CN104822834A

CN104822834A - 毛状体特异性启动子

Info

Publication number: CN104822834A
Application number: CN201380062599.5A
Authority: CN
Inventors: 保罗·约翰·迪尔加德; 马里纳斯·威兰姆·普林斯; 马丁·德·福斯
Original assignee: Triumphant King Co
Current assignee: Triumphant King Co; Keygene NV
Priority date: 2012-11-30
Filing date: 2013-11-29
Publication date: 2015-08-05
Also published as: WO2014084739A1; ES2651714T3; AU2013352636A1; BR112015012270A2; JP2015536152A; IL238591A0; US20150315602A1; EP2925869A1; US9856486B2; EP2925869B1; CA2889710A1

Abstract

本文提供了毛状体特异性植物启动子。本文还提供了包含这样的毛状体-特异性启动子的转基因细胞和有机体，尤其是植物细胞和植物，或包含这样的毛状体-特异性启动子的嵌合基因或载体。本发明进一步提供了利用毛状体特异性启动子在细胞和有机体中表达核酸序列的方法。

Description

毛状体特异性启动子

技术领域

本发明涉及毛状体特异性植物启动子及其用途。该启动子可被用于在毛状体细胞表达同源或异源蛋白，或用于表达活性核酸分子，例如正义和/或反义RNA。提供了具有启动子活性的核酸序列、以及嵌合基因、载体和重组(转基因)细胞以及包含它们的有机体。还提供了用于制备包括该启动子的转基因细胞和有机体的方法，尤其是植物和植物细胞。该启动子被用作在毛状体生产各种化合物，例如杀虫剂、挥发性油、香料或芳香剂、药物组分、细胞毒性蛋白等等。

背景技术

毛状体是植物中表皮的各种产物，包括分支和未分支的毛、囊泡、钩刺和螫毛。毛状体有桩支撑的(staked)、多细胞突出结构，其被认为在植物自我保护以抵抗食草动物中是重要的，而且还可以抵抗由于蒸腾作用和UV辐照造成的水分丧失(Mauricio&Rausher,1997,Evolution 51,1435 Wagner等人2004,Ann Bot 93,3)，并且作为毒性重金属和异型生物质的储槽(Salt等人,1995,植物Phys 109,1427；Domínguez-Solís等人2001,J Biol Chem 276,9297；Gutiérrez-Alcalá等人，2000,PNAS 97,11108)。

含有多重次生化合物的腺毛存在于许多茄属物种的叶子上，并且其对于多重害虫具有抗性的作用已被充分记载。番茄中的腺毛含有大量的萜烯(van der Hoeven等人,植物细胞.2000,vol.12(11):2283-2294)和甲基酮(Fridman等人,Plant Cells 2005,vol.17(4):1252-1267)。已将毛状体分类为I至VII型(Luckwill,1943,Aberdeen UniversityPress,UK)，其中I、IV、VI和VII为腺毛型，而II、III和V型为非腺型。IV、V和VI型是在野生番茄多毛番茄(S.habrochaites)中普遍存在的毛状体(Simmons和Gurr,2005,Agricultural and Forest Entomol 7,265)。在潘那利番茄(S.pennelli)中，对害虫的抗性主要与覆盖植物的所有部分的IV型腺毛的化学性质和密度有关(Simmons等人,2003Aus J Entomol 43,196；2004,Entomol Exp App 113,95)。当物理地除去腺毛的渗出液时，害虫存活且寿命增加而死亡率和诱捕减少(Simmons和Gurr,2005,Agricultural and Forest Entomol 7,265)。IV和VI型毛状体与害虫控制(pest control)正相关。

已经开发了无腺毛的棉花胚珠作为具有较高经济重要性的生物技术的靶标(Kimand Triplett,2001,Plant Physiol 127,1361)。腺毛分泌多种植物化学成分的能力，例如在潘那利番茄中分泌酰基糖和在多毛番茄中分泌甲基酮和萜烯，使得这些结构可能适合用于生物技术应用并为毛状体提供基于害虫管理的机会。

毛状体中的蛋白表达能够被用于生产有用的化合物，例如杀虫剂、药物组分、挥发性油、香料和芳香剂(Callow,2000Advances in botanical research eds.Hallahan和Gray,San Diego Academic Press；Wagner 2004 Ann Bot 93,3)。为了产生在毛状体中特有的组分，调节植物毛状体中的基因表达是必需的。专门的结构或细胞中直接蛋白表达的可能性避免了干扰植物代谢途径和由此干扰植物的性能。

组成性的强启动子例如公知的花椰菜花叶病毒(Cauliflower Mosaic Virus)启动子(CaMV 35S)启动子通常被用于异位-表达研究。然而，这种类型的启动子并不是非常适合用于特异性的表达和可能的植物性毒素化合物，例如萜烯。而且，代谢库的耗尽也会是个问题。

Gutierrez-Alcala(2005,J Exp Bot 56,2487)描述了拟南芥OASA1基因的启动子，其在烟草的现状和非腺毛中具有活性。

Wang等人(2002,J Exp Bot 53,1891)描述了来自烟草P450基因CYP71D16的毛状体特异性启动子，其显示出在所有发育阶段在烟草腺毛中表达。

WO2004/111183描述了来自番茄和烟草叶子的毛状体特异性启动子。然而，在WO2004/111183中描述的测试转基因在表达不是毛状体特异性(例如，在叶脉中的额外表达)和表达较弱的意义上来看没有获得令人满意的结果。

WO2009/082208描述了来自番茄的毛状体-特异性启动子。尽管这些启动子已经显示出严格的毛状体-特异性，但它们的活性相对较低。

尽管已经分离出毛状体特异性启动子，但它们均未显示出毛状体-特异性和高启动子活性的组合。显然还需要高活性毛状体-特异性或毛状体优选的启动子。而且，理想地应该鉴定若干这种启动子，以成功地基因改造毛状体中有用化合物的生产。这些化合物的生物合成经常需要使用多个基因，并且因此这些多个基因在毛状体中表达是理想的，优选利用各种启动子。

这样的新型植物启动子理想地应该满足以下要求：i.器官/组织特异性，该启动子应该对于避免在其它组织(例如，可食部分)中潜在不希望得到的化合物生产具有严格毛状体-特异性；ii.高启动子活性。

本发明提供了毛状体特异性转录调控序列，其适合用于可操作连接的核酸分子在腺体和非腺毛中的直接表达，尤其是在各种植物表明(地上部分，例如叶、茎、花器官)上的腺毛中，同时，在一些物种中，植物表面(例如果实和种子)没有它们的身影。在大多数被子植物以及一些裸子植物和苔藓类植物的地上表面上存在简单的毛状体(Wagner等人2004,Ann Bot 93,3)。在被子植物中，根据物种的不同，毛状体可存在于叶、花瓣、叶柄、梗、茎和种皮上。在大约30％的维管植物中发现了腺毛(Dell和McComb,1978,Adv Bot Res 6,227；Fahn,2000,Adv Bot Res 31,37)。

发明内容

本文提供了ShzFPS、ShZIS和ShTPS9启动子的核酸序列、核酸序列的片段、用途和应用。

提供了包含整合到其基因组中的嵌合基因的转基因植物或植物细胞或植物组织或器官，其特征在于，该嵌合基因包含操作性连接于同源或异源核酸序列的毛状体特异性启动子，其中该启动子选自：

(a)SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列(或其互补序列)；

(b)SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列的功能片段(或其互补序列)；

(c)与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列(或其互补序列)；

(d)包含转录调控活性的(c)的核酸序列的功能片段。

还提供了当引入到植物细胞中时具有毛状体特异性启动子活性的分离的核酸序列，其中该核酸序列包含选自以下的序列：

(d)包含转录调控活性的(c)的核酸序列的功能片段。

包含上述序列的载体、嵌合基因和宿主细胞也是本发明的实施方式。

此外，还提供了制备转基因植物或植物细胞的方法，包括以下步骤：

(a)如上文所述产生包含启动子的嵌合基因，操作性地连接于待转录的核酸序列，并可选地进一步连接至3’UTR核酸序列，或包含如上文所述的启动子的载体或如上文所述的嵌合基因；

(b)用所述嵌合基因或载体转化植物或植物细胞；以及，可选地，

(c)再产生转基因植物或植物细胞。

该方法进一步包括使该转基因植物(或其衍生物，例如衍生自杂交或自交并且该衍生物保留了嵌合基因)生长并收获毛状体或其部分(毛状体分泌物)以用于进一步用途(分子农业)。

或者，例如当嵌合基因使得植物对害虫和/或病原体具有抗性时，该方法可以进一步包括使转基因植物(或其衍生物，例如衍生自杂交或自交并且该衍生物保留了嵌合基因)生长并收获该植物的全部或部分，例如叶、果实、种子等等，以用于进一步用途。

本文中所提供的启动子序列表现出高活性和毛状体特异性表达，优选腺毛特异性表达。相比于早期报道的毛状体-特异性启动子，本文中提供的启动子序列是高度毛状体-特异性的并且导致其驱动的基因的高表达。另外，本文中示出了来自野生番茄的启动子序列在所栽培的番茄和其他具有毛状体的植物物种的毛状体中具有活性。

最后，本申请提供了ShzFPS和ShZIS的启动子的核酸序列的序列或片段与其各自的编码序列的组合用于使植物、植物细胞或植物器官在毛状体(优选腺毛)中显示出高度表达zFPS和ZIS并且在毛状体中以高水平累积7-表姜烯或萜类化合物等的用途和应用。

一般定义

“毛状体”在此处涵盖不同类型的毛状体，包括腺毛和/或非腺毛。

“毛状体细胞”是指组成毛状体结构的细胞，例如腺体或分泌细胞、基底细胞和茎、或柄细胞、细胞外腔和表皮细胞(cuticle cell)。毛状体也可以由一个单个细胞组成。

“分子农业”在本文中是指从在毛状体中表达一种或多种嵌合基因的转基因植物的毛状体产生和/或回收有用的化合物，从而在毛状体中产生例如次级代谢产物、药物化合物、芳香剂或香料。

术语“核酸序列“(或核酸分子)是指单链或双链形式的DNA或RNA分子，尤其是根据本发明的具有启动子活性的DNA或编码蛋白或蛋白片段的DNA。”分离的核酸序列“是指不再存在于其所分离的自然环境中的核酸序列，例如，细菌宿主细胞中或植物细胞核或质体基因组中的核酸序列。

术语“蛋白”或“多肽”可互换使用并且是指由氨基酸的链组成的分子，不考虑作用的特异性模式、大小、3-维结构或来源。因此，蛋白的“片段”或“部分”仍被称作“蛋白”。“分离的蛋白”用于指代不存在于天然环境中的蛋白，例如在体外或在重组细菌或植物宿主细胞中的蛋白。

术语“基因“意指转录到细胞的RNA分子(例如，mRNA)中的区域(转录区)的DNA序列，该区域操作性连接至适合的转录调控区(例如，启动子)。因此，基因可以包含若干操作性连接序列，例如启动子、包含例如涉及反义启动的序列的5’未翻译前导序列(也被称作5’UTR，其对应于翻译起始密码子的转录的nRNA序列上游)、(蛋白)编码区(cDNA或基因组DNA)和包含例如转录终止位点和多腺苷酸化位点(例如，AAUAAA或其变体)的3’未翻译序列(也被称为3’未翻译区或3’UTR)。

“嵌合基因”(或重组基因)是指任意基因，在物种中其通常不会在自然中发现，尤其是其中存在性质上彼此不相关的核酸序列的一个或多个部分的基因。例如，启动子在性质上不与转录区的部分或全部或者不与另外的调控区相关。术语"嵌合基因"被理解为包括表达构建体，其中启动子或转录调控序列操作性连接至一个或多个正义序列(例如，编码序列)或操作性连接至反义(正义链的反向互补链)或反向重复序列(正义和反义，而RNA转录本在转录后形成双链RNA)。

“3’UTR”或“3’未翻译序列”(通常也被称作3’未翻译区、或3’端)是指在基因的编码序列的下游发现的核酸序列，其包含例如转录终止位点和(在大多数情况下，但并不是所有的真核mRNAs)和多腺苷酸化信号(例如，AAUAAA或其变体)。在转录终止后，mRNA转录本可以是多腺苷酸化信号的切割的下游并且可以添加聚(A)尾，其与mRNA向细胞质(翻译在该处发生)的运输有关。

