als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Grenzen: einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette, und eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein GOS2-Promotor aus Reis (SEQ ID NO: 12) für die konstitutive Expression befand sich stromaufwärts dieser Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pGOS2::bHLH6-ähnlich (3) nach fachbekannten Methoden in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
  • Beispiel 8: Pflanzentransformation
  • Reistransformation
  • Agrobacterium, das den Expressionsvektor enthielt, wurde zur Transformation von Oryza-sativa-Pflanzen verwendet. Reife trockene Samen der japonica-Reissorte Nipponbare wurden entspelzt. Die Sterilisation erfolgte durch einminütiges Inkubieren in 70%igem Ethanol und anschließend 30 Minuten in 0,2% HgCl2, wonach 6 mal je 15 Minuten mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen wurde. Anschließend wurden die sterilen Samen auf einem Medium, das 2,4-D (Kallusinduktionsmedium) enthielt, zur Keimung gebracht. Nach vierwöchiger Inkubation im Dunkeln wurden embryogene, von Scutellum stammende Kalli herauspräpariert und auf dem gleichen Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Kalli durch Subkultur auf dem gleichen Medium für weitere 2 Wochen vervielfacht oder vermehrt. Embryogene Kallusstückchen wurden auf frischem Medium 3 Tage vor der Cokultivierung subkultiviert (um die Zellteilungsaktivität zu fördern).
  • Für die Cokultivierung verwendete man den Agrobacterium-Stamm LBA4404. Agrobacterium wurde auf AB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika überimpft und 3 Tage bei 28°C kultiviert. Anschließend wurden die Bakterien gewonnen und bis zum Erreichen einer Dichte (OD600) von ungefähr 1 in flüssigem Cokultivierungsmedium suspendiert. Anschließend wurde die Suspension in eine Petrischale überführt, und die Kalli wurden 15 Minuten in der Suspension eingetaucht. Dann wurden die Kallusgewebe auf einem Papierfilter trocken getupft und auf ein verfestigtes Cokultivierungsmedium umgesetzt und 3 Tage im Dunkeln bei 25°C inkubiert. Die cokultivierten Kalli wurden 4 Wochen im Dunkeln bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels auf 2,4-D-haltigem Medium herangezogen. Während dieses Zeitraums entwickelten sich rasch wachsende resistente Kallusinseln. Nach dem Umsetzen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation im Hellen wurde das embryogene Potential freigesetzt, und in den nächsten 4 bis 5 Wochen entwickelten sich Sprosse. Die Sprosse wurden von den Kalli herauspräpariert und 2 bis 3 Wochen lang auf auxinhaltigem Medium inkubiert, von dem sie in Erde umgesetzt wurden. Abgehärtete Sprosse wurden im Gewächshaus unter hoher Feuchtigkeit und im Kurztag herangezogen.
  • Pro Konstrukt wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Überprüfung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wurden nur transgene Ein-Kopien-Pflanzen mit Toleranz für die Selektionsmittel zurückbehalten, um T1-Samen zu ernten. Die Samen wurden dann 3 bis 5 Monate nach dem Umsetzen geerntet. Das Verfahren ergab Ein-Locus-Transformanten mit einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al., 1993, Hiei et al., 1994).
  • Maistransformation
  • Die Transformation von Mais (Zea mays) erfolgt durch eine Modifikation des von Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14 (6): 745–50 beschriebenen Verfahrens. Die Transformation in Mais ist genotypabhängig und nur spezifische Genotypen sind für eine Transformation und Regeneration zugänglich. Die Inzuchtlinie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als einem Elter sind gute Quellen für Donormaterial für die Transformation, aber es können auch andere Genotypen erfolgreich verwendet werden. Die Ähren werden von Maispflanzen etwa 11 Tage nach der Bestäubung (days after pollination, DAP) geerntet, wenn die Länge des unreifen Embryos etwa 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens cokultiviert, das den Expressionsvektor enthält, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Herauspräparierte Embryonen werden auf Kallusinduktionsmedium, dann auf Mais-Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel (zum Beispiel Imidazolinon, aber es können verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) enthält, herangezogen. Die Petrischalen werden im Hellen bei 25°C für 2–3 Wochen oder, bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Mais-Wurzelmedium überführt und bei 25°C für 2–3 Wochen inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden dann auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Weizentransformation
  • Die Transformation von Weizen erfolgt mit dem von Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14 (6): 745–50 beschriebenen Verfahren. Die Sorte Bobwhite (von CIMMYT, Mexico, erhältlich) wird üblicherweise zur Transformation verwendet. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens cokultiviert, das den Expressionsvektor enthält, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Nach der Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen in vitro auf Kallusinduktionsmedium, dann auf Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel (zum Beispiel Imidazolinon, aber es können verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) enthält, herangezogen. Die Petrischalen werden im Hellen bei 25°C für 2–3 Wochen oder, bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Wurzelmedium überführt und bei 25°C für 2–3 Wochen inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden dann auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Sojabohnentransformation
  • Sojabohne wird gemäß einer Modifikation des Verfahrens, das im Texas A & M-Patent US 5,164,310 beschrieben ist, transformiert. Es sind mehrere im Handel erhältliche Sojabohnen-Sorten für die Transformation durch dieses Verfahren zugänglich. Die (von der Illinois Seed Foundation erhältliche) Sorte Jack wird üblicherweise für die Transformation verwendet. Sojabohnensamen werden für die In-vitro-Aussaat sterilisiert. Das Hypokotyl, die Keimwurzel und ein Keimblatt werden von jungen, 7 Tage alten Keimlingen präpariert. Das Epikotyl und das verbleibende Keimblatt werden weiter gezüchtet, damit sich Achselknoten entwickeln. Diese Achselknoten werden herauspräpariert und mit Agrobacterium tumefaciens, das den Expressionsvektor enthält, inkubiert. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und auf Selektionsmedien umgesetzt. Regenerierte Sprosse werden herauspräpariert und auf Sprossverlängerungsmedium umgesetzt. Sprosse mit nicht mehr als 1 cm Länge werden auf Wurzelmedium umgesetzt, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Raps-/Canolatransformation
  • Keimblattpetiolen und -hypokotyle von 5–6 Tage alten jungen Keimlingen werden als Explantate für die Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183–188) transformiert. Die im Handel erhältliche Sorte Westar (Agriculture Canada) ist die für die Transformation eingesetzte Standardsorte, aber es können auch andere Sorten verwendet werden. Canolasamen werden für die In-vitro-Aussaat oberflächensterilisiert. Die Kotyledonenpetiolenexplantate mit dem daran befindlichen Keimblatt werden aus den In-vitro-Keimlingen herauspräpariert und mit Agrobacterium (das den Expressionsvektor enthält) beimpft, indem das abgeschnittene Ende des Petiolenexplantats in die Bakterienlösung getaucht wird. Die Explantate werden dann für 2 Tage auf MSBAP-3-Medium, das 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar enthält, bei 23°C, 16 Std. Licht gezüchtet. Nach zweitägiger Cokultur mit Agrobacterium werden die Petiolenexplantate für 7 Tage auf MSBAP-3-Medium umgesetzt, das 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l) enthält, und dann auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration gezüchtet. Wenn die Sprosse eine Länge von 5–10 mm haben, werden sie abgeschnitten und auf Sprossverlängerungsmedium (MSBAP-0,5 mit 0,5 mg/l BAP) umgesetzt. Sprosse mit einer Länge von etwa 2 cm werden für die Wurzelinduktion auf Wurzelmedium (MS0) umgesetzt. Die bewurzelten Sprosse werden auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Alfalfatransformation
  • Ein regenerierender Alfalfa-(Medicago sativa-)Klon wird unter Verwendung des Verfahrens von (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Alfalfa ist genotypabhängig und daher wird eine regenerierende Pflanze benötigt. Verfahren zur Gewinnung regenerierender Pflanzen sind beschrieben. Diese können zum Beispiel von der Sorte Rangelander (Agriculture Canada) oder jeder anderen im Handel erhältlichen Alfalfa-Sorte wie von Brown DCW und A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) beschrieben erhalten werden. Alternativ hat man die Sorte RA3 (University of Wisconsin) für die Verwendung bei der Gewebekultur ausgewählt (Walker et al., 1978 Am J Bot 65: 654–659). Petiolenexplantate werden mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839–847) oder LBA4404, die den Expressionsvektor enthalten, cokultiviert. Die Explantate werden für 3 Tage im Dunkeln auf SH-Induktionsmedium, das 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K2SO4 und 100 μm Acetosyringinon enthält, gezüchtet. Die Explantate werden in Murashige-Skoog-Medium (Murashige and Skoog, 1962) der halben Stärke gewaschen und auf demselben SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon, aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum für die Hemmung des Agrobacterium-Wachstums herangezogen. Nach mehreren Wochen werden somatische Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium umgesetzt, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika und 50 g/l Saccharose enthält. Die somatischen Embryonen lässt man anschließend auf Murashige-Skoog-Medium der halben Stärke keimen. Bewurzelte Keimlinge werden in Töpfe umgesetzt und im Gewächshaus herangezogen. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Baumwolltransformation
  • Baumwolle wird mit Agrobacterium tumefaciens gemäß dem in US 5,159,135 beschriebenen Verfahren transformiert. Baumwollsamen werden in 3% Natriumhypochlorit-Lösung für 20 Minuten oberflächensterilisiert und in destilliertem Wasser mit 500 μg/ml Cefotaxim gewaschen. Die Samen werden dann in SH-Medium mit 50 μg/ml Benomyl zur Keimung überführt. Die Hypokotylen von 4 bis 6 Tage alten Keimlingen werden entnommen, in 0,5 cm Stücke geschnitten und auf 0,8% Agar untergebracht. Eine Agrobacterium-Suspension (etwa 108 Zellen pro ml, verdünnt aus einer Übernachtkultur, die mit dem interessierenden Gen und geeigneten Selektionsmarkern transformiert war) wird zum Beimpfen der Hypokotyl-Explantate verwendet. Nach 3 Tagen bei Raumtemperatur und Belichtung werden die Gewebe auf ein festes Medium (1,6 g/l Gelrite) mit Murashige und Skoog-Salzen mit B5 Vitaminen (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50: 151–158 (1968)), 0,1 mg/l 2,4-D, 0,1 mg/l 6-Furfurylaminopurin und 750 μg/ml MgCl2, und mit 50 bis 100 μg/ml Cefotaxim und 400–500 μg/ml Carbenicillin zum Abtöten restlicher Bakterien überführt. Einzelne Zelllinien werden nach 2 bis 3 Monaten isoliert (unter Erstellung von Subkulturen alle 4 bis 6 Wochen) und werden weiter auf Selektionsmedium zur Gewebeamplifikation (30°C, 16 Std. Photoperiode) kultiviert. Die transformierten Gewebe werden anschließend weiter auf Nicht-Selektionsmedium für 2 bis 3 Monate kultiviert, so dass somatische Embryonen erhalten wurden. Gesund aussehende Embryonen mit mindestens 4 mm Länge werden dann in Röhrchen mit SH-Medium in feinem Vermiculit, angereichert mit 0,1 mg/l Indolessigsäure, 6 Furfurylaminopurin und Gibberelinsäure, überführt. Die Embryonen werden bei 30°C mit einer Photoperiode von 16 Std. gezüchet, und die Pflänzchen im 2- bis 3-Blattstadium werden in Töpfe mit Vermiculit und Nährstoffen umgepflanzt. Die Pflanzen werden abgehärtet und anschließend zur weiteren Anzucht ins Gewächshaus überführt.
  • Beispiel 9: Vorgehen bei der phänotypischen Auswertung
  • 9.1 Aufbau der Auswertung
  • Es wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden für das Heranziehen und Ernten von T1-Samen von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt. Es wurden sechs Ereignisse zurückbehalten, von denen die T1-Nachkommenschaft für Vorliegen/Abwesenheit des Transgens im Verhältnis 3:1 aufspaltete. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, die das Transgen enthielten (Hetero- und Homozygote), und ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, denen das Transgen fehlte (Nullizygoten), durch Beobachten der sichtbaren Markerexpression selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden nebeneinander in zufälliger Anordnung herangezogen. Die Gewächshausbedingungen waren Kurztage (12 Stunden Licht), 28°C im Hellen und 22°C im Dunkeln und eine relative Feuchtigkeit von 70%.
  • Vier T1-Ereignisse wurden in der T2-Generation nach dem gleichen Untersuchungsverfahren wie für die T1-Generation, jedoch mit mehr Individuen pro Ereignis, weiter untersucht. Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
  • Screening unter Trockenheitsbedingungen
  • Pflanzen aus T2-Samen wurden unter Normalbedingungen in Blumenerde herangezogen, bis sie das Stadium des Rispenschiebens erreichten. Anschließend wurden sie in ein ”trockenes” Areal gestellt, wo keine Bewässerung erfolgte. Um den Bodenwassergehalt (BWG) zu verfolgen, wurden Feuchtigkeitssonden in statistisch ausgewählte Töpfe eingeführt. Sank der BWG unter gewisse Schwellenwerte, wurden die Pflanzen automatisch ständig erneut gegossen, bis wieder ein Normalgehalt erreicht wurde. Dann wurden die Pflanzen wiederum in Normalbedingungen umgestellt. Die übrige Anzucht (Pflanzenreife, Samenernte) erfolgte wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben.
  • Screening auf Effizienz der Stickstoffnutzung
  • Reispflanzen aus T2-Samen werden in Blumenerde und mit Ausnahme der Nährlösung unter normalen Bedingungen gezüchtet. Die Töpfe werden von der Transplantierung bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährlösung gewässert, die einen reduzierten N Stickstoff-(N-)Gehalt, und zwar gewöhnlich 7 bis 8 Mal niedriger, aufweist. Die übrige Anzucht (Pflanzenreifung, Samenernte) entspricht ansonsten derjenigen von Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress gezüchtet werden. Wachstums- und Ertragsparameter werden wie für das Wachstum unter normalen Bedingungen beschrieben ausgewertet.
  • Salzstress-Screening
  • Die Pflanzen werden auf einem Substrat aus Kokosfasern und Argex (Verhältnis 3 zu 1) herangezogen. Während der ersten zwei Wochen nach dem Umsetzen der Pflänzchen in das Gewächshaus wird eine normale Nährlösung verwendet. Nach den ersten zwei Wochen wird die Nährlösung mit 25 mM Salz (NaCl) versetzt, bis die Pflanzen geerntet werden. Anschließend wurden die Samenparameter gemessen.
