CN112608920A - 蒺藜苜蓿豆球蛋白基因Mt1g072600启动子PMt1g072600及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了蒺藜苜蓿豆球蛋白基因Mt1g072600启动子PMt1g072600及其应用，属于生物技术领域。本发明公开了蒺藜苜蓿豆球蛋白基因Mt1g072600启动子PMt1g072600在驱动外源基因在受体植物种子中特异性高水平表达中的应用。转基因拟南芥种子萌发过程及成体植株各组织器官的GUS组织化学染色结果表明，所克隆的编码区上游序列为种子特异性启动子。转基因拟南芥种子的GUS酶活检测结果表明，所克隆启动子驱动GUS的表达量极显著高于CaMV35S启动子，认为其可用于植物基因工程领域，驱动外源基因在转基因植物种子中高水平表达。

Description

蒺藜苜蓿豆球蛋白基因Mt1g072600启动子PMt1g072600及其 应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及蒺藜苜蓿豆球蛋白基因Mt1g072600启动子PMt1g072600及其应用。

背景技术

苜蓿属(Medicago)植物为一年生或多年生草本，其中紫苜蓿(M.sativa)素有“牧草之王”的美称，是全世界公认的重要豆科(Leguminosae)牧草。蒺藜苜蓿为二倍体常自交(predominantly self-fertilizing)植物，与紫苜蓿亲缘关系较近，作为研究豆科植物-根瘤菌共生体系(legumes-rhizobia symbiosis)的模式植物，其全基因组测序工作已完成(Branca et al.,2011；Young et al.,2011)。

种子贮藏蛋白(seed storage proteins,SSPs)是指高等植物在种子成熟过程中合成并大量储存的贮藏蛋白质，可为种子的萌发过程提供氮源、碳源和硫源。由于具有高度多态性，苜蓿种子贮藏蛋白可用于品种或种质资源间的遗传多样性分析和品种鉴定工作。相对于种子作为人类蛋白质来源的大豆(Glycine max)、菜豆(Phaseolus vulgaris)等豆科植物而言，苜蓿种子因无食用价值，其种子贮藏蛋白的种类、数量及基因信息鲜有文献报道。Stuart等(1988)采用不同pH值和离子强度的缓冲液提取紫苜蓿种子贮藏蛋白，并进行分离纯化研究，认为其种子贮藏蛋白主要为7S豌豆球蛋白(vicilin)和11S豆球蛋白(legumin)2类，分别含有表观分子量(apparentmolecularweight)为52、36、32、20kD和49、47、45、39、22、20kD的成员。种子贮藏蛋白基因的启动子为种子特异性启动子的潜在来源。

因此，提供蒺藜苜蓿豆球蛋白基因Mt1g072600启动子PMt1g072600及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了蒺藜苜蓿豆球蛋白基因Mt1g072600启动子PMt1g072600及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

蒺藜苜蓿豆球蛋白基因Mt1g072600启动子PMt1g072600，其核苷酸序列如SEQ IDNO.15所示。

进一步，所述的蒺藜苜蓿豆球蛋白基因Mt1g072600启动子PMt1g072600在驱动外源基因在受体植物种子中特异性高水平表达中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了蒺藜苜蓿豆球蛋白基因Mt1g072600启动子PMt1g072600及其应用，种子贮藏蛋白为高等植物种子成熟过程中合成并贮存的大量贮藏蛋白质的总称，其基因的启动子是种子特异性启动子的重要来源。为发掘双子叶植物种子特异性启动子，本发明以蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)为试材，克隆其豆球蛋白基因Mt1g072600编码区上游2075bp序列，利用工具网站PLACE和PlantCARE预测顺式作用元件，构建其驱动GUS的植物表达载体并进行拟南芥的遗传转化。结果表明，该编码区上游序列含有E-box、A/T rich element、P-box等多个种子特异性启动子相关顺式作用元件，命名为PMt1g072600；转基因拟南芥种子(Arabidopsis thaliana)中GUS表达情况分析，发现PMt1g072600驱动GUS的表达量极显著地高于PCaMV35S。转基因拟南芥各组织/器官的组织化学染色结果表明PMt1g072600驱动GUS表现出组织/器官表达的特异性。本发明成功克隆了蒺藜苜蓿来源的种子特异性启动子，可用于驱动外源基因在转基因植物种子中表达。

