CN105112418A - 陆地棉种子球蛋白基因启动子的克隆及功能鉴定 - Google Patents

Abstract

本发明公开了陆地棉种子球蛋白基因启动子的克隆及功能鉴定。本发明提供了一种DNA分子，是如下任一种的DNA分子：1)编码区为序列表中序列1第1-1668位核苷酸所示的DNA分子；2)编码区为序列表中序列2第1-1647位核苷酸所示的DNA分子；3)编码区为序列表中序列3第1-1664位核苷酸所示的DNA分子。本发明的实验证明，本研究所克隆的三个陆地棉种子球蛋白基因启动子pGhαGLOA、pGhβGLOA和pGhβGLOB为种子特异性启动子，其中pGhαGLOA的启动子转录活性和特异性最好。

Description

陆地棉种子球蛋白基因启动子的克隆及功能鉴定

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及陆地棉种子球蛋白基因启动子的克隆及功能鉴定。

背景技术

球蛋白(globulin)是陆地棉(Gossypiumhirsutum)的主要种子贮藏蛋白，根据与其它贮藏蛋白的亲缘关系和前原蛋白分子量的不同，可以分为α、β两个家族(family)。每个家族根据其成员分子量的不同和糖基化位点的有无等特征，又可以分为两个亚家族(subfamily)。各亚家族成员的代表性基因分别为：GhαGLOA(登录号：M19378)、GhαGLOB(登录号：M16891)、GhβGLOA(登录号：M69188)和GhβGLOB(登录号：M16936)。

种子特异性启动子在植物基因工程领域的应用较为广泛：Vasconcelos等人利用GluB-1启动子的胚乳特异性转录活性，驱动大豆(Glycinemax)ferritin在转基因水稻(Oryzasativa)谷粒中特异性表达，提高了其铁和锌的含量。Sunilkumar等人利用陆地棉GhαGLOB启动子构建了δ-杜松萜烯合成酶(δ-cadinenesynthase)基因的RNAi载体，成功地将转基因棉花种子中棉酚(gossypol)的含量由对照的10.45μg/mg降低至0.46μg/mg。除在改善和提高种子营养品质中的应用以外，种子特异性启动子还广泛应用于基于转基因植物种子的植物生物反应器(plantbioreactor)，以表达如人血白蛋白(humanserumalbumin,HSA)、人凝血因子9(humancoagulationfactorIX,hFIX)等药用蛋白。

在种子特异性启动子的应用实践中，选择适当的启动子以驱动外源基因的定时、定位和适度表达是成功的关键因素。因此，除了现有的β-phaseolin启动子、Dc3启动子、棉花胚胎后期丰富(lateembryogenesisabundant)蛋白D113启动子等，进一步发掘新的驱动目的基因转录特异性强、转录强度适宜的种子特异性启动子，对于丰富启动子来源、多基因叠加复合性状育种、避免转基因沉默等具有一定的现实意义。

种子贮藏蛋白(seedstorageprotein)在种子发育过程中高水平表达，由于其编码基因的转录受到启动子严格的时空特异性调控，因而被认为是种子特异性启动子的重要来源。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种DNA分子。

本发明提供的DNA分子，是如下1)-5)中任一种的DNA分子：

1)为序列表中序列1第1-1668位核苷酸所示的DNA分子；

2)为序列表中序列2第1-1647位核苷酸所示的DNA分子；

3)为序列表中序列3第1-1664位核苷酸所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；

5)与1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且具有相同功能的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。

扩增上述DNA分子全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。

上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在驱动植物特定组织中目的基因表达中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述特定组织为种子。

上述应用中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

上述应用中，所述双子叶植物为十字花科植物，所述十字花科植物具体为拟南芥。

本发明的实验证明，本研究所克隆启动子pGhαGLOA、pGhβGLOA和pGhβGLOB，在成体植株各部位均表现有一定量的GUS活性，但相对于其在种子中的活性差异极大。综合考虑在转基因拟南芥成体植株不同器官中GUS的酶活，认为本研究所克隆的三个陆地棉种子球蛋白基因启动子pGhαGLOA、pGhβGLOA和pGhβGLOB为种子特异性启动子，其中pGhαGLOA的启动子转录活性和特异性最好。陆地棉种子特异性启动子的克隆可为利用基于转基因植物种子表达系统的植物生物反应器平台生产功能蛋白奠定基础；同时，可为开展种子特异性启动子顺式作用元件等相关研究工作提供基础条件。

