CN114656547B

CN114656547B - 草莓FaBBX21转录因子及其编码蛋白与应用

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Publication number: CN114656547B
Application number: CN202210346953.8A
Authority: CN
Inventors: 汤浩茹; 刘勇强; 江雷雨; 陈清; 岳茂兰; 林源秀; 张云婷; 张勇; 罗娅; 王燕; 刘泽静; 李梦瑶; 王小蓉; 叶云天
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2022-04-01
Filing date: 2022-04-01
Publication date: 2023-05-23
Anticipated expiration: 2042-04-01
Also published as: CN114656547A

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及草莓FaBBX21转录因子及其编码蛋白与应用。本发明所述转录因子FaBBX21来源于草莓，属于B‑box类转录因子。本发明基于所述转录因子FaBBX21构建过表达载体，并将其转化到草莓中，可进行稳定表达，有助于促进草莓花青素苷积累。

Description

草莓FaBBX21转录因子及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及草莓FaBBX21转录因子及其编码蛋白与应用。

背景技术

花青素苷(Anthocyanins)来源于植物类黄酮代谢途径，广泛分布于植物叶片、花、果实等器官，使其绚丽多彩，从而吸引虫蝶鸟兽帮助植物授粉、传播种子。同时，花青素苷也是一类重要的次生代谢产物，参与植物抵御各种逆境胁迫以适应环境变化。花青素苷还具有极高的营养保健价值，可帮助人体免受自由基的损害，在抗炎、抗氧化等方面有着积极作用。因此，深入研究植物花青素苷代谢的调控机理具有重要的意义。

草莓(Fragaria×ananassa)营养价值高，被广泛种植于世界各地。提高草莓果实中的花青素苷含量一直是草莓工作者的重要目标之一。在草莓中，大多研究主要集中于花青素苷合成途径中的结构基因及部分调控因子，如草莓花青素苷合成的关键基因MYB10受光诱导表达，其进一步激活花青素苷合成途径中的结构基因DFR、UFGT表达。在MYB10上游，光信号传导关键因子FvHY5会结合至MYB10启动子上并正向调控其表达，FvHY5还会与FvbHLH9蛋白互作，共同促进草莓花青素苷的合成。草莓B-box转录因子为草莓生长发育的重要调控因子，关于B-box转录因子蛋白的功能研究越来越深入，但其研究多是在植物光形态建成，控制开花和响应逆境胁迫等方面，其调控花青苷合成的作用未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供草莓FaBBX21转录因子及其编码蛋白与应用，提高草莓花青素苷含量，提升果实品质。

本发明提供了一种调控植物花青素代谢的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了编码上述所述蛋白质的核酸分子。

优选的，所述核酸分子的核苷酸序列包括如SEQ IDNO.2所示的核酸分子，或与SEQIDNO.2所示核苷酸序列具有80％以上同源性且编码所述蛋白质的核酸分子。

本发明还提供了含有上述核酸分子的重组载体、基因表达盒、转基因细胞系或重组菌。

本发明还提供了上述蛋白质或核酸分子或所述的重组载体、基因表达盒、转基因细胞系或重组菌在下述A1-A6任一种中的应用：

A1、调控植物花青素代谢；

A2、制备具有调控植物花青素代谢功能的产品；

A3、促进花青素苷合成的结构基因表达；

A4、促进花青素苷转运的结构基因表达；

A5、制备具有促进花青素苷合成的结构基因表达的产品；

A6、制备具有促进花青素苷转运的结构基因表达的产品。

优选的，所述促进花青素苷合成的结构基因包括PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、ANS和UFGT；所述促进花青素苷转运的结构基因包括RAP。

本发明还提供了一种提高草莓花青素苷含量的方法，包括如下步骤：在草莓的基因组中表达上述的核酸分子。

优选的，所述表达的方式包括将含有上述的核酸分子的重组载体导入草莓。

本发明所提供的转录因子FaBBX21是从草莓中获得的，属于B-box类转录因子。本发明通过PCR扩增和同源重组，构建过表达载体并转化到草莓中进行稳定表达，发现该转录因子在草莓中过表达后会促进花青素苷合成途径PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、ANS和UFGT基因以及花青素苷转运基因RAP的表达，具有促进草莓花青素苷积累的能力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例1草莓FaBBX21基因PCR扩增产物电泳图；

