CN101952445A

CN101952445A - 毛状体特异性启动子

Info

Publication number: CN101952445A
Application number: CN200880127299XA
Authority: CN
Inventors: P·M·布里克; C·C·N·范西; P·J·迪尔加得; R·C·舒瑞克; M·A·哈林; M·T·J·德博特
Original assignee: Keygene NV
Current assignee: Keygene NV
Priority date: 2007-12-21
Filing date: 2008-12-16
Publication date: 2011-01-19
Also published as: US20110113512A1; WO2009082208A3; WO2009082208A2; IL223217A0; US8809626B2; JP2011507506A; EP2554674A1; IL206494A0; EP2222859A2; EP2554674B1

Abstract

本发明提供了毛状体特异性植物启动子。还提供了转基因细胞和生物体，特别是包含毛状体特异性启动子的植物细胞和植物，以及在细胞和生物体中使用毛状体特异性启动子表达核酸序列的方法。

Description

毛状体特异性启动子

技术领域

本发明涉及毛状体特异性植物启动子及其用途。所述启动子可用于在毛状体细胞中表达同源蛋白或异源蛋白，或者用于表达活性核酸分子，如正义和/或反义RNA。提供了具有启动子活性的核酸序列，以及包含这些序列的嵌合基因、载体、重组型(转基因)细胞和生物体。还提供了用于制备包含所述启动子的转基因细胞和生物体(特别是植物和植物细胞)的方法。所述启动子可用于在毛状体中产生多种化合物，如杀虫剂、挥发油、调味剂或芳香剂、药物组分、细胞毒性蛋白等。

背景技术

毛状体是植物表皮的各种突起(outgrowth)，包括分支或不分支毛状物、泡囊、钩刺和蛰毛。毛状体是固定的多细胞凸出结构，被认为作为有毒重金属和异物的接收库(Salt et al.，1995，Plant Phys 109，1427；Domínguez-Solís et al.2001，J Biol Chem 276，9297；Gutiérrez-Alcaláetal.2000，PNAS 97，11108)，其在保护植物免受食草动物侵袭中是重要的，但也可抵抗由蒸腾和紫外光照射引起的水分损失(Mauricio&Rausher，1997，Evolution 51，1435Wagner et al.2004，Ann Bot 93，3)。

含多种次生化合物的腺毛状体存在于许多茄科物种的叶上，它们在抗多种害虫中的作用已经得到很好地证明(例如，Juvik et al.1988，JChem Ecol 14，1261；Heinz&Zalom，1995，J Econ Entomol 88，1494；Kennedy&Sorenson，1985，J Econ Entomol 78，547；Gurr，1995，PlantProt Quart 10，17；Gurr&McGrath，2002，Ann App Biol Calo et al.，2006，J Exp Bot 57，3911)。番茄中的腺毛状体包含大量的萜(van derHoeven et al.，2000)和甲基酮(Fridman et al.，2005)。毛状体已被分成I至VII型(Luckwill，1943，Aberdeen University Press，UK)，I型、IV型、VI型和VII型为腺毛状体型，II型、III型和V型为非腺的。IV型、V型和VI型是野生番茄多毛番茄(S.habrochaites)中最主要的毛状体类型(Simmons and Gurr，2005，Agricultural and Forest Entomol 7，265)。在潘那利番茄(S.pennelli)中，对害虫的抗性主要与IV型腺毛状体的化学和密度有关，该型腺毛状体覆盖该植物的所有部位(Simmons et al.，2003Aus J Entomol 43，196；2004，Entomol Exp App 113，95)。当物理地去除腺毛状体的溢泌物时，害虫的存活和寿命增加，而死亡率和捕集减少(Simmons and Gurr，2005，Agricultural and Forest Entomol 7，265)。IV型和VI型毛状体已被与害虫的防治呈正向关联。

棉花胚珠的非腺毛状体已被探讨作为经济上十分重要的生物技术的靶位(Kim and Triplett，2001，Plant Physiol 127，1361)。腺毛状体可分泌多种植物化学物(例如潘那利番茄中的酰基糖以及多毛番茄中的甲基酮和萜)的能力使得这些结构有可能适合于生物技术应用，并为基于毛状体的害虫管理提供了机会。

毛状体中的蛋白表达可用于产生有用的化合物如杀虫剂、药物组分、挥发油、调味剂和芳香剂(Callow，2000 Advances in botanical researcheds.Hallahan and Gray，San Diego Academic Press；Wagner 2004AnnBot 93，3)。为了特异性地在毛状体中产生组分，对植物毛状体中的基因表达进行调节是必需的。若能够在特定结构或细胞中指导蛋白表达，则可避免干扰植物代谢途径并由此避免干扰植物性能。

组成型强启动子如公知的花椰菜花叶病毒启动子(CaMV 35S)通常用于异位表达研究。然而，该类型的启动子不是很适合用于表达特定的且可能毒害植物的化合物，例如萜。而且，代谢库的耗尽可能是难以解决的问题。

Gutierrez-Alcala(2005，J Exp Bot 56，2487)描述了拟南芥(Arabidopsis thaliana)OASA1基因的启动子，该启动子在烟草腺毛状体和非腺毛状体中都有活性。

Wang等人(2002，J Exp Bot 53，1891)描述了来自烟草P450基因CYP71D16的毛状体特异性启动子，该启动子在烟草腺毛状体的所有发育阶段出现表达。

WO2004/111183描述了来自番茄和烟草叶的毛状体特异性启动子。然而，在测试WO2004/111183中描述的转基因物时，从表达不是毛状体特异性的(例如另外在叶脉中表达)且表达很弱的角度看，未获得满意的结果。

虽然毛状体特异性启动子已被分离，但是仍然需要不同的毛状体特异的启动子或毛状体优选的启动子。本发明提供了毛状体特异的转录调节序列，所述序列适合于指导在毛状体——尤其是出现于多种植物表面(地上部位如叶、茎、花器官)上的腺毛状体——中可操作地连接的核酸分子的表达，而在一些物种中，所述毛状体不存在于具体的植物表面例如果实和种子。简单的毛状体存在于大多数被子植物以及一些裸子植物和苔藓植物的地上表面上(Wagner et al.2004，Ann Bot 93，3)。在被子植物中，毛状体可出现于叶、花瓣、叶柄、花序梗、茎和种皮上，这取决于物种。腺毛状体出现于大概30％的维管植物上(Dell and McComb，1978，Adv Bot Res 6，227；Fahn，2000，Adv Bot Res 31，37)。

发明内容

本发明提供了一种转基因植物、植物细胞、植物组织或植物器官，其包含整合至其基因组中的嵌合基因，其特征在于所述嵌合基因包含可操作地连接于一个同源核酸序列或异源核酸序列的毛状体特异性启动子，其中所述启动子选自：

(a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的核酸序列(或其互补序列)；

(b)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的功能片段(或其互补序列)；

(c)与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3有至少70％序列同一性的核酸序列(或其互补序列)；

(d)包含转录调节活性的(c)的核酸序列的功能片段。

本发明还提供了一种在导入植物细胞时具有启动子活性的分离核酸序列，其中所述核酸序列包含选自以下的序列：

(d)包含转录调节活性的(c)的核酸序列的功能片段。

包含以上序列的载体、嵌合基因和宿主细胞也是本发明的实施方案。

此外，本发明提供了一种制备转基因植物或植物细胞的方法，包括步骤：

(a)产生一种包含如上所述的启动子的嵌合基因，所述启动子可操作地连接于待转录核酸序列并任选还连接于3’UTR核酸序列；或者产生一种包含这类嵌合基因的载体；

(b)转化含所述嵌合基因或载体的植物或植物细胞；并任选

(c)再生转基因植物或植物细胞。

所述方法还可包括：种植所述转基因植物(或其衍生物例如通过杂交或自交衍生而得，并且其中所述衍生物保留所述嵌合基因)，并收获所述毛状体或其部分(毛状体溢泌物)以备后用(分子农业)。