附图说明

图1为GUS转基因拟南芥PCR鉴定的部分结果。

图2为不同启动子驱动GUS在拟南芥种子中表达的酶活。

图3为GUS转基因拟南芥GUS染色结果。

图4为不同苗龄幼苗中GUS的酶活。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

陆地棉(Gossypiumhirsutum)品种‘珂字312’(Coker312)，记载在如下文献中：EffectsofhygromycinoncottonculturesanditsapplicationinAgrobacterium-mediatedcottontransformation[J].InVitroCellular&DevelopmentalBiology-Plant.2007,43(2):111-118。

拟南芥(Arabidopsisthaliana)哥伦比亚生态型(Columbia,Col)，记载在如下文献中：拟南芥PMRP的表达特性及功能分析,中国农业科学,2014,47(15):3094-3102，以下称为野生型拟南芥。

大肠杆菌菌株Trans5α、BL21(DE3)购自北京全式金生物技术有限公司，货号分别为CD201-01、CD601-01。

农杆菌菌株GV3101::pMP90购自北京华越洋生物科技有限公司，货号：GT707s。

pENTR-P35S::GUS载体按照如下方法构建：

1、合成linker-1/2

linker-1

AATTCGCCCTTGCGATCGCATGCGACTGCGGCCGCTCAGTGCACCCGGGCATGTCATGGCGCGCCAAGGGCG

linker-2

GCGGGAACGCTAGCGTACGCTGACGCCGGCGAGTCACGTGGGCCCGTACAGTACCGCGCGGTTCCCGCTTAA

2、用EcoRI对Invitrogen公司产品(货号：K250020SC)进行酶切。

3、linker-1/2退火形成具有粘性末端的双链后，连入的酶切后载体大片段，命名为pENTR-MCS。

4、用T35S(F)/(R)对pCAMBIA2300进行PCR扩增，获得CaMV35S终止子；

T35S(F):CCCGGGCGGCCATGCTAGAGTCCGCA

T35S(R):GGCGCGCCATGTCACTGGATTTTGGTTT

pCAMBIA2300记载在如下文献中：ProductionofearlyfloweringtransgenicbarleyexpressingtheearlyfloweringalleleofCryptochrome2gene.GMCrops.2011,2(1):50-7.doi:10.4161/gmcr.2.1.15627.

5、将CaMV35S终止子和pENTR-MCS用XmaI/AscI双酶切，将CaMV35S终止子连入pENTR-MCS的酶切后载体大片段，命名为pENTR-MCS-T35S；

6、用引物P35S(F)/P35S(R)对pMON82053进行PCR扩增，获得P35S；

P35S(F)：GCGATCGCGTCCGATGTGAGACTTTTC

P35S(R)：GCGGCCGCCCTCTCCAAATGAAATGAAC

pMON82053记载在如下文献中：ExpressionoftheArabidopsisthalianaBBX32geneinsoybeanincreasesgrainyield.PLoSOne.2012；7(2):e30717.doi:10.1371/journal.pone.0030717。

7、将P35S和pENTR-MCS-T35S用AsiSI/NotI双酶切，将P35S连入pENTR-MCS-T35S的酶切后载体大片段，命名为pENTR-P35S。

8、用引物GUS(F)/GUS(R)对pBI121进行PCR扩增，获得GUS片段；

GUS(F):GCGGCCGCATGTTACGTCCTGTAGAAAC

GUS(R):CCCGGGTCATTGTTTGCCTCCCTGCT

pBI121记载在如下文献中：CompletesequenceofthebinaryvectorpBI121anditsapplicationincloningT-DNAinsertionfromtransgenicplants.MolecularBreeding,2003,11(4):287-293.