“基因的表达”是指这样的过程，其中操作性连接于适合的调控区(尤其是启动子)的DNA区被转录成具有生物学活性的RNA，即，其能够被翻译成生物学活性蛋白或肽(或活性肽片段)或其本身具有活性(例如，转录后基因沉默或RNAi或通过miRNA沉默)。在某些实施方式中，活性蛋白是指由于存在抑制子区而具有显性负功能(dominant-negative function)的蛋白。编码序列优选为正义取向并且编码期望的，生物学活性蛋白或肽,或活性肽片段。基因沉默过程中，DNA序列优选以反义DNA或反向重复DNA的形式存在，包含处于反义或正义和反义取向的靶基因的短序列。基因表达的下调也能够通过微小RNAs(miRNA)的作用而发生，从茎-环RNA前体(pre-miRNAs)处理内源性21-24个核苷酸小RNAs，结合到RNA-诱导的沉默复合体(RISC)中，miRNAs通过mRNA切割或翻译抑制下调基因表达。

“异位表达”是指基因在其中正常地不被表达的组织中的表达。

“转录调控序列”在本文中被定义为能够调节操作性连接至转录调控序列的核酸序列的转录速率的核酸序列。因此，本文中所定义的转录调控序列包含对于启动转录(启动子元件)、用于维持或调控转录所必需的所有序列元件，例如，弱化子或增强子而且也包括沉默子。尽管在大多数情况下编码序列的上游(5’)转录调控序列是指调控序列，但发现该定义也包括编码序列的下游(3’)。

如本文中使用的，术语“启动子”是指功能在于控制一种或多种基因的转录的核酸片段，其相对于该基因的转录起始未填的转录方向位于上游(转录开始是指序列的位置内源性21-24个核苷酸小RNAs并且相对于该位置的任意上游核苷酸利用负数表示)，并且通过存在针对DNA-依赖性RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点和任意其他DNA结构域(顺式作用序列)的存在被结构上鉴别，其包括但不限于转录因子结合位点、抑制子和活化子蛋白结合位点、和本领域技术人员已知能够直接或间接作用于调节从启动子转录的量的核苷酸的任意其他序列。转录开始(+1)的真核顺式作用序列上游的实例包括TATA盒(通常在转录开始的大约-20至-30位置处)、CAAT盒(通常在相对于转录开始的大约-75位置处)、5’增强子或沉默子元件，等等。

"组成性"启动子(例如，CaMV 35S启动子)是在最符合生理和/或发育条件下在基本上所有组织和器官中具有活性的启动子。更优选地，组成性启动子在基本上所有生理和发育条件在所有主要器官中具有活性，例如至少叶、茎、根、种子、果实和花。最优选地，启动子在大多数(优选所有)生理和发育条件下在所有的器官中具有活性。

然而，组织-特异性或组织-优选的启动子(例如根据本发明的启动子)也可以被称作“组成性活性”。因此，该启动子在大多数发育和/或生理条件下具有活性，尽管仅仅是在特异性组织或主要在特异性组织中。因此，“具有组成性活性的启动子”或在植物或植物细胞中是“组成性”的是指在大多数生理和发育条件下使得特异性组织中的植物或植物细胞能够发生转录的核酸序列。

“可诱导的”启动子是生理学(例如，通过外部施加某些化合物)或发育上调控的启动子。

“组织特异性”启动子仅在特异性类型的组织或细胞中是活性的，例如毛状体细胞。因此，能够通过提及启动子赋予该启动子操作性连接至启动子下游(3’)的核酸序列的转录的启动子的环境来描述启动子活性。

“组织优选的”启动子优先地，但不是排他性地，在某些组织或细胞，例如在毛状体细胞和表皮细胞中具有活性。

“对一种或多种生物和/或非生物胁迫不敏感”或者“在暴露于一种或多种生物和/或非生物胁迫条件时其活性未下降”的启动子是指在正常生理和发育条件下具有启动子活性的核酸序列，并且当包含该启动子的有机体(例如，植物)或细胞或组织或器官经历生物和/或非生物胁迫时，该活性不会，或至少不会显著定量下降。

“胁迫”是指作用于植物或植物细胞的物理、化学或生物来源的条件或压力，其会导致植物的产量损失和/或质量损失，但对于植物不是致死性的。“非-胁迫条件”在本文中是指在该条件下生理机能和发育正常或最佳。“生物胁迫”是指由生物(活的)药剂例如真菌、病毒、支原体如有机体、昆虫、节肢动物、细菌、线虫类等等(即，尤其是植物害虫和病原体)造成的胁迫。“非生物胁迫”是指由非生物(非生命的)药剂，例如温度胁迫(冷/冻、热)、盐度(盐)、风、金属、日长(光周期)、水-胁迫(例如可利用的水太少或太多，即，干旱、脱水、洪涝等)等等造成的胁迫。

如本文中使用的，术语"操作性连接"是指多核苷酸元件在功能性关系中的连接(linkage)。当核酸被置于与另一核酸序列的功能性关系中时，核酸即为"操作性连接"。例如，如果其影响编码序列的转录，则启动子或转录调控序列操作性连接至编码序列。操作性连接意指所连接的DNA序列通常连续地，当必要时连接两个蛋白编码区，连续地并且在阅读框中，从而产生“嵌合的蛋白”。“嵌合的蛋白”或“杂合蛋白”是由多个蛋白“结构域”(或基序)构成的蛋白，未发现其具有这样的性质但其被连接以形成功能性蛋白，该功能性蛋白显示出该连接的结构域的功能性(例如，DNA接合结构域或导致现行负性功能的功能结构域的抑制)。嵌合蛋白也可以是天然存在的两种或更多种蛋白的融合蛋白。如本文中使用的术语"结构域"意指具有特异性结构或功能的(多个)部分或(多个)结构域，其能够转移至另一蛋白以用于具有至少该结构域的功能性特征的新杂合蛋白。

术语"靶肽"是指使蛋白靶向于细胞器例如质体，优选叶绿体、线粒体,或靶向于胞外空间(分泌信号肽)的氨基酸序列。编码靶肽的核酸序列可被稠合(在框架中)至编码该蛋白的氨基末端(N-末端)的核酸序列。例如，毛状体细胞的靶肽包括靶向毛状体细胞的白色体、叶绿体、线粒体、细胞核、过氧物酶体、内质网、质体、细胞外腔或液泡的肽。

“核酸构建体”或“载体”在本文中被理解为意指通过重组DNA技术获得的人造核酸分子并且其被用于将外源DNA递送到宿主细胞中。载体骨架可以是例如双元或超级双元载体(参见例如，US 5,591,616、US2002138879和WO 95/06722)、共整合载体或T-DNA载体，如本领域中已知的和本文其他部分所描述的，嵌合基因整合到其中，如果已经存在适合的转录调控序列/启动子，只有期望的核酸序列(例如，编码序列、反义或反向重复序列)被整合到转录调控序列/启动子的下游。载体通常包含另外的基因元件以便于其在分子克隆中的用途。例如，适合的标志物、多克隆位点等等(参见下文)。

术语"宿主细胞"或"重组宿主细胞"或“转化的细胞”是指新的个体细胞(或有机体)，作为引入到所述细胞中的至少一个核酸分子，其尤其包含编码期望的蛋白或核酸序列的嵌合基因，其在转录后产生用于靶基因/基因家族沉默的反义RNA或反向重复RNA(或发夹RNA)。宿主细胞优选为植物细胞，但也可以是细菌细胞、真菌细胞(包括酵母细胞)等等。宿主细胞可以含有作为染色体外(附着体)复制分子的核酸构建体，或跟优选地，包含整合到宿主细胞的细胞核或质体基因组中的嵌合基因。

"可选择的标志物"是本领域普通技术人员熟知的术语，其在本文中被用于描述任意遗传实体，当用于表述时能够使用该术语来选择含有可选择的标志物的细胞或细胞。可选择的标志物基因产物赋予了，例如，抗生素耐药性，或更优选地，除草剂抗性或其他可选择的特性，例如表型特性(例如，色素沉着发生改变)或营养需要。术语“报告子”主要用于指出可视的标志物，例如绿色荧光蛋白(GFP)、eGFP、荧光素酶、GUS等等，以及nptII标志物等等。

术语基因或蛋白的“直系同源(ortholog)”在本文中是指在其他物种中发现的同源基因或蛋白，其与该基因或蛋白具有相同的功能，但从物种藏有不同的基因的时间点开始，序列(通常)就是不同的(即，通过物种形成从共同祖先逐渐发展成该基因)。因此，可基于序列比较(例如，基于在整个序列或在特异性结构域上的百分比序列同一性)和功能性分析来鉴别一种植物物种的基因的直系同源。

术语“同源”和“异源”是指核酸或氨基酸序列和其宿主细胞或有机体之间的关系，尤其是在转基因有机体的情况下。因此，同源序列天然存在于宿主物种(例如，用番茄基因转化的番茄植物)中，而异源序列不天然存在于宿主细胞(例如，用来自马铃薯植物的序列转化的番茄植物)中。根据情境，术语“同源物(homolog)”或“同源的(homologous)”可以替代性地是指来自共同祖先的序列(例如，它们可以是直系同源)的后代的序列。

“严格的杂交条件”能够被用于鉴定核苷酸序列，其与给定的核苷酸序列基本完全相同。杂交条件的严格程度是序列依赖性的，并且在不同环境下会不同。通常，选择严格的条件为，在限定的离子强度和pH下针对特定序列低于热融点(Tm)约5℃。Tm是50％的靶序列杂交至完美匹配探针时的温度(在所定义的离子强度pH下)。通常，所选择的严格条件为在pH 7且温度为至少60℃条件下盐(NaCl)浓度为约0.02摩尔。降低盐浓度和/或升高温度会使严格程度增加。针对RNA-DNA杂交(利用例如，100nt的探针进行RNA印迹分析)的严格条件为，例如包括在0.2X SSC中在63℃下持续20分钟，或同等条件下进行至少一次洗涤。针对DNA-DNA杂交(利用例如，100nt的探针进行DNA印迹分析)的严格条件为，例如在0.2X SSC中在温度为至少50℃，通常为约55℃条件下持续20分钟，或等同条件下至少一次洗涤(通常为2次)。还参见Sambrook等人(1989)以及Sambrook和Russell(2001)。

“高严格性”条件能够例如通过在65℃下在含有6x SSC(20x SSC含有3.0M NaCl,0.3M柠檬酸钠,pH 7.0)、5x Denhardt's(含有2％聚蔗糖、2％聚乙烯吡咯烷酮、2％牛血清白蛋白的100X Denhardt’s溶液)、0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)、和作为非-特异性竞争剂的20μg/ml变性载体DNA(单链鱼精DNA，平均长度为120-3000个核苷酸)的水溶液中杂交来提供。在杂交之后，可以在若干步骤中进行高严格性洗涤，在杂交温度下在0.2-0.1×SSC,0.1％SDS中进行最终洗涤(约30分钟)。

“中等严格性”是指在上述溶液中但在约60-62℃下等同于杂交的条件。在该情况下，在杂交温度下在1x SSC,0.1％SDS中进行最终洗涤。

“低严格性”是指在上述溶液中但在约50-52℃下等同于杂交的条件。在该情况下，在杂交温度下在在2x SSC，0.1％SDS中进行最终洗涤。同样参见Sambrook等人(1989)以及Sambrook和Russell(2001)。

能够根据两个序列的长度通过利用全局或局部比对算法来比对两种肽或两个核苷酸序列来确定“序列同一性”和“序列类似性”。优选利用全局比对算法(例如，NeedlemanWunsch)来比对类似长度的序列，其比对最佳地在全长上比对序列，而实质上不同长度的序列优选利用局部比对算法(例如，Smith Waterman)来进行比对。然后，当序列(当最佳地通过例如GAP或BESTFIT程序利用默认参数比对)共有至少某种特定最小百分比序列同一性(如下文所定义的)时，就可以被称为"基本相同”或“基本相似”。GAP利用Needleman和Wunsch全局比对算法来在其全部长度(全长)上比对两个序列，使匹配的数目最大化并使空位的数目最小化。全局比对适合用于当两个序列具有相似长度时确定序列同一性。通常，使用GAP默认参数，空位制造罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白)且空位延伸罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白)。对于核苷酸，所使用的默认评分基质为nwsgapdna，而对于蛋白，该默认评分基质为Blosum62(Henikoff&Henikoff,1992,PNAS 89,915-919)。针对百分比序列同一性的序列比对和评分可以利用计算机程序类确定，例如GCG Wisconsin Package，Version 10.3，可获自Accelrys Inc.,9685Scranton Road,San Diego,CA 92121-3752USA或利用开放源代码软件，例如EmbossWIN version 2.10.0中的程序“needle”(利用全局Needleman Wunsch算法)或“water”(利用局部Smith Waterman算法)，利用针对上述GAP的相同参数，或利用默认设置(针对‘needle’和针对‘water’并且均用于蛋白和用于DNA比对，默认Gap开放罚分为10.0且默认空位延伸罚分为0.5；对于蛋白的默认评分基质为Blosum62，而对于DNA为DNAFull)当。序列具有实质上不同的总长度时，局部比对例如利用SmithWaterman算法是优选的。可替代第，可以通过在公共数据库中进行检索并利用例如FASTA,BLAST等的算法来确定百分比类似性或同一性。