图2-1～图2-4为实施例2载体示意图及双酶切鉴定结果；

图3为实施例3瞬时过表达FaBBX21与对照组的草莓果实表型图；

图4为实施例3瞬时过表达FaBBX21与对照组的草莓基因表达量与花青素苷含量比较图；

图5为实施例4瞬时过表达FaBBX21与对照组的草莓PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、ANS和UFGT基因表达量比较图；

图6为实施例5获得过表达FaBBX21转基因材料过程图以及愈伤组织和根组织颜色图；

图7为实施例5获得过表达FaBBX21转基因材料GUS染色结果；

图8为实施例6过表达FaBBX21草莓愈伤组织在光照培养和黑暗培养结果图；

图9为实施例6过表达FaBBX21草莓愈伤组织在光照培养和黑暗培养条件下FaBBX21基因表达量情况。

具体实施方式

本发明SEQ ID NO.1所示的蛋白质属于草莓转录因子FaBBX21，来源于草莓品种‘红颜’，由308个氨基酸组成，蛋白质分子量为33.94kD，理论等电点为6.59，分子式为C₁₄₇₈H₂₃₀₇N₄₁₃O₄₇₁S₁₇，不稳定指数为50.85，总平均亲水性为-0.436，是不稳定亲水性蛋白，在蛋白质N端含有两个保守的B-box结构域。

本发明所述草莓转录因子FaBBX21属于草莓B-box转录因子，能够激活PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、ANS和UFGT基因的表达，促进花色素苷的积累。

本发明转录因子FaBBX21可以进行改造和修饰，得到的具有激活PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、ANS和UFGT基因的表达，促进花色素苷的积累作用的蛋白质也属于本发明的保护范围。本发明所述改造的方式优选为将SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加。

在本发明中，与SEQ ID NO.1或经所述改造后的氨基酸序列具有80％以上同源性，并且具有激活PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、ANS和UFGT基因的表达，促进花色素苷的积累作用的蛋白质也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了编码所述蛋白的核酸分子。本发明所述核酸分子的核苷酸序列包括如SEQ IDNO.2所示的核酸分子，或与SEQ IDNO.2所示核苷酸序列具有80％以上同源性且编码所述蛋白质的核酸分子。

本发明如SEQ IDNO.2所示的核酸分子全长的为927bp，其编码序列表中SEQ IDNO.1序列所示的蛋白质。本发明序列表中SEQ IDNO.2所示自5’末端第1位到第927位为开放阅读框，开放阅读框部分为927bp，改核酸分子编码得到的蛋白质能够激活PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、ANS和UFGT基因的表达，促进花色素苷的积累。

在本发明中，与SEQ ID NO.2所示的核酸分子的序列具有80％以上同源性，并且能够编码生成激活PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、ANS和UFGT基因的表达，促进花色素苷积累的蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。

含有所述核酸分子的重组载体、基因表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

在本发明中，所述重组载体包括基础载体和所述核酸分子。本发明所述基础载体优选为pCAMBIA1301、pCAMBIA2301、pBI121或pGreen II-62-SK，进一步优选为pCAMBIA1301。本发明优选将所述所述核酸分子插入基础载体的多克隆位点，得到重组载体。例如，以pCAMBIA1301为基础载体为例，将所述核酸分子插入pCAMBIA1301酶切位点XbaI和SalI之间。本发明所述基因表达盒包括启动子、所述核酸分子、标记基因和终止子；所述启动子优选为CaMV35S启动子、Ubi启动子、MAS启动子，进一步优选为CaMV35S启动子；所述标记基因优选为3×Flag、3×HA、GFP、Myc，进一步优选为3×Flag；所述终止子优选为Nos终止子、MAS终止子、CaMVpoly(A)终止子，进一步优选为Nos终止子。本发明所述重组菌优选包括GV3101、EHA105或LBA4404，进一步优选为GV3101。

本发明含有所述核酸分子的重组载体、基因表达盒、转基因细胞系或重组菌均能够用于激活PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、ANS和UFGT基因的表达，促进花色素苷的积累。