9、将GUS片段和pENTR-P35S用NotI/XmaI双酶切，将GUS片段连入pENTR-P35S的酶切后大片段，命名为pENTR-P35S::GUS。

pEarleyGate303载体记载在如下文献中：Gateway-compatiblevectorsforplantfunctionalgenomicsandproteomics.ThePlantJournal,2006,45(4):616-629.DOI:10.1111/j.1365-313X.2005.02617.x。

实施例1、目的DNA片段PGhαGLOA、PGhβGLOA和PGhβGLOB的克隆

提取陆地棉珂字312叶片的基因组DNA，以如下引物进行PCR扩增：

扩增引物1如下：

扩增引物1扩增得到1668bp的PCR扩增产物，经过测序，该PCR产物具有序列表中序列1第1-1668位核苷酸所示的核苷酸，命名为PGhαGLOA；

扩增引物2扩增得到1647bp的PCR扩增产物，经过测序，该PCR产物具有序列表中序列2第1-1647位核苷酸所示的核苷酸，命名为PGhβGLOA；

扩增引物3扩增得到1664bp的PCR扩增产物，经过测序，该PCR产物具有序列表中序列3第1-1664位核苷酸所示的核苷酸，命名为PGhβGLOB。

实施例2、目的DNA片段的功能验证

一、转基因拟南芥的获得

1、载体的构建

Pvphas为来源于菜豆β-菜豆蛋白(β-phaseolin)基因的启动子，是已报道的一种双子叶植物高表达种子特异性启动子，其核苷酸序列为序列表中序列4自5’末端第1-1658位核苷酸。

陆地棉种子球蛋白基因编码区上游序列以及Pvphas启动子，用AsiSI/NotI进行双酶切，并替换入门载体pENTR-P35S::GUS上的CaMV35S启动子，以构建新的入门载体：

pENTR-PGhαGLOA::GUS为将序列表中序列1第1-1668位核苷酸所示的PGhαGLOA替换入门载体pENTR-P35S::GUS上AsiSI和NotI酶切位点间的DNA片段(CaMV35S启动子)，保持载体其余序列不变，得到的重组载体；

pENTR-PGhβGLOA::GUS为将序列表中序列2第1-1647位核苷酸所示的PGhβGLOA替换入门载体pENTR-P35S::GUS上AsiSI和NotI酶切位点间的DNA片段(CaMV35S启动子)，保持载体其余序列不变，得到的重组载体；

pENTR-PGhβGLOB::GUS为将序列表中序列3第1-1664位核苷酸所示的PGhβGLOB替换入门载体pENTR-P35S::GUS上AsiSI和NotI酶切位点间的DNA片段(CaMV35S启动子)，保持载体其余序列不变，得到的重组载体；

pENTR-PPvphas::GUS为将序列表中序列4第1-1658位核苷酸所示的PPvphas替换入门载体pENTR-P35S::GUS上AsiSI和NotI酶切位点间的DNA片段(CaMV35S启动子)，保持载体其余序列不变，得到的重组载体。

将入门载体pENTR-P35S::GUS、pENTR-PGhαGLOA::GUS、pENTR-PGhβGLOA::GUS、pENTR-PGhβGLOB::GUS和pENTR-PPvphas::GUS分别与pEarleyGate303进行LR反应，得到重组载体pEXPR-P35S::GUS、pEXPR-PGhαGLOA::GUS、pEXPR-PGhβGLOA::GUS、pEXPR-PGhβGLOB::GUS和pEXPR-PPvphas::GUS。