本发明获得了能够驱动外源基因在受体植物种子中特异性表达的种子特异性启动子，为实现外源基因表达的定时、定位、定量的精确“三维”调控，避免由于与受体植物内源性启动子的同源性而存在转基因沉默风险提供候选启动子资源。

本发明启动子驱动GUS的表达量极显著地高于PCaMV35S，认为该启动子可应用于种子生物反应器，驱动医药、饲料或工业用酶基因在双子叶植物中高效率表达。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明Mt1g072600编码区上游序列的PCR扩增结果；

其中，M:DNA分子量标准；1:Mt1g072600编码区上游序列扩增产物；

图2附图为本发明Mt1g072600编码区上游序列；

其中，方框或下划线示顺式作用元件，+1示转录起始位点；

图3附图为本发明植物表达载体pEXPR(PMt1g072600::GUS::T35S)示意图；

图4附图为本发明转基因拟南芥PCR检测的部分结果；

其中，M:DNA分子量标准；1-6:转基因拟南芥株系编号；CK:野生型拟南芥阴性对照；

图5附图为本发明转基因拟南芥种子中GUS酶活；

图6附图为本发明转基因拟南芥的GUS组织化学染色；

其中，A：野生型；B：PCaMV35S；C：PMt1g072600；1：胚；2：3日龄幼苗；3：9日龄幼苗；4：根；5：茎；6：莲座叶；7：茎生叶；8：果瓣；9：花；10：花序；标尺：1mm。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

蒺藜苜蓿R108、拟南芥(Arabidopsis thaliana)Col0种子由本实验室保存。

入门载体pENTRY(PCaMV35S::GUS::T35S)、目的载体pEarleyGate303均为本实验室保存。

其中，pENTRY(PCaMV35S::GUS::T35S)载体构建过程如下：

(1)合成linker-1/2

linker-1：

AATTCGCCCTTGCGATCGCATGCGACTGCGGCCGCTCAGTGCACCCGGGCATGTCATGGCGCGCCAAGGGCG；SEQ ID NO.1；

linker-2：

AATTCGCCCTTGGCGCGCCATGACATGCCCGGGTGCACTGAGCGGCCGCAGTCGCATGCGATCGCAAGGGCG；SEQ ID NO.2；

(2)用EcoRI对Invitrogen公司产品

(货号：K250020SC)进行酶切。

(3)linker-1/2退火形成具有粘性末端的双链后，连入

的酶切后载体大片段，命名为pENTR-MCS。

(4)用T35S(F)/(R)对pCAMBIA2300进行PCR扩增，获得CaMV35S终止子；

T35S(F)：5’-CCCGGGCGGCCATGCTAGAGTCCGCA-3’；SEQ ID NO.3；

T35S(R)：5’-GGCGCGCCATGTCACTGGATTTTGGTTT-3’；SEQ ID NO.4；

(5)将CaMV35S终止子和pENTR-MCS用XmaI/AscI双酶切，将CaMV35S终止子连入pENTR-MCS的酶切后载体大片段，命名为pENTR-MCS-T35S；

(6)用引物P35S(F)/P35S(R)对pMON82053进行PCR扩增，获得P35S；

P35S(F)：5’-GCGATCGCGTCCGATGTGAGACTTTTC-3’；SEQ ID NO.5；

P35S(R)：5’-GCGGCCGCCCTCTCCAAATGAAATGAAC-3’；SEQ ID NO.6；

pMON82053记载在如下文献中：Expression ofthe Arabidopsis thaliana BBX32gene in soybean increases grainyield.PLoS One.2012；7(2):e30717.doi:10.1371/journal.pone.0030717。

(7)将P35S和pENTR-MCS-T35S用AsiSI/NotI双酶切，将P35S连入pENTR-MCS-T35S的酶切后载体大片段，命名为pENTR-P35S。

(8)用引物GUS(F)/GUS(R)对pBI121进行PCR扩增，获得GUS片段；

GUS(F)：5’-GCGGCCGCATGTTACGTCCTGTAGAAAC-3’；SEQ ID NO.7；

GUS(R)：5’-CCCGGGTCATTGTTTGCCTCCCTGCT-3’；SEQ ID NO.8；

(9)将GUS片段和pENTR-P35S用NotI/XmaI双酶切，将GUS片段连入pENTR-P35S的酶切后大片段，命名为pENTRY(PCaMV35S::GUS::T35S)。