基因名称之前的缩写“Sh”是指来源于多毛番茄的基因，而基因名称之前的缩写“Sl”指代来源于番茄(Solanum lycopersicum)的基因。缩写“FPS”是指法尼基焦磷酸合成酶，缩写“ZIS”是指姜烯合成酶，缩写“TPS9”是指萜烯合成酶9，其为大根香叶烯合成酶。缩写“zFPS”是指Z,Z-法尼基焦磷酸合成酶(也被称为“Z,Z-法呢基二磷酸合成酶”)。

在本文件及其权利要求书中，所使用的动词“包含”及其结合以其非限制性含义使用，其意指包括该词语之后的事项，但不排除未具体提及的事项。另外，由不定冠词"一个"或"一种"所指的元素不排除存在多于一个该元素的可能性，除非上下文中明确要求存在一个且只存在一个该元素。因此，该不定冠词"一个"或"一种"意指"至少一个/种"。应进一步理解，当本文中提到“序列”时，通常是指具有特定序列亚单位(例如，氨基酸)的实际物理分子。

当提到制备根据本发明的“植物”或“植物”(或多种植物)时，除非另外指出，否则应该理解其中也涵盖植物部分(细胞、组织或器官、种子、切割(severed)或收获部分、叶、种皮，花、花粉、果实、茎、根、愈合组织、原生质体等)、后代或仍保留其亲代的区别特征(例如，存在转基因)的无形繁殖的植物，例如通过自交或杂交获得的种子，例如，杂合种子(通过两个自交系亲本杂交获得的)、杂合植物以及由其得到的植物部分。

具体实施方式

不考虑将组成性启动子例如CaMV 35S启动子(单个35S启动子，Franck等人,1980,Cell 21,285-294所描述的)用于需要在特异性组织水平上进行调控的基因(例如韧皮部或毛状体中的基因)，或仅在特异性条件下(例如，胁迫诱导的条件下)进行调控的基因的表达。

在本发明中，提供了若干植物启动子，其在毛状体中表现出高度的组成性并且具有组织特异性活性，并且可选地对于一种或多种生物和/或非生物胁迫基本上不敏感。在转基因植物中，这样的启动子对于核酸序列的受控表达是合乎需要的。

在一种实施方式中，本发明提供了番茄基因(番茄萜烯合成酶及其直系同源物和同源物)的启动子区域，其赋予在宿主植物中的较高毛状体特异性，优选腺毛-特异性表达，例如栽培的番茄、其他番茄也其他植物科和种。

核酸序列、嵌合基因和载体

在一种实施方式中，提供了在植物细胞中具有启动子活性的分离的核酸序列(优选基因组或合成DNA序列)，其在植物毛状体中显示出强的、高的、优选组成性的转录毛状体特异性活性，例如在叶、茎和花器官上发现的毛状体中。优选地，该启动子在一种或多种腺毛(I、IV、VI和/或VII型)中具有活性。

当转基因植物或植物组织或器官经历一种或多种非生物和/或生物胁迫时，优选根据本发明的核酸序列的启动子活性没有减小，或至少没有显著减小。在这方面的显著减小是指相比于在无胁迫条件下相同组织或器官中的活性，启动子活性的统计学显著(定量)减小1％或更多(例如，2％、3％、5％、10％等，高达100％)。因此，优选该启动子一种或多种胁迫条件下仍然是强的并且组成性的(在毛状体细胞中)。

在一种实施方式中，提供了毛状体特异性启动子，其包含SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2，或与其基本相似的核苷酸序列(被称作“变体”，参见下文定义)、或在一种或多种毛状体类型和/或毛状体细胞中具有启动子活性的任意这些的活性(功能性)片段，例如SEQ ID NO:4、3、1或2或其变体的片段的至少200，300，400，500，600，800，900，1000，1200，1500，2000，2400个或更多个连续核苷酸，或由它们组成。

“活性片段”或“功能片段”或“具有启动子活性的片段”是指能够在一种或多种不同类型的植物组织和器官(例如，在茎、叶子、花、花蕾或花的部分上)发现的一种或多种毛状体类型和/或一种或多种毛状体细胞中实现转录的核酸片段。优选的活性片段赋予毛状体特异性和/或至少毛状体优选表达，并且其优选地具有至少类似于SEQ IDNO:4、3、1或2的启动子的强度(或更高的强度)。这能够如下文所述进行测试，通过用这样的片段转化植物，优选该片段操作性连接至报告子基因，并且定性分析该启动子活性(时空转录)和/或优选地在毛状体中进行定量分析。显然，可以通过许多种方式产生，例如，利用DNA从头合成、或限制没、或端核酸酶等等。例如缺失分析能够被用于产生较强的和/或特异性更强的转录活性，其中产生包含不同尺寸的5’缺失的片段。

在一种实施方式中，当在腺毛中进行测量时，启动子和/或启动子片段的强度定量地基本等于或高于35S启动子。优选地，当在腺毛中进行测量时，该启动子和/或启动子片段的强度定量地还也基本上等于或高于甲基酮合成酶1(MKS1)启动子(MKS1的启动子；Sol Genomics Network登录Solyc01g108780.2)。

启动子包含SEQ ID NO:4、3、1或2、其变体或这些中任一种的功能片段或由其组成，该启动子优选对于至少一种(但优选多种，最优选任一种)生物和/或非生物胁迫不敏感，其中包含该启动子的植物或(一个或多个)植物细胞、组织或器官可暴露于其中(见下文)。因此，在暴露于一种或多种胁迫条件器件，毛状体中的活性仍是组成性的并且较强。

还提供了上述毛状体特异性启动子的“变体”，以及这样的变体的功能片段。这些变体包括核酸序列基本相似to SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2(和这些变体序列的功能片段，如上文所描述的)，并且其具有启动子活性，即，其也能够在植物毛状体中提供(优选组成性地，更优选高组成性地)转录。与SEQ ID NO:4和/或3和/或1和/或SEQ ID NO:2“基本相似”的序列为包含与SEQ ID NO:4和/或to SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2具有至少约50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，96，97，98，99％或更多的核酸序列同一性的核酸序列，利用Needleman和Wunsch或Smith Waterman Pairwise比对(例如，Embosswin中的程序“needle”或“water”，例如，2.10.0版，具有默认空位产生罚分和空位延伸罚分)并且其活性是毛状体特异性的。在一种优选的实施方式中，在毛状体中变体(和功能片段)的活性强，即，定量地至少像由SEQ ID NO:4、3、2或1提供的活性(或比由SEQ ID NO:4、3、2或1提供的活性要强)。该细胞类型的特异性还至少为SEQ ID NO:4、3、2或1的特异性或特异性根强。在进一步的实施方式中，这些变体(及其功能片段)的活性对于一种或多种生物和/或非生物胁迫不敏感。

显然，许多方法都能永远鉴定、合成或分离本文中提供的核酸序列的变体或功能片段，例如核酸杂交、PCR技术、计算机分析等核酸合成，等等。例如，核酸杂交能够被用于在其他植物物种或变体中鉴定DNA序列，其在严格的或中等严格的杂交条件下杂交至SEQ ID NO:4、3、1或2或杂交至其片段。

或者，能够利用已知算法(例如BLAST、FASTA)针对变异体序列在电脑中扫描序列数据库。这样有助于将变异体序列与其他植物物种或其他多重番茄分离。如下文所述，本文中尤其包括在番茄的其他变体或其他植物物种中发现的相同基因(ShzFPS、ShZIS和ShTPS9)的等位基因的启动子，尤其是马铃薯(Solanum)属的种。例如，cDNA文库可由一种或多种植物物种、一种或多种变体、或一种物种或变体的不同组织来构建。可针对单萜烯合成酶1或倍半萜烯合成酶1cDNAs(利用例如，衍生自SEQID NO:4、3、1、2或其片段或变体的探针或引物)扫描cDNA文库。同样，可以使用不同的显示方法(例如cDNA-AFLP)来鉴定这样的转录本。例如TAIL-PCR(Liu等人1995,Genomics 25(3):674-81；Liu等人2005,Methods Mol Biol.286:341-8)、Linker-PCR或Inverse PCR(IPCR)的方法可用于分离基因的上游转录调控区。

相同基因的变体，即分别编码法呢基二磷酸合成酶(ShzFPS)、姜烯合成酶(ShZIS)、和大根香叶烯合成酶(ShTPS9)的基因的直系同源和/或同源基因包括,例如,包含与GenBank登录号FJ194969(多毛番茄zFPS cDNA和蛋白；Sallaud等人,2009–Plant Cells)、JN990661(多毛番茄ZIS；Gonzalezs-Vigil等人,2012–Plant JournalcDNA and Protein)、和JN402388(多毛番茄TPS9cDNA；Bleeker等人2011–Plant Mol.Biol.77(4-5):323-336)的核苷酸序列或氨基酸序列具有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99％或更多个核酸或氨基酸序列同一性的核酸序列(DNA或RNA))或氨基酸序列。优选地，通过利用Needleman和Wunsch或者Smith WatermanPairwise比对(例如，Embosswin中的程序“needle”或“water”，例如，2.10.0版本具有默认空位产生罚分和空位延伸罚分)来确定序列同一性。这些变体的启动子优选在其活性方面是毛状体特异性的。可以使用例如cDNA-AFLP、其他基于PCR的方法或Northern杂交的方法来分离或鉴定这样多基因。能够利用已知的方法来克隆它们的启动子。在优选的实施方式中，该启动子获自来自属于茄科的植物的ShzFPS、ShZIS或ShTPS9基因，例如马铃薯(Solanum)属的种(包括重新分类为番茄的种)、烟草属(Nicotiana)、辣椒属(Capsicum)、碧冬茄属(Petunia)、咖啡属(Coffea)等等。来自野生种的直系同源基因尤其合乎需要。

能够利用各种方法来确定核酸序列(或变异体的片段)是否具有组成性启动子活性，即，其是否能够赋予毛状体转录特异性，该活性是否“强”，以及该核酸序列的活性是否对于转基因细胞、组织、器官或有机体(尤其是植物或植物细胞)可能暴露的至少一种(但优选更多的，最优选任意)生物和/或非生物胁迫不敏感。通常，人们能够区分定性方法和定量方法。定性方法(例如组织学GUS染色)被用于确定启动子的时间-空间活性(其是启动子活性的或在某些组织或器官中或在某些/发育条件下无活性)，而定量方法(例如荧光测定GUS分析)也能够定量分析相比于对照的活性的水平。适合的对照为，例如，用空白载体转化的植物(阴性对照)或用包含其他启动子的构建体转化的植物，例如拟南芥CER6启动子(Hooker等人，2002,Plant Phys 129,1568)其在烟草(N.tabacum)的表皮和毛状体中有活性，非转基因拟南芥植物。

为了测试和可选地定量分析相对或绝对活性，克隆的或合成的核酸分子，例如SEQID NO:4、3、1或2或其变体或它们之中任一种的片段可被操作性连接至已知核酸序列(例如，报告基因，例如gusA,或编码特异性蛋白的任何基因)并且其可被用于利用已知方法转化植物细胞并由其再生植物。

启动子的活性能够例如通过检测下游核酸序列的RNA转录本的水平来进行分析(并且可选地定量分析)，尤其是在毛状体细胞中。这可以利用定量方法来完成，例如，定量RT-PCR或其他基于PCR的方法等等。或者，可以分析和定量分析该报告子蛋白或该报告子蛋白的活性。例如，如果该报告子蛋白基因为gus基因，则可以使用荧光GUS分析，如在实施例中所述的。这样，能够将保持在正常生理(非-胁迫)条件下的转化的植物或植物细胞的定量启动子活性水平与暴露于一种或多种生物或非生物胁迫的植物或植物细胞的水平相比较。而且，毛状体细胞中的相对或绝对活性水平能够与组成性对照启动子，例如35S启动子、双-35S启动子，或与在毛状体中具有活性的其他启动子，例如MKS1启动子、CYP71D16启动子或OASA1启动子进行对比。应理解，优选利用统计学方法来确定和比较平均启动子活性水平。

因此，不论在特定时间在毛状体细胞中是否发现活性(时间-空间活性)，都能够例如，通过用转化用启动子-报告子基因构建体转化植物或植物细胞并在RNA转录本或报告蛋白(或其活性)的不同发育阶段对毛状体进行分析来进行测试。一个样品测试采用例如组织化学GUS染色，从而可视化评价蓝色指示毛状体中以及在毛状体的不同发育阶段的活性。