经过测序，

pEXPR-P35S::GUS为将序列表中序列5所示的P35S::GUS插入pDEST-21022中通过LR反应进行重组，得到的重组载体；

pEXPR-PGhαGLOA::GUS为将序列表中序列1所示的PGhαGLOA::GUS插入pDEST-21022中通过LR反应进行重组，得到的重组载体；

pEXPR-PGhβGLOA::GUS为将序列表中序列2所示的PGhαGLOA::GUS插入pDEST-21022中通过LR反应进行重组，得到的重组载体；

pEXPR-PGhβGLOB::GUS为将序列表中序列3所示的PGhβGLOB::GUS插入pDEST-21022中通过LR反应进行重组，得到的重组载体；

pEXPR-PPvphas::GUS为将序列表中序列4所示的PPvphas::GUS插入pDEST-21022中通过LR反应进行重组，得到的重组载体。

2、重组菌的制备

将上述重组载体pEXPR-P35S::GUS、pEXPR-PGhαGLOA::GUS、pEXPR-PGhβGLOA::GUS、pEXPR-PGhβGLOB::GUS和pEXPR-PPvphas::GUS分别通过冻融法转化农杆菌GV3101::pMP90，得到重组菌GV3101::pMP90/pEXPR-P35S::GUS、GV3101::pMP90/pEXPR-PGhαGLOA::GUS、GV3101::pMP90/pEXPR-PGhβGLOA::GUS、GV3101::pMP90/pEXPR-PGhβGLOB::GUS和GV3101::pMP90/pEXPR-PPvphas::GUS。

上述重组菌分别提取质粒，测序验证正确性。

3、转基因拟南芥的制备及分子鉴定

1)转基因拟南芥的制备

将上述重组菌GV3101::pMP90/pEXPR-P35S::GUS、GV3101::pMP90/pEXPR-PGhαGLOA::GUS、GV3101::pMP90/pEXPR-PGhβGLOA::GUS、GV3101::pMP90/pEXPR-PGhβGLOB::GUS和GV3101::pMP90/pEXPR-PPvphas::GUS分别通过蘸花法转化野生型拟南芥(col-0)，得到T0代转P35S::GUS拟南芥、T0代转PGhαGLOA::GUS拟南芥、T0代转PGhβGLOA::GUS拟南芥、T0代转PGhβGLOB::GUS拟南芥和T0代转PPvphas::GUS拟南芥。

蘸花法转化如下：

(1)以转化的当天为T日。在“T-2”日夜晚，挑取农杆菌工程菌单克隆，接种于10mLYEB+Rif50mg/L+Kan50mg/L+Gent50mg/L。28℃，220rpm培养24h。在“T-1”日夜晚，以1:100的比例扩大培养。

(2)配制浸染液(1L)：MSB₅干粉2.2g，蔗糖50g，6-BA0.044μmol/L，SilwetL-77200μL，pH5.7。

(3)T日中午，待农杆菌OD₆₀₀＝1时，停止摇菌。4,000rpm离心15min，富集菌体。

(4)将菌体沉淀用浸染液重新悬浮，调整菌液OD₆₀₀＝0.8-1.0。

(5)将野生型拟南芥剪去果荚，将花序浸入浸染液恰好30s。

(6)将浸染完毕的拟南芥侧放在大塑料托盘的底部。避光14h左右后正常培养。

收获T0代植株的种子，直接撒播于混合营养土(营养土：蛭石＝1：1)表面，对长出四片真叶的幼苗间隔3-4天均匀喷施两遍5000倍稀释的商品Basta溶液(20％,W/V)，得到T1代转P35S::GUS拟南芥、T1代转PGhαGLOA::GUS拟南芥、T1代转PGhβGLOA::GUS拟南芥、T1代转PGhβGLOB::GUS拟南芥和T1代转PPvphas::GUS拟南芥。

2)PCR扩增

待上述转基因拟南芥抽薹后，提取叶片的基因组DNA，用GUS引物进行PCR扩增。

GUS引物的序列如下：

结果如图1所示，M：DNA分子量标准；1-9：转基因拟南芥编号；10：阴性对照，可以看出，绝大部分样本可扩增出与预期大小一致的312bpGUS目的条带，极少数样本无扩增条带，将能扩增出目的条带为阳性转基因拟南芥，共得到12株阳性T1代转P35S::GUS拟南芥、12株阳性T1代转PGhαGLOA::GUS拟南芥、18株阳性T1代转PGhβGLOA::GUS拟南芥、14株阳性T1代转PGhβGLOB::GUS拟南芥和11株阳性T1代转PPvphas::GUS拟南芥。