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101(pMP90)感受态细胞购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司。

Zero Cloning Kit购自北京全式金生物技术有限公司，

LR Clonase^TM II Enzyme Mix购自Invitrogen life technology公司，

GXL DNA Polymerase购自宝日医生物技术(北京)有限公司，MonClone^TMHi-Fusion Cloning Mix V2购自莫纳生物科技有限公司，限制性核酸内切酶购自NEB(北京)有限公司。多糖多酚植物基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，微柱浓缩DNA凝胶回收试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司。

实施例1目的基因编码区上游序列克隆

(1)蒺藜苜蓿总DNA的提取

以蒺藜苜蓿R108幼苗的叶片为试材，参照多糖多酚植物基因组DNA提取试剂盒说明书提取总DNA。

(2)目标基因发掘及其编码区上游序列扩增引物设计

以检索式name:"seed storage protein"organism:"medicago truncatula"检索UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)。选择注释为“Legumin storage protein”的一个基因为研究对象。使用其对应的基因名MTR_1g072600做为关键词，检索EnsemblPlants(http://www.plants.ensembl.org/)网站的蒺藜苜蓿基因组序列信息(Howe et al.,2020)。下载该基因编码区上游3kb的核酸序列作为参考，进行引物设计。本发明使用的引物信息见表1。

蒺藜苜蓿的拉丁名是Medicago truncatula，MTR_1g072600是网站基因组数据库网站对该基因的命名，MTR为拉丁名缩写，本发明将该拉丁名缩写为Mt，该基因简写为Mt1g072600。

表1引物信息

(3)PCR扩增及扩增产物克隆

反应体系：5×PrimeSTAR GXL Buffer 10μL，dNTP Mixture 4μL，1g072600(F)1μL，1g072600(R)1μL，总DNA模板1μL，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1μL，灭菌超纯水32μL。

反应程序：95℃5min；98℃15s，60℃20s，68℃2min，30个循环；68℃5min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，结果见图1，获得与预期分子量(2075bp)大小一致的目标条带。切胶，利用微柱浓缩DNA凝胶回收试剂盒回收目标条带。参照

Zero Cloning Kit试剂盒说明书连接至

Zero克隆载体。挑取单克隆菌落，采用引物1g072600(F)/1g072600(R)进行菌液PCR鉴定后送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，编码区上游序列见SEQ ID NO.15。