如已经提到过的，优选启动子活性是组成性的并且还优选在毛状体细胞中活性强，尤其是在宿主物种中或根据所引入序列而不同。组成性活性意指优选在最(正常，非-胁迫的)生理学和发育条件下在毛状体细胞中操作性地连接于启动子的任意核酸序列的转录本。在一种实施方式中，根据本发明的启动子优选在表皮细胞中无活性。优选地，启动子在在茎、花和/或(新)叶中发现的所有腺毛中均有活性。

优选地，根据本发明的启动子在双子叶种和单子叶种的所有植物种的毛状体中提供强的、组成性活性，例如下文中所述的(例如，番茄、烟草、芸苔、瓜类和莴苣等)。

根据其驱动连接至下游(3’)的核酸序列的表达的能力，能够利用各种已知方法定量确定根据本发明的启动子(包括片段或变体)的强度(定量活性)。例如，能够利用RNA印迹分析或定量RT-PCR或下一代测序来定量分析所转录的转录本(mRNA)的量。优选地，在正常(非-胁迫)条件下，启动子强度至少基本等于在CaMV 35S的毛状体中的活性(Franck等人,同上)。因此，“强”意指在正常、非胁迫条件下，启动子强度优选至少等于，但更优选强于毛状体中35S启动子的强度。最优选地，毛状体中的平均定量启动子活性至少等于CaMV 35S启动子的活性，或者为高于毛状体中CaMV 35S启动子的平均活性至少5％，10％，20％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，70％，75％，或更高。应该理解，应该比较相同拷贝数和接合性(zygosity)水平的转化体，例如，转基因的半合子或纯合子。优选地，鉴定并比较单拷贝转化体。能够通过分析并且优选定量分析例如，p35S-GUS植物中的GUS基因表达并将其与根据本发明的启动子的表达相比较来测试宿主植物的毛状体中的35S启动子的强度。

优选地，启动子强度为至少基本上等于在生理(非-胁迫的)条件下甲基酮合成酶1(SlMKS1)启动子在毛状体中的活性(Fridman等人,同上)。因此，“强”意指优选至少大约等于但更优选比生理非-胁迫的条件下毛状体中SlMKS1启动子的活性更强的启动子强度。最优选地，毛状体中的平均定量启动子活性至少等于毛状体中SlMKS1启动子的活性，或比SlMKS1启动子的平均活性高至少两倍、4倍、6倍、8倍、10倍或更多。应该理解，应该比较相同拷贝数和接合性水平的转化体，例如，转基因的半合子或纯合子。优选地，鉴定和比较单拷贝转化体。宿主植物的毛状体中的SlMKS1启动子的强度能够通过分析并优选定量分析例如，p SlMKS1-GUS植物中的GUS基因表达并将其与根据本发明的启动子的表达相比较来测试。

因此，当包含该启动子的植物组织或器官或植物暴露于胁迫条件时，根据本发明的启动子的强度优选保持基本不变，或者至少不下降(或基本不下降)，所述胁迫条件选自以下至少一种或优选多种：干旱胁迫、热胁迫、水-胁迫(水过多或水过少)病原体胁迫(例如，病毒感染例如CMV、真菌感染、细菌感染等)、害虫胁迫(例如，植食性昆虫)受伤、盐胁迫辐照胁迫等等。而且，定量测试能够被用于确定它。例如，可将包含该启动子的重组植物从温度环境转移至温暖环境(例如约27℃至高达约50℃)，并且可以在比较在正常温度条件下和温暖温度条件下不同组织中的启动子活性和相同组织中的活性。

在一种实施方式中，提供了任意上述启动子用于在重组细胞或有机体尤其是植物细胞或植物中表达同源或异源核酸序列的应用。如下文中进一步描述的，这种应用包含就爱你个启动子操作性连接至同源或异源核酸序列以及转化植物或植物细胞。

尽管上文中关注的焦点在于根据本发明的启动子在植物和植物细胞中的应用，但本发明的实施方式还关注了该启动子用于在其他细胞和有机体中表达同源或异源核酸序列的应用，例如在任意原核或真核细胞或有机体中，例如，细菌、真菌(包括酵母，例如毕赤酵母、汉逊酵母等)、哺乳动物、人细胞或细胞系等等。

根据本发明的嵌合基因和载体

在本发明的一种实施方式中，具有启动子活性的核酸序列中的任一种被用于制备嵌合基因，并且包含这些嵌合基因的载体用于将嵌合基因转移到宿主细胞中并且在宿主细胞中表达操作性连接的同源或异源核酸序列，宿主细胞例如是来源于转化的细胞的细胞、组织、器官或整个有机体。

宿主细胞优选为植物细胞。任何植物可以为适合的宿主，例如单子叶植物或双子叶植物，例如玉米/黍类(玉蜀黍属，例如，玉米(Z.mays)、二倍体多年生类玉米种(Z.diploperennis)(chapule)、繁茂类玉米种(Zea luxurians)(Guatemalan teosinte)、委委特南戈类玉米亚种(Zea mays subsp.Huehuetenangensis)(San Antonio Huistateosinte)，墨西哥类玉米亚种(Mexican teosinte)、小颖类玉米亚种(Z.mays subsp.Parviglumis)(Balsas teosinte)、四倍体多年生类玉米种(Z.perennis)(perennial teosinte)和Z.ramosa，小麦(Triticum species)，大麦(例如，Hordeum vulgare)，燕麦(例如，Avena sativa)，高梁(surghum bicolor)，黑麦(Secale cereale)，大豆(大豆属(Glycinespp)，例如，黄豆(G.max))，棉花(树棉种(Gossypium species)，例如，陆地棉(G.hirsutum)、海岛棉(G.barbadense))，芸苔属(例如，欧洲油菜(B.napus)、芥菜(B.juncea)、野甘蓝(B.oleracea)、芜菁(B.rapa)等等)，向日葵(Helianthus annus)，烟草(烟草种)，苜蓿(Medicago sativa)，水稻(水稻种，例如，超级杂交水稻两优培九(O.sativa indica cultivar-group)或japonica cultivar-group)，牧草，珍珠稷(狼尾草种，例如，珍珠栗(P.glaucum))，树种，蔬菜种，如番茄属(Lycopersicon ssp)(最近被重新分类为属于茄属)，例如，番茄(别称为L.esculentum)例如，樱桃番茄，樱桃番茄变种(var.cerasiforme)或目前的番茄，醋栗番茄变种(var.pimpinellifolium))或树番茄(S.betaceum，别称为Cyphomandra betaceae)，马铃薯(Solanum tuberosum)和其他茄种，例如茄子(茄子(Solanum melongena))，香瓜茄(香瓜茄(S.muricatum))，可可(S.sessiliflorum)和奎东茄(S.quitoense)；胡椒(Capsicum annuum,Capsicumfrutescens)，豌豆(例如，Pisum sativum)，豆(例如，豆种(Phaseolus species))，胡萝卜(野胡萝卜(Daucus carota))，莴苣种(例如Lactuca sativa、山莴苣(Lactuca indica)、Lactuca perennis)，黄瓜(Cucumis sativus)、甜瓜(Cucumis melo)，西葫芦(Cucurbitapepo)，笋瓜(笋瓜(Cucurbita maxima)、西葫芦(Cucurbita pepo)、灰籽南瓜(Cucurbitamixta))，南瓜(Cucurbita pepo)，西瓜(Citrullus lanatus别称为Citrullus vulgaris)，肉质果种(葡萄、桃、李、草莓、芒果、甜瓜)，观赏种(例如，玫瑰、矮牵牛、菊属、百合、郁金香、大丁草种)，木材树种(例如，杨属、柳属、栎属、桉属的种)，纤维种例如，亚麻(Linum usitatissimum)和大麻(Cannabis sativa)。在一种实施方式中，优选蔬菜种，尤其优选茄种(包括番茄种)。

因此、可转化例如以下属中的种：南瓜(Cucurbita)、罗萨(Rosa)、葡萄(Vitis)、草莓(Juglans)、核桃(Fragaria)、莲子(Lotus)、红豆草(Medicago)、紫花苜蓿(Onobrychis)、三叶草(Trifolium)、葫芦(Trigonella)、豇豆(Vigna)、柑橘(Citrus)、亚麻(Linum)、天竺葵(Geranium)、蜀葵(Manihot)、胡萝卜(Daucus)、萝卜(Arabidopsis)、甘蓝(Brassica)、拟南芥(Raphanus)、芥末(Sinapis)、辣椒(Atropa)、曼陀罗(Capsicum)、颠茄(Datura)、莨菪(Cucumis)、黄瓜(Hyoscyamus)、番茄(Lycopersicon)、马铃薯(Solanum)、烟草(Nicotiana)、海棠(Malus)、矮牵牛(Petunia)、洋地黄(Digitalis)、Majorana、Ciahorium、向日葵(Helianthus)、莴苣(Lactuca)、无芒雀麦(Bromus)、西瓜(Citrullus)、芦笋(Asparagus)、金鱼草(Antirrhinum)、Heterocallis、Nemesis、天竺葵(Pelargonium)、Panieum、狼尾草(Pennisetum)、毛莨(Ranunculus)、千里光(Senecio)、蛾蝶花(Salpiglossis)、Browaalia、棉花(Glycine)、豌豆(Pisum)、绿豆(Phaseolus)、大豆(Gossypium)、棉花(Glycine)、黑麦草(Lolium)、高羊茅(Festuca)、剪股颖(Agrostis)。进一步优选南瓜、甘蓝、番茄、马铃薯、水稻和玉米。优选燕麦、苜蓿、辣椒、烟草、莴苣、豌豆、黄瓜、南瓜、甘蓝、茄子(包括番茄)、水稻和玉米。

嵌合基因的构建体和用于将嵌合基因引入到宿主细胞基因组中的载体通常是本领域公知的。为了产生嵌合基因，利用标准分子生物学技术将毛状体特异性启动子序列操作性连接至在宿主细胞中待转录的另一核酸序列。该启动子序列可以已经在载体中存在，以使得该待转录的核酸序列被简单地插入到启动子序列的载体下游中。然后，该载体被用于转化宿主细胞，并且优选将嵌合基因插入到核基因组中或插入到质体、线粒体或叶绿体基因组中，以使得该下游核酸序列由于启动子活性而被表达(例如，Mc Bride等人,1995Bio/Technology 13,362；US 5,693,507)。

因此，嵌合基因优选包含如上文所述的毛状体特异性启动子，其操作性连接于同源或异源核酸序列，并且接着操作性连接于3’未翻译核酸序列(3’UTR)。该同源或异源核酸序列可以是编码蛋白或肽的序列，或者可以是转录到活性RNA分子中的序列，例如在宿主细胞或有机体中适合用于沉默基因或基因家族的正义和/或反义RNA(正义和反义RNA包括例如dsRNA或茎-环RNA结构)。

包含毛状体特异性启动子的嵌合基因能够以常规方式被稳定地插入到单个植物细胞的核基因组中，并且该如此转化的植物细胞能够以常规方式被用于生产转化的植物，该转化的植物由于嵌合基因的表达而具有改变的表型。

在这方面，根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中的包含操作性连接至另一核酸序列的毛状体特异性启动子(或上文所述的变体或片段)的T-DNA载体能够被用于转化植物细胞，并且之后，转化的植物能够利用所描述的程序从该转化的植物细胞再生，例如，在EP 0 116 718、EP 0 270 822、PCT公开WO 84/02913和公开的欧洲专利申请EP 0 242 246中以及Gould等人(1991,plant Physiol.95,426-434)所描述的。用于农杆菌(Agrobacterium)介导的植物转化的T-DNA载体的构建是本领域中公知的。该T-DNA载体可以是如在EP 0 120 561和EP 0 120 515中描述的双元载体，或共整合载体载体，其能够通过同源重组而被整合到农杆菌Ti-质粒中，如在EP 0 116 718中所描述的。