或者，例如，如果所述嵌合基因增加所述植物对害虫和/或病原体的抵抗力，那么所述方法还可进一步包括：种植所述转基因植物(或其衍生物，例如通过杂交或自交衍生而得，并且其中所述衍生物保留所述嵌合基因)，并收获整株植物或植物的部分如叶、果实、种子等，以备后用。

本文提供的启动子序列呈现了明确的腺毛状体特异性表达。另外，本文表明，来自野生番茄的启动子序列在栽植番茄的毛状体中有活性。

一般性定义

“毛状体”在本文中涵盖不同类型的毛状体，包括腺毛状体和/或非腺毛状体。

“毛状体细胞”是指构成毛状体结构的细胞，例如腺细胞或分泌细胞、基底细胞和柄细胞或菌柄细胞、细胞外空腔和角质层细胞。毛状体还可以由单一细胞组成。

“分子农业”在本文中是指从在毛状体中表达一种或多种嵌合基因的转基因植物的毛状体生产和/或回收有用的化合物，从而在所述毛状体中生产例如次生代谢产物、药物化合物、芳香剂或调味剂。

术语“核酸序列”(或核酸分子)是指单链或双链形式的DNA或RNA分子，特别是具有本发明的启动子活性的DNA或者编码蛋白或蛋白片段的DNA。“分离的核酸序列”是指脱离了从中分离出它的天然环境的核酸序列，例如在细菌宿主细胞中或者在植物核基因组或质体基因组中的核酸序列。

术语“蛋白”或“多肽”可互换使用，指由氨基酸链组成的分子，不涉及具体的作用模式、大小、三维结构或来源。因此蛋白的“片段”或“部分”仍然可以指的是“蛋白”。“分离的蛋白”用来指脱离其天然环境的蛋白，例如在体外或者在重组细菌或植物宿主细胞中。

术语“基因”意为包含这样一个区域(转录区域)的DNA序列，该区域在细胞中被转录成RNA分子(例如mRNA)，可操作地连接合适的转录调控区域(例如启动子)。因此，基因可以包含几个可操作地连接的序列例如启动子、包含例如参与翻译起始的序列的5’非翻译前导序列(也被称为5’UTR，它对应于翻译起始密码子上游的转录mRNA序列)、(蛋白)编码区(cDNA或基因组DNA)和包含例如转录终止位点和多腺苷酸化位点(如AAUAAA或其变体)的3’非翻译序列(也被称为3’非翻译区即3’UTR)。

“嵌合基因”(或重组基因)是指不是在一个物种中正常天然存在的任何基因，特别是其中存在天然状态下彼此间没有联系的一个或多个核酸序列部分的基因。例如，启动子在天然状态下与部分或全部的转录区域或者与另一调节区域没有联系。术语“嵌合基因”可以理解为包括如下的表达构建体：其中的启动子或转录调节序列可操作地连接至一条或多条正义序列(例如编码序列)或者至反义序列(所述正义链的反向互补序列)或反向重复序列(正义的和反义的，由此所述RNA转录物在转录中形成双链RNA)。

“3’UTR”即“3’非翻译序列”(也经常被称为3’非翻译区或3’端)是指在基因的编码序列的下游存在的核酸序列，它包含例如转录终止位点和(在大部分但非全部的真核mRNA中)多腺苷酸化信号(例如AAUAAA或其变体等)。在转录终止后，可以切除所述mRNA转录物下游的多腺苷酸化信号并且加上多腺苷酸尾，该尾参与所述mRNA向细胞质(进行翻译的位置)中的转运。

“基因的表达”所指的过程是可操作地连接有合适的调节区域(特别是启动子)的DNA区域被转录成有生物活性的RNA，即它能够被翻译成具有生物活性的蛋白或肽(或活性肽片段)或者它自身具有活性(例如在转录后的基因沉默中或RNAi中，或者在通过miRNA的沉默中)。在某些实施方案中的活性蛋白是指由于存在阻遏域而具有显性负性功能的蛋白。编码序列优选为正义方向并编码所需的、有生物活性的蛋白或肽或者活性肽片段。在基因沉默方法中，所述DNA序列优选以反义DNA或反向重复DNA的形式存在，包含反义方向或正义和反义方向的靶基因的短序列。基因表达的向下调节还可通过微RNA(miRNA)的作用发生，这是从茎环RNA前体(miRNA前体)加工而来的21-24个核苷酸的内源小RNA。miRNA整合至RNA诱导的沉默复合体(RISC)，通过mRNA切割或翻译阻遏下调基因表达。

“异位表达”是指在正常情况下不表达所述基因的组织中表达。

“转录调节序列”在本文中被定义为能够调节可操作地连接于所述转录调节序列的核酸序列的转录速率的核酸序列。因此，本文定义的转录调节序列将包含启动转录(启动子元件)、维持和调节转录(包括例如弱化子或增强子，也包括沉默子)必需的所有序列元件。虽然主要提及的是编码序列上游(5’)的转录调节序列，但是在编码序列下游(3’)存在的调节序列也囊括在该定义中。

本文使用的术语“启动子”是指起到控制一个或多个基因转录作用的核酸片段，它位于所述基因转录起始位点(转录起点以序列的+1位置标示，相对于该位置的任何上游核苷酸使用负数标示)的转录方向的上游(5’)，并且在结构上通过存在以下结构鉴定：存在DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其他DNA结构域(顺式作用序列)，包括但不限于转录因子结合位点、阻遏蛋白和激活蛋白结合位点以及本领域技术人员已知可直接或间接调节由该启动子转录的量的任何其他核苷酸序列。位于转录起始(+1)上游的真核顺式作用序列的实例包括TATA盒(通常在转录起点的大约-20至-30的位置)、CAAT盒(通常在相对于转录起点的大约-75的位置)、5’增强子或沉默子元件等。

“组成型”启动子(例如CaMV 35S启动子)是大多数生理和/或发育条件下在几乎所有组织和器官都有活性的启动子。更优选地，组成型启动子在所有主要器官(例如至少叶、茎、根、种子、果实和花)的基本上所有的生理和发育条件下都是有活性的。最优选地，所述启动子在大多数(优选所有)生理和发育条件下在所有器官中都是有活性的。

然而，组织特异性启动子或组织优选的启动子(例如本发明的启动子)也可以被称为是“组成型活性的”。因此，所述启动子在大多数发育和/或生理条件下是有活性的，即便仅仅在特定的组织中或者主要在特定的组织中。因此，在植物或植物细胞中“具有组成型活性的启动子”或者“组成型的”启动子是指，在大多数生理和发育条件下在植物或特定组织的植物细胞中赋予转录作用的核酸序列。

“诱导型”启动子是生理调控的启动子(例如通过外部给予某些化合物)或发育调控的启动子。

“组织特异的”启动子仅在特定类型的组织或细胞如毛状体细胞中有活性。因此，所述启动子活性可描述为，其是指所述启动子转录可操作地连接于其下游(3’)的核酸序列的情形。

“组织优选的”启动子优选(但非排除地)在一些组织或细胞中(例如在毛状体细胞和表皮细胞中)有活性。

“对一种或多种生物和/或非生物胁迫不敏感”的启动子或者其活性“在暴露于一种或多种生物和/或非生物胁迫条件下时不降低”的启动子是指在正常生理和发育条件下具有启动子活性的核酸序列，并且由此当生物和/或非生物胁迫施于包含所述启动子的生物体(如植物)、细胞、组织或器官的时候，所述活性在量上不降低或者至少不显著降低。

“胁迫”是指作用在植物或植物细胞上的物理、化学或生物来源的条件或压力，它可以引起植物的产量降低和/或质量下降但对植物不是致死的。“非胁迫条件”在本文中指生理和发育正常或最佳的条件。“生物胁迫”是指由生物的(活的)因素例如真菌、病毒、支原体样生物体(mycoplasma like organism)、昆虫、节肢动物、细菌、线虫等(即特别是植物害虫和病原体)引起的胁迫。“非生物胁迫”是指由非生物的(无生命的)因素例如温度胁迫(冷/冰冻、热)、盐度(盐)、风、金属、昼长(光周期)、水分胁迫(例如过少或过多的水利用度，即干旱、脱水、渍水等)等引起的胁迫。