CTGATTGCTCAAAAGACTTCCTGAACATAGTTGATATGAAAGTTTATAGAAGTTGTGTAACTTGGACTTTCGAATAACCCTAGACGTTGATTTTTGAAAATCTTCGAAATAGCAGTCTTCGAACTTCTGGCTTGTTCTCGATCTTTGAAAAAAATGAACCTAGTTCGCTCGAAACTTTGTTATTAAAAATTTGCATATAACAGACTGAGATTTTCAAACGAGAGGCTACCCCTGCAATGAGATTGCCTCAATAGATAAGGTAAGTTGCACCAAATTAAAAGGACTGGATCTTAGACAATTGATGTACATTAGCTCCTATTAGTTTGTGTCTCTTTCTCTATAATAACTGATACCTTAGTTCGACATACAAATCTATATTTAAATAACTAATTAATCAATGGTTAACAAAAATAAGTTCACAGTAAAAATTGAAATCAACCATTGATATAAGTTGGTAAACTTGATTCAAGTTTATGTATTTATCGGTTGATATTAAGTGATTAAACGTAATTGGTAATTTATTTTGCACTTAAGTTTAGTTAAAACATAAAAGTAGGATGGTACAGATACCATCTAAACTGAAAATCATATGTTAGACTTGATATCTGCTTGAATCATAATTTTTTTGTTTTCAATGTTGTATGCTATCAGCATCACAGGCCATTGCGACCACCACTTGAACTCTGATGATAATACTCTATTAAGAGTGAACTTTGTAAGGGAGGTGGATGAATTGTTGCAAGAGGTTTGTTCGGAACATGACGAAGAAGAGAATGAACATGAGTTTAGTCCTGATACAGTTGCAAATAGATTAAAACAACAGGAGAAGCAACAACAATACACGTAGAAGGTTGTTTTTTTATTTACATATATTTGTTCAGTTGTCTTATAGTTTTGAATAGAAATTAGTATGCAGTGAGTGCAGAAAGGACACAAAAATGTAGACATGGAAATTTTTGGATTATCATGTGTTTTTAAAGGTAAAGGTATGTTAGAAATTGAGTTTTTGAATTTTATTTTATACATCTATGTACATCTGGTGAGTCCACCCAGTATTTTCTAGCATGTTTGGTTTTGTGGTGGTGAAAATGAATTTTAGTTAAAACTTTAAAGTCATGAGTTGAATGTACATTGGTCTATGTTTATATACATTTACATAAATGTGTTCAACAATAATTTGAAGTTAAAAATCTTATAAAGAGGCAAAACATCTAATTACATATTTGAGCTAGAATTTATTTTATAGAACGCTTAAATATATCAAGCAATTTTAATTTATGTGTCTAGAATATTTTTGGATCTTACAAAAGGGAATCCAAATATGCACCAAATGCACTGCATTGATTTAAACATCAATGACAACAATCAACCTGAATTCTCTAGAGCTTACTTGAATTCAAACAACTGGAAGGTAAATACTGAACTTTCAGAGCATAAATTTTAAGAGATTAAGTTATATATGCACTGATGGTGTAAAAAAAATTTTTTACAAACGCATGCAATCAAACTATATCATACTTTTATAAGTTAGATTTTAAAATATTTCTATTTTGATGCATGAGTAAAAATGTTTTACGCTTAAGTTATGCTGTTTCTGTTGCGAAGGCTACAGATTGATAATAACAAAGAGAGGTACTATTAAGCTAGAATTTCTACTTTAATCACTACATACATCTATATATTTGAGTCTGAGCAACACTGTTACTGCTTAATGAAAACTGTAAATGAATTAAGTAAAGTGAAAAAGAAGTAATGATATCAACATGTAAAGAATCGACGCAGAATGCATGGGACCATCCCATGCCATATACATTTGTTCTCATTCATTTAACTGCAGTCATGATTCCATATGTAAAGATACCAACAAATATACACTCTGTGATGTCTCTGTGCACATATATCTTAATGTGATGTGTAGGAAATTAAGAATTCATAGGCATGCATGGTGAAGAATGTCATGAACTAGCAACCTACACTGTGTGACGTGTCCCTTCCTCACTCTTCTCTTCTTACTATAAATCACCACTCCACAGGTTCTTCTCTTCACCAATTCATTCACCAAACTCACAAACACA；SEQ ID NO.15。

(4)编码区上游序列的生物信息学分析

将测序结果与已公开蒺藜苜蓿基因组Mt1g072600编码区上游序列进行比对，本发明所克隆序列与其一致率为100％，证明所克隆序列为Mt1g072600编码区上游序列。使用PLACE(https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/？action＝new place)网站的在线工具，对所克隆序列中启动子相关顺式作用元件进行分析和注释工作，结果见图2。图2结果显示：所克隆编码区上游序列含有E-box、A/T rich element、P-box等多个种子特异性启动子相关顺式作用元件，初步认为所克隆序列具有种子特异性启动子功能，命名为PMt1g072600。

实施例2编码区上游序列驱动GUS表达载体的构建

以测序正确的克隆载体为模板，使用1g072600(IF)/1g072600(IF)进行PCR扩增，扩增体系及程序同实施例1，经电泳分离后，切胶回收目标基因编码区上游序列。入门载体pENTRY(PCaMV35S::GUS::T35S)用AsiSⅠ/NotⅠ双酶切切除PCaMV35S启动子片段，经电泳分离后，切胶回收载体骨架。参考MonClone^TM Hi-Fusion Cloning Mix V2试剂盒方法，将编码区上游序列及载体骨架进行连接反应。将测序正确的重组入门载体命名为pENTRY(PMt1g072600::GUS::T35S)。参考

LR Clonase^TM II Enzyme Mix试剂盒说明书将入门载体pENTRY(PCaMV35S::GUS::T35S)或pENTRY(PMt1g072600::GUS::T35S)与目的载体pEarleyGate303进行LR重组反应，获得表达载体pEXPR(PCaMV35S::GUS::T35S)和pEXPR(PMt1g072600::GUS::T35S)(图3)。

实施例3农杆菌工程菌株的获得及拟南芥的遗传转化

1)pEXPR(PCaMV35S::GUS::T35S)、pEXPR(PMt1g072600::GUS::T35S)采用冻融法转化农杆菌GV3101(pMP90)感受态细胞，获得根癌农杆菌工程菌株GV3101[pEXPR(PCaMV35S::GUS::T35S)]和GV3101[pEXPR(PMt1g072600::GUS::T35S)]。