  • 9.2 Statistische Analyse: F-Test
  • Als statistisches Modell für die Gesamtauswertung der phänotypischen Eigenschaften der Pflanze wurde eine zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) verwendet. Mit allen Parametern, die bei allen Pflanzen von allen Ereignissen, die mit dem erfindungsgemäßen Gen transformiert wurden, bestimmt wurden, wurde ein F-Test durchgeführt. Der F-Test erfolgte zur Überprüfung im Hinblick auf einen Effekt des Gens über alle Transformationsereignisse und zur Feststellung eines Gesamteffekts des Gens, was auch als globaler Geneffekt bezeichnet wird. Die Signifikanzschwelle für einen echten globalen Geneffekt wurde bei dem F-Test auf dem 5%-Wahrscheinlichkeitsniveau festgelegt. Ein signifikanter F-Test-Wert weist auf einen Geneffekt hin, was bedeutet, dass mehr als nur das einfache Vorhandensein oder die Lage des Gens die Unterschiede im Phänotyp verursacht.
  • Da zwei Versuche mit überlappenden Ereignissen durchgeführt wurden, wurde eine kombinierte Analyse durchgeführt. Dies ist dazu geeignet, die Übereinstimmung der Effekte über die beiden Versuche zu überprüfen, und wenn dies der Fall ist, Befunde von beiden Versuchen zu vereinigen, um die Verlässlichkeit der Schlussfolgerung zu erhöhen. Bei dem verwendeten Verfahren handelte es sich um einen ”Mixed-Modell”-Ansatz, der die mehrschichtige Struktur der Daten (d. h. Versuch – Ereignis – Segreganten) berücksichtigt. Die p-Werte wurden dadurch erhalten, dass der Wahrscheinlichkeits-Quotienten-Test mit Chi-Quadrat-Verteilungen verglichen wurde.
  • 9.3 Messparameter
  • Biomasseparameter-Messung
  • Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen. Die oberirdische Pflanzenfläche (oder Blattbiomasse) wurde dadurch bestimmt, dass man die Gesamtanzahl der Pixel auf den Digitalbildern von oberirdischen Pflanzenteilen zählte, die sich vom Hintergrund unterschieden. Dieser Wert wurde über die zu demselben Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommenen Bilder gemittelt und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Versuche zeigen, dass die auf diese Weise gemessene oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist diejenige Fläche, die zu dem Zeitpunkt gemessen wurde, an dem die Pflanzen ihre maximale Blattbiomasse erreicht hatten. Die Jungpflanzenvitalität ist die oberirdische Fläche der Pflanze (des Keimlings) drei Wochen nach der Keimung.
  • Die Jungpflanzenvitalität wurde bestimmt, indem die Gesamtzahl der Pixel von oberirdischen Pflanzenteilen, die sich vom Hintergrund unterschieden, gezählt wurde. Dieser Wert wurde über die zu demselben Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommenen Bilder gemittelt und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Die nachstehend beschriebenen Ergebnisse gelten für Pflanzen drei Wochen nach der Keimung.
  • Samenparameter-Messungen
  • Die reifen Primärrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode versehen und dann drei Tage bei 37°C in einem Ofen getrocknet. Dann wurden die Rispen gedroschen und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden von den leeren Spelzen mittels einer Luftblaseeinrichtung getrennt. Die leeren Spelzen wurden verworfen und die restliche Fraktion wurde nochmals gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl gefüllter Samen wurde dadurch bestimmt, dass man die Anzahl der gefüllten Spelzen, die nach dem Abtrennungsschritt verblieben, auszählte. Der Gesamtsamenertrag wurde dadurch gemessen, dass man alle von einer Pflanze geernteten gefüllten Spelzen wog. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde dadurch gemessen, dass man die von einer Pflanze geerntete Anzahl Spelzen auszählte. Das Tausendkorngewicht (TKG) wird aus der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert. Der Harvest Index (HI) ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag und der oberirdischen Fläche (mm2), multipliziert mit einem Faktor 106, definiert. Die Gesamtanzahl an Blüten pro Rispe ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen der Gesamtanzahl an Samen und der Anzahl an reifen Primärrispen definiert. Die Samenfüllungsrate ist bei der vorliegenden Erfindung als der Anteil (ausgedrückt als %) der Anzahl gefüllter Samen zu der Gesamtzahl Samen (oder Einzelblüten) definiert. Die Anzahl der Blüten pro Rispe wurde berechnet aus der Gesamtanzahl Samen und der Anzahl der ersten Rispen, und es handelt sich dabei um eine Abschätzung der durchschnittlichen Anzahl der Einzelblüten pro Rispe an einer Pflanze.
  • Beispiel 10: Ergebnisse der phänotypischen Untersuchung transgener Pflanzen
  • Die unter normalen Wachstumsbedingungen gewachsenen transgenen Reispflanzen, die das bHLH6-ähnliche Protein von SEQ ID NO: 2 exprimieren, zeigten im Vergleich zu den Kontrollpflanzen eine Erhöhung der Auflaufvitalität und des Samenertrags (wie es durch die Anzahl der Blüten pro Rispe gezeigt wurde, siehe nachstehende Tabelle). Diese Steigerungen wurden in 2 Experimenten mit Pflanzen der T1- und T2-Generation gemessen und waren statistisch signifikant.
    T1-Generation T2-Generation
    Parameter % Erhöhung % Erhöhung
    Auflaufvitalität 11,9 2,8
    Anzahl Blüten pro Rispe 7,4 6,2
  • Zudem wurden positive Effekte für das Gesamtgewicht der Samen, die Anzahl der gefüllten Samen und den Harvest Index in der T1-Generation und in der T2-Generation beobachtet.
  • Beispiel 11: Klonierung der Nukleinsäuresequenz, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird
  • Klonierung von SEQ ID NO: 57 (die RrmJ/FtsJ-Methyltransferase codiert):
  • Ein cDNA-AFLP-Experiment wurde an einer synchronisierten Tabak-BY2-Zellkultur (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow-2) durchgeführt und in BY2 exprimierte Sequenz-Tags, die mit dem Verlauf des Zellzyklus moduliert wurden, wurden für die weitere Klonierung ausgewählt. Die exprimierten Sequenz-Tags wurden für das Screening einer Tabak-cDNA-Bank (in einem Gateway kompatiblen Vektor; Invitrogen, Paisley, UK) und zur Isolation einer interessierenden Volllängen-DNA, nämlich einer DNA, die die RrmJ/FtsJ-Methyltransferase Nukleinsäuresequenz nach SEQ ID NO: 57 kodierte, verwendet.
  • Das isolierte Plasmid, das SEQ ID NO: 57 umfasste, wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor verwendet, der zur Transformation von Oryza sativa verwendet wurde. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Grenzen: einen pflanzlichen Selektionsmarker, eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, die für LR bei der In vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen sind. Ein Reis-Oleosin-Promotor (SEQ ID NO: 91) für eine samenspezifische Expression was befand sich stromaufwärts dieser Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor pOleo::GRP (6) in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 nach Verfahren des Standes der Technik transformiert.
  • Beispiel 12: Pflanzentransformation
  • Reistransformation
  • Agrobacterium, das den Expressionsvektor enthielt, wurde zur Transformation von Oryza-sativa-Pflanzen verwendet. Reife trockene Samen der japonica-Reissorte Nipponbare wurden entspelzt. Die Sterilisation erfolgte durch einminütiges Inkubieren in 70%igem Ethanol und anschließend 30 Minuten in 0,2% HgCl2; wonach 6 Mal je 15 Minuten mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen wurde. Anschließend wurden die sterilen Samen auf einem Medium, das 2,4-D enthielt, (Kallusinduktionsmedium) zur Keimung gebracht. Nach vierwöchiger Inkubation im Dunkeln wurden embryogene, vom Scutellum stammende Kalli herauspräpariert und mittels Subkultur auf dem gleichen Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Kalli mittels Subkultur auf dem gleichen Medium für weitere 2 Wochen vervielfacht oder vermehrt. Stückchen der embryogenen Kalli wurden 3 Tage vor der Cokultivierung auf frischem Medium subkultiviert (um die Zellteilungsaktivität zu fördern).
  • Für die Cokultivierung verwendete man den Agrobacterium-Stamm LBA4404, der den Expressionsvektor enthielt. Agrobacterium wurde auf AB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika überimpft und für 3 Tage bei 28°C kultiviert. Anschließend wurden die Bakterien gewonnen und bis zum Erreichen einer Dichte (OD600) von ungefähr 1 in flüssigem Cokultivierungsmedium suspendiert. Anschließend wurde die Suspension in eine Petrischale überführt und die Kalli wurden 15 Minuten in der Suspension eingetaucht. Dann wurden die Kallusgewebe auf einem Papierfilter trocken getupft, auf ein verfestigtes Cokultivierungsmedium umgesetzt und für 3 Tage im Dunkeln bei 25°C inkubiert. Die cokultivierten Kalli wurden 4 Wochen im Dunkeln bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels auf 2,4-D-haltigem Medium herangezogen. Während dieses Zeitraums entwickelten sich rasch wachsende resistente Kallusinseln. Nach dem Umsetzen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation im Hellen wurde das embryogene Potential freigesetzt und in den nächsten 4 bis 5 Wochen entwickelten sich Sprosse. Die Sprosse wurden aus den Kalli herauspräpariert und 2 bis 3 Wochen lang auf auxinhaltigem Medium inkubiert, von dem sie in Erde umgesetzt wurden. Abgehärtete Sprosse wurden im Gewächshaus unter hoher Feuchtigkeit und im Kurztag herangezogen.
  • Pro Konstrukt wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Überprüfung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wurden für die Ernte von T1-Samen nur transgene Ein-Kopien-Pflanzen zurückbehalten, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel zeigten. Die Samen wurden dann 3 bis 5 Monate nach der Transplantation geerntet. Das Verfahren ergab Einzel-Locus-Transformanten mit einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al., 1993, Hiei et al., 1994).
  • Beispiel 13: Verfahren bei der phänotypischen Untersuchung
  • 13.1 Aufbau der Untersuchung
  • Es wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden für das Heranziehen und Ernten von T1-Samen von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgestellt. Sechs Ereignisse, von denen sich die T1-Nachkommenschaft im Verhältnis 3:1 für Vorliegen/Abwesenheit des Transgens aufspaltete, wurden behalten. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, die das Transgen enthielten (Hetero- und Homozygoten) und ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, denen das Transgen fehlte (Nullizygoten) durch Beobachten der visuellen Markerexpression selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden nebeneinander in zufälliger Anordnung herangezogen. Die Gewächshausbedingungen waren kurze Tage (12 Stunden Licht), 28°C im Hellen und 22°C im Dunkeln, und eine relative Feuchtigkeit von 70%.
  • Vier T1-Ereignisse wurden in der T2-Generation nach dem gleichen Untersuchungsverfahren wie für die T1-Generation, jedoch mit mehr Individuen pro Ereignis, weiter untersucht.
  • Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
  • Screening unter Trockenheitsbedingungen
  • Pflanzen aus T2-Samen wurden unter Normalbedingungen in Blumenerde herangezogen, bis sie das Stadium des Rispenschiebens erreichten. Anschließend wurden sie in ein ”trockenes” Areal gestellt, wo keine Bewässerung erfolgte. Um den Bodenwassergehalt (BWG) zu verfolgen, wurden Feuchtigkeitssonden in statistisch ausgewählte Töpfe eingeführt. Sank der BWG unter gewisse Schwellenwerte, wurden die Pflanzen automatisch ständig erneut gegossen, bis wieder ein Normalgehalt erreicht wurde. Dann wurden die Pflanzen wiederum in Normalbedingungen umgestellt. Die übrige Anzucht (Pflanzenreife, Samenernte) erfolgte wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben.
  • Screening auf Effizienz der Stickstoffnutzung
  • Reispflanzen aus T2-Samen werden in Blumenerde und mit Ausnahme der Nährlösung unter normalen Bedingungen gezüchtet. Die Töpfe werden von der Transplantierung bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährlösung gewässert, die einen reduzierten N Stickstoff-(N-)Gehalt, und zwar gewöhnlich 7 bis 8 Mal niedriger, aufweist. Die übrige Anzucht (Pflanzenreifung, Samenernte) entspricht ansonsten derjenigen von Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress gezüchtet werden. Wachstums- und Ertragsparameter werden wie für das Wachstum unter normalen Bedingungen beschrieben ausgewertet.
  • 13.2 Statistische Analyse: F-Test
  • Als statistisches Modell für die Gesamtauswertung der phänotypischen Eigenschaften der Pflanze wurde eine zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) verwendet. Mit allen Parametern, die bei allen Pflanzen von allen Ereignissen, die mit dem erfindungsgemäßen Gen transformiert wurden, bestimmt wurden, wurde ein F-Test durchgeführt. Der F-Test erfolgte zur Überprüfung im Hinblick auf einen Effekt des Gens über alle Transformationsereignisse und zur Feststellung eines Gesamteffekts des Gens, was auch als globaler Geneffekt bezeichnet wird. Die Signifikanzschwelle für einen echten globalen Geneffekt wurde bei dem F-Test auf dem 5%-Wahrscheinlichkeitsniveau festgelegt. Ein signifikanter F-Test-Wert weist auf einen Geneffekt hin, was bedeutet, dass mehr als nur das einfache Vorhandensein oder die Lage des Gens die Unterschiede im Phänotyp verursacht.
  • Da zwei Versuche mit überlappenden Ereignissen durchgeführt wurden, wurde eine kombinierte Analyse durchgeführt. Dies ist dazu geeignet, die Übereinstimmung der Effekte über die beiden Versuche zu überprüfen, und wenn dies der Fall ist, Befunde von beiden Versuchen zu vereinigen, um die Verlässlichkeit der Schlussfolgerung zu erhöhen. Bei dem verwendeten Verfahren handelte es sich um einen ”Mixed-Modell”-Ansatz, der die mehrschichtige Struktur der Daten (d. h. Versuch – Ereignis – Segreganten) berücksichtigt. Die p-Werte wurden dadurch erhalten, dass der Wahrscheinlichkeits-Quotienten-Test mit Chi-Quadrat-Verteilungen verglichen wurde.
  • 13.3 Messparameter
  • Biomasseparameter-Messung
  • Die oberirdische Pflanzenfläche (oder Blattbiomasse) wurde dadurch bestimmt, dass man die Gesamtanzahl der Pixel auf den Digitalbildern von oberirdischen Pflanzenteilen zählte, die sich vom Hintergrund unterschieden. Dieser Wert wurde über die zu demselben Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommenen Bilder gemittelt und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Versuche zeigen, dass die auf diese Weise gemessene oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist diejenige Fläche, die zu dem Zeitpunkt gemessen wurde, an dem die Pflanzen ihre maximale Blattbiomasse erreicht hatten.