本发明还提供了上述蛋白质或核酸分子或重组载体、基因表达盒、转基因细胞系或重组菌在下述A1-A6任一种中的应用：

A1、调控植物花青素代谢；

A2、制备具有调控植物花青素代谢功能的产品；

A3、促进花青素苷合成的结构基因表达；

A4、促进花青素苷转运的结构基因表达；

A5、制备具有促进花青素苷合成的结构基因表达的产品；

A6、制备具有促进花青素苷转运的结构基因表达的产品本发明所述花青素苷合成和/或转运途径的结构基因包括PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、ANS、UFGT或RAP。本发明所述蛋白质或核酸分子或重组载体、基因表达盒、转基因细胞系或重组菌能够在草莓体内表达FaBBX21蛋白，后者作为转录因子通过直接或间接方式激活或抑制相关基因表达进而调控PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、ANS、UFGT或RAP的表达，促进花青素苷的合成。

本发明还提供了一种提高植物花青素苷含量的方法，包括如下步骤：在植物的基因组中表达上述核酸分子。

本发明中优选通过将含有上述核酸分子的重组载体导入植株，从而使植物的基因组中表达所述核酸分子。本发明所述重组载体的构建方法优选包括如下步骤：

利用扩增引物对扩增FaBBX21基因，插入载体pCAMBIA1301的多克隆位点，得所述重组载体。

在本发明中，所述扩增引物对包括序列为SEQ ID NO.3所示的上游引物FaBBX21-OXF和序列为SEQ ID NO.4所示的下游引物FaBBX21-OXR。本发明所述上游引物FaBBX21-OXF含有XbaI酶切位点，下游引物FaBBX21-OXR含有SalI酶切位点，可通过同源重组技术将目的基因FaBBX21插入改造后的pCAMBIA1301-35S-3FLAG-NOS载体。

本发明将FaBBX21基因插入载体pCAMBIA1301的多克隆位点前，优选对所述载体pCAMBIA1301进行改造。本发明所述改造的方式包括在pCAMBIA1301酶切位点EcoRI/HindIII加入一个由CaMV35S启动子驱动，Nos为终止子的表达盒子CaMV35S-MCS-3FLAG-Nos，得到如图2中B所示的载体pCAMBIA1301-35S-3FLAG-NOS。本发明将所述FaBBX21基因插入至该表达盒子酶切位点XbaI和SalI之间，在植物中表达FaBBX21基因。本发明通过改造载体pCAMBIA1301，添加CaMV35S启动子和Nos终止子后得到的载体pCAMBIA1301-35S-3FLAG-NOS可以使FaBBX21基因在植物体内大量表达。

利用扩增引物对扩增FaBBX21基因前，本发明优选包括以草莓品种‘Camarosa’基因组设计所述特异性引物对，以草莓品种‘红颜’cDNA为模板，扩增得所述FaBBX21基因。本发明所述特异性引物对包括序列为SEQ ID NO.5所示的上游引物FaBBX21-F和序列为SEQID NO.6所示的下游引物FaBBX21-R。

本发明各引物的碱基序列，从5’-3’依次如下：

FaBBX21-OXF：TCACGCGTGACTAGTTCTAGAAATGGTCTAAACCTCTTGGAGCC；

FaBBX21-OXR：AAGCTTATCGATACCGTCGACATGAAGATCCAGTGTGACGTGTGC；

FaBBX21-F：ATGAAGATCCAGTGTGACGTGTG；

FaBBX21-R：AGAACCGGGTTGTTGGAAA；

得重组载体后，本发明优选利用冻融法将重组载体转化至农杆菌感受态GV3101，挑选阳性农杆菌株后扩大培养，得含有重组载体的菌液。本发明对所述冻融法、转化和扩大培养的方式没有严格要求，常规进行即可。本发明优选在所述阳性农杆菌株的OD₆₀₀值为0.5～0.8时，停止扩大培养。

得含有重组载体的菌液后，本发明将所述含有重组载体的菌液导入植物，实现重组载体的导入。本发明所述导入的方式优选为注射，进一步优选为将含有重组载体的注入植物果实。本发明所述植物包括草莓。

本发明优选将导入重组载体的植株至于光照条件下培养，促进花青素苷的表达和积累。本发明所述光照强度优选为6000Lux。

本发明所提供的转录因子FaBBX21是从草莓中获得的，属于B-box类转录因子。本发明通过同源重组，构建过表达载体并转化到草莓中进行稳定表达，发现该转录因子在草莓中过表达后会促进花青素苷合成途径PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、ANS和UFGT基因以及花青素苷转运基因RAP的表达，具有促进草莓花青素苷积累的能力。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1草莓FaBBX21基因的克隆