2)拟南芥的遗传转化

使用根癌农杆菌工程菌株GV3101[pEXPR(PCaMV35S::GUS::T35S)]和GV3101[pEXPR(PMt1g072600::GUS::T35S)]分别对野生型拟南芥Col0进行蘸花法转化，具体步骤如下：

(1)以转化的当天为T日；在“T-2”日夜晚，挑取农杆菌工程菌单克隆，接种于10mLYEB+Rif50 mg/L+Kan 50mg/L+Gent 50mg/L；28℃，220rpm培养24h；在“T-1”日夜晚，以1:100的比例扩大培养。

(2)配制浸染液(1L)：MSB₅干粉(Phytotech公司，货号M404)2.2g，蔗糖50g，6-BA0.044μmol/L，Silwet L-77200μL，pH 5.7。

(3)T日中午，待农杆菌OD₆₀₀＝1时，停止摇菌；4,000rpm离心15min，富集菌体。

(4)将菌体沉淀用浸染液重新悬浮，调整菌液OD₆₀₀＝0.8-1.0。

(5)将野生型拟南芥剪去果荚，将花序浸入浸染液恰好30s。

(6)将浸染完毕的拟南芥侧放在大塑料托盘的底部。避光14h左右后正常培养。

3)拟南芥种子的收获、筛选及PCR检测

(1)待果荚成熟、干枯变黄后，双手佩戴乳胶手套，剪下果枝，通过适当揉搓，使种子掉落在干净的报纸上。采用适当方式，去除果荚后，将干净的种子倒入装有适量干燥硅胶的离心管中，4℃保存。在操作过程中，应勤换手套，避免种子的交叉污染。

(2)T₁代种子，可直接撒播在营养土中，待长出四片真叶后，用5,000倍稀释的20％(W/V)Basta间隔3-4天喷施于叶片表面。T₂/T₃代种子，可播在含有8-10mg/L的草铵膦平板上筛选。

采集经

抗性筛选呈阳性的T₁代拟南芥幼苗，提取其基因组DNA，利用引物GUS(F)/GUS(R)进行GUS序列的PCR检测。

PCR反应体系：5×PrimeSTAR GXL Buffer 10μL，dNTP Mixture 4μL，GUS(F)1μL，GUS(R)1μL，总DNA模板1μL，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1μL，灭菌超纯水32μL。

PCR反应程序：95℃5min；98℃15s，60℃20s，68℃2min，30个循环；68℃5min。

结果表明，上述农杆菌经转化分别获得13和15株转基因阳性材料，部分植株PCR检测结果如图4所示。

实施例4GUS活性的检测

一、Mt1g072600编码区上游序列驱动GUS在转基因拟南芥成熟种子中表达的活性分析

(1)试剂配制

A、0.2M磷酸钠缓冲液(pH7.0)

0.2MNa₂HPO₄取305ml，0.2M NaH₂PO₄取195ml。

0.2M NaH₂PO₄溶液：11.998g NaH₂PO₄(CAS:7558-80-7,MW＝119.98)溶于500ml水。

0.2M Na₂HPO₄溶液：14.196g Na₂HPO₄(CAS:7558-79-4,MW＝141.96)溶于500ml水。

B、10％SDS溶液

将90ml水稍微加热，加10g SDS，搅拌溶解，加入NaOH调节PH至7.2，然后加水定容至100ml。

C、0.5M EDTA(pH8.0)

在80ml水中加入18.61g Na₂EDTA·2H₂O(乙二胺四乙酸二钠盐,CAS:6381-92-6,MW:372.24)，用NaOH调PH至8.0(约需2g左右的固体NaOH)，溶解后定容至100ml。

D、Gus提取缓冲液

50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)，10mM EDTA，0.1％Triton X-100，0.1％SDS，10mMβ-巯基乙醇，4℃保存。

配法：0.2M磷酸钠缓冲液(pH7.0)取250ml；10％SDS取10ml；0.5M EDTA(pH8.0)取20ml；TritonX-100取1ml；β-巯基乙醇1ml；用水定容至1L。

E、反应缓冲液(1mM MUG)