  • Samenparameter-Messungen
  • Die reifen Primärrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode versehen und dann drei Tage bei 37°C in einem Ofen getrocknet. Dann wurden die Rispen gedroschen und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden von den leeren Spelzen mittels einer Luftblaseeinrichtung getrennt. Die leeren Spelzen wurden verworfen und die restliche Fraktion wurde nochmals gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl gefüllter Samen wurde dadurch bestimmt, dass man die Anzahl der gefüllten Spelzen, die nach dem Abtrennungsschritt verblieben, auszählte. Der Gesamtsamenertrag wurde dadurch gemessen, dass man alle von einer Pflanze geernteten gefüllten Spelzen wog. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde dadurch gemessen, dass man die von einer Pflanze geerntete Anzahl Spelzen auszählte. Das Tausendkorngewicht (TKG) wird aus der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert. Der Harvest Index (HI) ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag und der oberirdischen Fläche (mm2), multipliziert mit einem Faktor 106, definiert. Die Gesamtanzahl an Blüten pro Rispe ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen der Gesamtanzahl an Samen und der Anzahl an reifen Primärrispen definiert. Die Samenfüllungsrate ist bei der vorliegenden Erfindung als der Anteil (ausgedrückt als %) der Anzahl gefüllter Samen zu der Gesamtzahl Samen (oder Einzelblüten) definiert.
  • Beispiel 14: Ergebnisse der phänotypischen Untersuchung der transgenen Pflanzen
  • Die transgenen Reispflanzen, die die GRP-Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 57 unter der Kontrolle des Oleosin-Promotors exprimieren, zeigten eine Erhöhung von mehr als 5% für das Gesamtgewicht der Samen, die Anzahl der gefüllten Samen, die Füllungsrate und den Harvest Index.
    Durchschn. % Steigerung in 2 Ereignissen in der T1 Generation Durchschn. Steigerung in 2 Ereignissen in der T2 Generation
    Gesamtsamenertrag pro Pflanze 48% 46%
    Gesamtanzahl gefüllter Samen 46% 44%
    Füllungsrate 39% 45%
    Harvest Index 40% 40%
  • Beispiel 15: Transformation anderer Kulturpflanzen
  • Maistransformation
  • Die Transformation von Mais (Zea mays) erfolgt durch eine Modifikation des von Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14 (6): 745–50 beschriebenen Verfahrens. Die Transformation in Mais ist genotypabhängig und nur spezifische Genotypen sind für eine Transformation und Regeneration zugänglich. Die Inzuchtlinie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als einem Elter sind gute Quellen für Donormaterial für die Transformation, aber es können auch andere Genotypen erfolgreich verwendet werden. Die Ähren werden von Maispflanzen etwa 11 Tage nach der Bestäubung (days after pollination, DAP) geerntet, wenn die Länge des unreifen Embryos etwa 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens cokultiviert, das den Expressionsvektor enthält, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Herauspräparierte Embryonen werden auf Kallusinduktionsmedium, dann auf Mais-Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel (zum Beispiel Imidazolinon, aber es können verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) enthält, herangezogen. Die Petrischalen werden im Hellen bei 25°C für 2–3 Wochen oder, bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Mais-Wurzelmedium überführt und bei 25°C für 2–3 Wochen inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden dann auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Weizentransformation
  • Die Transformation von Weizen erfolgt mit dem von Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14 (6): 745–50 beschriebenen Verfahren. Die Sorte Bobwhite (von CIMMYT, Mexico, erhältlich) wird üblicherweise zur Transformation verwendet. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens cokultiviert, das den Expressionsvektor enthält, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Nach der Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen in vitro auf Kallusinduktionsmedium, dann auf Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel (zum Beispiel Imidazolinon, aber es können verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) enthält, herangezogen. Die Petrischalen werden im Hellen bei 25°C für 2–3 Wochen oder, bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Wurzelmedium überführt und bei 25°C für 2–3 Wochen inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden dann auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Sojabohnentransformation
  • Sojabohne wird gemäß einer Modifikation des Verfahrens, das im Texas A & M-Patent US 5,164,310 beschrieben ist, transformiert. Es sind mehrere im Handel erhältliche Sojanbohnen-Sorten für die Transformation durch dieses Verfahren zugänglich. Die (von der Illinois Seed Foundation erhältliche) Sorte Jack wird üblicherweise für die Transformation verwendet. Sojabohnensamen wird für die In-vitro-Aussaat sterilisiert. Das Hypokotyl, die Keimwurzel und ein Keimblatt werden von jungen, 7 Tage alten Keimlingen präpariert. Das Epikotyl und das verbleibende Keimblatt werden weiter gezüchtet, damit sich Achselknoten entwickeln. Diese Achselknoten werden herauspräpariert und mit Agrobacterium tumefaciens, das den Expressionsvektor enthält, inkubiert. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und auf Selektionsmedien umgesetzt. Regenerierte Sprosse werden herauspräpariert und auf Sprossverlängerungsmedium umgesetzt. Sprosse mit nicht mehr als 1 cm Länge werden auf Wurzelmedium umgesetzt, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Raps-/Canolatransformation
  • Keimblattpetiolen und -hypokotyle von 5–6 Tage alten jungen Keimlingen werden als Explantate für die Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183–188) transformiert. Die im Handel erhältliche Sorte Westar (Agriculture Canada) ist die für die Transformation eingesetzte Standardsorte, aber es können auch andere Sorten verwendet werden. Canolasamen werden für die In-vitro-Ausssat oberflächensterilisiert. Die Kotyledonenpetiolenexplantate mit dem daran befindlichen Keimblatt werden aus den In-vitro-Keimlingen herauspräpariert und mit Agrobacterium (das den Expressionsvektor enthält) beimpft, indem das abgeschnittene Ende des Petiolenexplantats in die Bakterienlösung getaucht wird. Die Explantate werden dann für 2 Tage auf MSBAP-3-Medium, das 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar enthält, bei 23°C, 16 Std. Licht gezüchtet. Nach zweitägiger Cokultur mit Agrobacterium werden die Petiolenexplantate für 7 Tage auf MSBAP-3-Medium umgesetzt, das 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l) enthält, und dann auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration gezüchtet. Wenn die Sprosse eine Länge von 5–10 mm haben, werden sie abgeschnitten und auf Sprossverlängerungsmedium (MSBAP-0,5 mit 0,5 mg/l BAP) umgesetzt. Sprosse mit einer Länge von etwa 2 cm werden für die Wurzelinduktion auf Wurzelmedium (MS0) umgesetzt. Die bewurzelten Sprosse werden auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Alfalfatransformation
  • Ein regenerierender Alfalfa-(Medicago sativa-)Klon wird unter Verwendung des Verfahrens von (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Alfalfa ist genotypabhängig und daher wird eine regenerierende Pflanze benötigt. Verfahren zur Gewinnung regenerierender Pflanzen sind beschrieben. Diese können zum Beispiel von der Sorte Rangelander (Agriculture Canada) oder jeder anderen im Handel erhältlichen Alfalfa-Sorte wie von Brown DCW und A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) beschrieben erhalten werden. Alternativ hat man die Sorte RA3 (University of Wisconsin) für die Verwendung bei der Gewebekultur ausgewählt (Walker et al., 1978 Am J Bot 65: 654–659). Petiolenexplantate werden mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839–847) oder LBA4404, die den Expressionsvektor enthalten, cokultiviert. Die Explantate werden für 3 Tage im Dunkeln auf SH-Induktionsmedium, das 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K2SO4 und 100 μm Acetosyringinon enthält, gezüchtet. Die Explantate werden in Murashige-Skoog-Medium (Murashige and Skoog, 1962) der halben Stärke gewaschen und auf demselben SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon, aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum für die Hemmung des Agrobacterium-Wachstums herangezogen. Nach mehreren Wochen werden somatische Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium umgesetzt, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika und 50 g/l Saccharose enthält. Die somatischen Embryonen lässt man anschließend auf Murashige-Skoog-Medium der halben Stärke keimen. Bewurzelte Keimlinge werden in Töpfe umgesetzt und im Gewächshaus herangezogen. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Baumwolltransformation
  • Die Transformation von Baumwolle (Gossypium hirsutum L.) erfolgt unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens an Hypokotylenexplantaten. Die handelsüblichen Sorten, wie Coker 130 oder Coker 312 (SeedCo, Lubbock, TX) sind für die Transformation verwendete Standardsorten, aber es können auch andere Sorten verwendet werden. Die Samen werden oberflächensterilisiert und im Dunkeln gekeimt. Hypokotylenexplantate von den gekeimten Keimlingen werden auf eine Länge von etwa 1–1,5 Zentimeter geschnitten. Das Hypokotylenexplantat wird in dem Agrobacterium tumefaciens-Impfgut, das den Expressionsvektor enthält, für 5 Minuten eingetaucht und dann für etwa 48 Stunden auf MS + 1,8 mg/l KNO3 + 2% Glucose bei 24°C im Dunkeln cokultiviert. Die Explantate werden in das gleiche Medium, das geeignete bakterielle und pflanzliche Selektionsmarker enthält (und mehrmals erneuert wird) umgesetzt, bis embryogene Kalli beobachtet werden. Die Kalli werden dann getrennt und subkultiviert, bis somatische Embryonen auftreten. Pflänzchen, die von den somatischen Embryonen stammen, lässt man auf Wurzelmedium reifen, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden auf Blumenerde im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Beispiel 16: Klonierung der Nukleinsäuresequenz, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird
  • Klonierung von SEQ ID NO: 104 (das ein GRP codiert, wobei das GRP-Polypeptid ein basisches Helix-Loop-Helix 4 (bHLH4) Polypeptid ist):
    Die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO: 104, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren werden wurde, wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine maßgeschneiderte cDNA-Bank aus Arabidopsis thaliana-Mischgeweben (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, UK) verwendet wurde. Die PCR wurde unter Verwendung von Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Matrize in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren prm06763 (SEQ ID NO: 107; sense:
    Figure 02290001
    und prm06764 (SEQ ID NO: 108; revers, komplementär):
    Figure 02290002
    die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination enthalten. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls unter Verwendung von Standardverfahren aufgereinigt. Anschließend wurde der erste Schritt des Gateway-Verfahrens, die BP-Reaktion, durchgeführt, bei der das PCR-Fragment in vivo mit dem Plasmid pDONR201 unter Bildung eines – gemäß der Gateway-Teminologie – ”entry clone”, pLBD, rekombinierte. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Bestandteil der Gateway®-Technologie erworben.
  • Der ”entry clone”, der die SEQ ID NO: 104 enthielt, wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor, der für die Transformation von Oryza sativa verwendet wird, verwendet. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Grenzen: einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette und eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein HMGB-Promotor aus Reis (SEQ ID NO: 106) für die konstitutive Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pHMGB::GRP (8) nach fachbekannten Methoden in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
  • Beispiel 17: Pflanzentransformation
  • Reistransformation
  • Agrobacterium, das den Expressionsvektor enthielt, wurde zur Transformation von Oryza-sativa-Pflanzen verwendet. Reife trockene Samen der japonica-Reissorte Nipponbare wurden entspelzt. Die Sterilisation erfolgte durch einminütiges Inkubieren in 70%igem Ethanol und anschließend 30 Minuten in 0,2% HgCl2, wonach 6 mal je 15 Minuten mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen wurde. Anschließend wurden die sterilen Samen auf einem Medium, das 2,4-D (Kallusinduktionsmedium) enthielt, zur Keimung gebracht. Nach vierwöchiger Inkubation im Dunkeln wurden embryogene, von Scutellum stammende Kalli herauspräpariert und auf dem gleichen Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Kalli durch Subkultur auf dem gleichen Medium für weitere 2 Wochen vervielfacht oder vermehrt. Embryogene Kallusstückchen wurden auf frischem Medium 3 Tage vor der Cokultivierung subkultiviert (um die Zellteilungsaktivität zu fördern).
  • Für die Cokultivierung verwendete man den Agrobacterium-Stamm LBA4404. Agrobacterium wurde auf AB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika überimpft und 3 Tage bei 28°C kultiviert. Anschließend wurden die Bakterien gewonnen und bis zum Erreichen einer Dichte (OD600) von ungefähr 1 in flüssigem Cokultivierungsmedium suspendiert. Anschließend wurde die Suspension in eine Petrischale überführt, und die Kalli wurden 15 Minuten in der Suspension eingetaucht. Dann wurden die Kallusgewebe auf einem Papierfilter trocken getupft und auf ein verfestigtes Cokultivierungsmedium umgesetzt und 3 Tage im Dunkeln bei 25°C inkubiert. Die cokultivierten Kalli wurden 4 Wochen im Dunkeln bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels auf 2,4-D-haltigem Medium herangezogen. Während dieses Zeitraums entwickelten sich rasch wachsende resistente Kallusinseln. Nach dem Umsetzen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation im Hellen wurde das embryogene Potential freigesetzt, und in den nächsten 4 bis 5 Wochen entwickelten sich Sprosse. Die Sprosse wurden von den Kalli herauspräpariert und 2 bis 3 Wochen lang auf auxinhaltigem Medium inkubiert, von dem sie in Erde umgesetzt wurden. Abgehärtete Sprosse wurden im Gewächshaus unter hoher Feuchtigkeit und im Kurztag herangezogen.
  • Pro Konstrukt wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Überprüfung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wurden nur transgene Ein-Kopien-Pflanzen mit Toleranz für die Selektionsmittel zurückbehalten, um T1-Samen zu ernten. Die Samen wurden dann 3 bis 5 Monate nach dem Umsetzen geerntet. Das Verfahren ergab Ein-Locus-Transformanten mit einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al., 1993, Hiei et al., 1994).
  • Beispiel 18: Verfahren bei der phänotypischen Untersuchung
  • 18.1 Aufbau der Untersuchung
  • Es wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden für das Heranziehen und Ernten von T1-Samen von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgestellt. Fünf Ereignisse, von denen sich die T1-Nachkommenschaft im Verhältnis 3:1 für Vorliegen/Abwesenheit des Transgens aufspaltete, wurden behalten. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, die das Transgen enthielten (Hetero- und Homozygoten) und ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, denen das Transgen fehlte (Nullizygoten) durch Beobachten der visuellen Markerexpression selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden nebeneinander in zufälliger Anordnung herangezogen. Die Gewächshausbedingungen waren kurze Tage (12 Stunden Licht), 28°C im Hellen und 22°C im Dunkeln, und eine relative Feuchtigkeit von 70%.
  • Vier T1-Ereignisse wurden in der T2-Generation nach dem gleichen Untersuchungsverfahren wie für die T1-Generation, jedoch mit mehr Individuen pro Ereignis, weiter untersucht.
  • Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
  • 18.2 Statistische Analyse: F-Test
  • Als statistisches Modell für die Gesamtauswertung der phänotypischen Eigenschaften der Pflanze wurde eine zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) verwendet. Mit allen Parametern, die bei allen Pflanzen von allen Ereignissen, die mit dem erfindungsgemäßen Gen transformiert worden waren, bestimmt wurden, wurde ein F-Test durchgeführt. Der F-Test erfolgte zur Überprüfung im Hinblick auf einen Effekt des Gens über alle Transformationsereignisse und zur Feststellung eines Gesamteffekts des Gens, was auch als globaler Geneffekt bezeichnet wird. Die Signifikanzschwelle für einen echten globalen Geneffekt wurde bei dem F-Test auf dem 5%-Wahrscheinlichkeitsniveau festgelegt. Ein signifikanter F-Test-Wert weist auf einen Geneffekt hin, was bedeutet, dass mehr als nur das einfache Vorhandensein oder die Lage des Gens die Unterschiede im Phänotyp verursacht Da zwei Versuche mit überlappenden Ereignissen durchgeführt wurden, wurde eine kombinierte Analyse durchgeführt. Dies ist dazu geeignet, die Übereinstimmung der Effekte über die beiden Versuche zu überprüfen, und wenn dies der Fall ist, Befunde von beiden Versuchen zu vereinigen, um die Verlässlichkeit der Schlussfolgerung zu erhöhen. Bei dem verwendeten Verfahren handelte es sich um einen ”Mixed-Modell”-Ansatz, der die mehrschichtige Struktur der Daten (d. h. Versuch – Ereignis – Segreganten) berücksichtigt. Die p-Werte wurden dadurch erhalten, dass der Wahrscheinlichkeits-Quotienten-Test mit Chi-Quadrat-Verteilungen verglichen wurde.
  • 18.3 Messparameter
  • Biomasseparameter-Messung
  • Die oberirdische Pflanzenfläche (oder Blattbiomasse) wurde dadurch bestimmt, dass man die Gesamtanzahl der Pixel auf den Digitalbildern von oberirdischen Pflanzenteilen zählte, die sich vom Hintergrund unterschieden. Dieser Wert wurde über die zu demselben Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommenen Bilder gemittelt und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Versuche zeigen, dass die auf diese Weise gemessene oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist diejenige Fläche, die zu dem Zeitpunkt gemessen wurde, an dem die Pflanzen ihre maximale Blattbiomasse erreicht hatten.
  • Samenparameter-Messungen
  • Die reifen Primärrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode versehen und dann drei Tage bei 37°C in einem Ofen getrocknet. Dann wurden die Rispen gedroschen und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden von den leeren Spelzen mittels einer Luftblaseeinrichtung getrennt. Die leeren Spelzen wurden verworfen und die restliche Fraktion wurde nochmals gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl gefüllter Samen wurde dadurch bestimmt, dass man die Anzahl der gefüllten Spelzen, die nach dem Abtrennungsschritt verblieben, auszählte. Der Gesamtsamenertrag wurde dadurch gemessen, dass man alle von einer Pflanze geernteten gefüllten Spelzen wog. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde dadurch gemessen, dass man die von einer Pflanze geerntete Anzahl Spelzen auszählte. Das Tausendkorngewicht (TKG) wird aus der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert. Der Harvest Index (HI) ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag und der oberirdischen Fläche (mm2), multipliziert mit einem Faktor 106, definiert. Die Gesamtanzahl an Blüten pro Rispe ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen der Gesamtanzahl an Samen und der Anzahl an reifen Primärrispen definiert. Die Samenfüllungsrate ist bei der vorliegenden Erfindung als der Anteil (ausgedrückt als %) der Anzahl gefüllter Samen zu der Gesamtzahl Samen (oder Einzelblüten) definiert.
  • Beispiel 19: Ergebnisse der phänotypischen Untersuchung der transgenen Pflanzen
  • Die transgenen Reispflanzen, die die GRP-Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 104 unter der Kontrolle des HMGB-Promotors exprimieren, zeigten eine Zunahme von mehr als 5% beim Gesamtgewicht der Samen, der Anzahl an gefüllten Samen, der Füllungsrate und beim Harvest Index.
    gesamte durchschn. Zunahme in % in 5 Ereignissen in der T1-Generation Durchschn. Zunahme in % in 2 Ereignissen in der T2-Generation
    Jungpflanzenvitalität 21% 7%
    Gesamt-Samenertrag pro Pflanze 23% 27%
    Gesamtanzahl gefüllter Samen 22% 28%
    Samenfüllungsrate 12% 15%
    Harvest Index 18% 17%
    Greenness Index 4% 9%
  • Beispiel 20: Transformation anderer Kulturpflanzen
  • Maistransformation
  • Die Transformation von Mais (Zea mays) erfolgt durch eine Modifikation des von Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14 (6): 745–50 beschriebenen Verfahrens. Die Transformation in Mais ist genotypabhängig und nur spezifische Genotypen sind für eine Transformation und Regeneration zugänglich. Die Inzuchtlinie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als einem Elter sind gute Quellen für Donormaterial für die Transformation, aber es können auch andere Genotypen erfolgreich verwendet werden. Die Ähren werden von Maispflanzen etwa 11 Tage nach der Bestäubung (days after pollination, DAP) geerntet, wenn die Länge des unreifen Embryos etwa 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens cokultiviert, das den Expressionsvektor enthält, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Herauspräparierte Embryonen werden auf Kallusinduktionsmedium, dann auf Mais-Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel (zum Beispiel Imidazolinon, aber es können verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) enthält, herangezogen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C für 2–3 Wochen oder, bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Mais-Wurzelmedium überführt und bei 25°C für 2–3 Wochen inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden dann auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Weizentransformation
  • Die Transformation von Weizen erfolgt mit dem von Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14 (6): 745–50 beschriebenen Verfahren. Die Sorte Bobwhite (von CIMMYT, Mexiko, erhältlich) wird üblicherweise zur Transformation verwendet. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens cokultiviert, das den Expressionsvektor enthält, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Nach der Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen in vitro auf Kallusinduktionsmedium, dann auf Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel (zum Beispiel Imidazolinon, aber es können verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) enthält, herangezogen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C für 2–3 Wochen oder, bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Wurzelmedium überführt und bei 25°C für 2–3 Wochen inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden dann auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Sojatransformation
  • Soja wird gemäß einer Modifikation des Verfahrens, das im Texas A & M-Patent US 5,164,310 beschrieben ist, transformiert. Es sind mehrere im Handel erhältliche Sojasorten für die Transformation durch dieses Verfahren zugänglich. Die (von der Illinois Seed Foundation erhältliche) Sorte Jack wird üblicherweise für die Transformation verwendet. Sojasamen werden für die In-vitro-Aussaat sterilisiert. Das Hypokotyl, die Keimwurzel und ein Keimblatt werden von jungen, 7 Tage alten Keimlingen präpariert. Das Epikotyl und das verbleibende Keimblatt werden weiter gezüchtet, damit sich Achselknoten entwickeln. Diese Achselknoten werden herauspräpariert und mit Agrobacterium tumefaciens, das den Expressionsvektor enthält, inkubiert. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und auf Selektionsmedien umgesetzt. Regenerierte Sprosse werden herauspräpariert und auf ein Sprossverlängerungsmedium umgesetzt. Sprosse mit nicht mehr als 1 cm Länge werden auf Wurzelmedium umgesetzt, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Raps-/Canolatransformation
  • Keimblattpetiolen und -hypokotyle von 5–6 Tage alten jungen Keimlingen werden als Explantate für die Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183–188) transformiert. Die im Handel erhältliche Sorte Westar (Agriculture Canada) ist die für die Transformation eingesetzte Standardsorte, aber es können auch andere Sorten verwendet werden. Canolasamen werden für die In-vitro-Ausssat oberflächensterilisiert. Die Kotyledonenpetiolenexplantate mit dem daran befindlichen Keimblatt werden aus den In-vitro-Keimlingen herauspräpariert und mit Agrobacterium (das den Expressionsvektor enthält) beimpft, indem das abgeschnittene Ende des Petiolenexplantats in die Bakteriensuspension getaucht wird. Die Explantate werden dann für 2 Tage auf MSBAP-3-Medium, das 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar enthält, bei 23°C, 16 Std. Licht gezüchtet. Nach zweitägiger Cokultur mit Agrobacterium werden die Petiolenexplantate für 7 Tage auf MSBAP-3-Medium umgesetzt, das 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l) enthält, und dann auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration gezüchtet. Wenn die Sprosse eine Länge von 5–10 mm haben, werden sie abgeschnitten und auf Sprossverlängerungsmedium (MSBAP-0,5 mit 0,5 mg/l BAP) umgesetzt. Sprosse mit einer Länge von etwa 2 cm werden für die Wurzelinduktion auf Wurzelmedium (MS0) umgesetzt. Die bewurzelten Sprosse werden auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Alfalfatransformation
  • Ein regenerierender Alfalfa-(Medicago sativa-)Klon wird unter Verwendung des Verfahrens von (Mckersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Alfalfa ist genotypabhängig und daher wird eine regenerierende Pflanze benötigt. Verfahren zur Gewinnung regenerierender Pflanzen sind beschrieben. Diese können zum Beispiel von der Sorte Rangelander (Agriculture Canada) oder jeder anderen im Handel erhältlichen Alfalfa-Sorte wie von Brown DCW und A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) beschrieben, erhalten werden. Alternativ hat man die Sorte RA3 (University of Wisconsin) für die Verwendung bei der Gewebekultur ausgewählt (Walker et al., 1978 Am J Bot 65: 654–659). Petiolenexplantate werden mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839–847) oder LBA4404, die den Expressionsvektor enthalten, cokultiviert. Die Explantate werden für 3 Tage im Dunkeln auf SH-Induktionsmedium, das 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K2SO4 und 100 μm Acetosyringinon enthält, gezüchtet. Die Explantate werden in Murashige-Skoog-Medium (Murashige and Skoog, 1962) der halben Stärke gewaschen und auf demselben SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon, aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum für die Hemmung des Agrobacterium-Wachstums ausplattiert. Nach mehreren Wochen werden somatische Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium umgesetzt, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika und 50 g/l Saccharose enthält. Die somatischen Embryonen lässt man anschließend auf Murashige-Skoog-Medium der halben Stärke keimen. Bewurzelte Keimlinge werden in Töpfe umgesetzt und im Gewächshaus herangezogen. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Baumwolltransformation
  • Die Transformation von Baumwolle (Gossypium hirsutum L.) erfolgt unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens an Hypokotylenexplantaten. Die handelsüblichen Sorten, wie Coker 130 oder Coker 312 (SeedCo, Lubbock, TX) sind für die Transformation verwendete Standardsorten, aber es können auch andere Sorten verwendet werden. Die Samen werden oberflächensterilisiert und im Dunkeln gekeimt. Hypokotylenexplantate von den gekeimten Keimlingen werden auf eine Länge von etwa 1–1,5 Zentimeter geschnitten. Das Hypokotylenexplantat wird in dem Agrobacterium tumefaciens-Impfgut, das den Expressionsvektor enthält, für 5 Minuten eingetaucht und dann für etwa 48 Stunden auf MS + 1,8 mg/l KNO3 + 2% Glucose bei 24°C im Dunkeln cokultiviert. Die Explantate werden in das gleiche Medium, das geeignete bakterielle und pflanzliche Selektionsmarker enthält (und mehrmals erneuert wird), umgesetzt, bis embryogene Kalli beobachtet werden. Die Kalli werden dann getrennt und subkultiviert, bis somatische Embryonen auftreten. Pflänzchen, die von den somatischen Embryonen stammen, lässt man auf Wurzelmedium reifen, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden auf Blumenerde im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Beispiel 21: Screening unter abiotischen Stressbedingungen
  • Screening unter Trockenheitsbedingungen
  • Reispflanzen aus T1-, T2- oder weiteren Generationen werden in Blumenerde unter Normalbedingungen herangezogen, bis sie das Stadium des Rispenschiebens erreichten. Anschließend werden sie in ein ”trockenes” Areal umgestellt, wo keine Bewässerung erfolgt. Um den Bodenwassergehalt (BWG) zu verfolgen, wurden Feuchtigkeitssonden in statistisch ausgewählte Töpfe eingeführt. Sinkt der BWG unter gewisse Schwellenwerte, werden die Pflanzen automatisch ständig erneut gegossen, bis wieder ein Normalgehalt erreicht ist. Dann werden die Pflanzen wiederum in Normalbedingungen umgestellt. Die übrige Anzucht (Pflanzenreife, Samenernte) erfolgt wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben.
  • Screening unter Salzstress
  • Reispflanzen aus der T1-, T2- oder weiteren Generationen werden auf einem Substrat aus Kokosfasern und Argex (Verhältnis 3 zu 1) herangezogen. Während der ersten zwei Wochen nach dem Umsetzen der Pflänzchen in das Gewächshaus wird eine normale Nährlösung verwendet. Nach den ersten zwei Wochen wird die Nährlösung mit 25 mM Salz (NaCl) versetzt, bis die Pflanzen geerntet werden. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben.
  • Screening auf Effizienz der Stickstoffnutzung
  • Reispflanzen aus der T1-, T2- oder weiteren Generationen werden in Blumenerde und mit Ausnahme der Nährlösung unter normalen Bedingungen gezüchtet. Die Töpfe werden von der Transplantierung bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährlösung gewässert, die einen reduzierten Stickstoff-(N-)Gehalt, und zwar gewöhnlich 7 bis 8 Mal niedriger, aufweist. Die übrige Anzucht (Pflanzenreifung, Samenernte) entspricht ansonsten derjenigen von Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress gezüchtet werden. Wachstums- und Ertragsparameter werden wie für das Wachstum unter normalen Bedingungen beschrieben aufgezeichnet.
  • Beispiel 22: Klonierung der Nukleinsäuresequenz, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird
  • Klonierung der SEQ ID NO: 131 (die ein GRP kodiert, wobei das GRP-Polypeptid ein Isopentenyltransferase-(IPT-)Polypeptid ist):
  • Die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO: 131, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wurde, wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine maßgeschneiderte cDNA-Bank aus gemischten Arabidopsis thaliana-Geweben (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, UK) verwendet wurde. Die PCR wurde unter Verwendung von Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Matrize in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren prm03095 (SEQ ID NO: 134; sense):
    Figure 02370001
    und prm03096 (SEQ ID NO: 135; revers, komplementär):
    Figure 02370002
    die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination enthalten. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls unter Verwendung von Standardverfahren aufgereinigt. Anschließend wurde der erste Schritt des Gateway-Verfahrens, die BP-Reaktion, durchgeführt, bei der das PCR-Fragment in vivo mit dem Plasmid pDONR201 unter Bildung eines – gemäß der Gateway-Teminologie – ”entry clone” rekombinierte. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Bestandteil der Gateway®-Technologie erworben.
  • Der ”entry clone”, der die SEQ ID NO: 131 enthielt, wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor, der für die Transformation von Oryza sativa verwendet wird, verwendet. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Grenzen Folgendes: Einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette und eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein Prolamin-Promotor aus Reis (SEQ ID NO: 133) für die samenspezifische Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pProl::GRP (11) nach im Stand der Technik bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
  • Beispiel 23: Pflanzentransformation
  • Reistransformation
  • Agrobacterium, das den Expressionsvektor enthielt, wurde zur Transformation von Oryza-sativa-Pflanzen verwendet. Reife trockene Samen der japonica-Reissorte Nipponbare wurden entspelzt. Die Sterilisation erfolgte durch einminütiges Inkubieren in 70%igem Ethanol und anschließend 30 Minuten in 0,2% HgCl2, wonach 6 Mal je 15 Minuten mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen wurde. Anschließend wurden die sterilen Samen auf einem Medium, das 2,4-D enthielt, (Kallusinduktionsmedium) zur Keimung gebracht. Nach vierwöchiger Inkubation im Dunkeln wurden embryogene, vom Scutellum stammende Kalli herauspräpariert und auf dem gleichen Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Kalli mittels Subkultur auf dem gleichen Medium für weitere 2 Wochen vervielfacht oder vermehrt. Stückchen der embryogenen Kalli wurden 3 Tage vor der Cokultivierung auf frischem Medium subkultiviert (um die Zellteilungsaktivität zu fördern).