本文使用的术语“可操作地连接”是指多聚核苷酸元件之间在功能关系方面的连接。当一个核酸与另一个核酸序列具有功能关系时该核酸是“可操作地连接的”。例如，若启动子或转录调节序列影响编码序列的转录，则它们可操作地连接至该编码序列。可操作地连接的意思是被连接的DNA序列通常是邻接的，并且在需要把两个蛋白编码区域相连接时是邻接的且在阅读框内的，从而产生“嵌合蛋白”。“嵌合蛋白”或“杂合蛋白”是由多个蛋白“结构域”(或基序)构成的、其自身在自然界中并不存在的蛋白，但是所述蛋白“结构域”(或基序)被连接起来会形成功能蛋白，它表现出所连接的结构域(例如DNA结合结构域或引起显性负性功能的功能阻遏结构域)的功能性。嵌合蛋白还可以是两种或多种天然存在的蛋白的融合蛋白。本文使用的术语“结构域”意思是具有特定结构或功能的蛋白的任何一个或多个部分或结构域，该蛋白的所述部分或结构域可以被转移至另一种蛋白用于提供一种至少具有所述结构域的功能特征的新杂合蛋白。

术语“靶向肽”指把蛋白靶向至胞内细胞器例如质体(优选叶绿体、线粒体)或者至细胞外间隙(分泌信号肽)的氨基酸序列。编码靶向肽的核酸序列可以与编码蛋白氨基末端(N-末端)的核酸序列融合(在阅读框内)。例如，毛状体细胞的靶向肽包括靶向毛状体细胞的白色体、叶绿体、线粒体、细胞核、过氧化物酶体、内质网、质体、细胞外空腔或液泡的肽。

“核酸构建体”或“载体”在本文可理解为使用重组DNA技术产生的并用于把外源DNA送递至宿主细胞的人造核酸分子。载体骨架可以是例如二元或超二元载体(例如参见US 5,591,616、US2002138879和WO 95/06722)、共整合载体或T-DNA载体，这是本领域已知的并且如本文其他部分所述，所述载体骨架中整合有嵌合基因，或者若已存在合适的转录调节序列/启动子，则仅所需的合适核酸序列(如编码序列、反义序列或反向重复序列)被整合于该转录调节序列/启动子的下游。载体通常包含有利于将其用于分子克隆的其他遗传元件，例如筛选标记、多克隆位点等等(见下文)。

术语“宿主细胞”、“重组宿主细胞”或“转化的细胞”是指将至少一种核酸分子引入所述细胞而产生的新个体细胞(或生物体)，所述核酸分子尤其包含编码所需蛋白的嵌合基因或者包含在转录时产生用于沉默靶基因/基因家族的反义RNA或反向重复RNA(或发夹RNA)的核酸序列。所述宿主细胞优选地是植物细胞，但也可以是细菌细胞、真菌细胞(包括酵母细胞)等等。所述宿主细胞可以包含作为染色体外(附加型)复制分子的核酸构建体，或者更优选地包含整合进入宿主细胞的核基因组或质体基因组中的嵌合基因。

术语“筛选标记”是本领域普通技术人员熟悉的术语，并且在本文是用来描述当其被表达的时候可以用于筛选包含所述筛选标记的一种或多种细胞的任何遗传实体。筛选标记基因产物赋予例如抗生素抗性或者更优选除草剂抗性或其他可选择的性状，例如表型特征(例如色素沉着的变化)或营养需求。术语“报告物”主要用于指可见的标记物，例如绿色荧光蛋白(GFP)、eGFP、萤光素酶、GUS等等，以及nptII标记物等等。

术语基因或蛋白的“直系同源物(ortholog)”在本文中是指在另一个物种中存在的同源基因或蛋白，它与所述基因或蛋白有相同的功能，但是(通常)从含有所述基因的物种趋异的时间点开始出现序列的趋异(即从共同祖先通过物种形成演化的基因)。因此可以同时基于序列比较(例如基于整条序列或特定结构域的序列同一性百分比)和功能分析在其他植物物种中识别来自同一植物种的基因的直系同源物。

术语“同源的”和“异源的”是指核酸或氨基酸序列与其宿主细胞或生物体之间的关系，特别是在转基因生物体的情况下。因此，同源序列天然存在于宿主细胞中(例如用番茄基因转化的番茄植物)，而异源序列不会天然存在于宿主细胞中(如用马铃薯植物的序列转化的番茄植物)。根据上下文，所述术语“同源物”或“同源的”可以替代地指来自共同祖先序列的子序列(例如它们可以是直系同源物)。

“严格杂交条件”可以用于鉴定核苷酸序列，它与给定核苷酸序列基本一致。杂交条件的严格度根据序列而定并且在不同的情形下会有差异。通常，选择的严格条件为在确定的离子强度和pH下较具体序列的热解链温度(T_m)低约5℃。T_m是(在确定的离子强度和pH下)50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度。选择如下典型的严格条件，其中在pH7下盐(NaCl)浓度为约0.02摩，温度不低于60℃。降低盐浓度和/或增加温度可提高严格度。RNA-DNA杂交(使用例如100个核苷酸的探针的RNA印迹法)的严格条件为例如那些包括于63℃下在0.2X SSC中至少洗涤一次且持续每次20分钟的条件，或者与之等价的条件。DNA-DNA杂交(使用例如100个核苷酸的探针的DNA印迹法)的严格条件为例如那些包括于至少50℃(通常约55℃)的温度下在0.2X SSC中洗涤至少一次(通常2次)且持续每次20分钟的条件，或者与之等价的条件。亦见Sambrook et al.(1989)和Sambrook and Russell(2001)。

“高严格”条件可以通过例如于65℃下在包含如下成分的水性溶液中的杂交来提供：6×SSC(含3.0M NaCl、0.3M柠檬酸钠的20×SSC，pH7.0)、5x Denhardt′s(含2％Ficoll、2％聚乙烯吡咯烷酮、2％牛血清白蛋白的100X Denhardt’s)、0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)和作为非特异性竞争物的20μg/ml变性载体DNA(单链鱼精子DNA，平均长度120-3000个核苷酸)。在杂交后，可以在多个步骤中进行高严格洗涤，末次洗涤(约30分钟)于杂交温度下在0.2-0.1×SSC、0.1％SDS中进行。

“中度严格”所指的条件等价于在上述溶液中但在约60-62℃下进行杂交。在该情形下，末次洗涤于杂交温度下在1×SSC、0.1％SDS中进行。

“低度严格”所指的条件等价于在上述溶液中但在约50-52℃下进行杂交。在该情形下，末次洗涤于杂交温度下在2×SSC、0.1％SDS中进行。亦参见Sambrook et al.(1989)和Sambrook and Russell(2001)。

“序列同一性”和“序列相似性”可以通过使用全局或局部比对算法(取决于这两个序列的长度)比对两个肽或两个核苷酸序列确定。相似长度的序列优选使用在全长上获得序列最佳比对的全局比对算法(例如Needleman Wunsch)比对，而显著不同的长度的序列优选使用局部比对算法(例如Smith Waterman)比对。如果序列(通过例如使用默认参数的程序GAP或BESTFIT进行最佳比对时)共有至少某一最低限度的序列同一性(在下文中定义)百分数时，那么可以认为它们是“大体相同的”或“基本相似的”。GAP使用Needleman和Wunsch全局比对算法在其整个长度(全长)上比对两个序列，它使匹配的数目最大化并使空位的数目最小化。全局比对适宜用来在两个序列具有相似长度时确定序列的同一性。通常使用GAP的默认参数，其空位产生罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白)，空位扩展罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白)。对核苷酸而言，使用的默认打分矩阵是nwsgapdna，而对蛋白而言，默认打分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff，1992，PNAS 89，915-919)。序列比对和序列同一性百分数得分可通过如下方式确定：使用计算机程序例如软件包GCG Wisconsin(版本10.3，从Accelrys Inc.，9685Scranton Road，San Diego，CA 92121-3752USA获得)，或者使用开放源码软件例如版本2.10.0的EmbossWIN中的程序“needle”(使用全局Needleman Wunsch算法)或“water”(使用局部Smith Waterman算法)，使用与上文GAP相同的参数或者使用默认设置(同时适用于“needle”和“water”并且同时适用于蛋白和DNA比对，默认空位开放罚分是10.0，且默认空位扩展罚分是0.5；蛋白的默认打分矩阵是Blossum62，DNA的是DNAFull)。如果序列具有显著不同的总长度，优选局部比对例如使用Smith Waterman算法。或者，可以通过使用FASTA、BLAST等算法搜索公共数据库确定相似性或同一性的百分数。