称取0.1219g MUG(4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucuronide,C₁₆H₁₆O₉·3H₂O,CAS:6160-80-1,MW:406.4)，溶于300ml Gus提取缓冲液中，4℃可保存2周。

F、反应终止液(0.2mol/LNa₂CO₃)

称21.198gNa₂CO₃(CAS:497-19-8,MW＝105.99)，用水定容到1L。

G、考马斯亮蓝G₂₅₀溶液

考马斯亮蓝G₂₅₀0.01g，95％乙醇5ml，H₃PO₄10ml，定容至100ml，过滤后4℃保存。

H、0.25mg/ml BSA母液

0.0125g BSA，用Gus提取缓冲液定容至50ml。

I、1mM 4-MU

称取0.008808g 4-MU(4-甲基伞形酮,CAS:90-33-5,MW＝176.17)，用反应终止液定容至50ml。4℃避光可贮存1个月，贮存过程中可能结晶。

(2)实验方案

①Gus提取

取2mg拟南芥种子，液氮速冻后砸样粉碎；加入500μl Gus提取缓冲液，振荡提取5min；13,000rpm，4℃离心10-15min，将上清转至另一洁净的Ep管，冰上放置待用。

②蛋白定量(Bradford法)购买塑料微量比色皿

A、制作标准曲线

定量要求(康为世纪BCA蛋白定量试剂盒)

BCA法测定蛋白浓度时，吸光值会随着时间的延长不断加深。因此所有样品测定需在3-5分钟内完成，否则会影响蛋白定量的准确度。推荐每个测定的样本做2-3个平行反应。

取6个Ep管，按照下表配制溶液。

加入考马斯亮蓝G250溶液，充分混匀，室温静置5min。用紫外分光光度计测定595nm处的吸收值。以吸收值A595对蛋白浓度(μg/ml)作图绘制标准曲线。

B、取待测蛋白样品5μl，加245μl Gus提取缓冲液，加入1.25ml考马斯亮蓝G250溶液，充分混匀，室温静置5min。用紫外分光光度计测定595nm处的吸收值。代入公式，求出蛋白样品的浓度。

注：该方法涉及的试剂体积，综合考虑了样品蛋白提取效率、比色皿装样量，参考了李圣彦实验室博士论文。BSA和样品全部用Gus提取缓冲液处理待预实验结果。考虑取液精确，调整了BSA母液浓度。需用微量比色皿。

③酶反应

将Gus反应缓冲液于37℃预热；取EP管，各加入1.96ml反应终止液，以反应时间编号，待用；取5μl蛋白上清，加入995μl 37℃预热的反应缓冲液，37℃温浴。在0min、20min、40min和60min分别取混合反应物40μl加入到1.96ml反应终止液，室温避光保存。

④荧光测定

A、制作标准曲线

按上表配制溶液，用荧光分光光度计在激发波长365nm、发射波长455nm，狭缝10nm下，测定各样品荧光，以反应终止液为空白溶液，以荧光值对4-MU浓度作图，绘制标准曲线。

B、用荧光分光光度计在激发波长365nm、发射波长455nm，狭缝10nm下，以0min管为空白，测定不同时间点样品的荧光强度值。

(3)酶活计算

A、测量样品不同反应时间的荧光强度值。根据4-MU标准曲线计算4-MU的物质的量浓度。用4-MU的物质的量浓度对反应时间做图，斜率即为单位时间内4-MU的生成量(物质的量浓度)。

B、单位时间内4-MU的生成量(物质的量浓度)乘以测量时的体积为4-MU的物质的量。

C、该数值需除以粗蛋白的质量得最终酶的比活力。

D、如nmol 4-MU·mg protein^-1·min^-1

以组成型启动子PCaMV35S为对照，测定T₂代转基因拟南芥种子的GUS酶活。以转基因株系每mg种子来源的总可溶性蛋白在单位时间内催化生成4-MU(4-甲基伞形酮)的物质的量为指标，结果(图5)显示，所克隆Mt1g072600编码区上游序列具备启动子功能，可以驱动GUS在转基因受体材料种子中表达。以启动子类型为处理因素，以PCaMV35S(13个独立转化事件)和PMt1g072600(15个独立转化事件)驱动GUS在不同株系转基因拟南芥种子的酶活为因变量，对酶活数据进行单因素方差分析：P值(P-value)＝9.27×10^-10<0.01，且F(检验统计量)＝81.05>F crit(检验临界值)＝7.64，说明PMt1g072600驱动GUS在拟南芥种子中的转录活性极显著地高于植物基因工程常用的PCaMV35S。