  • Für die Cokultivierung wurde der Agrobacterium-Stamm LBA4404, der den Expressionsvektor enthielt, verwendet. Agrobacterium wurde auf AB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika überimpft und für 3 Tage bei 28°C kultiviert. Anschließend wurden die Bakterien gewonnen und bis zum Erreichen einer Dichte (OD600) von ungefähr 1 in flüssigem Cokultivierungsmedium suspendiert. Anschließend wurde die Suspension in eine Petrischale überführt und die Kalli wurden für 15 Minuten in der Suspension eingetaucht. Dann wurden die Kallusgewebe auf einem Papierfilter trocken getupft, auf ein verfestigtes Cokultivierungsmedium umgesetzt und für 3 Tage im Dunkeln bei 25°C inkubiert. Die cokultivierten Kalli wurden 4 Wochen im Dunkeln bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels auf 2,4-D-haltigem Medium herangezogen. Während dieses Zeitraums entwickelten sich rasch wachsende resistente Kallusinseln. Nach dem Umsetzen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation im Hellen wurde das embryogene Potential freigesetzt und in den nächsten 4 bis 5 Wochen entwickelten sich Sprosse. Die Sprosse wurden aus den Kalli herauspräpariert und 2 bis 3 Wochen lang auf auxinhaltigem Medium inkubiert, von dem sie in Erde umgesetzt wurden. Abgehärtete Sprosse wurden im Gewächshaus unter hoher Feuchtigkeit und im Kurztag herangezogen.
  • Pro Konstrukt wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Überprüfung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wurden für die Ernte von T1-Samen nur transgene Ein-Kopien-Pflanzen zurückbehalten, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel zeigten. Die Samen wurden dann 3 bis 5 Monate nach der Transplantation geerntet. Das Verfahren ergab Einzel-Locus-Transformanten mit einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al., 1993, Hiei et al., 1994).
  • Beispiel 24: Vorgehen bei der phänotypischen Auswertung
  • 24.1 Aufbau der Auswertung
  • Es wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden für das Heranziehen und Ernten von T1-Samen von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt. Es wurden sechs Ereignisse zurückbehalten, von denen die T1-Nachkommenschaft für Vorliegen/Abwesenheit des Transgens im Verhältnis 3:1 aufspaltete. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, die das Transgen enthielten (Hetero- und Homozygote), und ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, denen das Transgen fehlte (Nullizygoten), durch Beobachten der sichtbaren Markerexpression selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden nebeneinander in zufälliger Anordnung herangezogen. Die Gewächshausbedingungen waren Kurztage (12 Stunden Licht), 28°C im Hellen und 22°C im Dunkeln und eine relative Feuchtigkeit von 70%.
  • Vier T1-Ereignisse wurden in der T2-Generation weiter untersucht, wobei dasselbe Untersuchungsverfahren, wie für die T1-Generation, aber mit mehr Individuen pro Ereignis, verwendet wurde.
  • Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
  • 24.2 Statistische Analyse: F-Test
  • Als statistisches Modell für die Gesamtauswertung der phänotypischen Eigenschaften der Pflanzen wurde eine zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) verwendet. Mit allen Parametern, die bei allen Pflanzen von allen Ereignissen, die mit dem erfindungsgemäßen Gen transformiert worden waren, bestimmt wurden, wurde ein F-Test durchgeführt. Der F-Test erfolgte zur Überprüfung im Hinblick auf einen Effekt des Gens über alle Transformationsereignisse und zur Feststellung eines Gesamteffekts des Gens, was auch als globaler Geneffekt bezeichnet wird. Die Signifikanzschwelle für einen echten globalen Geneffekt wurde bei dem F-Test auf dem 5%-Wahrscheinlichkeitsniveau festgelegt. Ein signifikanter F-Test-Wert weist auf einen Geneffekt hin, was bedeutet, dass mehr als nur das einfache Vorhandensein oder die Lage des Gens die Unterschiede im Phänotyp verursacht.
  • Da zwei Experimente mit überlappenden Ereignissen durchgeführt wurden, wurde eine kombinierte Analyse durchgeführt. Dies ist dazu geeignet, die Übereinstimmung der Effekte über die beiden Versuche zu überprüfen, und wenn dies der Fall ist, Aussagen von beiden Versuchen zu vereinigen, um die Verlässlichkeit der Schlussfolgerung zu erhöhen. Bei dem verwendeten Verfahren handelte es sich um einen ”Mixed-Modell”-Ansatz, der die mehrschichtige Struktur der Daten (d. h. Versuch – Ereignis – Segreganten) berücksichtigt. Die p-Werte wurden dadurch erhalten, dass man den Wahrscheinlichkeits-Quotienten-Test mit Chi-Quadrat-Verteilungen verglich.
  • 24.3 Messparameter
  • Messung der Biomasseparameter
  • Die oberirdische Pflanzenfläche (oder Blattbiomasse) wurde dadurch bestimmt, dass man die Gesamtanzahl der Pixel auf den Digitalbildern von oberirdischen Pflanzenteilen zählte, die sich vom Hintergrund unterschieden. Dieser Wert wurde über die zu demselben Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommenen Bilder gemittelt und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Versuche zeigen, dass die auf diese Weise gemessene oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist diejenige Fläche, die zu dem Zeitpunkt gemessen wurde, an dem die Pflanze ihre maximale Blattbiomasse erreicht hatte.
  • Messungen der Samenparameter
  • Die reifen Primärrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode versehen und dann drei Tage bei 37°C in einem Ofen getrocknet. Dann wurden die Rispen gedroschen und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden von den leeren Spelzen mittels einer Luftblaseeinrichtung getrennt. Die leeren Spelzen wurden verworfen und die verbleibende Fraktion wurde nochmals gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl gefüllter Samen wurde dadurch bestimmt, dass man die Anzahl der gefüllten Spelzen, die nach dem Abtrennungsschritt verblieben, auszählte. Der Gesamt-Samenertrag wurde dadurch gemessen, dass man alle von einer Pflanze geernteten gefüllten Spelzen wog. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde dadurch gemessen, dass man die von einer Pflanze geerntete Anzahl Spelzen auszählte. Das Tausendkorngewicht (TKG) wird aus der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert. Der Harvest Index (HI) ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag und der oberirdischen Fläche (mm2), multipliziert mit einem Faktor 106, definiert. Die Gesamtanzahl an Blüten pro Rispe ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen der Gesamtanzahl an Samen und der Anzahl an reifen Primärrispen definiert. Die Samenfüllungsrate ist bei der vorliegenden Erfindung als der Anteil (ausgedrückt als %) der Anzahl gefüllter Samen an der Gesamtzahl der Samen (oder Blüten) definiert.
  • Beispiel 25: Ergebnisse der phänotypischen Untersuchung der transgenen Pflanzen
  • Die transgenen Reispflanzen, die die GRP-Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 131 unter der Kontrolle des Prolamin-Promotors exprimieren, zeigten eine Zunahme von mehr als 5% beim Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, der Anzahl an gefüllten Samen, der Gesamtanzahl der Samen und beim Harvest Index.
    gesamte durchschn. Zunahme in % in 4 Ereignissen in der T1-Generation Durchschn. Zunahme in % in 4 Ereignissen in der T2-Generation
    Gesamt-Samenertrag pro Pflanze 19% 14%
    Anzahl gefüllter Samen 20% 16%
    Gesamtanzahl der Samen 16% 8%
    Harvest Index 9% 15%
  • Beispiel 26: Transformation anderer Kulturpflanzen
  • Maistransformation
  • Die Transformation von Mais (Zea mays) erfolgt durch eine Modifikation des von Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14 (6): 745–50 beschriebenen Verfahrens. Die Transformation in Mais ist genotypabhängig und nur spezifische Genotypen sind für eine Transformation und Regeneration zugänglich. Die Inzuchtlinie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als einem Elter sind gute Quellen für Donormaterial für die Transformation, aber es können auch andere Genotypen erfolgreich verwendet werden. Die Ähren werden von Maispflanzen etwa 11 Tage nach der Bestäubung (days alter pollination, DAP) geerntet, wenn die Länge des unreifen Embryos etwa 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens cokultiviert, das den Expressionsvektor enthält, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Herauspräparierte Embryonen werden auf Kallusinduktionsmedium, dann auf Mais-Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel (zum Beispiel Imidazolinon, aber es können verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) enthält, herangezogen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C für 2–3 Wochen oder, bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Mais-Wurzelmedium überführt und bei 25°C für 2–3 Wochen inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln.
  • Die bewurzelten Sprosse werden dann auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Weizentransformation
  • Die Transformation von Weizen erfolgt mit dem von Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14 (6): 745–50 beschriebenen Verfahren. Die Sorte Bobwhite (von CIMMYT, Mexiko, erhältlich) wird üblicherweise zur Transformation verwendet. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens cokultiviert, das den Expressionsvektor enthält, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Nach der Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen in vitro auf Kallusinduktionsmedium, dann auf Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel (zum Beispiel Imidazolinon, aber es können verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) enthält, herangezogen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C für 2–3 Wochen oder, bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Wurzelmedium überführt und bei 25°C für 2–3 Wochen inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden dann auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Sojatransformation
  • Soja wird gemäß einer Modifikation des Verfahrens, das im Texas A & M-Patent US 5,164,310 beschrieben ist, transformiert. Es sind mehrere im Handel erhältliche Sojasorten für die Transformation durch dieses Verfahren zugänglich. Die (von der Illinois Seed Foundation erhältliche) Sorte Jack wird üblicherweise für die Transformation verwendet. Sojasamen werden für die In-vitro-Aussaat sterilisiert. Das Hypokotyl, die Keimwurzel und ein Keimblatt werden von jungen, 7 Tage alten Keimlingen präpariert. Das Epikotyl und das verbleibende Keimblatt werden weiter gezüchtet, damit sich Achselknoten entwickeln. Diese Achselknoten werden herauspräpariert und mit Agrobacterium tumefaciens, das den Expressionsvektor enthält, inkubiert. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und auf Selektionsmedien umgesetzt. Regenerierte Sprosse werden herauspräpariert und auf ein Sprossverlängerungsmedium umgesetzt. Sprosse mit nicht mehr als 1 cm Länge werden auf Wurzelmedium umgesetzt, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Raps-/Canolatransformation
  • Keimblattpetiolen und -hypokotyle von 5–6 Tage alten jungen Keimlingen werden als Explantate für die Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183–188) transformiert. Die im Handel erhältliche Sorte Westar (Agriculture Canada) ist die für die Transformation eingesetzte Standardsorte, aber es können auch andere Sorten verwendet werden. Canolasamen werden für die In-vitro-Ausssat oberflächensterilisiert. Die Kotyledonenpetiolenexplantate mit dem daran befindlichen Keimblatt werden aus den In-vitro-Keimlingen herauspräpariert und mit Agrobacterium (das den Expressionsvektor enthält) beimpft, indem das abgeschnittene Ende des Petiolenexplantats in die Bakteriensuspension getaucht wird. Die Explantate werden dann für 2 Tage auf MSBAP-3-Medium, das 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar enthält, bei 23°C, 16 Std. Licht gezüchtet. Nach zweitägiger Cokultur mit Agrobacterium werden die Petiolenexplantate für 7 Tage auf MSBAP-3-Medium umgesetzt, das 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l) enthält, und dann auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration gezüchtet. Wenn die Sprosse eine Länge von 5–10 mm haben, werden sie abgeschnitten und auf Sprossverlängerungsmedium (MSBAP-0,5 mit 0,5 mg/l BAP) umgesetzt. Sprosse mit einer Länge von etwa 2 cm werden für die Wurzelinduktion auf Wurzelmedium (MS0) umgesetzt. Die bewurzelten Sprosse werden auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Alfalfatransformation
  • Ein regenerierender Alfalfa-(Medicago sativa-)Klon wird unter Verwendung des Verfahrens von (Mckersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Alfalfa ist genotypabhängig und daher wird eine regenerierende Pflanze benötigt. Verfahren zur Gewinnung regenerierender Pflanzen sind beschrieben. Diese können zum Beispiel von der Sorte Rangelander (Agriculture Canada) oder jeder anderen im Handel erhältlichen Alfalfa-Sorte wie von Brown DCW und A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) beschrieben, erhalten werden. Alternativ hat man die Sorte RA3 (University of Wisconsin) für die Verwendung bei der Gewebekultur ausgewählt (Walker et al., 1978 Am J Bot 65: 654–659). Petiolenexplantate werden mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839–847) oder LBA4404, die den Expressionsvektor enthalten, cokultiviert. Die Explantate werden für 3 Tage im Dunkeln auf SH-Induktionsmedium, das 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K2SO4 und 100 μm Acetosyringinon enthält, gezüchtet. Die Explantate werden in Murashige-Skoog-Medium (Murashige and Skoog, 1962) der halben Stärke gewaschen und auf demselben SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon, aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum für die Hemmung des Agrobacterium-Wachstums ausplattiert. Nach mehreren Wochen werden somatische Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium umgesetzt, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika und 50 g/l Saccharose enthält. Die somatischen Embryonen lässt man anschließend auf Murashige-Skoog-Medium der halben Stärke keimen. Bewurzelte Keimlinge werden in Töpfe umgesetzt und im Gewächshaus herangezogen. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Baumwolltransformation
  • Die Transformation von Baumwolle (Gossypium hirsutum L.) erfolgt unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens an Hypokotylenexplantaten. Die handelsüblichen Sorten, wie Coker 130 oder Coker 312 (SeedCo, Lubbock, TX) sind für die Transformation verwendete Standardsorten, aber es können auch andere Sorten verwendet werden. Die Samen werden oberflächensterilisiert und im Dunkeln gekeimt. Hypokotylenexplantate von den gekeimten Keimlingen werden auf eine Länge von etwa 1–1,5 Zentimeter geschnitten. Das Hypokotylenexplantat wird in dem Agrobacterium tumefaciens-Impfgut, das den Expressionsvektor enthält, für 5 Minuten eingetaucht und dann für etwa 48 Stunden auf MS + 1,8 mg/l KNO3 + 2% Glucose bei 24°C im Dunkeln cokultiviert. Die Explantate werden in das gleiche Medium, das geeignete bakterielle und pflanzliche Selektionsmarker enthält (und mehrmals erneuert wird), umgesetzt, bis embryogene Kalli beobachtet werden. Die Kalli werden dann getrennt und subkultiviert, bis somatische Embryonen auftreten. Pflänzchen, die von den somatischen Embryonen stammen, lässt man auf Wurzelmedium reifen, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden auf Blumenerde im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Beispiel 27: Screening unter abiotischen Stressbedingungen
  • Screening unter Trockenheitsbedingungen
  • Reispflanzen aus T1-, T2- oder weiteren Generationen werden in Blumenerde unter Normalbedingungen herangezogen, bis sie das Stadium des Rispenschiebens erreichten. Anschließend werden sie in ein ”trockenes” Areal umgestellt, wo keine Bewässerung erfolgt. Um den Bodenwassergehalt (BWG) zu verfolgen, wurden Feuchtigkeitssonden in statistisch ausgewählte Töpfe eingeführt. Sinkt der BWG unter gewisse Schwellenwerte, werden die Pflanzen automatisch ständig erneut gegossen, bis wieder ein Normalgehalt erreicht ist. Dann werden die Pflanzen wiederum in Normalbedingungen umgestellt. Die übrige Anzucht (Pflanzenreife, Samenernte) erfolgt wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben.