在本文本及其权利要求书中，动词“包含”及其变化形式使用其非限制含义，意为包括该词之后接着的项目，但是并不排除没有明确指出的项目。另外，用不定冠词“一个(a)”或“一种(an)”提及要素时并不排除存在超过一种所述要素的可能性，除非上下文中清楚地要求有且仅有一种该要素。因此，不定冠词“一个(a)”或“一种(an)”通常指“至少一个(一种)”。还需要理解，如果在本文中提及“序列”，通常是指具有某个亚基序列(例如氨基酸)的现实实体分子。

每当提及制备本发明的一种“植物”或“多种植物”(或数种植物)的时候，需要理解的是，除非另外指出，在本文中还包括植物部分(细胞、组织或器官、种子、切除或收获的部分、叶、幼苗、花、花粉、果实、茎、根、愈伤组织、原生质体等等)、保留其亲本区别性特征(例如存在转基因)的植物的子代或克隆繁殖物例如通过自交或杂交获得的种子(例如杂交种子(通过两个纯系(inbred)亲本系杂交获得))、杂交植物及来源于它们的植物部分。

具体实施方式

组成型启动子如CaMV 35S启动子(单35S启动子，记载于Francket al.，1980，Cell 21，285-294)被认为不可用于表达需要仅在特定组织水平或在特定条件下受到调节的基因。

在本发明中提供了多种植物启动子，所述启动子在毛状体中呈现组成型的、但组织特异的活性，并且任选地基本上对一种或多种生物胁迫和/或非生物胁迫不敏感。这类启动子是控制核酸序列在转基因植物中表达所需要的。

在一个实施方案中，本发明提供了番茄基因(番茄的萜类的合酶及其直系同源物和同源物)的启动子区，所述启动子区在宿主植物如栽植的番茄(番茄(Solanum lycopersicum))、其他茄科(Solanaceae)以及其他植物科或种中赋予腺毛状体特异性的和/或腺毛状体优选的组成型表达。

核酸序列、嵌合基因和载体

在一个实施方案中，提供了在植物细胞中具有启动子活性的分离核酸序列(优选基因组DNA序列或合成的DNA序列)，所述核酸序列在植物毛状体(如出现于叶、茎和花器官上的毛状体)中显示出强组成型转录毛状体特异性活性。所述启动子优选在一种或多种腺毛状体(I型、IV型、VI和/或VII型)中有活性。

当所述转基因植物或者植物组织或器官遭受一种或多种非生物胁迫和/或生物胁迫时，本发明的核酸序列的启动子活性优选不降低，或者至少不显著降低。这方面的显著降低是指，与相同组织或器官在非胁迫条件下的活性相比，启动子活性在统计学意义上显著地(量上)降低1％或更多(例如2％、3％、5％、10％等，最多100％)。因此，优选地，所述启动子在一种或多种胁迫条件下(在毛状体细胞中)仍保持为强组成型启动子。

在一个实施方案中提供了一种毛状体特异性启动子，所述启动子包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3；或者，与之基本相似的核苷酸序列(被称为“变体”，见下文的定义)；或者，在一种或多种毛状体类型和/或毛状体细胞中具有启动子活性的它们任一个的活性(功能)片段，例如SEQ ID NO：1、2或3或者其变体的至少200、300、400、500、600、800、900、1000、1200、1500、2000、2400或更多个连续核苷酸的片段。

“活性片段”或“功能片段”或者“具有启动子活性的片段”所指的核酸片段能够在出现于一种或多种不同类型的植物组织和器官上(例如在茎、叶、花芽或花部位上)的一种或多种毛状体类型和/或一种或多种毛状体细胞中赋予转录作用。活性片段优选赋予毛状体特异性的表达和/或至少毛状体优选的表达特征，并且它们优选具有与SEQ ID NO：1、2或3的启动子类似的强度(或更高的强度)。这一点可如下文所述来进行测试：通过以优选可操作地连接于报告基因的这类片段转化植物，并且在毛状体中定性地(空间及时间转录)并且/或者优选定量地测定所述启动子活性。明显地，DNA片段可以以多种方式产生，例如使用从头DNA合成、限制性酶或末端核酸酶等。产生包含多种长度5’缺失的片段的缺失分析例如可用于形成更强的并且/或者更特异性的转录活性。

在一个实施方案中，启动子片段的强度在量上基本等于或者高于35S启动子的强度。

包含SEQ ID NO：1、2或3，其变体，或者它们任一种的功能片段的启动子，或者由SEQ ID NO：1、2或3，其变体，或者它们任一种的功能片段组成的启动子优选地对于包含所述启动子的植物或者植物细胞、组织或器官可能接触到(见下文)的至少一种(但优选多种，最优选任何)生物胁迫和/或非生物胁迫不敏感。因此，在暴露于一种或多种胁迫条件时毛状体中的活性仍保持是强的组成型活性。

还提供了以上毛状体特异性启动子的“变体”，以及这类变体的功能片段。这些变体包括与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3基本相似的核酸序列(以及如上述的这些变体序列的功能片段)，所述核酸序列具有启动子活性，即还能够在植物毛状体中提供(优选组成型)转录作用。与SEQ ID NO：1、2和/或3“基本相似”的序列是与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和/或与SEQ ID NO：3有至少约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99％或更高的核酸序列同一性、并且其活性是毛状体特异性的核酸序列，测定核酸序列同一性使用的是Needleman和Wunsch或者Smith Waterman的两两比对(例如，Embosswin中的程序“needle”或“water”，如版本2.10.0，设置为默认空位产生罚分和空位扩展罚分)。在一个优选的实施方案中，所述变体(及功能片段)的活性在毛状体中很强，即在量上至少相当于(或强于)SEQ IDNO：1、2或3提供的活性。而且，所述细胞类型特异性至少等于或者高于SEQ ID NO：1、2或3的特异性。在另一个实施方案中，这些变体(及其功能片段)的活性对一种或多种生物胁迫和/或非生物胁迫是不敏感的。

很明显，多种方法例如核酸杂交、PCR技术、计算机(in silico)分析和核酸合成等可以用于识别、合成或分离本文提供的核酸序列的变体或功能片段。例如，核酸杂交可用于识别其他植物物种或变种中的如下DNA序列，所述DNA序列在严格的或中度严格的杂交条件下与SEQ IDNO：1、2或3或者它们的片段杂交。

或者，可以使用已知算法例如BLAST、FASTA等就变体序列对序列数据库进行计算机搜索。以这种方式从其他植物物种或番茄的其他变种分离变体序列是可行的。本文特别包括在番茄的其他变种或在其他植物物种特别是茄属(Solanum)的种(将在下文中描述)中发现的相同基因的其他等位基因(单萜合酶1，如芳樟醇合酶；倍半萜合酶1)的启动子。例如，可以从一个或多个植物物种、一个或多个变种或者一个物种或变种的不同组织构建cDNA文库。可以从所述cDNA文库筛选单萜合酶1或倍半萜合酶1cDNA(使用例如源自SEQ ID NO：1、2、3或者其片段或变体的探针或引物)。同样，可以使用差异显示方法(例如cDNA-AFLP)来识别这类转录物。诸如TAIL-PCR(Liu et al.1995，Genomics25(3)：674-81；Liu et al.2005，Methods Mol Biol.286：341-8)、Linker-PCR或反向PCR(IPCR)等方法可以用于分离所述基因的上游转录调节区。