优选的T-DNA载体每一个均含有操作性地连接于在T-DNA边界序列之间转录的核酸序列的，或至少位于边界序列的左侧的毛状体特异性启动子。在Gielen等人1984,EMBO J 3,835-845中描述了边界序列。当然，其他类型的载体也能够被用于转化植物细胞，利用例如如下的程序：直接基因转移(如所述的，例如在EP 0 223 247中，或颗粒或微粒轰击(bombardment)如在US2005/055740和WO 2004/092345中描述的)、花粉介导的转化(如所述的，例如在EP 0 270 356和WO 85/01856中)、原生质体转化，例如，US 4,684,611中所描述的，植物病毒介导的转化、脂质体介导的转化(如所述的，例如在US 4,536,475中)，以及其他方法例如用于转化某些玉米(例如，US6,140,553；Fromm等人,1990,Bio/Technology 8,833-839；Gordon-Kamm等人,1990,ThePlant Cells 2,603-618)和水稻(Shimamoto等人,1989,Nature 338,274-276；Datta等人1990,Bio/Technology 8,736-740)细胞系的所述方法，以及通常用于转化单子叶植物的方法(WO 92/09696)。对于棉花转化，还可参见WO 00/71733，而对于水稻转化，参见例如，Jeoung JM等人2002,Hereditas 137:20-8或Zhao ZY等人2000,Plant MolBiol.44:789-98)。对于番茄或烟草转化，还参见An G.等人,1986,Plant Physiol.81:301-305；Horsch R.B.等人,1988,In:Plant Molecular Biology Manual A5,Dordrecht,Netherlands,Kluwer Academic Publishers.pp 1-9；Koornneef M.等人,1986,In:NevinsD.J.和R.A.Jones编著.Tomato Biotechnology,New York,NY,USA,Alan R.Liss,Inc.pp169-178)。同样，从转化的的细胞选择和再生转化的植物也是本领域中公知的。显然，对于不同物种或甚至对于单个物种的不同变种或品种，试验方案以高频率具体适用于再产生转化体。

本发明中也包括质粒基因组的转化，也被称为核基因组的转化，优选叶绿体基因组的转化。质粒基因组转化的一个优点在于，能够减少(一个或多个)转基因的散布的风险。质粒基因组转化能够如本领域公知的技能型，参见例如，Sidorov VA等人，1999,Plant J.19:209-216或Lutz KA等人2004,plant J.37(6):906-13。

所得到的转化的植物能够被用于常规植物育种方案以产生含有转基因的更加转化的植物。能够利用例如DNA印迹分析或基于方法或Technology分析(ThirdWave Technologies,Inc.)的PCR来选择单拷贝转化体。能够通过嵌合基因的存在容易地将经过转化的细胞和植物能够与非转化的细胞和植物区分开。也可以对侧链具有转基因插入位点的植物DNA的序列进行测序，从而开发“事件特异性”检测方法，以用于常规用途。参见例如WO 01/41558，其中描述了基于例如针对整合序列和侧链(基因组)序列的精准事件检测试剂盒(例如PCR检测试剂盒)。

在一种实施方式中，待转录且可选地待反义(如果其是编码序列)核酸序列被插入到植物基因组中，以使得该待转录的序列为适合的3'端转录调控信号(“3’端”)(即，转录本形成和多腺苷酸化信号)的上游(即5')。多腺苷酸化和转录本形成信号，包括胭脂碱合成酶基因(“3’nos”)(Depicker等人,1982J.Molec.Appl.Genetics 1,561-573.)、真蛸碱合成酶基因(“3’ocs”)(Gielen等人,1984,EMBO J 3,835-845)和T-DNA基因7(“3’基因7”)(Velten和Schell,1985,Nucleic Acids Research 13,6981-6998)的信号，其在转化的植物细胞和其他细胞中起到3'-未翻译DNA序列的作用。

在一种实施方式中，所使用的3’端序列(或3’UTR)是ShzFPS、ShZIS或ShTPS9，例如与SEQ ID NO:4、3、1或2或其变体有关的基因的3’端。

在一种实施方式中，待表达的核酸序列是编码包括杂合蛋白或肽或融合蛋白的蛋白或肽的序列。该编码序列可以是任何来源的，即，植物、真菌(包括酵母)、动物、细菌、合成物、病毒、人等等。其也可以包含编码靶肽的序列，例如分泌信号肽或靶向于质体的信号肽。编码序列也可以in-frame连接于编码可选择或可评分的标志物的基因，例如带来卡那霉素抗性的neo(或nptII)基因(EP 0 242 236)，以使得细胞表达融合蛋白，其可容易地检测。尽管可以使用任意基因的编码区(cDNA或基因组DNA)，但以下基因的编码区的实例优选操作性连接至根据本发明的启动子：

1.害虫或病原体疾病信号转导通路基因或通路，或抗病基因或通路；例如抗真菌或抗病毒蛋白、杀虫蛋白，等等。

2.食草动物驱除基因或通路

3.害虫、病原体或食草动物引诱基因或通路(以产生捕虫或诱虫作物)

4.次级代谢生物合成基因或通路，包括用于产生(倍半)萜烯，例如表姜烯、黄酮类或油类，治疗和/或药理学和化妆品用的重要产物或由工业生产价值的化合物的基因；提供营养学或营养保健化合物、风味物质或香料、芳香物质(草本)的基因；传粉媒介吸引子(attractor)基因

5.植物修复应用，例如，离子和污染物金属分泌基因(Psaras等人,2000,Ann Bot86,73)

根据本发明的嵌合基因或载体也可以被用于转化微生物，例如细菌(例如，大肠埃希氏菌、假单胞菌、农杆菌、杆菌，等)或真菌或藻类或昆虫、或基因或载体可内用于基因工程化病毒。具有本发明的核酸序列的细菌的转化(其结合到适合的克隆载体中)能够以常规方式进行，优选利用常规的电穿孔技术，如Maillon等人(1989,FEMSMicrobiol.Letters 60,205)和WO 90/06999中所描述的。对于编码序列在宿主细胞中的表达，核酸序列的密码子应用可据此被最优化(同样，对于植物细胞中编码序列的表达，核酸序列的密码子应用可如已知的被最优化)。内含子序列应该被除去并且如已知的进行对于最优表达的其他适应性改变。

为了在单子叶植物(例如草物种，例如，玉米或水稻)中获得增强表达的核酸序列，可将内含子(优选单子叶植物内含子)加入到嵌合基因中。例如，将玉米Adh1基因的内含子插入到5'调控区中已显示出在玉米中增强表达(Callis等人,1987,GenesDevelop.1:1183)。同样，如US 5,859,347中所描述的HSP70内含子可被用于增强表达。因此，可以可选地将一种或多种内含子插入到根据本发明的任意启动子序列中，或插入到5’UTR或编码序列中。

如下文中进一步描述的，本文还涵盖包含操作性连接至蛋白或多肽编码核酸序列的毛状体特异性启动子的转基因植物(及其部分)。

在不同实施方式中，根据本发明的启动子被用于制备用于基因沉默的嵌合基因和载体，从而该启动子被操作性连接至靶基因(在毛状体细胞中特意性地被沉默的内源性基因或基因家族)的正义和/或反义核酸序列。

“基因沉默”是指一种或多种靶基因的基因表达的下调或完全抑制。使用抑制性RNA来减少或消除基因表达是本领域中被广为接受的并且是多篇综述的主题(例如，Baulcombe,1996,Plant Cells 8:1833-1844；Stam等人,1997,Plant Journal 12:63-82；Depicker和Van Montagu,1997,Curr.Opinion Cells Biol.9:373-382)。存在大量的技术可用于在植物中实现基因沉默，例如嵌合基因，其产生全部或部分靶基因的反义RNA的嵌合基因(参见例如，EP 0 140 308 B1、EP 0 240 208 B1和EP 0 223 399 B1)或铲射功能正义RNA(也被称为共抑制)，参见EP 0 465 572 B1。

然而，迄今为止，最成功的方法为产生靶基因的正义和反义RNA(“反向重复序列”)，其在细胞中形成双链RNA(dsRNA)并且使靶基因沉默。在EP 1 068 311、EP 983370 A1、EP 1 042 462 A1、EP 1 071 762 A1和EP 1 080 208 A1中已经描述了载体s for用于dsRNA产生的方法和载体以及基因沉默。

因此，根据本发明的载体包含操作性连接至靶基因的正义和/或反义DNA片段的毛状体特异性启动子。靶基因序列的短(正义和反义)延伸片段(stretches)，例如编码或非编码序列的至少约17，18，19，20，21，22，23，24或25个核苷酸就足够了。经常使用较长的序列，例如至少约100，200，250，300，400，500，1000，1500个核苷酸，或更多。优选地，该正义和反义片段通过间隔区序列(例如内含子)分隔，其在dsRNA形成之后形成环(或发夹)。A靶基因的任何延伸可被用于制备基因沉默载体和转基因植物，其中该靶基因或基因家族沉默。产生发夹构建体的一种方便的方法是使用通用载体，例如pHANNIBAL和pHELLSGATE，其为基于技术的载体(参见Wesley等人2004,Methods Mol Biol.265:117-30；Wesley等人2003,MethodsMol Biol.236:273-86以及Helliwell&Waterhouse 2003,Methods 30(4):289-95)，所有这些结合于本文作为参考。

通过选择靶基因的保守核酸序列，宿主植物中的家族成员能够在毛状体细胞中沉默。

本文中还涵盖包含毛状体特异性启动子的转基因植物，该毛状体特异性启动子操作性连接至靶基因核酸序列的正义和/或反义DNA片段并且表现出靶基因沉默表型。该表型将取决于基因的功能，并且可以是化学或分子改变、宏观上可见的或者不可见的。因此，这样的嵌合基因和载体能够被用于确定或证实毛状体中基因的功能。

根据本发明的嵌合基因可被稳定地引入到宿主基因组这能够或者可以作为附加单元(episomal unit)存在。

根据本发明的转基因细胞和有机体

提供了可通过上述方法获得的转基因细胞和有机体，尤其是植物、植物细胞、组织或器官。这些细胞和有机体的特征在于在其细胞或基因组中通过存在根据本发明的启动子而存在嵌合基因。另外，mRNA转录本或反义的蛋白可以改变细胞或有机体，例如，植物毛状体，尤其是腺毛的表型。

在一种实施方式中，被引入到植物中的嵌合基因由在宿主属或种中全部天然存在的部分组成，例如，如果茄属植物的宿主植物被转化，优选使用来自茄属植物的根据本发明的启动子并且将其操作性连接至同样来自茄属植物的核酸序列且可选地连接至来自来自茄属植物的的3’UTR。对宿主的种施加相同的处理。尽管该植物将会携带转基因，但因此所有的核苷酸元件是在宿主属或种(即使在这种组合中并非如此)中天然存在的，这减少了调控问题并且改善了公众的接受性。

基因组中嵌合基因的位置能够影响启动子的活性和嵌合基因的表达水平。因此，能够通过例如，分析拷贝数目(DNA印迹分析)、mRNA转录本水平(例如，RNA印迹分析或RT-PCR)或通过分析由核酸序列编码的蛋白的存在和水平(例如，SDS-PAGE接着是蛋白质印迹分析；ELISA分析、免疫细胞化学分析等)来选择表达高的、组成性水平的蛋白和/或反义转录本(当使用构建体时)的转化体(“事件”或“转化事件”)。也可以针对该转化体在一种或多种生物和/或非生物胁迫条件的表达稳定性进行测试，并且能够鉴定出那些在一种或多种期望条件下保持高的、组成性表达的事件并选择以用于进一步应用。

转基因植物能够被用于传统育种方法中，例如杂交、自交、回交等等。通过使转化体自交，能够产生针对转基因的纯合子植物。育种程序是本领域中公知的并且在植物育种的标准教科书中又描述，例如Allard,R.W.,Principles of Plant Breeding(1960)New York,NY,Wiley,第485页；Simmonds,N.W.,Principles of Crop Improvement(1979),London,UK,Longman,第408页；Sneep,J.等人,(1979)Tomato Breeding(p.135-171)in:Breeding of Vegetable Crops,Mark J.Basset,(1986,editor),The Tomato crop:ascientific basis for improvement,by Atherton,J.G.&J.Rudich(编辑),Plant BreedingPerspectives(1986)；Fehr,Principles of Cultivar Development—Theory and Technique(1987)New York,NY,MacMillan。

转基因细胞或有机体也能够被用于细胞培养物中(植物细胞培养物、细菌或真菌细胞培养物，例如酵母培养物、人或哺乳动物细胞培养物、昆虫细胞培养物)，例如用于大规模生产重组蛋白。在一种实施方式中，提供了细胞培养物，其包含包括根据本发明的启动子的细胞。

根据本发明的方法和用途

本文还提供了用于制备转基因植物或植物细胞的方法，包括以下步骤：

(a)产生包含根据本发明的启动子的嵌合基因或载体，其操作性连接至待表达的核酸序列；

(c)再产生转基因植物或植物。

在该方法的一种实施方式中，在步骤a)中使用包含本发明启动子的载体，并且所述载体包含SEQ ID NO:1的核酸序列，其操作性连接至编码氨基酸序列SEQ ID NO:5(ShzFPS)或其与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少80％同一性的变体的核酸序列，所述氨基酸序列具有法呢基二磷酸合酶活性。SEQ ID NO:5的所述变体可以与SEQ IDNO:5的氨基酸序列具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％,或99％的序列同一性，优选在全长上。