  • Screening unter Salzstress
  • Reispflanzen aus der T1-, T2- oder weiteren Generationen werden auf einem Substrat aus Kokosfasern und Argex (Verhältnis 3 zu 1) herangezogen. Während der ersten zwei Wochen nach dem Umsetzen der Pflänzchen in das Gewächshaus wird eine normale Nährlösung verwendet. Nach den ersten zwei Wochen wird die Nährlösung mit 25 mM Salz (NaCl) versetzt, bis die Pflanzen geerntet werden. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben.
  • Screening auf Effizienz der Stickstoffnutzung
  • Reispflanzen aus der T1-, T2- oder weiteren Generationen werden in Blumenerde und mit Ausnahme der Nährlösung unter normalen Bedingungen gezüchtet. Die Töpfe werden von der Transplantierung bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährlösung gewässert, die einen reduzierten Stickstoff-(N-)Gehalt, und zwar gewöhnlich 7 bis 8 Mal niedriger, aufweist. Die übrige Anzucht (Pflanzenreifung, Samenernte) entspricht ansonsten derjenigen von Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress gezüchtet werden. Wachstums- und Ertragsparameter werden wie für das Wachstum unter normalen Bedingungen beschrieben aufgezeichnet.
  • Beispiel 28: Klonierung der Nukleinsäuresequenz, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird und die ein STO-(Salztoleranz-)Protein kodiert
  • Die Nukleinsäuresequenz, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wurde, wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine maßgeschneiderte cDNA-Bank aus Oryza sativa-Keimlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, UK) verwendet wurde. Die PCR wurde unter Verwendung von Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Matrize in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren prm1-STO (SEQ ID NO: 216; sense, Startcodon fettgedruckt): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgaaggtgcagtgcga-3' und prm2-STO (SEQ ID NO: 217; revers, komplementär): 5'-ggggacactttgtacaagaaagctgggttcaccagtacaagcagggag 3', die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination enthalten. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls unter Verwendung von Standardverfahren aufgereinigt. Anschließend wurde der erste Schritt des Gateway-Verfahrens, die BP-Reaktion, durchgeführt, bei der das PCR-Fragment in vivo mit dem Plasmid pDONR201 unter Bildung eines – gemäß der Gateway-Teminologie – ”entry clone”, pSTO, rekombinierte. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Bestandteil der Gateway®-Technologie erworben.
  • Der ”entry clone”, der die SEQ ID NO: 168 enthielt, wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor, der für die Transformation von Oryza sativa verwendet wird, verwendet. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Grenzen Folgendes: Einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette und eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein GOS2-Promotor aus Reis (SEQ ID NO: 218) für die wurzelspezifische Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pGOS2::STO (17) nach im Stand der Technik bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
  • Beispiel 29: Pflanzentransformation
  • Reistransformation
  • Agrobacterium, das den Expressionsvektor enthielt, wurde zur Transformation von Oryza-sativa-Pflanzen verwendet. Reife trockene Samen der japonica-Reissorte Nipponbare wurden entspelzt. Die Sterilisation erfolgte durch einminütiges Inkubieren in 70%igem Ethanol und anschließend 30 Minuten in 0,2% HgCl2, wonach 6 Mal je 15 Minuten mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen wurde. Anschließend wurden die sterilen Samen auf einem Medium, das 2,4-D enthielt, (Kallusinduktionsmedium) zur Keimung gebracht. Nach vierwöchiger Inkubation im Dunkeln wurden embryogene, vom Scutellum stammende Kalli herauspräpariert und auf dem gleichen Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Kalli mittels Subkultur auf dem gleichen Medium für weitere 2 Wochen vervielfacht oder vermehrt. Stückchen der embryogenen Kalli wurden 3 Tage vor der Cokultivierung auf frischem Medium subkultiviert (um die Zellteilungsaktivität zu fördern).
  • Für die Cokultivierung wurde der Agrobacterium-Stamm LBA4404, der den Expressionsvektor enthielt, verwendet. Agrobacterium wurde auf AB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika überimpft und für 3 Tage bei 28°C kultiviert. Anschließend wurden die Bakterien gewonnen und bis zum Erreichen einer Dichte (OD600) von ungefähr 1 in flüssigem Cokultivierungsmedium suspendiert. Anschließend wurde die Suspension in eine Petrischale überführt und die Kalli wurden für 15 Minuten in der Suspension eingetaucht. Dann wurden die Kallusgewebe auf einem Papierfilter trocken getupft, auf ein verfestigtes Cokultivierungsmedium umgesetzt und für 3 Tage im Dunkeln bei 25°C inkubiert. Die cokultivierten Kalli wurden 4 Wochen im Dunkeln bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels auf 2,4-D-haltigem Medium herangezogen. Während dieses Zeitraums entwickelten sich rasch wachsende resistente Kallusinseln. Nach dem Umsetzen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation im Hellen wurde das embryogene Potential freigesetzt und in den nächsten 4 bis 5 Wochen entwickelten sich Sprosse. Die Sprosse wurden aus den Kalli herauspräpariert und 2 bis 3 Wochen lang auf auxinhaltigem Medium inkubiert, von dem sie in Erde umgesetzt wurden. Abgehärtete Sprosse wurden im Gewächshaus unter hoher Feuchtigkeit und im Kurztag herangezogen.
  • Pro Konstrukt wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Überprüfung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wurden für die Ernte von T1-Samen nur transgene Ein-Kopien-Pflanzen zurückbehalten, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel zeigten. Die Samen wurden dann 3 bis 5 Monate nach der Transplantation geerntet. Das Verfahren ergab Einzel-Locus- Transformanten mit einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al., 1993, Hiei et al., 1994).
  • Maistransformation
  • Die Transformation von Mais (Zea mays) erfolgt durch eine Modifikation des von Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14 (6): 745–50 beschriebenen Verfahrens. Die Transformation in Mais ist genotypabhängig und nur spezifische Genotypen sind für eine Transformation und Regeneration zugänglich. Die Inzuchtlinie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als einem Elter sind gute Quellen für Donormaterial für die Transformation, aber es können auch andere Genotypen erfolgreich verwendet werden. Die Ähren werden von Maispflanzen etwa 11 Tage nach der Bestäubung (days alter pollination, DAP) geerntet, wenn die Länge des unreifen Embryos etwa 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens cokultiviert, das den Expressionsvektor enthält, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Herauspräparierte Embryonen werden auf Kallusinduktionsmedium, dann auf Mais-Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel (zum Beispiel Imidazolinon, aber es können verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) enthält, herangezogen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C für 2–3 Wochen oder, bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Mais-Wurzelmedium überführt und bei 25°C für 2–3 Wochen inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden dann auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Weizentransformation
  • Die Transformation von Weizen erfolgt mit dem von Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14 (6): 745–50 beschriebenen Verfahren. Die Sorte Bobwhite (von CIMMYT, Mexiko, erhältlich) wird üblicherweise zur Transformation verwendet. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens cokultiviert, das den Expressionsvektor enthält, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Nach der Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen in vitro auf Kallusinduktionsmedium, dann auf Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel (zum Beispiel Imidazolinon, aber es können verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) enthält, herangezogen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C für 2–3 Wochen oder, bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Wurzelmedium überführt und bei 25°C für 2–3 Wochen inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden dann auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Sojatransformation
  • Soja wird gemäß einer Modifikation des Verfahrens, das im Texas A & M-Patent US 5,164,310 beschrieben ist, transformiert. Es sind mehrere im Handel erhältliche Sojasorten für die Transformation durch dieses Verfahren zugänglich. Die (von der Illinois Seed Foundation erhältliche) Sorte Jack wird üblicherweise für die Transformation verwendet. Sojasamen werden für die In-vitro-Aussaat sterilisiert. Das Hypokotyl, die Keimwurzel und ein Keimblatt werden von jungen, 7 Tage alten Keimlingen präpariert. Das Epikotyl und das verbleibende Keimblatt werden weiter gezüchtet, damit sich Achselknoten entwickeln. Diese Achselknoten werden herauspräpariert und mit Agrobacterium tumefaciens, das den Expressionsvektor enthält, inkubiert. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und auf Selektionsmedien umgesetzt. Regenerierte Sprosse werden herauspräpariert und auf ein Sprossverlängerungsmedium umgesetzt. Sprosse mit nicht mehr als 1 cm Länge werden auf Wurzelmedium umgesetzt, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Raps-/Canolatransformation
  • Keimblattpetiolen und -hypokotyle von 5–6 Tage alten jungen Keimlingen werden als Explantate für die Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183–188) transformiert. Die im Handel erhältliche Sorte Westar (Agriculture Canada) ist die für die Transformation eingesetzte Standardsorte, aber es können auch andere Sorten verwendet werden. Canolasamen werden für die In-vitro-Ausssat oberflächensterilisiert. Die Kotyledonenpetiolenexplantate mit dem daran befindlichen Keimblatt werden aus den In-vitro-Keimlingen herauspräpariert und mit Agrobacterium (das den Expressionsvektor enthält) beimpft, indem das abgeschnittene Ende des Petiolenexplantats in die Bakteriensuspension getaucht wird. Die Explantate werden dann für 2 Tage auf MSBAP-3-Medium, das 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar enthält, bei 23°C, 16 Std. Licht gezüchtet. Nach zweitägiger Cokultur mit Agrobacterium werden die Petiolenexplantate für 7 Tage auf MSBAP-3-Medium umgesetzt, das 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l) enthält, und dann auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration gezüchtet. Wenn die Sprosse eine Länge von 5–10 mm haben, werden sie abgeschnitten und auf Sprossverlängerungsmedium (MSBAP-0,5 mit 0,5 mg/l BAP) umgesetzt. Sprosse mit einer Länge von etwa 2 cm werden für die Wurzelinduktion auf Wurzelmedium (MS0) umgesetzt. Die bewurzelten Sprosse werden auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Alfalfatransformation
  • Ein regenerierender Alfalfa-(Medicago sativa-)Klon wird unter Verwendung des Verfahrens von (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Alfalfa ist genotypabhängig und daher wird eine regenerierende Pflanze benötigt. Verfahren zur Gewinnung regenerierender Pflanzen sind beschrieben. Diese können zum Beispiel von der Sorte Rangelander (Agriculture Canada) oder jeder anderen im Handel erhältlichen Alfalfa-Sorte wie von Brown DCW und A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) beschrieben, erhalten werden. Alternativ hat man die Sorte RA3 (University of Wisconsin) für die Verwendung bei der Gewebekultur ausgewählt (Walker et al., 1978 Am J Bot 65: 654–659). Petiolenexplantate werden mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839–847) oder LBA4404, die den Expressionsvektor enthalten, cokultiviert. Die Explantate werden für 3 Tage im Dunkeln auf SH-Induktionsmedium, das 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K2SO4 und 100 μm Acetosyringinon enthält, gezüchtet. Die Explantate werden in Murashige-Skoog-Medium (Murashige and Skoog, 1962) der halben Stärke gewaschen und auf demselben SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon, aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum für die Hemmung des Agrobacterium-Wachstums ausplattiert. Nach mehreren Wochen werden somatische Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium umgesetzt, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika und 50 g/l Saccharose enthält. Die somatischen Embryonen lässt man anschließend auf Murashige-Skoog-Medium der halben Stärke keimen. Bewurzelte Keimlinge werden in Töpfe umgesetzt und im Gewächshaus herangezogen. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Beispiel 30: Vorgehen bei der phänotypischen Auswertung
  • 30.1 Aufbau der Auswertung
  • Es wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden für das Heranziehen und Ernten von T1-Samen von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt. Es wurden sechs Ereignisse zurückbehalten, von denen die T1-Nachkommenschaft für Vorliegen/Abwesenheit des Transgens im Verhältnis 3:1 aufspaltete. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, die das Transgen enthielten (Hetero- und Homozygote), und ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, denen das Transgen fehlte (Nullizygoten), durch Beobachten der sichtbaren Markerexpression selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden nebeneinander in zufälliger Anordnung herangezogen. Die Gewächshausbedingungen waren Kurztage (12 Stunden Licht), 28°C im Hellen und 22°C im Dunkeln und eine relative Feuchtigkeit von 70%.
  • Vier T1-Ereignisse wurden in der T2-Generation weiter untersucht, wobei dasselbe Untersuchungsverfahren, wie für die T1-Generation, aber mit mehr Individuen pro Ereignis, verwendet wurde. Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
  • Screening unter Trockenheitsbedingungen
  • Pflanzen wurden aus T2-Samen in Blumenerde unter Normalbedingungen herangezogen, bis sie das Stadium des Rispenschiebens erreichten. Anschließend wurden sie in ein ”trockenes” Areal umgestellt, wo keine Bewässerung erfolgte. Um den Bodenwassergehalt (BWG) zu verfolgen, wurden Feuchtigkeitssonden in statistisch ausgewählte Töpfe eingeführt. Sank der BWG unter gewisse Schwellenwerte, wurden die Pflanzen automatisch ständig erneut gegossen, bis wieder ein Normalgehalt erreicht war. Dann wurden die Pflanzen wiederum in Normalbedingungen umgestellt. Die übrige Anzucht (Pflanzenreife, Samenernte) erfolgte wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen. Wachstums- und Ertragsparameter wurden aufgezeichnet, wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben.
  • Screening auf Effizienz der Stickstoffnutzung
  • Reispflanzen aus T2-Samen wurden in Blumenerde und mit Ausnahme der Nährlösung unter normalen Bedingungen gezüchtet. Die Töpfe wurden von der Transplantierung bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährlösung gewässert, die einen reduzierten Stickstoff-(N-)Gehalt, und zwar gewöhnlich 7 bis 8 Mal niedriger, enthielt. Die übrige Anzucht (Pflanzenreifung, Samenernte) entsprach ansonsten derjenigen von Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress gezüchtet wurden. Wachstums- und Ertragsparameter werden wie für das Wachstum unter normalen Bedingungen beschrieben aufgezeichnet.