相同基因的变体——即单萜合酶1(芳樟醇合酶)和倍半萜合酶1的直系同源物和/或同源物——包括例如与GenBank登记号AY840091(番茄MTS1cDNA和蛋白；van Schie et al.2007，Plant Mol Biol.64：251-263)、AF279455(多毛番茄SSTLH1；van der Hoeven et al.2000，Plant Cell 12：2283-2294，cDNA和蛋白)、AF279453(番茄SSTLE1；vander Hoeven et al.2000，Plant Cell 12：2283-2294)的核苷酸序列或氨基酸序列有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99％或更高的核酸或氨基酸序列同一性的核酸序列(DNA或RNA)或氨基酸序列。测定序列同一性优选通过使用Needleman和Wunsch或者Smith Waterman两两比对法(例如，Embosswin中的程序“needle”或“water”，如版本2.10.0，设置为默认空位产生罚分和空位扩展罚分)进行的两两比对。这些变体的启动子的活性还优选是毛状体特异性的。诸如cDNA-AFLP、其他基于PCR的方法或RNA杂交等方法可以用于分离或识别这类基因。可以使用已知方法克隆它们的启动子。在一个优选的实施方案中，所述启动子获自属于茄科的植物的单萜合酶1(芳樟醇合酶)和倍半萜合酶1基因，所述茄科例如茄属(包括重新分类的番茄属(Lycopersicon)的种)、烟草属(Nicotiana)、辣椒属(Capsicum)、碧冬茄属(Petunia)、咖啡属(coffea)等的种。来自野生物种的直系同源物尤其是所需的。

使用多种方法可确定核酸序列(或变体的片段)是否具有组成型启动子活性，即是否能够特异地在毛状体中赋予转录作用；所述活性是否是“强的”；以及所述核酸序列的活性对于所述转基因细胞、组织或器官(特别是植物或植物细胞)可能接触到的至少一种(但优选多种，最优选任何)生物胁迫和/或非生物胁迫是否不敏感。一般而言，定性方法和定量方法是技术人员可区分的。定性方法(例如GUS组织学染色)用于确定启动子的空间-时间活性(启动子在某一组织或器官中或者在某些环境/发育状态下是不是有活性)，而定量方法(例如GUS荧光测定)还可定量测定相对于对照物的活性水平。例如，合适的对照物有：以空载体转化的植物(阴性对照)；以包含其他启动子，例如在普通烟草(N.tabacum)的表皮和毛状体中有活性的鼠耳芥属(Arabidopsis)CER6启动子(Hooker et al.2002，Plant Phys 129，1568)的构建体转化的植物；或者非转基因鼠耳芥属植物。

为了测试并任选地定量测定相对活性或绝对活性，可以将克隆的或合成的核酸分子(例如SEQ ID NO：1、2或3，其变体，或者它们任一种的片段)可操作地连接于已知核酸序列(例如，报告基因如gusA或任何编码特定蛋白的基因)，并且用于通过已知方法转化植物细胞并从而再生植物。

例如，可以通过检测下游核酸序列的RNA转录物水平(尤其是在毛状体细胞中)测定(并任选地定量测定)所述启动子活性。这可以使用定量方法进行，例如定量RT-PCR、其他基于PCR的方法等。或者，可测定并定量测定所述报告蛋白或所述报告蛋白的活性。例如，如果报告基因为gus基因，那么如实施例中所述，可以使用GUS荧光测定。以此方式，可以将保持在正常生理(非胁迫)条件下转化植物或植物细胞的定量启动子活性水平与暴露于一种或多种生物胁迫或非生物胁迫下的植物或植物细胞的水平相比较。同时，毛状体细胞中的相对活性水平或绝对活性水平可以与组成型对照启动子例如35S启动子或双35S启动子相比较，或者与在毛状体中有活性的其他启动子例如CYP71D16启动子或OASA1启动子相比较。应理解，优选使用统计学方法确定并比较平均启动子活性水平。

因此，例如可以通过以下方式测试在某一时间点在毛状体细胞中是否存在活性(空间-时间活性)：以启动子-报告基因构建体转化植物或植物细胞，并在多个发育阶段中分析毛状体的RNA转录物或报告蛋白(或它的活性)。一项简单的测试应用了例如GUS组织化学染色，通过该染色，目视检测到的蓝色表明毛状体中的活性以及在毛状体的多个发育阶段的活性。

如已提及的，毛状体细胞中的启动子活性优选是组成型的，并且还优选该活性在毛状体细胞中很强，特别是在导入有所述序列的宿主物种或变种中。组成型活性是指，在大多数(正常，非胁迫)生理条件和发育条件下，在毛状体细胞中优选地产生任何可操作地连接于所述启动子的核酸序列的转录物。在一个实施方案中，本发明的启动子优选在表皮细胞中是无活性的。所述启动子优选在出现于茎、花和/或(嫩)叶上的所有腺毛状体中是有活性的。

本发明的启动子优选地在所有植物物种的毛状体中提供强组成型活性，所述植物物种包括双子叶物种和单子叶物种，例如下文所述的(例如番茄、烟草、芸苔、甜瓜、莴苣等)。

在驱动下游(3’)连接的核酸序列表达的能力方面，可使用多种已知方法定量地确定本发明的启动子(包括片段或变体)的强度(定量的活性)。例如，转录的转录物(mRNA)的量可通过定量RT-PCR或RNA印迹法确量。所述启动子强度优选至少基本等于正常(非胁迫)条件下CaMV35S(Franck et al.，见上文)在毛状体中的活性。因此，“强”是指，所述启动子强度优选至少大致等同于但更优选强于正常、非胁迫条件下35S在毛状体中的强度。最优选地，毛状体中启动子活性的平均量至少等于CaMV 35S启动子的活性，或者比CaMV 35S启动子在毛状体中的平均活性高至少5％、10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％或更多。应理解，应该比较相同拷贝数和接合性水平的转化体，例如半合子转基因或纯合子转基因。优选地鉴定并比较单拷贝的转化体。35S启动子在宿主植物毛状体中的强度可以通过以下方式测试：分析并优选地定量测定例如P35S-GUS植物中的GUS基因表达，并将它与本发明的启动子的表达相比较。

或者，“强”可以指，所述启动子强度优选地至少大致等同于但更优选强于正常、非胁迫条件下由SEQ ID NO：1、2或3组成的至少一个启动子在毛状体中的强度。最优选地，毛状体中启动子活性的平均量至少等于SEQ ID NO：1、2或3组成的至少一个启动子在毛状体中的活性，或者比SEQ ID NO：1、2或3组成的至少一个启动子在毛状体中的平均活性高至少5％、10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％或更多。应理解，应该比较相同拷贝数和接合性水平的转化体，例如半合子转基因或纯合子转基因。优选地鉴定并比较单拷贝转化体。

因此，优选地，本发明的启动子的强度在以下情形保持基本不变或者至少不降低(或不显著地降低)：含有所述启动子的植物组织或器官或者植株暴露于选自以下的至少一个——优选几个——胁迫条件：干旱胁迫、热胁迫、水胁迫(水过多和水过少两种)、病原体胁迫(例如CMV的病毒感染、真菌感染、细菌感染等)、害虫胁迫(例如昆虫咬食)、创伤、盐胁迫、辐射胁迫等。另外，定量测定可以用于确定所述强度。例如，可以把含有所述启动子的重组植物从正常的温度环境转移至温暖的环境(例如约27℃至最高约50℃)中，并且所述启动子在各种组织中的活性可以与在正常温度下和在温暖温度条件下的相同组织中的活性相比较。

在一个实施方案中，提供了以上任一启动子用于在重组细胞或生物体(特别是植物细胞或植物)中表达同源或异源核酸序列的用途。该用途包含将所述启动子可操作地连接于一条同源或异源的核酸序列并且转化植物或植物细胞，如下文进一步描述。

虽然上文聚焦于本发明的启动子在植物和植物细胞中的用途，但是使用所述启动子在其他细胞和生物体(如在任何原核或真核细胞或生物体中，例如细菌、真菌(包括酵母例如毕赤酵母属(Pichia)、汉森酵母属(Hansenula)等)、哺乳动物、人的细胞或细胞系等)中表达同源或异源核酸序列也是本发明的实施方案。