在一种实施方式中，在步骤a)中使用包含本发明的第二启动子的第二载体，并且所述第二载体包含SEQ ID NO:2的核酸序列，其操作性连接至编码SEQ ID NO:6的氨基酸序列的核酸序列或其与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少92％同一性的变体，所述氨基酸序列具有姜烯合成酶活性。7-表姜烯合成酶(SEQ ID NO:6)的变体包括例如，与SEQ ID NO:6具有至少92％，92.5％，93％，93.5％，94％，94.5％，95％，95.5％，96％，96.5％，97％，97.5％，98％，98.5％，99％，99.5％或更高(例如100％)的氨基酸序列同一性，优选在全部长度上，的蛋白。

注意到，该载体和第二载体可以被组合成单个载体，以用于本发明的目的。

因此，ShzFPS基因和ShZIS基因均优选在其自身启动子的控制下在转基因植物或植物细胞中表达。在一种实施方式这能够，SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6的氨基酸序列通过靶向序列而被提前，利用用于使Z,Z-法尼基焦磷酸合成酶和/或7-表姜烯合成酶靶向于细胞器例如质体，优选叶绿体,或线粒体,或用于从细胞细胞分泌。靶向于质体尤其具有吸引力，因为在细胞溶质中过多产生倍半萜烯通常对于细胞是毒性的，而在质体中过多产生倍半萜烯则不会产生这个问题。靶向序列可以是所述Z,Z-法尼基焦磷酸合成酶的天然靶向序列序列(如SEQ ID NO:7中所述的)和/或7-表姜烯合成酶的天然靶向序列(如SEQ ID NO:8中所述的)。或者，也可以使用其他靶向测序。如果需要的话，本领域技术人员将能够选择适合的靶向序列。

优选地，所述植物或植物细胞不是多毛番茄(Solanum habrochaites)植物或植物细胞。

本发明还包括可通过本文中所述的方法获得的转基因植物或植物细胞。在一种实施方式中，所述植物或植物细胞不是多毛番茄植物或植物细胞。优选地，所述植物或植物细胞不是植物或植物细胞。

再生的植物(或其保留了转基因的后代)或其部分可被用于各种目的，例如如此用于农业或用于分子农业。进一步应用取决于由转基因带来的表型。例如，如果该转基因植物在毛状体中产生高水平的次级代谢，则该植物将会生长并且收获代谢产物。因此，取决于该转基因，可以收获植物的全部或部分以用于分类或动物消费或用于工业目的。而且，也可以出于不同目的而收获植物的不同部分，例如，可以收获或种子以用于，而可以收获收获叶、茎和/或花以用于工业目的。

显然，转基因带来的表型能够在，例如，在田间试验中(例如，疾病或害虫抗性测试能够利用常规方法来进行)进行。

在非胁迫条件下可以鉴别在毛状体中提供组成性高启动子活性的转基因植物，而当植物暴露于一种或多种生物和/或非生物胁迫时，启动子活性保持基本不变(至少没有减少，或没有显著减少)。

该植物可用于常规农业方法和育种方法。

以下的非限制性实例描述了根据本发明的启动子的应用。除非在实施例中另外说明，否则根据标准试验方案进行所有的重组DNA技术，如根据Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,以及Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,NY；以及Ausubel等人(1994)Current Protocols inMolecular Biology,Current Protocols,USA的第1卷和第2卷。用于植物分子工作的标准材料和方法在R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中描述，由BIOSScientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications,UK联合出版。本文中引用的所有文献以引用方式结合于本文作为参考。

附图说明

图1示出了用pTPS9:GUS转化的植物的毛状体-特异性GUS染色。其显示出TPS9启动子在番茄的毛状体中具有特异性活性。

图2示出了用pzFPS:GUS转化的植物的毛状体-特异性GUS染色。其示出了zFPS启动子在番茄的毛状体中具有特异性活性。

图3示出了GUS的毛状体-特异性表达。用两个独立组的引物来进行Q-PCR，以确定GUS在由ShTPS9启动子(SEQ ID NO:4)驱动的用GUS转化的3个独立转基因植物的毛状体中的表达。将该内源性毛状体-特异性番茄基因(MKS1)的表达设定为100％。显而易见地，ShTPS9启动子的活性远远超过(10-100倍)tSlMKS1启动子的活性。

图4示出了GUS的毛状体-特异性表达。用两个独立组的引物来进行Q-PCR，以确定GUS在由zFPS启动子(SEQ ID NO:1)驱动的用GUS转化的2个独立转基因植物的毛状体中的表达。将该内源性毛状体-特异性番茄基因(MKS1)的表达设定为100％。显而易见地，ShzFPS启动子的活性远远超过(8-65倍)SlMKS1启动子的活性。

序列表

SEQ ID NO:1：ShzFPS启动子序列。

TGGCCATTACGTGGACTAATTTTTTTACAATAAATGATCACTTTATTTTTAACAAGTATGATTAATAATTAATTGAAATTAGTGAGTTTGAAATTTGACTTTTGTTTAGCCTATGAGCAAACCTTTAAAGTTAATTCAAAATTAAAAGTTATTGATTTTTAATCATGTTTATGAATCAAATGTGATCAAAAGGTCAAAATCAACTGTCTCCCAAATAATTTTTTTAAACTCGAGATGATTTGAAATTTTTTTCAACCAATAGTTATATTTTCCAATGTCATATTATTAAAAACTTGAGGCTAATTCCATCCTGGAATTTATGACTATAGTTATAGTTATCTTAGACTCTTAGCTGCGTTATAGTCAGACTTGATAATTATTAAAAAGTGTGTGACTCTGATTTTTCACATATGACGATTTGAGAAATTGATAATCTAGAAAGCTATATCATGAAAAATTCTAAGAATGATTGAAGATAATAAGAATATTTTGAAATATCGCAACCCTACCACAAAGTTTTACCAACCTATTTTCTTTTATATAGATATGAGCTATATGACACATGGAAATACAATTATAAAGCAGTAGTTAGAGGTGAATTAATATTGAATTTTAAAGGGAATAATCAATGGATGATATCTTTTTTACTTTTTTTTCTTTTATCACTAAAAGTGCATTCATTGTAGACTAAAACACATTAAATAGAGTTTTATATCCTTTTCTCATACATGGTCCCTCATTTTCTTCTTAGTCTTGTATTATAAGTCACCTCTTTTTAAAAATAATTGGATCATAATATATGTTATTTTATAAAATTTATGCATAAAATATCATATTTTGCTCATTATATTTTTATTGATTAATTAATAATCTTAAAATATATTTATTTTGACTGATCTTGAAAATCAATAACTAATTAAATAAGGGCATAGAAATAAAATTATCTTATTTCTTGTTACAAGTACAAATACAAAAAGTGACTTATAATATGGGACGGGGGGAGTAATTAAGTGAAAGGTTATTCGTTCTTTATTGGTATTATCAGTTATTTAGGAGATAACTGATTTAGCAATTTTTAGTCTTTATTTATTTTATACACAGTTTATAAAACATACTTACATTTTTGAACTTGGTGATGGCGTAGCCCAGGGGTGTTAAATGGGCGGGTTGGGTTGAAATTGGAAATATTACTATGGGTGAATAGAAATTGGGTTGGGTTTGACCCGCCCAAATTTACTTTGGGCTCAAATGAGCTAAAATATGGGTTGGGTCTTGACCCGCTCAATTTGACCCGCTTAATCTTAGTTATTTAACATATTGATATTTAATTTTTATAATCACAATTTGAATCTCCGTTCAAGAATTTTTTTTTTATAATAAAAGTAACAAATGGATAGATAAATCATAAAAAAAAAGCAACAAATCGATAATAATTCATACTGTAAATATAGGAACATATCTTAATACTAAGTTATAAAACAGGTTGAAATTAGTAATTGAATTGGGCTCAATTGAGAATTCTCTTCAAATAGGTTAAGCTTGAATGGGTTGAGGTTGAACCCAACTCAAATTATCTTGAGCTCAATCCTTAAAATTCTGAGCGTATTGGGCATGTTACCATGTTTGGGTTCATTTTTAACGCCCCTAGCGTAGTCGAAAGAAGTCAATCCATGAGGTTTGTAAAACAAATGCGAATAATTTACTCTACCATTGAGCTTGTTAGTCATATGGTGTAGCAAAATGGTAGATTATCGAAAAAATATCTTAATTATGCTTCATAGTTATAATTTGTTAATTACAATTAGTAGCTACATGTTATATGGAGGAGAGTGGCGAGCGAGATTGGGAGAGGAAAGAGAGAAGTGAGTGAGACAAGGTAGAGAGTGGGAGAGAGGCGAACTGCATATGCATATTTGTCAAAATAATTGTATATATGTAACTGGTATACATACGTATTCGTATATCTGGTGAGTGAGGAGAGAAAAGAGAGAAGCGAGCGAGATTGGAAGAGGAAAGAGAGAGCCGAGCGAGAGAGGACAATAATTTATGTAATTCGCATCTCATTTGTATAATTAATTTTGTTCGAAATGCGGTTCAATATAATTTTTTAACCATAAGCATAAACAACCCTATATAGAACTATTGATCAATATAGAACTATTGATCTATTGATCAAAAGAGTCATACCATAATTCTATTTAAACACCACCTCCCTTGTTTCACTTCACAATAAAATAAATTTGAGTAATAAAGC