  • 30.2 Statistische Analyse: F-Test
  • Als statistisches Modell für die Gesamtauswertung der phänotypischen Eigenschaften der Pflanzen wurde eine zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) verwendet. Mit allen Parametern, die bei allen Pflanzen von allen Ereignissen, die mit dem erfindungsgemäßen Gen transformiert worden waren, bestimmt wurden, wurde ein F-Test durchgeführt. Der F-Test erfolgte zur Überprüfung im Hinblick auf einen Effekt des Gens über alle Transformationsereignisse und zur Feststellung eines Gesamteffekts des Gens, was auch als globaler Geneffekt bezeichnet wird. Die Signifikanzschwelle für einen echten globalen Geneffekt wurde bei dem F-Test auf dem 5%-Wahrscheinlichkeitsniveau festgelegt. Ein signifikanter F-Test-Wert weist auf einen Geneffekt hin, was bedeutet, dass mehr als nur das einfache Vorhandensein oder die Lage des Gens die Unterschiede im Phänotyp verursacht.
  • Da zwei Experimente mit überlappenden Ereignissen durchgeführt wurden, wurde eine kombinierte Analyse durchgeführt. Dies ist dazu geeignet, die Übereinstimmung der Effekte über die beiden Versuche zu überprüfen, und wenn dies der Fall ist, Aussagen von beiden Versuchen zu vereinigen, um die Verlässlichkeit der Schlussfolgerung zu erhöhen. Bei dem verwendeten Verfahren handelte es sich um einen ”Mixed-Modell”-Ansatz, der die mehrschichtige Struktur der Daten (d. h. Versuch – Ereignis – Segreganten) berücksichtigt. Die p-Werte wurden dadurch erhalten, dass man den Wahrscheinlichkeits-Quotienten-Test mit Chi-Quadrat-Verteilungen verglich.
  • 30.3 Messparameter
  • Messung der Biomasseparameter
  • Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen. Die oberirdische Pflanzenfläche (oder Blattbiomasse) wurde dadurch bestimmt, dass man die Gesamtanzahl der Pixel auf den Digitalbildern von oberirdischen Pflanzenteilen zählte, die sich vom Hintergrund unterschieden. Dieser Wert wurde über die zu demselben Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommenen Bilder gemittelt und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Versuche zeigen, dass die auf diese Weise gemessene oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist diejenige Fläche, die zu dem Zeitpunkt gemessen wurde, an dem die Pflanze ihre maximale Blattbiomasse erreicht hatte. Die Jungpflanzenvitalität ist die oberirdische Fläche der Pflanze (des Keimlings) drei Wochen nach der Keimung. Eine Erhöhung der Wurzelbiomasse wird als Anstieg der Gesamtwurzelbiomasse (die als maximale Biomasse der Wurzeln, die während der Lebenszeit einer Pflanze beobachtet werden, gemessen wird) oder als ein Anstieg des Wurzel/Spross-Index (der als das Verhältnis zwischen Wurzelmasse und Sprossmasse im aktiven Wachstumszeitraum von Wurzel und Spross gemessen wird) ausgedrückt.
  • Die Jungpflanzenvitalität wurde bestimmt, indem die Gesamtzahl der Pixel von oberirdischen Pflanzenteilen, die sich vom Hintergrund unterschieden, gezählt wurde. Dieser Wert wurde über die zu demselben Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommenen Bilder gemittelt und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Die nachstehend beschriebenen Ergebnisse gelten für Pflanzen drei Wochen nach der Keimung.
  • Die Blütezeit wurde berechnet, wie zuvor beschrieben ( PCT/EP2007/001422 ). Kurz gesagt, wurde die Zeit berechnet, die zwischen der Aussaat und dem Moment, in dem die erste Rispe an der Pflanze erschien, verstrich. Das Auftreten der ersten Rispe bezieht sich auf den Zeitpunkt, an dem die Rispe in den wie in ( PCT/EP2007/001422 ) beschrieben verarbeiteten Photographien der Pflanzen sichtbar und nachweisbar ist.
  • Messungen der Samenparameter
  • Die reifen Primärrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode versehen und dann drei Tage bei 37°C in einem Ofen getrocknet. Dann wurden die Rispen gedroschen und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden von den leeren Spelzen mittels einer Luftblaseeinrichtung getrennt. Die leeren Spelzen wurden verworfen und die verbleibende Fraktion wurde nochmals gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl gefüllter Samen wurde dadurch bestimmt, dass man die Anzahl der gefüllten Spelzen, die nach dem Abtrennungsschritt verblieben, auszählte. Der Gesamt-Samenertrag wurde dadurch gemessen, dass man alle von einer Pflanze geernteten gefüllten Spelzen wog. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde dadurch gemessen, dass man die von einer Pflanze geerntete Anzahl Spelzen auszählte. Das Tausendkorngewicht (TKG) wird aus der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert. Der Harvest Index (HI) ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag und der oberirdischen Fläche (mm2), multipliziert mit einem Faktor 106, definiert. Die Gesamtanzahl an Blüten pro Rispe ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen der Gesamtanzahl an Samen und der Anzahl an reifen Primärrispen definiert. Die Samenfüllungsrate ist bei der vorliegenden Erfindung als der Anteil (ausgedrückt als %) der Anzahl gefüllter Samen an der Gesamtzahl der Samen (oder Blüten) definiert.
  • Beispiel 31: Ergebnisse der phänotypischen Untersuchung der transgenen Pflanzen
  • Die Ergebnisse der Untersuchung transgener Reispflanzen, die eine STO-Nukleinsäure unter Nichtstressbedingungen exprimieren, sind im Folgenden dargestellt. Eine Zunahme von mindestens 5% wurden für die Auflaufvitalität (Jungpflanzenvitalität) beobachtet und je nach der spezifischen transgenen Linie wurde eine zwischen 3 und 6 Tagen (6–9%) frühere Blüte bei den transgenen Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen beobachtet.
  • Die Ergebnisse der Untersuchung transgener Reispflanzen, die eine STO-Nukleinsäure unter Trockenheitsstressbedingungen exprimieren, sind im Folgenden dargestellt. Es wurde eine Zunahme für das Gesamtsamengewicht, die Anzahl an gefüllten Samen, die Füllungsrate, den Harvest Index und das Tausendkorngewicht beobachtet (Tabelle D). Tabelle D: Ergebnis der phänotypischen Untersuchung der transgenen STO-Pflanzen.
    Parameter Prozent Unterschied zwischen transgenen und Kontroll-Pflanzen
    Auflaufvitalität 15
    Blütezeit (früh/kürzer) 7
  • Beispiel 32: Klonierung der Nukleinsäuresequenz, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird und die ein UGE (UDP-Glucose 4-Epimerase oder UDP-Gal 4-Epimerase) Polypeptid kodiert
  • Die Nukleinsäuresequenz, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wurde, wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine maßgeschneiderte cDNA-Bank aus Oryza sativa-Keimlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, UK) verwendet wurde. Die PCR wurde unter Verwendung von Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Matrize in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren prm1 (SEQ ID NO: 272; sense, Startcodon fettgedruckt): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggtttcggccttgttg-3' und prm2 (SEQ ID NO: 273; revers, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgctgctgctactggaggatt-3', die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination enthalten. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls unter Verwendung von Standardverfahren aufgereinigt. Anschließend wurde der erste Schritt des Gateway-Verfahrens, die BP-Reaktion, durchgeführt, bei der das PCR-Fragment in vivo mit dem Plasmid pDONR201 unter Bildung eines – gemäß der Gateway-Teminologie – ”entry clone”, AUGE, rekombinierte. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Bestandteil der Gateway®-Technologie erworben.
  • Der ”entry clone”, der die SEQ ID NO: 224 umfasste, wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor, der für die Transformation von Oryza sativa verwendet wird, verwendet. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Grenzen Folgendes: Einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette und eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein GOS2-Promotor aus Reis (SEQ ID NO: 274) für die wurzelspezifische Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pGOS2::UGE (22) nach im Stand der Technik bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
  • Beispiel 33: Pflanzentransformation
  • Reistransformation
  • Agrobacterium, das den Expressionsvektor enthielt, wurde zur Transformation von Oryza-sativa-Pflanzen verwendet. Reife trockene Samen der japonica-Reissorte Nipponbare wurden entspelzt. Die Sterilisation erfolgte durch einminütiges Inkubieren in 70%igem Ethanol und anschließend 30 Minuten in 0,2% HgCl2, wonach 6 Mal je 15 Minuten mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen wurde. Anschließend wurden die sterilen Samen auf einem Medium, das 2,4-D enthielt, (Kallusinduktionsmedium) zur Keimung gebracht. Nach vierwöchiger Inkubation im Dunkeln wurden embryogene, vom Scutellum stammende Kalli herauspräpariert und auf dem gleichen Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Kalli mittels Subkultur auf dem gleichen Medium für weitere 2 Wochen vervielfacht oder vermehrt. Stückchen der embryogenen Kalli wurden 3 Tage vor der Cokultivierung auf frischem Medium subkultiviert (um die Zellteilungsaktivität zu fördern).
  • Für die Cokultivierung wurde der Agrobacterium-Stamm LBA4404, der den Expressionsvektor enthielt, verwendet. Agrobacterium wurde auf AB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika überimpft und für 3 Tage bei 28°C kultiviert. Anschließend wurden die Bakterien gewonnen und bis zum Erreichen einer Dichte (OD600) von ungefähr 1 in flüssigem Cokultivierungsmedium suspendiert. Anschließend wurde die Suspension in eine Petrischale überführt und die Kalli wurden für 15 Minuten in der Suspension eingetaucht. Dann wurden die Kallusgewebe auf einem Papierfilter trocken getupft, auf ein verfestigtes Cokultivierungsmedium umgesetzt und für 3 Tage im Dunkeln bei 25°C inkubiert. Die cokultivierten Kalli wurden 4 Wochen im Dunkeln bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels auf 2,4-D-haltigem Medium herangezogen. Während dieses Zeitraums entwickelten sich rasch wachsende resistente Kallusinseln. Nach dem Umsetzen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation im Hellen wurde das embryogene Potential freigesetzt und in den nächsten 4 bis 5 Wochen entwickelten sich Sprosse. Die Sprosse wurden aus den Kalli herauspräpariert und 2 bis 3 Wochen lang auf auxinhaltigem Medium inkubiert, von dem sie in Erde umgesetzt wurden. Abgehärtete Sprosse wurden im Gewächshaus unter hoher Feuchtigkeit und im Kurztag herangezogen.
  • Pro Konstrukt wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Überprüfung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wurden für die Ernte von T1-Samen nur transgene Ein-Kopien-Pflanzen zurückbehalten, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel zeigten. Die Samen wurden dann 3 bis 5 Monate nach der Transplantation geerntet. Das Verfahren ergab Einzel-Locus-Transformanten mit einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al., 1993, Hiei et al., 1994).
  • Maistransformation
  • Die Transformation von Mais (Zea mays) erfolgt durch eine Modifikation des von Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14 (6): 745–50 beschriebenen Verfahrens. Die Transformation in Mais ist genotypabhängig und nur spezifische Genotypen sind für eine Transformation und Regeneration zugänglich. Die Inzuchtlinie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als einem Elter sind gute Quellen für Donormaterial für die Transformation, aber es können auch andere Genotypen erfolgreich verwendet werden. Die Ähren werden von Maispflanzen etwa 11 Tage nach der Bestäubung (days alter pollination, DAP) geerntet, wenn die Länge des unreifen Embryos etwa 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens cokultiviert, das den Expressionsvektor enthält, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Herauspräparierte Embryonen werden auf Kallusinduktionsmedium, dann auf Mais-Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel (zum Beispiel Imidazolinon, aber es können verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) enthält, herangezogen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C für 2–3 Wochen oder, bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Mais-Wurzelmedium überführt und bei 25°C für 2–3 Wochen inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden dann auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Weizentransformation
  • Die Transformation von Weizen erfolgt mit dem von Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14 (6): 745–50 beschriebenen Verfahren. Die Sorte Bobwhite (von CIMMYT, Mexiko, erhältlich) wird üblicherweise zur Transformation verwendet. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens cokultiviert, das den Expressionsvektor enthält, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Nach der Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen in vitro auf Kallusinduktionsmedium, dann auf Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel (zum Beispiel Imidazolinon, aber es können verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) enthält, herangezogen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C für 2–3 Wochen oder, bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Wurzelmedium überführt und bei 25°C für 2–3 Wochen inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden dann auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Sojatransformation
  • Soja wird gemäß einer Modifikation des Verfahrens, das im Texas A & M-Patent US 5,164,310 beschrieben ist, transformiert. Es sind mehrere im Handel erhältliche Sojasorten für die Transformation durch dieses Verfahren zugänglich. Die (von der Illinois Seed Foundation erhältliche) Sorte Jack wird üblicherweise für die Transformation verwendet. Sojasamen werden für die In-vitro-Aussaat sterilisiert. Das Hypokotyl, die Keimwurzel und ein Keimblatt werden von jungen, 7 Tage alten Keimlingen präpariert. Das Epikotyl und das verbleibende Keimblatt werden weiter gezüchtet, damit sich Achselknoten entwickeln. Diese Achselknoten werden herauspräpariert und mit Agrobacterium tumefaciens, das den Expressionsvektor enthält, inkubiert. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und auf Selektionsmedien umgesetzt. Regenerierte Sprosse werden herauspräpariert und auf ein Sprossverlängerungsmedium umgesetzt. Sprosse mit nicht mehr als 1 cm Länge werden auf Wurzelmedium umgesetzt, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Raps-/Canolatransformation
  • Keimblattpetiolen und -hypokotyle von 5–6 Tage alten jungen Keimlingen werden als Explantate für die Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183–188) transformiert. Die im Handel erhältliche Sorte Westar (Agriculture Canada) ist die für die Transformation eingesetzte Standardsorte, aber es können auch andere Sorten verwendet werden. Canolasamen werden für die In-vitro-Ausssat oberflächensterilisiert. Die Kotyledonenpetiolenexplantate mit dem daran befindlichen Keimblatt werden aus den In-vitro-Keimlingen herauspräpariert und mit Agrobacterium (das den Expressionsvektor enthält) beimpft, indem das abgeschnittene Ende des Petiolenexplantats in die Bakteriensuspension getaucht wird. Die Explantate werden dann für 2 Tage auf MSBAP-3-Medium, das 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar enthält, bei 23°C, 16 Std. Licht gezüchtet. Nach zweitägiger Cokultur mit Agrobacterium werden die Petiolenexplantate für 7 Tage auf MSBAP-3-Medium umgesetzt, das 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l) enthält, und dann auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration gezüchtet. Wenn die Sprosse eine Länge von 5–10 mm haben, werden sie abgeschnitten und auf Sprossverlängerungsmedium (MSBAP-0,5 mit 0,5 mg/l BAP) umgesetzt. Sprosse mit einer Länge von etwa 2 cm werden für die Wurzelinduktion auf Wurzelmedium (MS0) umgesetzt. Die bewurzelten Sprosse werden auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Alfalfatransformation
  • Ein regenerierender Alfalfa-(Medicago sativa-)Klon wird unter Verwendung des Verfahrens von (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Alfalfa ist genotypabhängig und daher wird eine regenerierende Pflanze benötigt. Verfahren zur Gewinnung regenerierender Pflanzen sind beschrieben. Diese können zum Beispiel von der Sorte Rangelander (Agriculture Canada) oder jeder anderen im Handel erhältlichen Alfalfa-Sorte wie von Brown DCW und A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) beschrieben, erhalten werden. Alternativ hat man die Sorte RA3 (University of Wisconsin) für die Verwendung bei der Gewebekultur ausgewählt (Walker et al., 1978 Am J Bot 65: 654–659). Petiolenexplantate werden mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839–847) oder LBA4404, die den Expressionsvektor enthalten, cokultiviert. Die Explantate werden für 3 Tage im Dunkeln auf SH-Induktionsmedium, das 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K2SO4 und 100 μm Acetosyringinon enthält, gezüchtet. Die Explantate werden in Murashige-Skoog-Medium (Murashige and Skoog, 1962) der halben Stärke gewaschen und auf demselben SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon, aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum für die Hemmung des Agrobacterium-Wachstums ausplattiert. Nach mehreren Wochen werden somatische Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium umgesetzt, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika und 50 g/l Saccharose enthält. Die somatischen Embryonen lässt man anschließend auf Murashige-Skoog-Medium der halben Stärke keimen. Bewurzelte Keimlinge werden in Töpfe umgesetzt und im Gewächshaus herangezogen. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Beispiel 34: Vorgehen bei der phänotypischen Auswertung
  • 34.1 Aufbau der Auswertung
  • Es wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden für das Heranziehen und Ernten von T1-Samen von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt. Es wurden sechs Ereignisse zurückbehalten, von denen die T1-Nachkommenschaft für Vorliegen/Abwesenheit des Transgens im Verhältnis 3:1 aufspaltete. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, die das Transgen enthielten (Hetero- und Homozygote), und ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, denen das Transgen fehlte (Nullizygoten), durch Beobachten der sichtbaren Markerexpression selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden nebeneinander in zufälliger Anordnung herangezogen. Die Gewächshausbedingungen waren Kurztage (12 Stunden Licht), 28°C im Hellen und 22°C im Dunkeln und eine relative Feuchtigkeit von 70%.