二、目的片段功能验证

本研究分别以CaMV35S和Pvphas启动子为组成型和种子特异性启动子对照，分别测定各启动子驱动GUS在转基因拟南芥种子中的酶活。

将上述各种阳性T1代转基因拟南芥播种，收获得到T2代植株。

1、转基因拟南芥种子GUS酶活检测目的片段功能

T2代转P35S::GUS拟南芥(CaMV35S)、T2代转PGhαGLOA::GUS拟南芥(GhαGLOA)、T2代转PGhβGLOA::GUS拟南芥(GhβGLOA)、T2代转PGhβGLOB::GUS拟南芥(GhβGLOB)和T2代转PPvphas::GUS拟南芥(Pvphas)种子各取5mg(约300粒)，进行GUS酶活检测。

GUS酶活检测如下：提取上述转基因拟南芥种子的总蛋白，加入995μL的GUS反应缓冲液，于37℃预热至恒温。取数只2mL离心管，分别加入1.96mL反应终止液。相应于样品编号和反应时间标记，置于离心管架待用。取适当稀释的样品总蛋白粗提液5μL，加入995μL37℃预热的反应缓冲液，37℃温浴。在0min、20min、40min和60min分别取反应混合物40μL加入到1.96mL反应终止液，室温避光保存。4-MU的生成速率与催化该酶促反应的总蛋白质量之比即为GUS酶活，以nmol4-MU·min^-1·mg^-1protein为单位。

结果如图2所示，误差线代表标准差；a-d代表在0.05水平的差异显著性；A-C代表在0.01水平的差异显著性。以转基因株系每mg种子来源的总可溶性蛋白在单位时间内催化生成4-MU的物质的量为指标，T2代转P35S::GUS拟南芥(CaMV35S)、T2代转PPvphas::GUS拟南芥(Pvphas)、T2代转PGhαGLOA::GUS拟南芥(GhαGLOA)、T2代转PGhβGLOA::GUS拟南芥(GhβGLOA)和T2代转PGhβGLOB::GUS拟南芥(GhβGLOB)种子中GUS酶活分别为145.52、2,464.10、2,620.95、1,129.47和437.16nmol4-MU·min^-1·mg^-1protein。该结果表明，所克隆的三个陆地棉种子球蛋白基因编码区上游序列pGhαGLOA、pGhβGLOA和pGhβGLOB，均具有启动子功能，能够驱动GUS在拟南芥种子中表达。

为了客观评价各启动子在转录活性上的差异，以各启动子驱动GUS在不同株系拟南芥种子的酶活为因变量，以启动子类型为处理因素，经单因素方差分析和多重比较，发现pGhαGLOA启动子与Pvphas启动子在驱动外源基因于拟南芥种子中表达的能力上无显著差异；并且，该启动子与其它参比启动子：pGhβGLOA、pGhβGLOB和CaMV35S的差异达到极显著水平。同时，pGhβGLOA与pGhβGLOB在驱动GUS在拟南芥种子中表达的能力上差异达到显著水平，且二者和CaMV35S的差异都达到了极显著水平。

2、启动子pGhαGLOA、pGhβGLOA和pGhβGLOB的种类鉴定

1)转基因拟南芥各组织GUS染色

为了发现和比较各启动子驱动GUS在种子萌发过程中表达的差异，本研究以野生型拟南芥为阴性对照，CaMV35S启动子为组成型启动子对照，Pvphas启动子为种子特异性启动子对照。