SEQ ID NO:2：ShZIS启动子序列。

CTCTCTCTAAAGAAGTTGAAGATACCTTCTTCCAGTAAGTGGGACTGGAGGGGGAGATTTGTTGAATCCATCCCATTTTTTTTGGTCAACTTTAGCTACTCAATTGGTACAAGCAATTGTTAAAAAGGAATAGTAATTGGAGTTGAAAAGAAAAGATTTGGTAGTTGGCAAATTGGTAAGATTTGCAACCATTTTTGACTTTGCTATGTTTACATATGTCATTAGTGACATAGGTATGGTTTTATCCTTCTATAAATAGCGCACTCTTGCTCATTTGTAGAACACACCAAGTTAGAGAGAAAAACAATTTTGAGAGCAAAGTGAGGTATTCCATAGACTATATAAGAAAATAGTCTGTGAAGAAAAATAGAGTGTGAGCGATATTTTAGTAAGACGGAAACCAAAAGAGTGTTGTTCCTTTTGAGTGTGTAGTAGTCACTTTGAGTATTGTATTCGTGACTACACAGTGTAAAATTCCTTACTATAGTAATATCAATTGCTCCTCTTAGTCCGCGGTTTTTTCCCTTATTCAGAAGGGTTTCCACGTAAAATTCTTGGTGTCATTATTTTCCCATTTTATTTCCATTACTTTTACCATATATACTTTtGTGCTTGTCCGCGTTTTCCCAACAAGATGGTGTTTAAATAGAATTATGGTATGACTCTTTTGATCAATAGTTCTATATAGGGTTGTTCATGCTTATGGTTAAAAAATCATATTGAATCGCATTTCGAATCAAAATTGATAATACAAATGAGATGCGAAGCTTGCATGAGTTCCAAAAAATATAAATAACGGTAAAATGGTAAAGTTACATCATTTTTTAATGCAACTGCAAAGTAAAAATATAACATATAAAATGAGACAGAGGAAGTATGTAAAATCAATAATGAATATGTATTACTCCCTCTATTTCATAATAACTTAAGCTTTGAAGTGTTTCACACCCTTTAAAAAAAGTAGGTTAGGACATAAATGAACATAATTTTTCATTTTTGTCCTTATTAATTATTGTCAAAAATAACTAAACATTAATTATAATAACTAATtCCAATACTAACTTAATGGGTAAAATTAGAAGAAATTTTTTAAAATAGTCTTGAAAATTTAAAACATAAGTTAATTGAAAAATGGAAAGAAAAAAAAGCTCAAATCTTGTTATTATGTAATGGAGGGAGTATTAGACAGAGAAATTATTAATTRCTCCCTCCGTCCCATATTATAAGTCACTTTTTTCATTTGTACTTGCAACAAGAAATAAGATAATTTTATTTCTATGCCCTTTGTTATAGATTTTCAAAATTAGTCAAAGTAAATATATTTTCAAAAYTAATTAATTAATCAATAAGGATATAATGAGCAAAATATGGTATTTAGTATAAATTTATAAATACATATATTATGATCAATATTTAGAGAAGGTGACCTATAATATGAAGGAAGAAATGAGGACCATATATGAGAAAGGATATAAACTCTATTTAATGTGTTTAGTGTACAATGAATGCACTTTAGTGATAAAGAAAAAAGTTAAAAAAATATCATCCATGATTATTCCCTTTAAAATTCGATATTAGTTCACCTCTAACTACTTACAATAATTGTATTTCCATGTGTCATATAGCTCATATTTATATAAAGAAAATAGGTTGGTAAAACTTTGTGGTAGGTTTGAGATATTTCAAAATATTCTTATAATTTTTCAATTATTCTTCCAATTTTTTCATGATATAGCTTTCTAGATCATCAATTTTCTTAAATCGTCATATGTGAAAATTGGAGTCACACACTTTTTAATAGTTATCAAGTTTGACTATAGCGCAGCTAAGAGTCTAAGATAACTATAACAATAATCATAAATTACAGGATGGAATTAGCCTCAAGTTTGTAATAACATGACATTCGAAAATATAACCATTGGATAAAAAAAATTTCAAATCATCTCGAGTTTATAAAAATTATTTGAGAGACAGTTGATTTTGACCTTTTGATCACGTGTGATTCATAAACATGATCAAAAATCAACAATTTTTAATTTTTAATTGACTTTAAAGGTTTGCTAATAGGCTAAACGGAAGTCAAATTTCAAACTCACTATTTCAATTAATTATTAATCATACTATGTTAAAAATAGTCCACGTAATGGCCAACAACTAGCAAAACTTATCACGAGATTCTATATGATACTATATATGCTTTGTTTTTTCGATATTCATTTTATTTAAAGTTTGATATTTATATTAAAATTAAAATAGATTTTAAATTTGTATTAAGAAAATTCATTATAAAAGGTTGAAACATTTTCTAACAAAAAGATATGATGTCCACTTGAATCAAAGAGTAATAATGCTCATATACTTTTTCTGCTTTGAAATAAGATATGCGATAATGATTGACTAATAAAAATTAAAGACTAGTCATTTATAGGGCAAAACGTGCATTTTTACATTTAATTACACATCAAGKTTATACCAAAGTGAGATATTATAAGGAAAAATCTTTGTGGCCAAAATTTTTGGACAGAACGATATTTTATTTATGTTATTTTAATTTTAATACATTTTAACTACAAAATGGAAAAAATAACAGTTTATTATAAAATAAAAAAATATTTTAGTTTTTTTTATTTTTTTAGTCAATTTTTCTAGCCATTTAGCTCTTTCCATATTATAATATAAAGAGAAAAGTATTTAAAATATCTCTAAATTTGGTGTGAATTAATAGGTTTGTCTCCGAATTATTGACAACATTAAAACTACTCTCTACTTGACAAATTGAACTTAAACATATATACCCTTGATCTTGTCACATCAGTGATATACAATCCCAAATTCTCGTCAACTTTAGGGGTATTTTGAACACTTCTTTTGACATTTTATTAAGAGTCTCACGTTCCTACAAGAGTTTGAGACTACTTGATATGCCATGTGGCAGACTGGAGTGTATTTTAAGTTCAGTTAGTCAACTAAACAATTTTTTTAGAGTAAATTTTAGGTTTAACAAACATAAAAATCATATATGTATGTTAATAATTATAGTTGGTATAATTGCGCTTCATAGCAAACTTTATGTTTGCTATGACTATTAATTTGTATATTTTGATATACATATACAAAAGAATGAATTGTATAATCTCTATTTGTATAAAGCGAGAACGAGAGAAGACAAATGAAAACTGGTAGCGAGAAATGGAGAGTGACGAAAGACAACTGTTTAATTTGAATCAATGATTTGCTATTTTATACATTTTTTCCTTATTTTTAAGACTATCAATAATTGAGTGACGAAATTAATAATTTGCATTAAATTTAATTAAAAATATTTTCAACATTTCTCTCCGCTAAATATTTATTTATAACGAGGAAACAAAATCAAAGACAAACACAAAATAGGAGAAATTTCTTCATTTTTGACCCCTCCACTCCCAAAAACAACACACAATATTCAAGG

SEQ ID NO:3：ShTPS9启动子序列。

TTATTTCACTAATTAAATTTATTCTTAAATATTTATATATATTTATTTTGCTATGCTAATTTATTTTTTTTATAATAAAATTAGTTGAGTGATTTGATGGATACAAAGTCATAAATTGAATGACTTAACTAAATAAATTATTAAAGTTGAATGATATTATTGATAAAAAGACATAAATTGAATAATTTTTTTGATATAAAATAAAGTTCAGATATTGTTACACAATTAACCATCCTTTTCAATTTTAATAAATAAACTCCTCTTTAATATCGTTCTAATGAAAATTTCTTCCAAACAACATAAATAATAAGTTCATCATTTATCGACTAATTCATAAATATTATTTGAGTAATATCTATGCAATTTTTTACAATGTTTATATTATGTCATTTAAAAGATAAGGACAGATGCCGGTAAGCATTACAATAAGTGGTAGTAACTACATTATAAATAGGCCCATCCAATTAGCATAACTTAAACCCACAAATTAAGCTTGAAAAAAAAAGAGCAAACCTTAGAACAAACAAGCA

SEQ ID NO:4：ShTPS9启动子序列(长)。

TTTAAATTTTATATTTATATTAAACATTTTATTAATATATATATATATATAGCTATAAACTCAATAATTACGATGACTTACTATAAATTCGATTTTAAGTTTGAACTCAAAAATTCTTAAAACTCTAATTCTACTTGTGTATTCATCTAGCCTCTTATGACACGTaAAAAAAAATACAATAAATAAATTGCAATAACTCAAATTATTTATATGTGACATAAAGAATCGTGTGGCTCTAAAATTTTATTTCTCTGCGGTCCAATTAAAGTTTTGATAATCCACCAAATTGAAGACTTAAAATGCCTTATTGAGGTGCCAAATACTAATGAAGAAGAAAACAAAACAAAATAAAAACACCTACTCATAAATTATAATATAACTGTATCTCATTGCTAATATGACATTTAATAGGAGAGTATGAAAATCGATAATTAGGATATATTGTTAATATATAATCAAACGTTTTATTTCTTCCTAGTGGTAGAGTAAGGTTCTAATCTAGAGCCCCTATCCCCTTACCATTACTGTTTAGTATTATGCAAGTTATTTTTTTACTTTGATTATCTCTAATATTTTTACTGTCGTTATTTTTGTTTTTTTAATATAATTTTTGTCATATTTTTTGCTGTTACAATACTTTCAAATCATGTTTTGAAGAATGATTTCTTGATCCGAGGATCTATAGTAAACATTCTTTCTATCAAATAAAGATACATATAACTTATAAGGTCTGCATACATAATACTATCCTTCTCAAACCCCACTTATATGAAATGATACCAGATGACTGAGTCAATATCTCAAAAGGTCACTCAAGTTTAAGAATATATCTAGTAAAGTTATTAAACTTTCTTTACTATCAATAAAATCACTTAACTTAGATACGTGGATCAATAAAATCACTCAACTCAATTTATCATTAAAAAAATTATCATAGATAAATAATTTTTTATGCCATGTAAATATGAACTCCATAAATTAATAAAATTAAAAAAAATCCATCAAGACTTTTTTATGAATAAACTTAATAATTTATTAGGATATTATTATATAATTCTAATGTATTATTACGAGCTTTATTAAGAAAAAGTTAGGGTATTGTATGGTAAATAATTGGGGGTACATGATTTTTATCATATAAAAATATATAGACATTGGCTTAATAACTCTAACTCTGCAAATATTACTCTGTTACGATCATTAAATTATAAAAATAAATTGACGTCTTATAATTATTTTTCGTTGCAATCATTAAGCCCTATGACAATATCAGTATATAGTAATTGGTAATGTAACATTCATTCTGATACCAATTTTAAGTGCATAATAATATTATATTAATATTTATTTCACTAATTAAATTTATTCTTAAATATTTATATATATTTATTTTGCTATGCTAATTTATTTTTTTTATAATAAAATTAGTTGAGTGATTTGATGGATACAAAGTCATAAATTGAATGACTTAACTAAATAAATTATTAAAGTTGAATGATATTATTGATAAAAAGACATAAATTGAATAATTTTTTTGATATAAAATAAAGTTCAGATATTGTTACACAATTAACCATCCTTTTCAATTTTAATAAATAAACTCCTCTTTAATATCGTTCTAATGAAAATTTCTTCCAAACAACATAAATAATAAGTTCATCATTTATCGACTAATTCATAAATATTATTTGAGTAATATCTATGCAATTTTTTACAATGTTTATATTATGTCATTTAAAAGATAAGGACAGATGCCGGTAAGCATTACAATAAGTGGTAGTAACTACATTATAAATAGGCCCATCCAATTAGCATAACTTAAACCCACAAATTAAGCTTGAAAAAAAAAAGAGCAAACCTTAGAACAAACAAGCA

SEQ ID:5:多毛番茄Z,Z-法呢基二磷酸合酶(zFPS)氨基酸序列。

ARGLNKISCSLSLQTEKLCYEDNDNDLDEELMPKHIALIMDGNRRWAKDKGLDVSEGHKHLFPKLKEICDISSKLGIQVITAFAFSTENWKRAKGEVDFLMQMFEELYDEFSRSGVRVSIIGCKTDLPMTLQKCIALTEETTKGNKGLHLVIALNYGGYYDILQATKSIVNKAMNGLLDVENINKNLFDQELESKCPNPDLLIRTGGVQRVSNFLLWQLAYTEFYFTKTLFPDFGEEDLKEAIINFQQRHRRFGGHTY

SEQ ID NO:6:多毛番茄7-表-姜烯(ZIS)氨基酸序列。

CSHSTPSSMNGFEDARDRIRESFGKVELSPSSYDTAWVAMVPSKHSLNEPCFPQCLDWIIENQREDGSWGLNPSHPLLLKDSLSSTLACLLALTKWRVGDEQIKRGLGFIETQSWAIDNKDQISPLGFEIIFPSMIKSAEKLNLNLAINKRDSTIKRALQNEFTRNIEYMSEGFGELCDWKEIIKLHQRQNGSLFDSPATTAAALIYHQHDKKCYEYLNSILQQHKNWVPTMYPTKIHSLLCLVDTLQNLGVHRHFKSEIKKALDEIYRLWQQKNEEIFSNVTHCAMAFRLLRISYYDVSSDELAEFVDEEHFFATSGKYTSHVEILELHKASQLAIDHEKDDILDKINNWTRTFMEQKLLNNGFIDRMSKKEVELALRNFYIISDLAENRRYIKSYEENNFKILKAAYRSPNINNKDLFIFSIRDFELCQAQHQEELQQLKRWFEDCRLDQLGLSEQFISASYLCAIPIVPGPELSDARLVYAKYVMLLTIVDDHFESFASTDECLNIIELVERWDDYASVGYKSERVKVLFSMFYKSIEEIATIAEIKQGRSVKNHLINLWLKVMKLMLMERVEWCSGKTIPRIEEYLYVSSITFGSRLIPLTTQYFIGIKISKDLLESDEIYGLCNFTGIVLRLLNDLQDSKREQKEGSINLVTLLMKSISEEEAIMKMKEILEMKRRELFKMVLVQKKGSQLPQLCKEIFWRTCKWAHFTYSQTDRYRFPEEMENHIDEVFYKPLNH

SEQ ID NO:7：多毛番茄Z,Z-法呢基二磷酸合酶(zFPS)靶序列(氨基酸序列)

MSSLVLQCWKLSSPSLILQQNTSISMGAFKGIHKLQIPNSPLTVS

SEQ ID NO:8：多毛番茄7-表-姜烯(ZIS)靶序列(氨基酸序列)

MIVGYRSTIITLSHPKLGNGKTISSNAIFRRSCRVR

实施例

启动子分离的基因选择

利用下一代测序技术(Illumina HiSeq 2000)对番茄和野生番茄多毛番茄的毛状体-特异性cDNA文库进行测序。使用TruSeq试剂盒(llunima)来制备cDNA文库。测序后，数据分析显示，针对多毛番茄法呢基二磷酸合成酶(ShzFPS；FJ194969)、多毛番茄姜烯合成酶(ShZIS；JN990661)和多毛番茄大根香叶烯合成酶(ShTPS9；JN402388)的阅读频率相比于在多毛番茄(LA1777和PI127826)和番茄(例如，ShMKS1和SlMTS1；参见表1)中表达的其他已知毛状体-特异性基因要高。随后，番茄cvMoneymaker和野生番茄多毛番茄的不同组织的RNA被分离。在包括毛状体的若干不同的植物器官中测试ShzFPS、ShZIS和ShTPS9的组织特异性表达水平。ShzFPS、ShZIS和ShTPS9基因的表达比其他的公知毛状体-特异性基因(例如ShMKS1和SlMTS1；表1)要高得多。而且，其示出了ShzFPS和ShTPS9的表达是毛状体-特异性的(图1和图2)