  • Vier T1-Ereignisse wurden in der T2-Generation weiter untersucht, wobei dasselbe Untersuchungsverfahren, wie für die T1-Generation, aber mit mehr Individuen pro Ereignis, verwendet wurde. Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
  • Screening unter Trockenheitsbedingungen
  • Pflanzen wurden aus T2-Samen in Blumenerde unter Normalbedingungen herangezogen, bis sie das Stadium des Rispenschiebens erreichten. Anschließend wurden sie in ein ”trockenes” Areal umgestellt, wo keine Bewässerung erfolgte. Um den Bodenwassergehalt (BWG) zu verfolgen, wurden Feuchtigkeitssonden in statistisch ausgewählte Töpfe eingeführt. Sank der BWG unter gewisse Schwellenwerte, wurden die Pflanzen automatisch ständig erneut gegossen, bis wieder ein Normalgehalt erreicht war. Dann wurden die Pflanzen wiederum in Normalbedingungen umgestellt. Die übrige Anzucht (Pflanzenreife, Samenernte) erfolgte wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen. Wachstums- und Ertragsparameter wurden aufgezeichnet, wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben.
  • Screening auf Effizienz der Stickstoffnutzung
  • Reispflanzen aus T2-Samen wurden in Blumenerde und mit Ausnahme der Nährlösung unter normalen Bedingungen gezüchtet. Die Töpfe wurden von der Transplantierung bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährlösung gewässert, die einen reduzierten Stickstoff-(N-)Gehalt, und zwar gewöhnlich 7 bis 8 Mal niedriger, enthielt. Die übrige Anzucht (Pflanzenreifung, Samenernte) entsprach ansonsten derjenigen von Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress gezüchtet wurden. Wachstums- und Ertragsparameter werden wie für das Wachstum unter normalen Bedingungen beschrieben aufgezeichnet.
  • 34.2 Statistische Analyse: F-Test
  • Als statistisches Modell für die Gesamtauswertung der phänotypischen Eigenschaften der Pflanzen wurde eine zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) verwendet. Mit allen Parametern, die bei allen Pflanzen von allen Ereignissen, die mit dem erfindungsgemäßen Gen transformiert worden waren, bestimmt wurden, wurde ein F-Test durchgeführt. Der F-Test erfolgte zur Überprüfung im Hinblick auf einen Effekt des Gens über alle Transformationsereignisse und zur Feststellung eines Gesamteffekts des Gens, was auch als globaler Geneffekt bezeichnet wird. Die Signifikanzschwelle für einen echten globalen Geneffekt wurde bei dem F-Test auf dem 5%-Wahrscheinlichkeitsniveau festgelegt. Ein signifikanter F-Test-Wert weist auf einen Geneffekt hin, was bedeutet, dass mehr als nur das einfache Vorhandensein oder die Lage des Gens die Unterschiede im Phänotyp verursacht.
  • Da zwei Experimente mit überlappenden Ereignissen durchgeführt wurden, wurde eine kombinierte Analyse durchgeführt. Dies ist dazu geeignet, die Übereinstimmung der Effekte über die beiden Versuche zu überprüfen, und wenn dies der Fall ist, Aussagen von beiden Versuchen zu vereinigen, um die Verlässlichkeit der Schlussfolgerung zu erhöhen. Bei dem verwendeten Verfahren handelte es sich um einen ”Mixed-Modell”-Ansatz, der die mehrschichtige Struktur der Daten (d. h. Versuch – Ereignis – Segreganten) berücksichtigt. Die p-Werte wurden dadurch erhalten, dass man den Wahrscheinlichkeits-Quotienten-Test mit Chi-Quadrat-Verteilungen verglich.
  • 34.3 Messparameter
  • Messung der Biomasseparameter
  • Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen. Die oberirdische Pflanzenfläche (oder Blattbiomasse) wurde dadurch bestimmt, dass man die Gesamtanzahl der Pixel auf den Digitalbildern von oberirdischen Pflanzenteilen zählte, die sich vom Hintergrund unterschieden. Dieser Wert wurde über die zu demselben Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommenen Bilder gemittelt und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Versuche zeigen, dass die auf diese Weise gemessene oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist diejenige Fläche, die zu dem Zeitpunkt gemessen wurde, an dem die Pflanze ihre maximale Blattbiomasse erreicht hatte. Die Jungpflanzenvitalität ist die oberirdische Fläche der Pflanze (des Keimlings) drei Wochen nach der Keimung. Eine Erhöhung der Wurzelbiomasse wird als Anstieg der Gesamtwurzelbiomasse (die als maximale Biomasse der Wurzeln, die während der Lebenszeit einer Pflanze beobachtet werden, gemessen wird) oder als ein Anstieg des Wurzel/Spross-Index (der als das Verhältnis zwischen Wurzelmasse und Sprossmasse im aktiven Wachstumszeitraum von Wurzel und Spross gemessen wird) ausgedrückt.
  • Die Jungpflanzenvitalität wurde bestimmt, indem die Gesamtzahl der Pixel von oberirdischen Pflanzenteilen, die sich vom Hintergrund unterschieden, gezählt wurde. Dieser Wert wurde über die zu demselben Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommenen Bilder gemittelt und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Die nachstehend beschriebenen Ergebnisse gelten für Pflanzen drei Wochen nach der Keimung.
  • Messungen der Samenparameter
  • Die reifen Primärrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode versehen und dann drei Tage bei 37°C in einem Ofen getrocknet. Dann wurden die Rispen gedroschen und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden von den leeren Spelzen mittels einer Luftblaseeinrichtung getrennt. Die leeren Spelzen wurden verworfen und die verbleibende Fraktion wurde nochmals gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl gefüllter Samen wurde dadurch bestimmt, dass man die Anzahl der gefüllten Spelzen, die nach dem Abtrennungsschritt verblieben, auszählte. Der Gesamt-Samenertrag wurde dadurch gemessen, dass man alle von einer Pflanze geernteten gefüllten Spelzen wog. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde dadurch gemessen, dass man die von einer Pflanze geerntete Anzahl Spelzen auszählte. Das Tausendkorngewicht (TKG) wird aus der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert. Der Harvest Index (HI) ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag und der oberirdischen Fläche (mm2), multipliziert mit einem Faktor 106, definiert. Die Gesamtanzahl an Blüten pro Rispe ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen der Gesamtanzahl an Samen und der Anzahl an reifen Primärrispen definiert. Die Samenfüllungsrate ist bei der vorliegenden Erfindung als der Anteil (ausgedrückt als %) der Anzahl gefüllter Samen an der Gesamtzahl der Samen (oder Blüten) definiert.
  • Beispiel 35: Ergebnisse der phänotypischen Auswertung der transgenen Pflanzen
  • Die Ergebnisse der Untersuchung transgener Reispflanzen, die eine UGE-Nukleinsäure unter Nichtstressbedingungen und unter Trockenheitsstress-(Wasserbeschränkungs-)bedingungen exprimieren, sind nachstehend dargestellt. Eine Erhöhung von mindestens 5% wurde für den Gesamt-Samenertrag, die Anzahl gefüllter Samen, die Füllungsrate und den Harvest Index beobachtet. Tabelle E zeigt die Ergebnisse der phänotypischen Auswertung. Tabelle E: Ergebnis der phänotypischen Auswertung transgener Pflanzen.
    Ertragsmerkmal Nichtstressbedingungen Trockenheitsstressbedingungen
    % Unterschied Transgen/Kontrolle* % Unterschied Transgen/Kontrolle*
    Samenertrag (g) 15 45
    Anz. gefüllter Samen 13 42
    Füllungsrate 5 45
    Harvest Index 10 49
  • * Die Erhöhung wurde in den transgenen Pflanzen verglichen mit den entsprechenden nullizygoten Kontrollpflanzen gemessen und in Prozent (%) ausgedrückt.
  • Zusammenfassung
  • Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen und Verfahren zu ihrer Herstellung
  • Die vorliegende Erfindung gehört allgemein zum Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Verbesserung verschiedener ökonomisch wichtiger Ertragsmerkmale bei Pflanzen. Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen, indem man in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein ertragsverbesserndes Polypeptid kodiert, moduliert. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein ertragsverbesserndes Polypeptid kodiert, wobei die Pflanzen verbesserte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen.
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims (22)

  1. Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure moduliert, die ein ertragsverbesserndes Polypeptid kodiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Folgendem besteht: – bHLH6-ähnlichem (basisches Helix-Loop-Helix 6-ähnlichem) Protein, – einem GRP (wachstumsregulierenden Protein, engl. Growth Regulating Protein), wobei das GRP aus der folgenden Gruppe ausgewählt wird: – einem RrmJ/FtsJ-Ribosomen-RNA-Methyltransferase-Polypeptid (RrmJ/FtsJ-Polypeptid) – einem basischen Helix-Loop-Helix 4-(bHLH4-)Polypeptid – einem Isopentenyltransferase-(IPT-)Polypeptid – einem STO-(Salztoleranz-)Protein – einem UGE-(UDP-Glucose 4-Epimerase- oder UDP-Gal 4-Epimerase-)Polypeptid.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das einen Ertrag verbessernde Polypeptid aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: – einem Polypeptid mit der Aktivität von einem der in Tabelle A1, A2, A3, A4, A5 und/oder A6 dargestellten Polypeptide; – einem Polypeptid mit einer Sequenz gemäß einem der in Tabelle A1, A2, A3, A4, A5 und/oder A6 dargestellten Polypeptide; – einem Polypeptid, das von einer der Nukleinsäuren der Tabelle A1, A2, A3, A4, A5 und/oder A6 oder von einer Nukleinsäure, die mit einer solchen Nukleinsäure hybridisieren kann, kodiert wird – einem Polypeptid, das mindestens eines der Motive, wie in Motiv 1 bis 12 dargestellt oder wie in den Figuren gezeigt, umfasst.
  3. Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodiert, moduliert, wobei das bHLH6-ähnliche Polypeptid eine HLH-Domäne umfasst.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das bHLH6-ähnliche Polypeptid ein oder mehrere der folgenden Motive umfasst: (i) Motiv 1 (SEQ ID NO: 3), (ii) Motiv 2 (SEQ ID NO: 4), (iii) Motiv 3: (SEQ ID NO: 5), (iv) Motiv 7 (SEQ ID NO: 9) oder eine Sequenz, die mindestens 80% Sequenzidentität mit der SEQ ID NO: 9 besitzt.
  5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die modulierte Expression dadurch erreicht wird, dass man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodiert, einführt und exprimiert.
  6. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodiert, eines der in Tabelle A1 aufgelisteten Proteine kodiert oder ein Abschnitt einer solchen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure, die mit einer solchen Nukleinsäure hybridisieren kann, ist.
  7. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle A1 angegebenen Proteine kodiert.
  8. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale erhöhten Ertrag, vorzugsweise erhöhte Auflaufvitalität und/oder erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, wobei die Nukleinsäure mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt einem GOS2-Promotor aus Reis, funktionsfähig verbunden ist.
  11. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze stammt, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, am stärksten bevorzugt aus Arabidopsis thaliana.
  12. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die durch ein Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch erhältlich sind, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein bHIH6-ähnliches Polypeptid kodiert.
  13. Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodiert, nach den Ansprüchen 1 bis 4; (ii) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz unter (a) vorantreiben können; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  14. Konstrukt nach Anspruch 13, wobei eine der Kontrollsequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis, ist.
  15. Verwendung eines Konstrukts nach Anspruch 13 oder 14 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigerter Auflaufvitalität und/oder gesteigertem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  16. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die mit einem Konstrukt nach Anspruch 13 oder 14 transformiert sind.
  17. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid nach Anspruch 1 bis 4 kodiert, in eine(r) Pflanze; und (ii) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze fördern.
  18. Transgene Pflanze mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, der aus einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid nach Anspruch 1 bis 4 kodiert, resultiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die von der transgenen Pflanze stammt.
  19. Transgene Pflanze nach Anspruch 12, 16 oder 18 oder eine daraus stammende transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Zwerghirse, Mohrenhirse und Hafer, ist.
  20. Erntbare Teile einer Pflanze nach Anspruch 19, wobei die erntbaren Teile vorzugsweise die Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
  21. Produkte, die von einer Pflanze nach Anspruch 19 und/oder von erntbaren Teilen einer Pflanze nach Anspruch 20 stammen.
  22. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein bHLH6-ähnliches Polypeptid kodiert, zur Steigerung des Ertrags, insbesondere zur Steigerung des Samenertrags und/oder der Sprossbiomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
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