以草莓品种‘Camarosa’基因组设计特异性引物对FaBBX21-F/R；以草莓品种‘红颜’cDNA为模板，采用TaKaRa公司的高保真酶PrimeSTAR Max DNA聚合酶进行PCR扩增，该反应程序为98℃预变性3min，变性10s，56℃退火15s，72℃延伸30s，循环35次，72℃终延伸5min，4℃保存。扩增体系：cDNA模板2μL，上游引物2μL，下游引物2μL，高保真酶MIX 25μL，用无菌水补足总体系至50μL。

扩增产物进行1％琼脂糖电泳，电泳后进行切胶纯化，回收目的条带并克隆到全式金公司的pEASY-Blunt克隆载体上，转化至大肠杆菌Trans T1，涂布在含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养，挑选单菌落，进行菌落PCR，反应程序为94℃预变性3min，变性10s，55℃退火10s，72℃延伸30s，循环35次，72℃终延伸5min，4℃保存。扩增体系：菌液模板2μL，引物M13-F 2μL，引物M13-R 2μL，PCR酶MIX 25μL，用无菌水补足总体系至50μL。经电泳验证为阳性克隆的重组菌(记为pEASY-Blunt-FaBBX21)送至生物公司进行测序。PCR扩增FaBBX21电泳结果见图1，测序结果显示，扩增得到的目的基因全长为927bp，具体的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO.2所示，其编码序列表中SEQ IDNO.1所示的蛋白质，SEQ IDNO.1由308个氨基酸序列组成，将该基因命名为FaBBX21。

实施例2草莓FaBBX21基因表达载体的构建

以实施例1已测序的阳性克隆质粒(pEASY-Blunt-FaBBX21)为模板，用扩增引物对(FaBBX21-OXF：5’TCACGCGTGACTAGTTCTAGAAATGGTCTAAACCTCTTGGAGCC-3’；FaBBX21-OXR：5’AAGCTTATCGATACCGTCGACATGAAGATCCAGTGTGACGTGTGC-3’)，采用TaKaRa公司的高保真酶PrimeSTAR Max DNA聚合酶进行PCR扩增，该反应程序为98℃预变性3min，变性10s，60℃退火15s，72℃延伸30s，循环35次，72℃终延伸5min，4℃保存。扩增体系：cDNA模板2μL，上游引物2μL，下游引物2μL，高保真酶MIX 25μL，用无菌水补足总体系至50μL。

扩增产物进行1％琼脂糖电泳，电泳后进行切胶纯化，回收目的条带，插入到改造后的pCAMBIA1301-35S-3FLAG-NOS(以pCAMBIA1301载体为出发载体，在其多克隆位点添加由CaMV35S启动子驱动，Nos为终止子的表达盒子，如图2-1所示)的质粒上，得重组载体pCAMBIA1301-35S-FaBBX21-3FLAG-NOS(如图2-2和图2-3所示)。连接体系为线性化载体片段5μL，插入片段2μL，重组酶2μL，5×Buffer 4μL，用无菌水补足总体系至20μL，连接条件为37℃30min；

对重组载体进行双酶切验证，酶切体系为质粒5μL，内切酶SalI 1μL，内切酶EcoRI1μL，10×Buffer 5μL，用无菌水补足总体系50μL，反应条件为37℃2h。双酶切验证结果如图2-4所示。由图2-4可以看出，重组载体经双酶验证之后，共显示3条目的条带，大小分别为12688bp、861bp和449bp，表明成功将目的片段重组至载体中。

实施例3草莓果实FaBBX21基因的瞬时表达

参照GV3101转化说明书(唯地生物，CAT#:AC1001)，将实施例2重组载体pCAMBIA1301-35S-FaBBX21-3FLAG-NOS转化至农杆菌GV3101后，涂布在YEP固体培养基上，28℃培养3天后挑选阳性农杆菌株进行扩大培养，28℃震荡培养至OD₆₀₀＝1.0后富集菌体，利用MS液体(含有10mmol·L^-1MES，10mmol·L^-1MgCl₂，20g·L^-1蔗糖)进行洗涤、重悬，加入乙酰丁香酮(250μmol·L^-1)于28℃摇床(转速50r·min^-1)内活化3h后，将菌液OD₆₀₀值调整至0.8，分别进行‘红颜’草莓果实(自然条件下果肉颜色为红色)和‘小白’草莓果实(自然条件下果肉颜色为白色)注射：具体的，使用1mL注射器吸取菌液，沿草莓果蒂处进行注射，当草莓果实表面出现水渍状后停止注射，注射后的果子放置于25℃培养箱内暗培养24h后见光，室温培养7d后观察表型、测定FaB BX21基因表达量和花青素苷含量，以转入空载体pCAMBIA1301-35S-MCS-3FLAG的‘红颜’草莓果实和‘小白’草莓果实为空白对照。