本发明的嵌合基因和载体

在本发明的一个实施方案中，具有启动子活性的任何上述核酸序列均用于制备嵌合基因和包含这些嵌合基因的载体，这些载体用于把所述嵌合基因转移至宿主细胞中，并且在宿主细胞(例如源自转化细胞的细胞、组织、器官或整个生物体)中表达可操作地连接的同源或异源核酸序列。

宿主细胞优选是植物细胞。任何植物都可以是合适的宿主，如单子叶植物或双子叶植物，例如玉米(maize/corn)(玉蜀黍属(Zea)的种例如玉米(Z.mays)、大刍草(Z.diploperennis)(chapule)、繁茂大刍草(Zealuxurians)(危地马拉(Guatemala)大刍草)、委委特南戈玉米亚种(Z.mayssubsp.huehuetenangensis)(San Antonio Huista大刍草)、墨西哥玉米亚种(Z.mays subsp.mexicana)(墨西哥大刍草)、小颖玉米亚种(Z.mayssubsp.parviglumis)(巴尔萨斯大刍草(Balsas teosinte))、多年生玉米(Z.perennis)(多年生大刍草)和Z.ramosa、小麦(小麦属的种)、大麦(barley)(例如大麦(Hordeum vulgare))、燕麦(oat)(例如燕麦(Avenasativa))、高粱(sorghum)(高粱(Sorghum bicolor))、黑麦(rye)(黑麦(Secalecereale))、大豆(soybean)(大豆属(Glycine)的多个种，例如大豆(G.max))、棉花(棉属(Gossypium)的种，例如陆地棉(Gossypium hirsutum)、海岛棉(Gossypium barbadense))、芸苔属(Brassica)的多个种(例如甘蓝型油菜(Brassica napus)、芥菜(Brassicajuncea)、甘蓝(Brassica oleracea)、芜青(Brassica rapa)等)、向日葵(sunflower)(向日葵(Helianthus annus))、烟草(烟草(Nicotiana)属的种)、苜蓿(alfalfa)(紫花苜蓿(Medicago sativa))、稻(稻属(Oryza)的种，例如印度稻(O.sativa indica)栽培种或日本稻(O.sativa japonica)栽培种)、牧草、珍珠粟(pearl millet)(狼尾草(Pennisetum)属的种，例如珍珠粟(Pennisetum glaucum))、树类物种、蔬菜类物种例如番茄属(Lycopersicon)的亚种(最近被重新分到茄属(Solanum))——如番茄(tomato)(普通番茄(L.esculentum)，异名番茄(Solanum lycopersicum))例如樱桃番茄、小果型变种(var.cerasiforme)或现代番茄(currenttomato)、醋栗变种(var.pimpinellifolium)或树番茄(tree tomato)(S.betaceum，异名树番茄(Cyphomandra betaceae))——、马铃薯(potato)(马铃薯(Solanum tuberosum))，以及其他茄属的种例如茄子(eggplant)(茄子(Solanum melongena))、人参果(pepino)(人参果(S.muricatum))、cocona(S.sessiliflorum)和奎东茄(naranjilla)(乐乐茄(S.quitoense))；辣椒类(peppers)(辣椒(Capsicum annuum)、小米椒(Capsicum frutescens))、豌豆(pea)(例如豌豆(Pisum sativum))、菜豆(bean)(例如菜豆属(Phaseolus)的种)、胡萝卜(carrot)(胡萝卜(Daucus carota))、莴苣属的种(例如莴苣(Lactuca sativa)、山莴苣(Lactuca indica)、宿根莴苣(Lactuca perennis))、黄瓜(cucumber)(黄瓜(Cucumis sativus))、甜瓜(melon)(甜瓜(Cucumismelo))、西葫芦(zucchini)(西葫芦(Cucurbita pepo))、南瓜(squash)(笋瓜(Cucurbita maxima)、西葫芦(Cucurbita pepo)、灰籽南瓜(Cucurbitamixta))、圆橙南瓜(pumpkin)(西葫芦(Cucurbita pepo))、西瓜(watermelon)(西瓜(Citrullus lanatus)，异名西瓜(Citrullus vulgaris))、肉质果的物种(葡萄、桃、李、草莓、芒果、甜瓜)、观赏植物的物种(例如玫瑰、碧冬茄属(Petunia)、菊属(Chrysanthemum)、百合、郁金香、大丁草属(Gerbera)的种)、木本树(例如杨属(Populus)、柳属(Salix)、栎属(Quercus)、桉属(Eucalyptus)的种)、纤维植物物种例如亚麻(flax)(亚麻(Linum usitatissimum))和大麻(hemp)(大麻(Cannabis sativa))。在一个实施方案中优选蔬菜类物种，特别是茄属的种(包括番茄属的种)。

因此，可以转化例如以下属的种：南瓜属(Cucurbita)、玫瑰属(Rosa)、葡萄属(Vitis)、胡桃属(Juglans)、草莓属(Fragaria)、百脉根属(Lotus)、苜蓿属(Medicago)、驴食草属(Onobrychis)、三叶草属(Trifolium)、胡卢巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、柑桔属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、鼠耳芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica)、萝卡属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、辣椒属(Capsicum)、曼陀罗属(Datura)、黄瓜属(Cucumis)、莨菪属(Hyoscyamus)、番茄属(Lycopersicon)、茄属(Solanum)、烟草属(Nicotiana)、苹果属(Malus)、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、墨角纶属(Majorana)、菊苣属(Ciahorium)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、西瓜属(Citrullus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、萱草属(Heterocallis)、Nemesis、天竺葵属(Pelargonium)、黍属(Panieum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛莨属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、智利喇叭花属(Salpiglossis)、紫水晶属(Browaalia)、大豆属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、菜豆属(Phaseolus)、棉属(Gossypium)、大豆属(Glycine)、黑麦草属(Lolium)、羊茅属(Festuca)、剪股颖属(Agrostis)。另一个优选是南瓜属(Cucurbita)、芸苔属(Brassica)、番茄属(Lycopersicon)、茄属(Solanum)、稻属(Oryza)和玉蜀黍属(Zea)中的每个成员。一个优选是燕麦属(Avena)、苜蓿属(Medicago)、辣椒属(Capsicum)、烟草属(Nicotiana)、莴苣属(Lactuca)、豌豆属(Pisum)、黄瓜属(Cucumis)、南瓜属(Cucurbita)、芸苔属(Brassica)、茄属(Solanum)(包括番茄属(Lcopersicon))、稻属(Oryza)和玉蜀黍属(Zea)中的每个成员。

嵌合基因的构建以及用于把嵌合基因导入宿主细胞的基因组的载体的构建是本领域普遍公知的。为了形成嵌合基因，使用标准的分子生物学技术，将毛状体特异性启动子序列可操作地连接至另一条待在宿主细胞中转录的核酸序列。所述启动子序列可以已经存在于载体中，从而将待转录的核酸序列简单地插入到所述载体中所述启动子序列的下游。然后，所述载体用于转化宿主细胞，并且所述嵌合基因优选被插入到核基因组或质体基因组、线粒体基因组或叶绿体基因组中，从而由于所述启动子的活性使得下游核酸序列表达(例如，Mc Bride et al.，1995Bio/Technology 13，362；US 5,693,507)。

因此，嵌合基因优选地包含上述的毛状体特异性启动子，所述启动子可操作地连接有同源或异源核酸序列，并且任选地后面有3’非翻译核酸序列(3’UTR)。所述同源或异源的核酸序列可以是编码蛋白或肽的序列，或者它可以是能被转录成活性RNA分子的核酸序列，所述活性RNA分子例如为适合于在宿主细胞或生物体中沉默基因或基因家族的正义和/或反义RNA(正义或反义RNA包括例如dsRNA或茎环RNA结构)。

通过常规的方式可以将包含毛状体特异性启动子的嵌合基因稳定地插入到单个植物细胞的核基因组中，并且照这样转化的植物细胞可通过常规的方式用于产生具有由于所述嵌合基因表达而导致改变的表型的转化植物。