表1.作为文库中阅读/转录本总数的％的定位于以下基因的阅读/转录本的数目

基因	S.hab LA_1777	S.hab PI127826	S.lyc LA_4024
				ShzFPS	0.2354	0.1939	n/a
ShZIS	0.1406	0.1929	n/a
				ShTPS9	0.0563	0.0036	n/a
ShMKS1	0.0058	0.0002	n/a
				SlMTS1	n/a	n/a	0.0001

启动子序列分离

为了获得启动子序列，根据Clontech GenomeWalkerUniversal试剂盒实施在基因组DNA上的基因组步移。从多毛番茄PI127826分离总基因组DNA。用若干6-碱基识别尺寸剪切限制酶分别消化2μg的gDNA，之后用适配子捆扎(ligation)并稀释。用适配子引物1和基因-特异性引物来实施第一轮扩增。随后，用适配子引物2和嵌套基因-特异性引物实施第二轮的嵌套扩增。进行又一轮的嵌套扩增。克隆扩增的PCR片段并进行Sanger测序。

具有适配子和特异性引物的不同基因组DNA片段上的嵌套PCR产生了新的启动子序列片段。利用来自Invitrogen的Original TA试剂盒来利用质粒2.1进行PCR产物的克隆。在测序之后，新的反向引物能够被设计为新型启动子片段序列。具有含针对克隆的适合限制性位点的引物的基因组DNA上的PCR获得最终DNA调控核酸片段。

基于如在GenBank登录号FJ194969(ShzFPS)、JN990661(ShZIS)和JN402388(ShTPS9)中所述的核酸序列的5’序列信息，设计特异性反向引物。

引物试剂盒：

适配子引物1(AP1；22-mer)

5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’

嵌套的适配子引物2(AP2；19-mer)

5’-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3’

用于ShzFPS启动子的基因组步移的引物(SEQ ID NO:1)

用于ShZIS启动子的基因组步移的引物(SEQ ID NO:2)

用于ShTPS9启动子的基因组步移的引物(SEQ ID NO:3)

引物名称	5’–3’序列
		第1轮
引物外显子1ShTPS9	CGTAAATGGATATGTATCTCCTTGCTTC

嵌套的引物

GCTTCACTAACTTCAACCTTAAGAGAG

用于ShTPS9长启动子的基因组步移的引物(SEQ ID NO:4)

所获得的启动子序列如下。

毛状体-特异性启动子序列

SEQ ID NO 1：2254bp ShzFPS启动子

SEQ ID NO 2：3451bp ShZIS启动子

SEQ ID NO 3：530bp ShTPS9启动子

SEQ ID NO 4：1875bp ShTPS9长启动子

转化构建体

将最终ShzFPS和ShTPS9启动子序列(分别为SEQ ID NO:1和4)置于pKG1662载体中的GUS-A标志物基因的前方。启动子和标志物基因随后穿梭到双元pBIN-plus载体的多克隆位点中(Van Engelen等人,1995,转基因Res,288)。将这些构建体结合到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101中并用于转化番茄(S.lycopersicumvar)。根据Koornneef等人(1986.Transformation of tomato.In:Nevins D.J.and R.A.Jones,eds.Tomato Biotechnology.New York,NY,USA,Alan R.Liss,Inc.pp 169-178.)所述的方法Moneymaker，植物在卡那霉素选择条件下转化和再生，并且使原代再生株(T₀)生长成为种子。

转化体的表达分析

在T0植物上实施定量和定性β-葡萄糖苷酸酶(GUS)活性分析。

利用组织学GUS分析进行启动子活性的定性分析。在磷酸盐缓冲液(1mg/ml,K₂HPO₄,40mM,KH₂PO₄,10mM,pH 7.2,0,2％Triton X-100)中存在大气中的氧气和Xgluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-葡糖苷酸环己胺盐)底物的条件下，将各个植物部分在37℃培养过夜。通过用乙醇重复洗涤使样品脱染色。非-转基因植物用作阴性对照。具有ShzFPSp:GUS和ShTPS9p:GUS的转基因植物的毛状体显示出亮蓝色的毛状体，而这些转基因植物的非-毛状体组织和非-转基因对照植物的毛状体未被染色(图1和图2)。

利用Q-PCR进行转基因番茄植物的毛状体中启动子活性的定量分析来确定相比于公知的毛状体特异性基因的GUS表达，该公知的毛状体特异性基因即，番茄MKS1(Uniprot E0YCS4_SOLLC；Sol Genomics Network entry Solyc01g108780.2)。为了分离毛状体，从转基因和非-转基因番茄植物切下叶柄和4cm的一段茎并立即将其在液氮中冷冻。通过涡旋混合从冷冻的茎收集毛状体并将其保留在液氮中或在-80℃储存直至进一步分析。对于每个样品获得三个独立的生物学复本。随后，根据制造商的说明用QiagenPlant Mini Kit分离总RNA。简言之，将50mg的毛状体置于液氮中并将细粉转移至预冷冻的微量离心管(eppendorf tube)。毛状体被破坏，从大的碎片澄清细胞裂解液并且总RNA结合于柱，纯化并洗脱。以所述的体积使用所提供所述的缓冲液。实现了250ng/μl总RNA的平均产量。

cDNA合成：首先根据制造商的说明用Promega RQ1RNase-Free DNase试剂盒处理总RNA以除去剩余的基因组DNA。随后，利用Invitrogen Superscript^TMII反向转录酶试剂盒通过锚定的寡聚dT引物作为引物来合成500ng总RNA单链cDNA。在进一步反应之前将该cDNA稀释三倍。

为了确定和比较ShzFPS和ShTPS9启动子(分别为SEQ ID NO:1和4)的活性与番茄(MKS1)中的公知毛状体特异性启动子的活性，我们进行了qPCR分析。使用RocheApplied Science480 DNA SYBR Green I Master试剂盒来进行单链cDNA的qPCR扩增。反应基本上根据制造商的试验方案进行，其中在15μl的终体积中有2μl cDNA作为输入材料。以0.5pmol/μl的终浓度使用引物(如表2中所列出的)并在测试前用于线性和单产物扩增表征。利用480装置来进行扩增反应。该扩增过程为：5分钟950C；10s 95℃,20s 58℃,30s 72℃；32次循环。对SYBR绿色荧光信号进行评分并且通过480软件计算Cp值。使用自动设定的背景校准和截止值(cut-off)。ΔΔCt方法用于计算相比于外源番茄MKS1基因(已知的毛状体-特异性基因)的表达的浓度依赖性平均启动子活性。

若干独立转化的番茄植物(表达pShTPS9:GUS或pShzFPS:GUS)的qPCR数据指示了在毛状体能够发现对于GUS的高水平mRNA，这表明我们发明的启动子是高度活性的且具有毛状体-特异性(图3和图4)。而且，启动子活性以大数量级高于之前描述的番茄毛状体-特异性启动子MKS1，如在Fridman等人(2005；同上),Ben-Israel等人(Plant Physiol.2009,vol.151(4):1952-1964)和Yu等人(Plant Physiol.2010,vol.154(1):67–77.)的文献中所描述的(图3和图4)。另外，其清楚地显示出ShTPS9和ShzFPS启动子在除了其原始鉴定/分离的物种(即多毛番茄)之外的植物种中具有毛状体-特异性活性。这表明，除了具有高活性之外，这些启动子还在其他植物物种的毛状体中具有通用用途。

表2：qPCR引物序列：

ShZIS的转化和毛状体-特异性表达

在pKG1662载体中将ShZIS启动子序列(SEQ ID NO:2)置于GUS-A标记基因之前。随后姜启动子和标记基因穿插到双元pBIN-plus载体的多克隆位点中(VanEngelen等人,1995,Transgenic Res,288)。将该构建体结合到根癌农杆菌GV3101中并用于转化番茄变体。Moneymaker，根据Koornneef等人所描述的方法(1986.transfoprmation of tomato.In:Nevins D.J.和R.A.Jones,eds.Tomato Biotechnology.NewYork,NY,USA,Alan R.Liss,Inc.pp 169-178.)。使得在卡那霉素选择和原代再生(T0)条件下转化的植物生长为种子。进行GUS-表达分析并在番茄中显示出特异性毛状体表达。的GUS表达，以及由此餐来的ShZIS启动子活性显著高于在文献中描述的已知毛状体-特异性启动子(例如，ShMKS1)。此外，其显示出ShZIS启动子在除了已分离毛状体的植物种之外的植物种的毛状体中具有活性。

利用本发明的启动子通过代谢工程使代谢产物增加。

利用代谢通路工程化显示出高活性的ShzPFS、ShZIS和ShTPS9启动子。用分别由两种已知启动子SlMTS1和ShMKS1以及SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4的启动子驱动的ShzFPS的CDS(编码SEQ ID NO:5的氨基酸序列的核酸序列)和ShZIS(编码SEQ ID NO:6的氨基酸序列的核酸序列)转化番茄植物(分别参见WO2009/082208和Fridman等人,2005,同上)。为了评价启动子活性，利用Q-PCR来确定ShzFPS和ShZIS转录水平。而且，在这些组的转基因植物中通过GC-MS来确定姜烯(由ShzFPS和ShZIS的活化产生的代谢终产物)的水平。两个测试均表明ShzFPS、ShZIS和ShTPS9启动子的活性比之前所描述的毛状体-特异性启动子要强。

Claims

1.转基因植物或植物细胞或植物组织或器官，所述转基因植物或植物细胞或植物组织或器官包含整合到其基因组中的嵌合基因，其特征在于，所述嵌合基因包含操作性连接于同源或异源核酸序列的毛状体-特异性启动子，所述同源或异源核酸序列可选地被进一步操作性连接于同源或异源3’UTR序列，其中，所述启动子选自下组中：

(a)SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列；

(b)SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列的功能片段；

(c)与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列；

(d)(c)核酸序列的功能片段。

2.根据权利要求1所述的植物、植物细胞、组织或器官，其中，所述启动子在腺毛中具有特异性活性。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的植物、植物细胞、组织或器官，其中，所述启动子具有组成性活性。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的植物、植物细胞、组织或器官，其中，当所述植物、细胞、组织或器官暴露于一种或多种生物和/或非生物胁迫时，所述启动子活性不会显著下降。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的转基因植物、植物细胞、组织或器官，其中，所述植物属于茄科。

6.分离的核酸序列，所述核酸序列当被引入到植物细胞中时具有毛状体特异性启动子活性，其中，所述核酸序列包含选自以下的序列：

(a)SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列；

(b)SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列的片段；

(d)(c)核酸序列的功能片段。

7.根据权利要求1(d)或5(d)中定义的片段，其中，所述片段包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列的至少200个连续核苷酸。

8.包含根据权利要求6所述的核酸序列或根据权利要求7所述的片段的嵌合基因。

9.根据权利要求8所述的嵌合基因，其中，根据权利要求6所述的核酸序列或根据权利要求7所述的片段被操作性连接于同源或异源核酸序列以及可选地3’UTR序列。

10.包含根据权利要求6所述的核酸序列、根据权利要求7所述的片段或根据权利要求8或9中任一项所述的嵌合基因的载体。

11.包含根据权利要求8所述的嵌合基因或根据权利要求10所述的载体的转基因植物或植物细胞。

12.用于制备转基因植物或植物细胞的方法，包括以下步骤：

(a)产生根据权利要求8所述的嵌合基因或根据权利要求10所述的载体；

(c)再生转基因植物。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，在步骤a)中使用根据权利要求10所述的载体，并且所述载体包含SEQ ID NO:1的核酸序列，所述SEQ ID NO:1的核酸序列被操作性连接于编码SEQ ID NO:5的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少80％同一性的其变体的核酸序列，所述氨基酸序列具有法呢基二磷酸合酶活性。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，在步骤a)中使用根据权利要求10所述的第二载体，并且所述第二载体包含SEQ ID NO:2的核酸序列，所述SEQ ID NO:2的核酸序列被操作性连接于编码SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少92％同一性的其变体的核酸序列，所述氨基酸序列具有姜烯合成酶活性。

15.能够通过权利要求12-14中任一项所述的方法获得或通过权利要求12-14中任一项所述的方法获得的转基因植物或植物细胞。

16.根据权利要求15所述的转基因植物或植物细胞，所述转基因植物或植物细胞是番茄植物或植物细胞。