FaBBX21基因表达量的测定方法为：利用CTAB法对草莓进行总RNA提取，反转录试剂盒为成都福际生物有限公司的RT EasyTM II cDNA第一链合成试剂盒，PCR Mix为SYBRGreen I。以草莓FaACTIN基因(登录号：AB116565.1)为内参校正基因。荧光定量PCR仪为Bio-Rad公司的CFX96，采用10μL反应体系：5μL SYBR Green I Mix，荧光定量上下游引物各1μL，1μL待测草莓样品cDNA模板，加水补至10μL。PCR反应程序为：95℃预变性3min，95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共40次循环。利用2^-ΔΔCT法计算相对表达量。

花青素苷含量的测定方法为pH示差法，具体的：花青素苷提取液为丙酮：甲醇：水：冰醋酸＝60ml：60ml：30ml：15ml，取适当材料0.5g左右(鲜重)，液氮研磨后加提取液5ml，避光4℃浸提过夜，最大速度离心10min，取上清液用于测量。同一样品分别用pH4.5 NaAc缓冲液和pH1.0 KCl缓冲液稀释10倍，分别在496nm和700nm条件下进行吸光度测量，以双蒸水调零。花青素苷含量主要以天竺葵-3-葡萄糖苷(pelargonidin-3-glucoside)代表，计算公式：花青素苷含量(mg·g^-1)＝(A₀-A₁)×V×n×M/(ε×m)，其中A₀为在pH为1.0时A₄₉₆nm-A₇₀₀nm，A₁为在pH为4.5时A₄₉₆ nm-A₇₀₀ nm，V代表提取液体积(ml)，n代表稀释倍数，M为天竺葵-3-葡萄糖苷摩尔质量433.2，ε为吸光系数15600，m为称取样品质量(g)。

表型观察结果如图3，FaBBX21基因表达量和花青素苷含量检测结果如图4。根据图3和图4可以看出，FaBBX21基因过表达的‘红颜’草莓果实FaBBX21基因的相对表达量为对照组的52倍；FaBBX21基因过表达的‘小白’草莓果实FaBBX21基因的相对表达量为对照组的251倍。本发明FaBBX21基因过表达能够提高‘红颜’草莓果实和‘小白’草莓果实花青素苷的含量，‘红颜’草莓果实花青素苷的含量为655.25μg·g^-1，相比对照组提高了1.7倍；‘小白’草莓果实花青素苷的含量为203.64μg·g^-1，相比对照组提高了3.7倍。

实施例4过表达FaBBX21基因对PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、ANS和UFGT基因以及花青素苷转运基因RAP表达量的影响

具体实施过程同实施例3，其中，只在‘红颜’草莓果实中进行瞬时表达研究，以转入空载体pCAMBIA1301-35S-MCS-3FLAG的‘红颜’草莓果实为空白对照。

PAL基因表达量的测定方法为：具体实施过程同实施例3，其中PAL基因定量引物为(SEQ ID NO.7(PAL-F)：TTGAAGCTCATGTCTTCCAC；SEQ ID NO.8(PAL-R)：CAAGTTCTCCTCCAAATG)，利用2^-ΔΔCT法计算相对表达量；

C4H基因表达量的测定方法为：具体实施过程同实施例3，其中C4H基因定量引物为(SEQ ID NO.9(C4H-F)：TGCCCTTGGCTTCATGACT；SEQ ID NO.10(C4H-R)：GCTTGACACTACGGAGAAAGGT)，利用2^-ΔΔCT法计算相对表达量；4CL基因表达量的测定方法为：具体实施过程同实施例3，其中4CL基因定量引物为(SEQ ID NO.11(4CL-F)：GTAGCCAAATCATGAAAGG；SEQ ID NO.12(4CL-R)：GTCGATGTACCCTATATCACC)，利用2^-ΔΔCT法计算相对表达量；

CHS基因表达量的测定方法为：具体实施过程同实施例3，其中CHS基因定量引物为(SEQ ID NO.13(CHS-F)：GCTGTCAAGGCCATTAAGGA；SE Q ID NO.14(CHS-R)：GAGCAAACAACGAGAACACG)，利用2^-ΔΔCT法计算相对表达量；