在这方面，在根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中的T-DNA载体(包含可操作地连接有另一条核酸序列的毛状体特异性启动子(或者如上述的变体或片段))可用于转化植物细胞，并且之后使用例如在EP 0 116718、EP 0 270 822、PCT公开文本WO 84/02913和公布的欧洲专利申请EP 0 242 246中以及在Gould et al.(1991，Plant Physiol.95，426-434)中记载的方法可以从所述转化的植物细胞再生为转化的植物。用于进行农杆菌介导的植物转化的T-DNA载体的构建是本领域公知的。所述T-DNA载体可以是如EP 0 120 561和EP 0 120 515中所记载的二元载体或者是可以通过同源重组整合进农杆菌Ti-质粒中的共整合载体(如EP 0 116718中的描述)。

每个优选的T-DNA载体都包含可操作地连接有待转录的核酸序列的毛状体特异性启动子，所述启动子位于T-DNA边界序列之间，或者至少位于其右边界序列的左边。边界序列在Gielen et al.(1984，EMBO J3,835-845)中有记载。当然，其他类型的载体也可以通过例如以下的方法用于转化植物细胞：直接基因转移(例如在EP 02 23 247中记载的，或者如US 2005/055740和WO 2004/092345中记载的粒子轰击或微粒轰击)、花粉介导的转化(例如在EP 0 270 356和WO 85/01856中记载的)、例如在US 4,684,611中记载的原生质体转化、植物病毒介导的转化、脂质体介导的转化(例如在US 4,536,475中记载的)以及其他方法例如那些所记载的用于转化某些玉米系(如US 6,140,553；Fromm et al.，1990，Bio/Technology 8，833-839；Gordon-Kamm et al.，1990，The Plant Cell 2，603-618)和稻系(Shimamotoetal.，1989，Nature 338，274-276；Datta et al.1990，Bio/Technology 8，736-740)的方法，以及一般用于转化单子叶植物的方法(WO 92/09696)。对于棉花转化，亦见WO 00/71733；对于稻转化，亦见WO 92/09696、WO 94/00977和WO 95/06722中记载的方法。对于高粱转化，亦见例如Jeoung JM et al.2002，Hereditas 137：20-8或ZhaoZY et al.2000，Plant Mol Biol.44：789-98。对于番茄或烟草转化，亦见AnG.etal.，1986，Plant Physiol.81：301-305；Horsch R.B.et al.，1988，PlantMolecular Biology Manual A5，Dordrecht，Netherlands，KluwerAcademic Publishers.第1-9页；Koornneef M.et al.，1986，Nevins D.J.and R.A.Jones编著，Tomato Biotechnology，New York，NY，USA，Alan R.Liss，Inc.第169-178页。类似地，从转化细胞选择并再生转化植株是本领域公知的。很明显，对于不同物种和甚至单个物种的不同品种或栽培种，可以具体地调整方案以用于高频地再生转化体。

除核基因组的转化外，本发明还包括质体基因组(优选叶绿体基因组)的转化。质体基因组转化的一个优点是可以减少所述转基因扩散的风险。质体基因组转化可以按本领域的公知技术进行，例如见Sidorov VA et al.1999、Plant J.19：209-216或Lutz KA et al.2004，Plant J.37(6)：906-13。

可以将这样产生的转化植物用于常规的植物育种方案中以产生更多的包含转基因的转化植物。使用例如DNA印迹分析、基于PCR的方法或

测定法(Third Wave Technologies，Inc.)，可以选择单拷贝转化体。通过所述嵌合基因的存在可以容易地将非转化的细胞和植株与转化的细胞和植株区分开。还可以将所述转基因的插入位点侧翼的植物DNA序列测序，从而可以开发一种用于常规使用的“事件特异性”检测方法。见例如WO 01/41558，它记载了基于例如整合序列和侧翼(基因组)序列的优良事件检测试剂盒(elite event detection kit)(例如PCR检测试剂盒)。

在一个实施方案中，将待转录并任选待翻译的(如果它为编码序列)核酸序列插入到植物基因组中，从而使待转录的序列位于合适的3’端转录调节信号(“3’端”)(即转录物形成和多腺苷酸化信号)的上游(即5’)。多腺苷酸化和转录物形成信号包括胭脂碱合成酶基因(“3’nos”)(Depicker etal.，1982J.Molec.Appl.Genetics 1，561-573)、章鱼碱合成酶基因(“3’ocs”)(Gielen et al.，1984，EMBO J 3，835-845)和T-DNA基因7(“3’基因7”)(Velten and Schell，1985，Nucleic Acids Research 13，6981-6998)的多腺苷酸化和转录物形成信号，所述信号在转化的植物细胞中作为3’-非翻译DNA序列等等。

在一个实施方案中，所使用的3’端序列为单萜合酶1(芳樟醇合酶)、倍半萜合酶1或甲基酮合酶的3’端序列，例如SEQ ID NO：1、2或3或者其变体的基因的3’端。

待表达核酸序列在一个实施方案中是编码蛋白或肽(包括杂合蛋白或肽或者融合蛋白)的序列。所述编码序列可以是任何来源的，即可以来源于植物、真菌(包括酵母)、动物、细菌、合成的、病毒、人等等。它还可以包含编码靶向肽(例如分泌信号肽或质体靶向信号)的序列。编码序列还可以在阅读框内连接至一个编码选择性或标志性标记的基因(例如赋予卡那霉素抗性的neo(或nptII)基因(EP 0 242 236))，从而细胞表达可以容易地被检测到的融合蛋白。虽然可以使用任何基因的编码区(cDNA或基因组DNA)，但是以下基因的编码区的实例优选可操作地连接至本发明的启动子：

1.害虫或病原体疾病信号转导通路基因或通路，或者疾病抗性基因或通路；例如抗真菌或抗病毒蛋白、杀昆虫蛋白等。

2.驱食草动物的基因或通路。

3.害虫、病原体或食草动物引诱基因或通路(以产生捕集作物或诱集作物)。

4.次级代谢物生物合成基因或通路，包括用于生产治疗产物的基因和/或药理学和美容上具有重要作用的产物的基因，或者有产业价值的化合物的基因；提供营养化合物、营养保健化合物、调味剂或者香味剂、芳香剂(草本)的基因、授粉者吸引剂的基因。

5.植物修复应用基因，例如离子和污染金属分泌基因(Psaras et al.，2000，Ann Bot 86，73)。

本发明的嵌合基因或载体还可以用于转化微生物例如细菌(例如大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、假单胞菌(pseudomonas)、农杆菌(Agrobacterium)、芽胞杆菌(Bacillus)等)、真菌、藻类或昆虫，或者所述基因或载体可以用于操作病毒。可以以常规的方式，用整合进合适的克隆载体的本发明核酸序列转化细菌，优选使用如Maillon et al.(1989，FEMS Microbiol.Letters 60，205)和WO 90/06999中所记载的常规电穿孔技术。对于编码序列在原核宿主细胞中的表达，可以相应优化所述核酸序列的密码子选择(类似地，对于编码序列在植物细胞中的表达，可以根据已知知识优化所述核酸序列的密码子选择)。应该去除内含子序列，并且为优化表达可以根据已知知识进行其他的调整。

为了在单子叶植物例如禾本科植物的种(例如玉米或稻)中获得增强的核酸序列表达，可将内含子——优选单子叶植物的内含子——加入到嵌合基因中。例如，已经证明将玉米Adh1基因的内含子插入5’端调节区会增强在玉米中的表达(Callis et. al.，1987，Genes Develop.1：1183)。类似地，US 5,859,347中记载了HSP70内含子可用于增强表达。因此，一个或多个内含子可以任选地插入至本发明的任何启动子序列中，或者插入至5’UTR或编码序列中。

本文还涵盖含有毛状体特异性启动子的转基因植物(及其部分)，所述启动子可操作地连接于编码蛋白或多肽的核酸序列，如下文进一步所述。

在一个不同的实施方案中，本发明启动子用于制备用于基因沉默的嵌合基因和载体，从而将所述启动子可操作地连接至靶基因(毛状体细胞中待沉默的内源基因或基因家族)的正义和/或反义核酸序列。