将野生型拟南芥、种子酶活为244.12±34.98nmol4-MU·min^-1·mg^-1protein的T2代转P35S::GUS拟南芥(CaMV35S)、种子酶活为327.64±20.48nmol4-MU·min^-1·mg^-1proteinT2代转PGhαGLOA::GUS拟南芥(GhαGLOA)、种子酶活为295.53±31.82nmol4-MU·min^-1·mg^-1proteinT2代转PGhβGLOA::GUS拟南芥(GhβGLOA)、种子酶活为308.63±29.72nmol4-MU·min^-1·mg^-1proteinT2代转PGhβGLOB::GUS拟南芥(GhβGLOB)和种子酶活为574.57±27.63nmol4-MU·min^-1·mg^-1proteinT2代转PPvphas::GUS拟南芥(Pvphas)种子经表面消毒后，播种于含有草铵膦(10mg/L)的MS平板上，培养。种子“露白”当天记为1日龄，对其生长不同时期进行连续取材、GUS染色和观察拍照工作。

GUS染色结果如图3所示，A：野生型拟南芥；B：CaMV35S；C：Pvphas；D：GhαGLOA；E：GhβGLOA；F：GhβGLOB；G：F5中星号标记叶片的放大。1：胚；2：1日龄幼苗；3：3日龄幼苗；4：5日龄幼苗；5：8日龄幼苗；标尺：1mm；

可以看出，

胚：从拟南芥干种子中剥取胚，经GUS染液处理，所有转基因材料均能着蓝色。说明各启动子均能够驱动GUS在胚中的转录；

1日龄幼苗：在该时期，经过三天春化的拟南芥种子普遍“露白”，所有转基因材料的胚根部分均能着色，且种皮部分区域亦能着色；

3日龄幼苗：所有转基因材料的茎部着色不均匀，表现为茎上部(近子叶端)着色较下部(近根端)浅。CaMV35S启动子作为组成型启动子，其转基因材料包括根毛在内的整个根部着色均匀；而其余各启动子的转基因材料在根的上部(近茎端)着色较深，在根的下部(近根尖端)着色较浅，但根尖区着色较深；

5日龄幼苗：各转基因材料在茎部的着色情况同3日龄基本一致，即茎的上部着色较下部浅，这一现象在GhαGLOA启动子的转基因材料中表现的尤为明显。就根部着色的情况而言，GhβGLOA与Pvphas启动子的转基因材料表现相似，即：根部着色的区域明显大于GhαGLOA和GhβGLOB启动子的转基因材料；

8日龄幼苗：拟南芥现两片真叶，除GhβGLOB启动子的个别转基因材料真叶肉眼可见蓝色斑点(图3的G所示)外，其余种子来源启动子的转基因材料着色均与野生型的真叶一致。

从上述可以看出，总体而言，各种子贮藏蛋白基因启动子pGhαGLOA、pGhβGLOA和pGhβGLOB的转基因材料随着幼苗的生长、发育，其着色程度有逐渐下降的趋势；就各种子贮藏蛋白基因来源启动子驱动GUS在真叶和根中着色的差异而言，表现出与CaMV35S启动子明显不同的组织/器官特异性转录的特征，pGhαGLOA、pGhβGLOA和pGhβGLOB为种子特异性启动子。

2)、转基因拟南芥种子萌发阶段各时期GUS酶活荧光检测

在进行上述1)的转基因拟南芥组织化学染色的同时，同步对四种种子球蛋白基因来源启动子驱动GUS的各苗龄转基因材料取材进行GUS活性的荧光测定。

结果如图4所示，对种子萌发后1/3/5/8日龄幼苗的GUS活性荧光检测，Pvphas启动子的均值分别为600.03、100.41、56.68、10.65；GhαGLOA的均值分别为294.88、131.50、68.59、17.57；GhβGLOA的均值分别为272.31、100.61、47.51、12.53；GhβGLOB的均值分别为332.40、108.43、57.27、18.13。可以看出：随着苗龄的增加，各种子贮藏蛋白基因启动子驱动GUS在幼苗中的表达量均呈现明显的下降趋势；这一特征在Pvphas启动子上的表现尤为明显，虽然其干种子GUS酶活高于其它启动子，导致其1日龄幼苗的GUS酶活为600.03nmol4-MU·min^-1·mg^-1protein，但伴随着发育进程，其幼苗的GUS酶活迅速降低至与其它陆地棉种子贮藏蛋白基因启动子较接近的水平。综合不同苗龄幼苗GUS活性组织化学染色的结果来看，造成各启动子酶活随着发育进程呈现下降趋势的原因主要有两个方面：1.GUS在原表达区域表达量的降低：如8日龄幼苗和5日龄幼苗相比，各种子贮藏蛋白基因启动子驱动GUS在子叶中的表达量在着色程度上有所降低。2.GUS表达部位的减少：最明显的变化是，各种子贮藏蛋白基因启动子驱动GUS在真叶中已基本不再表达；并且，相对于3日龄幼苗中根部均有GUS表达的情况，8日龄幼苗中根的下部(近根尖区)GUS已基本不再表达。