CHI基因表达量的测定方法为：具体实施过程同实施例3，其中CHI基因定量引物为(SEQ ID NO.15(CHI-F)：AGGGGGATGGAGATACAGGG；SE Q ID NO.16(CHI-R)：CCGTCTTGCCCTTCCACTTA)，利用2^-ΔΔCT法计算相对表达量；

F3H基因表达量的测定方法为：具体实施过程同实施例3，其中F3H基因定量引物为(SEQ ID NO.17(F3H-F)：ATCACCGTTCAACCTGTGGAAG；SEQ ID NO.18(F3H-R)：TCTGGAATGTGGCTATGGACAAC)，利用2^-ΔΔCT法计算相对表达量；

ANS基因表达量的测定方法为：具体实施过程同实施例3，其中ANS基因定量引物为(SEQ ID NO.19(ANS-F)：GAAGTGCGTACCCAACTCCATCGT；SEQ ID NO.20(ANS-R)：ACCTTCTCCTTGTTGACGAGCCC)，利用2^-ΔΔCT法计算相对表达量；

UFGT基因表达量的测定方法为：具体实施过程同实施例3，其中UFGT基因定量引物为(SEQ ID NO.21(UFGT-F)：CTACTACCATGGGTTGGTCC；SEQ ID NO.22(UFGT-R)：GTATTGTCCCAAAATGGCCC)，利用2^-ΔΔCT法计算相对表达量；

RAP基因表达量的测定方法为：具体实施过程同实施例3，其中RAP基因定量引物为(SEQ ID NO.23(RAP-F)：CAAGTTCCAGCAATCGAAGA；SEQ ID NO.24(RAP-R)：TGGGAAGGATCACAAGTTGA)，利用2^-ΔΔCT法计算相对表达量。

PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、ANS、UFGT和RAP基因表达量如图5，根据5可以看出，FaBBX21基因过表达的‘红颜’草莓果实PAL基因的相对表达量为对照组的1.4倍；FaBBX21基因过表达的‘红颜’草莓果实C4H基因的相对表达量为对照组的3.7倍；FaBBX21基因过表达的‘红颜’草莓果实4CL基因的相对表达量为对照组的2.5倍；FaBBX21基因过表达的‘红颜’草莓果实CHS基因的相对表达量为对照组的3.2倍；FaBBX21基因过表达的‘红颜’草莓果实CHI基因的相对表达量为对照组的2.6倍；FaBBX21基因过表达的‘红颜’草莓果实F3H基因的相对表达量为对照组的1.5倍；FaBBX21基因过表达的‘红颜’草莓果实ANS基因的相对表达量为对照组的2.1倍；FaBBX21基因过表达的‘红颜’草莓果实UFGT基因的相对表达量为对照组的2.9倍；FaBBX21基因过表达的‘红颜’草莓果实RAP基因的相对表达量为对照组的3.2倍。本发明FaBBX21基因过表达能够提高‘红颜’草莓果实PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、ANS和UFGT基因的表达，从而促进草莓花青素苷积累。

实施例5草莓果实FaBBX21基因的遗传转化

选择生长在1/2MS培养基上的健壮‘红颜’草莓叶片进行打孔，叶盘直径约为4mm，置于预培养基(MS固体培养基含2mg·L^-1TDZ，0.5mg·L^-1IBA，20g·L^-1蔗糖，pH 5.8)中暗培养3天。将实施例3含FaBBX21过表达质粒的阳性农杆菌扩大培养至OD₆₀₀＝0.5，富集菌体后加入等体积的MS液体清洗两次，加入乙酰丁香酮(100μmol·L^-1)于28℃摇床(转速50r·min^-1)内活化3h后用于侵染。将预培养结束后的叶盘置于活化好的菌液中，侵染15min，期间轻轻摇晃。侵染结束后吸干叶片表面菌液，置于共培养基(MS固体培养基含2mg·L^-1TDZ，0.5mg·L^-1IBA，100μmol·L^-1AS，20g·L^-1蔗糖，pH 5.5)中暗培养3天，共培养结束后将叶盘转移至抑菌培养基(MS固体培养基含2mg·L^-1TDZ，0.5mg·L^-1IBA，500mg·L^- ¹Carbenicillin，20g·L^-1蔗糖，pH 5.8)中避光培养7天，后转至筛选培养基(MS固体培养基含2mg·L^-1TDZ，0.5mg·L^-1IBA，500mg·L^-1Carbenicillin，10mg·L^-1Hygromycin B，20g·L^-1蔗糖，pH 5.8)中见光培养，间隔20天更换一次筛选培养基，直至获得大量抗性愈伤组织及转基因植株，转基因草莓植株培养在1/2MS培养基中进行生根壮苗，观察愈伤组织和根组织颜色，结果如图6所示，其中图5中A为预培养阶段的愈伤组织；B为获得的草莓抗性愈伤组织，更具体的，上图为过表达FaBBX21的愈伤组织，下图野生型对照愈伤组织；C为野生型草莓根组织；D为过表达FaBBX21草莓根组织；E为过表达FaBBX21草莓植株与野生型对比图，其中E中#1～#3(记为35Spro::FaBBX21-3FLAG)分别为利用实施例3中含FaBBX21过表达质粒的阳性农杆菌进行遗传转化后的结果。