二、PMt1g072600驱动GUS在转基因拟南芥种子萌发过程中的染色观察GUS活性的组织化学染色与脱色

在适当容器中，将待染色植物材料没入GUS染液，抽真空1h，37℃染色30min至过夜。待植物材料充分着色后，使用脱色液[乙酸：乙醇＝3:1(V/V)]对进行脱色。脱色过程中需勤换脱色液，切忌加热。

GUS染液配方

(1)母液

A、0.2M磷酸钠缓冲液(pH7.0)

0.2MNa₂HPO₄取305ml，0.2M NaH₂PO₄取195ml。

0.2M NaH₂PO₄溶液：11.998g NaH₂PO₄(CAS:7558-80-7,MW＝119.98)溶于500ml水。

0.2M Na₂HPO₄溶液：14.196g Na₂HPO₄(CAS:7558-79-4,MW＝141.96)溶于500ml水。

B、0.5M EDTA(pH8.0)

C、0.1M铁氰化钾(MW＝329.24)

取1.647g铁氰化钾，定容至50ml。

D、0.1M亚铁氰化钾(MW＝422.39)

取2.112g亚铁氰化钾，定容至50ml。

E、X-Gluc 10mg/ml

DMSO助溶(10ml溶液约需4ml DMSO)

F、Triton X-10020％

(2)工作液

Mt1g072600基因组注释为种子贮藏蛋白基因，其启动子序列推测为种子特异性启动子，为了观察其驱动GUS在种子萌发过程中的表达模式，以野生型拟南芥种子为阴性对照，以PCaMV35S驱动GUS转基因种子为阳性对照，将种子消毒后播种于MS平板，并于适当时期移栽至土壤中进行常规管理。以种子露白当天记为1日龄，开展种子萌发不同时期和成体植株各器官的取材、GUS组织化学染色工作，结果见图6。

图6结果表明：pEXPR(PMt1g072600::GUS::T35S)转基因拟南芥3日龄幼苗的茎部、子叶部有GUS表达，而根部无表达；9日龄幼苗仅在子叶中观察到较弱的蓝色；在成体植株各器官，除果瓣的端部有GUS表达外，其余均为GUS染色阴性。认为Mt1g072600启动子PMt1g072600为种子特异性启动子，其幼苗中GUS染色阳性的器官(子叶、茎)为种子发育阶段PMt1g072600驱动GUS转录及表达的产物，因PMt1g072600无法驱动GUS在除种子以外的其它器官转录，随着幼苗生长，子叶、茎部位的GUS被逐步降解或稀释，在成体植株各器官无法检出。

本发明基于蒺藜苜蓿基因组测序及注释结果，克隆了注释为种子贮藏蛋白的Mt1g072600编码区上游2075bp序列，构建其驱动GUS的植物表达载体，并进行拟南芥的遗传转化。转基因拟南芥种子萌发过程及成体植株各组织器官的GUS组织化学染色结果表明，所克隆的编码区上游序列为种子特异性启动子。转基因拟南芥种子的GUS酶活检测结果表明，所克隆启动子驱动GUS的表达量极显著高于CaMV35S启动子，认为其可用于植物基因工程领域，驱动外源基因在转基因植物种子中高水平表达。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 河南科技学院

<120> 蒺藜苜蓿豆球蛋白基因Mt1g072600启动子PMt1g072600及其应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

aattcgccct tgcgatcgca tgcgactgcg gccgctcagt gcacccgggc atgtcatggc 60

gcgccaaggg cg 72

<210> 2

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

aattcgccct tggcgcgcca tgacatgccc gggtgcactg agcggccgca gtcgcatgcg 60

atcgcaaggg cg 72

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

cccgggcggc catgctagag tccgca 26

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ggcgcgccat gtcactggat tttggttt 28