上述进一步证明pGhαGLOA、pGhβGLOA和pGhβGLOB为种子特异性启动子。

3)转基因拟南芥组织GUS酶活荧光检测

将上述1)的转基因拟南芥移栽到营养土中进行培养，并对其成体植株各器官进行GUS活性的荧光测定。本次测定与上述检测种子中GUS活性的方法基本一致，不同之处在于大幅度提高了酶促反应体系中GUS粗提物与反应缓冲液的比例(1:1)，以便能够有效检出痕量的GUS活性。

果瓣(valve)的取材时期较为独特，当绿色的角果(silique)长度达到最大、不再生长时(时期17)，适时摘取并在体视显微镜下剖出未成熟种子，保留角果的果瓣和隔膜(replum)部分；并同时采摘实验所需的其它器官。取材时，为了平衡转基因株系T₂代不同单株间拷贝数可能存在的差异，每个参试样本均来源于该启动子三个以上单株的混样，且每个组织/器官均至少重复检测两次。

检测结果如表1所示：1、各启动子均能在转基因材料的根、茎、莲座叶、茎生叶等部位检出痕量的GUS酶活，如pGhαGLOA在果瓣和根中的酶活分别为1.37和0.33nmol4-MU·min^-1·mg^-1protein。2、相对于其它启动子，pGhβGLOB在莲座叶和茎生叶中的酶活略高，认为该启动子相对于其它启动子而言在叶片中的特异性欠佳，这一结果与能够观察到该启动子个别植株的真叶有GUS的特征性着色结果相一致。

在众多针对种子特异型性启动子的研究中，发现所谓种子特异性启动子，并非指其仅驱动基因在种子中表达，而是指在种子中的表达量显著高于其它组织或器官，如：在陆地棉种子球蛋白基因GhαGLOB启动子驱动下，GUS在转基因陆地棉种子中的表达量是根、花芽等器官的3,000多倍；在陆地棉LEA基因D113启动子驱动下，GUS在转基因烟草种子中的表达量高于根、叶等器官约15倍。在菜豆Pvphas启动子驱动下，菜豆蛋白(β-phaseolin)在转基因烟草种子中的表达量是其它组织的1,000倍。种子以外部位的痕量表达，与启动子3’-端序列中包含TATA框、起始子等基本启动子元件有关；而启动子上游序列中的种子特异性转录调控元件与种子细胞中相应的转录因子之间的相互作用，是造成该启动子在种子中转录活性较强的主要原因。

表1各启动子驱动GUS在成体植株的酶活

^a数值为至少两次重复的GUS酶活平均值±SD

^aValuesaremeanGUSactivity±SDfromatleasttworeplicates

Claims (7)

1.一种DNA分子，是如下1)-5)中任一种的DNA分子：

1)为序列表中序列1第1-1668位核苷酸所示的DNA分子；

2)为序列表中序列2第1-1647位核苷酸所示的DNA分子；

3)为序列表中序列3第1-1664位核苷酸所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；

5)与1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且具有相同功能的DNA分子。

2.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

3.扩增权利要求1所述DNA分子全长或其任意片段的引物对。

4.权利要求1所述DNA分子或权利要求2所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在驱动植物特定组织中目的基因表达中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述特定组织为种子。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

7.根据权利要求4-6中任一所述的应用，其特征在于：所述双子叶植物为十字花科植物，所述十字花科植物具体为拟南芥。