由图6可以看出，草莓再生出的抗性愈伤组织部分变为红色，红色愈伤组织进一步分化成草莓植株，与野生型草莓植株相比，过表达FaBBX21后的草莓根组织为红色，而野生型为白色。

参照GUS染色试剂盒说明书(Coolaber，CAT#:SL7160)。以培育得到的抗性愈伤组织及转基因植株根组织为实验组，野生型草莓愈伤组织及根组织为对照组，将需要染色的新鲜材料完全浸没于GUS染色液中，于37℃避光静置染色12h后，移除染色液，加入70％乙醇进行脱色2-3次，直至褪去背景色，拍照观察。染色结果如图7。由图7此可以看出，本发明过表达FaBBX21草莓再生出的抗性愈伤组织为阳性愈伤组织。

实施例6转基因草莓愈伤组织光照处理

选取实施例4状态良好、长势一致的过表达FaBBX21基因草莓愈伤组织，转空载愈伤组织作为对照。将上述愈伤组织分别继代培养在草莓愈伤组织培养基中(MS固体培养基含4mg·L^-1TDZ，0.5mg·L^-1IBA，10mg·L^-1Hygromycin B，20g·L^-1蔗糖，pH 5.8)，每种愈伤组织接种8瓶，23℃避光培养两周后，取出一半材料接受光照处理，光强为6000勒克斯左右，处理7天后进行表型观察，并按照实施例3记载的方法测定FaBBX21基因表达量。表型和测定结果如图8和图9。根据图8和图9可以看出，过表达FaBBX21的草莓愈伤组织能够促进花青素苷积累，在光照条件下积累花青素苷积累能力有了显著提高。

本发明提供的转录因子FaBBX21会促进花青素苷合成途径PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、ANS和UFGT基因以及花青素苷转运基因RAP的表达，具有促进草莓花青素苷积累的能力。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 草莓FaBBX21转录因子及其编码蛋白与应用

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 308

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Ile Gln Cys Asp Val Cys Asn Lys Asp Glu Ala Ser Val Phe

1 5 10 15

Cys Thr Ala Asp Glu Ala Ala Leu Cys Asp Gly Cys Asp His Arg Val

20 25 30

His His Ala Asn Lys Leu Ala Ser Lys His Gln Arg Phe Ser Leu Ile

35 40 45

His Pro Ser Ser Ser Lys Leu Ser Pro Leu Cys Asp Ile Cys Gln Glu

50 55 60

Arg Arg Ala Phe Leu Phe Cys Gln Gln Asp Arg Ala Ile Leu Cys Arg

65 70 75 80

Glu Cys Asp Val Pro Ile His Ser Thr Asn Gln His Thr Gln Lys His

85 90 95

Asn Arg Phe Leu Phe Thr Gly Val Lys Leu Ser Ala Thr Ser Thr Val

100 105 110

Tyr Thr Ser Thr Glu Ser Ala Ala Val Thr Asp Pro Lys Pro Gln Pro

115 120 125

Leu Ile Asn Lys Gln Gln Pro Val Pro Val Ser Ser Ser Ile Ser Asn

130 135 140

Pro Phe Ser Val Pro Lys Ile Ser Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Val