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

gcgatcgcgt ccgatgtgag acttttc 27

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

gcggccgccc tctccaaatg aaatgaac 28

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

gcggccgcat gttacgtcct gtagaaac 28

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

cccgggtcat tgtttgcctc cctgct 26

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

ctgattgctc aaaagacttc ctg 23

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

tgtgtttgtg agtttggtga at 22

<210> 11

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

cgaattcgcc cttgcgatcg cctgattgct caaaagactt cctg 44

<210> 12

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

ctacaggacg taacatgcgg ccgctgtgtt tgtgagtttg gtgaat 46

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

cgccgatgca gatattcgta a 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

aaagtcccgc tagtgccttg t 21

<210> 15

<211> 2075

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

ctgattgctc aaaagacttc ctgaacatag ttgatatgaa agtttataga agttgtgtaa 60

cttggacttt cgaataaccc tagacgttga tttttgaaaa tcttcgaaat agcagtcttc 120

gaacttctgg cttgttctcg atctttgaaa aaaatgaacc tagttcgctc gaaactttgt 180

tattaaaaat ttgcatataa cagactgaga ttttcaaacg agaggctacc cctgcaatga 240

gattgcctca atagataagg taagttgcac caaattaaaa ggactggatc ttagacaatt 300

gatgtacatt agctcctatt agtttgtgtc tctttctcta taataactga taccttagtt 360

cgacatacaa atctatattt aaataactaa ttaatcaatg gttaacaaaa ataagttcac 420

agtaaaaatt gaaatcaacc attgatataa gttggtaaac ttgattcaag tttatgtatt 480

tatcggttga tattaagtga ttaaacgtaa ttggtaattt attttgcact taagtttagt 540

taaaacataa aagtaggatg gtacagatac catctaaact gaaaatcata tgttagactt 600

gatatctgct tgaatcataa tttttttgtt ttcaatgttg tatgctatca gcatcacagg 660

ccattgcgac caccacttga actctgatga taatactcta ttaagagtga actttgtaag 720

ggaggtggat gaattgttgc aagaggtttg ttcggaacat gacgaagaag agaatgaaca 780

tgagtttagt cctgatacag ttgcaaatag attaaaacaa caggagaagc aacaacaata 840

cacgtagaag gttgtttttt tatttacata tatttgttca gttgtcttat agttttgaat 900

agaaattagt atgcagtgag tgcagaaagg acacaaaaat gtagacatgg aaatttttgg 960

attatcatgt gtttttaaag gtaaaggtat gttagaaatt gagtttttga attttatttt 1020

atacatctat gtacatctgg tgagtccacc cagtattttc tagcatgttt ggttttgtgg 1080

tggtgaaaat gaattttagt taaaacttta aagtcatgag ttgaatgtac attggtctat 1140

gtttatatac atttacataa atgtgttcaa caataatttg aagttaaaaa tcttataaag 1200

aggcaaaaca tctaattaca tatttgagct agaatttatt ttatagaacg cttaaatata 1260

tcaagcaatt ttaatttatg tgtctagaat atttttggat cttacaaaag ggaatccaaa 1320

tatgcaccaa atgcactgca ttgatttaaa catcaatgac aacaatcaac ctgaattctc 1380

tagagcttac ttgaattcaa acaactggaa ggtaaatact gaactttcag agcataaatt 1440

ttaagagatt aagttatata tgcactgatg gtgtaaaaaa aattttttac aaacgcatgc 1500

aatcaaacta tatcatactt ttataagtta gattttaaaa tatttctatt ttgatgcatg 1560

agtaaaaatg ttttacgctt aagttatgct gtttctgttg cgaaggctac agattgataa 1620

taacaaagag aggtactatt aagctagaat ttctacttta atcactacat acatctatat 1680

atttgagtct gagcaacact gttactgctt aatgaaaact gtaaatgaat taagtaaagt 1740

gaaaaagaag taatgatatc aacatgtaaa gaatcgacgc agaatgcatg ggaccatccc 1800

atgccatata catttgttct cattcattta actgcagtca tgattccata tgtaaagata 1860

ccaacaaata tacactctgt gatgtctctg tgcacatata tcttaatgtg atgtgtagga 1920

aattaagaat tcataggcat gcatggtgaa gaatgtcatg aactagcaac ctacactgtg 1980

tgacgtgtcc cttcctcact cttctcttct tactataaat caccactcca caggttcttc 2040

tcttcaccaa ttcattcacc aaactcacaa acaca 2075

Claims (2)

1.蒺藜苜蓿豆球蛋白基因Mt1g072600启动子PMt1g072600，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

2.权利要求1所述的蒺藜苜蓿豆球蛋白基因Mt1g072600启动子PMt1g072600在驱动外源基因在受体植物种子中特异性高水平表达中的应用。

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