145 150 155 160

Pro Lys Thr Ser Thr Ser Thr Lys Ser Gly Ala Ser Leu Ile Pro Asn

165 170 175

Asp Gly Val Gly Ser Met Ser Ser Ile Ser Glu Tyr Leu Thr Glu Thr

180 185 190

Leu Pro Gly Trp His Val Glu Asp Leu Leu Asp Ile Ser Ser Asn His

195 200 205

Pro Phe Gly Phe Cys Lys Ala Asp Asn Glu Ala Leu Pro Phe Phe Asp

210 215 220

Asp Asp Ile Gln Ser Asn Leu Ser Ser Phe Ser Ser Glu Asn Leu Gly

225 230 235 240

Ile Trp Val Pro Lys Ala Arg Asn Pro Ser Leu Gln His Ser Gln Met

245 250 255

Gly Phe Lys Glu Ala Thr Lys Glu Ala Ala Thr Asn Met Asn Met Thr

260 265 270

Lys Ala Asn Tyr Asn Ser Asn Tyr Ile Ser Met Trp Asn Val Asp Asp

275 280 285

Ser Phe Thr Val Pro Gln Ile Ser Pro Pro Ser Val Gly Ser Lys Arg

290 295 300

Phe Arg Pro Phe

305

<210> 2

<211> 927

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaagatcc agtgtgacgt gtgcaacaag gacgaagcgt cggtgttctg caccgccgac 60

gaggctgctc tctgcgacgg ctgcgaccac cgtgtccacc atgccaataa gctcgcctcc 120

aaacatcaac gcttctccct catccacccc tcctcttcca aactctcccc tctctgcgat 180

atctgccagg agagacgagc tttcttgttc tgtcagcagg acagagcaat cttatgtaga 240

gagtgtgacg ttccgattca ctctacaaac caacacacac agaagcataa tcgctttctt 300

ttcacagggg tcaagctctc tgctacctct acagtttaca catctactga gtctgctgcg 360

gttactgatc ccaagcctca gcctttgatc aacaagcagc agcctgttcc agtttcctca 420

tctatttcaa atcccttttc agttcccaag atttcaacta ctactactac tactacagtt 480

cccaagacct caactagtac taaaagtggt gcaagtttga taccaaatga tggggttgga 540

tcaatgagta gcatatcaga gtatttgact gagacgcttc cgggttggca cgttgaggac 600

cttcttgata tttcctctaa ccatcccttt ggtttctgta aggctgacaa tgaagcttta 660

ccctttttcg atgatgatat ccaaagcaat ctcagctctt tctcgtcaga gaacctgggg 720

atttgggtcc ctaaagcacg aaatccttct cttcaacatt cacaaatggg gttcaaagag 780

gctacaaagg aggctgctac aaatatgaac atgaccaaag ccaactataa cagcaattac 840

atatcaatgt ggaacgtcga cgatagcttc acagttcctc agattagtcc tccatctgtt 900

ggctccaaga ggtttagacc attttga 927

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcacgcgtga ctagttctag aaatggtcta aacctcttgg agcc 44

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aagcttatcg ataccgtcga catgaagatc cagtgtgacg tgtgc 45

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgaagatcc agtgtgacgt gtg 23

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agaaccgggt tgttggaaa 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttgaagctca tgtcttccac 20

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caagttctcc tccaaatg 18

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgcccttggc ttcatgact 19

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcttgacact acggagaaag gt 22

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtagccaaat catgaaagg 19

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtcgatgtac cctatatcac c 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gctgtcaagg ccattaagga 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gagcaaacaa cgagaacacg 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

agggggatgg agatacaggg 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ccgtcttgcc cttccactta 20

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atcaccgttc aacctgtgga ag 22

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tctggaatgt ggctatggac aac 23

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gaagtgcgta cccaactcca tcgt 24

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

accttctcct tgttgacgag ccc 23

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ctactaccat gggttggtcc 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gtattgtccc aaaatggccc 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

caagttccag caatcgaaga 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tgggaaggat cacaagttga 20

Claims

1.一种调控草莓花青素苷含量的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列为如SEQID NO.2所示的核酸分子，或与SEQ ID NO.2所示核苷酸序列具有80％以上同源性且编码所述蛋白质的核酸分子。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、基因表达盒或重组菌。

5.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的重组载体、基因表达盒或重组菌在调控草莓花青素苷含量和/或制备具有调控草莓花青素苷含量功能的产品中的应用。

6.一种提高草莓花青素苷含量的方法，包括如下步骤：在草莓的基因组中表达权利要求2或3所述的核酸分子。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述表达的方式包括将含有权利要求2或3所述的核酸分子的重组载体导入草莓。