“基因沉默”是指一个或多个靶基因的基因表达下调或完全抑制。使用抑制性RNA减少或消除基因表达在本领域中已经是公知，并且是多篇综述的主题(例如，Baulcombe，1996，Plant Cell 8：1833-1844；Stam et al.，1997，Plant Journal 12：63-82；Depicker and Van Montagu，1997，Curr.Opinion Cell Biol.9：373-382)。存在大量可用的技术可以完成植物中的基因沉默，例如产生全部或部分靶基因的反义RNA的嵌合基因(见例如，EP 0 140 308 B1、EP 0 240 208 B1和EP 0 223 399 B1)或产生正义RNA的嵌合基因(也被称为共抑制)，见EP 0 465 572 B1。

然而迄今为止最成功的方法是同时产生靶基因的正义和反义RNA(“反向重复序列”)，它在细胞中形成双链RNA(dsRNA)并沉默一个或多个靶基因。用于产生dsRNA和基因沉默的方法和载体在EP 1 068311、EP 983 370 A1、EP 1 042 462 A1、EP 1 071 762 A1和EP 1 080 208 A1中已有记载。

因此，本发明的载体可以包含可操作地连接有靶基因的正义和/或反义DNA片段的毛状体特异性启动子。靶基因序列的短(正义和反义)链(例如编码或非编码序列的至少约17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸)可能是足够的。还经常使用更长的序列，例如至少约100、200、250、300、400、500、1000、1500个核苷酸或更长。优选地，正义和反义片段被间隔序列例如内含子分开，在形成dsRNA双链时它形成环(或发夹)。靶基因的任何一段都可以用于制备基因沉默的载体和转基因植物，在所述植物中所述靶基因或基因家族被沉默。产生发夹构建体的一种方便的方法是使用诸如pHANNIBAL和pHELLSGATE(基于

技术的载体)等通用载体(见Wesley et al.2004，Methods MolBiol.265：117-30；Wesley et al.2003，Methods Mol Biol.236：273-86和Helliwell&Waterhouse 2003，Methods 30(4)：289-95)，所有这些文献通过引用的方式纳入本文。

通过选择靶基因的保守核酸序列，宿主植物中的靶基因家族成员在毛状体中可以被沉默。

本文还包括包含毛状体特异性启动子的转基因植物，该启动子可操作地连接至靶基因核酸序列的正义和/或反义DNA片段，并且所述植物表现出靶基因沉默表型。所述表型将依赖于基因的功能，并且可以是肉眼可见或不可见的化学或分子变化。因此，这些嵌合基因和载体也可以用于在毛状体中确定或验证基因的功能。

本发明的嵌合基因可以稳定地引入到宿主的基因组中，或者可以作为附加体单元存在。

本发明的转基因细胞和生物体

本发明提供了转基因细胞和生物体特别是植物、植物细胞、组织或器官，它们可通过上文的方法获得的。这些细胞和生物体的特征在于在它们的细胞或基因组中存在嵌合基因，在于存在本发明的启动子。另外，mRNA转录物或翻译的蛋白可以改变细胞或生物体例如植物毛状体(特别是腺毛状体)的表型。

在一个实施方案中，导入所述植物中的嵌合基因由均天然出现在所述宿主属或种中的各部分构成，例如如果转化茄属的宿主植物，那么优选使用来自茄属的本发明的启动子，并且所述启动子可操作地连接于亦来自茄属的核酸序列，并任选地连接于来自茄属的3’UTR。这同样适用于所述宿主的种。虽然所述植物可携带转基因，但是其所有核苷酸元件天然地出现于宿主属或种中(即使不以组合方式存在)，这可减少调节问题并提高公共接受度。

所述嵌合基因在基因组中的位置可以影响所述启动子的活性以及所述嵌合基因的表达水平。因此，可以通过例如分析拷贝数(DNA印迹分析)、mRNA转录物水平(例如RNA印迹分析或RT-PCR)或者通过分析所述核酸序列编码的蛋白的存在和水平(例如SDS-PAGE后的蛋白印迹分析；ELISA测定、免疫细胞学测定等)，选择表达高的、组成型水平的蛋白或正义和/或反义转录物(当使用沉默构建体的时候)的转化体(“事件”或“转化事件”)。还可以测试所述转化体在一种或多种生物和/或非生物胁迫条件下的表达稳定性，并可就其它用途识别和选择那些在一种或多种需要的条件下保持高的组成型表达的事件。

可以将所述转基因植物用于传统育种方法例如杂交、自交、回交等中。通过所述转化体的自交可以产生所述转基因的纯合植物。育种方法是本领域公知的并且在植物育种的标准教科书中有记载，例如Allard，R.W.，Principles of Plant Breeding(1960)New York，NY，Wiley，第485页；Simmonds，N.W.，Principles of Crop Improvement(1979)，London，UK，Longman，第408页；Sneep，J.et al.，(1979)Tomato Breeding(p，135-171)in：Breeding of Vegetable Crops；Mark J.Basset编者(1986)，The Tomatocrop：a scientific basis for improvement；Atherton，J.G.&J.Rudich编著，Plant Breeding Perspectives(1986)；Fehr，Principles of CultivarDevelopment-Theory and Technique(1987)New York，NY，MacMillan。

还可以将转基因细胞或生物体用于细胞培养中(植物细胞培养、细菌或真菌细胞培养例如酵母培养、人或哺乳动物细胞培养、昆虫细胞培养)，例如用于大规模生产重组蛋白。在一个实施方案中提供了一种细胞培养物，它包含含有本发明的启动子的细胞。

本发明的方法和用途

本发明还提供了一种用于制备转基因植物或植物细胞的方法，包含以下的步骤：

(a)产生含有本发明的启动子的嵌合基因或载体，所述启动子可操作地连接有待表达的核酸序列；

(b)用所述嵌合基因或载体转化植物或植物细胞；并且，任选地，

(c)再生一株或多株转基因植物。

所述再生植物(或其保留所述转基因的后代)或其部分可用于多种目的，例如在农业中原样使用或者用于分子农业。进一步的用途取决于所述转基因赋予的表型。例如，如果转基因植物在毛状体中产生高水平的次生代谢物，那么将种植所述植物并收获所述代谢物。因此，可以收获整株植物或植物部分用于人消费或动物消费，或者用于工业目的，这取决于所述转基因。同时，可以收获所述植物的不同部分用于不同目的，例如可以收获果实或种子用于消费，而可以收获叶、茎和/或花用于工业目的。

明显地，可以测试由转基因赋予的表型，例如在大田试验中进行(例如，可以使用常规方法进行疾病或害虫抗性试验)。

可以鉴定在非胁迫条件下在毛状体中提供强(例如组成型)启动子活性的转基因植物，从而在所述植物在暴露于一种或多种生物胁迫和/或非生物胁迫时，所述启动子活性基本保持不变(至少不降低，或者不显著降低)。

所述植物可用于传统农业和育种方法中。

附图

图1.

ShSTS1在番茄(多毛番茄LA1777)有毛状体的叶(LT)、有毛状体的茎(ST)、秃茎(BS)和毛状体(T)中的表达。

图2.

SlSTS1在番茄(Moneymaker)不同器官中的表达。

图3.

pKG1662的载体图谱。

图4A和4B

(A)pKG1917和(B)pKG1918的载体图谱。

图5

显示出腺毛状体的蓝色Xgluc染色(圈)的SlMTS1p：GUS转化番茄植物的照片。

如下的非限制实施例描述了本发明的启动子的用途。除非在实施例中另外声明，否则所有重组DNA技术都是按照在如下文献中记载的标准方法完成：Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press和Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，以及Ausubel et al.(1994)Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols，USA的第1和2卷。用于植物分子实验的标准材料和方法在R.D.D.Croy的PlantMolecular Biology Labfax(1993)(由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications，UK联合出版)中有记载。

实施例

选择用于启动子分离的基因

分离番茄栽培种Moneymaker和野生番茄多毛番茄变种LA1777的cDNA。在包括毛状体和秃茎(从其上去除了毛状体)的多种不同植物器官中测试了番茄单萜合酶1(SlMTS1；AY840091)、番茄倍半萜合酶1(SlSTS1；AF279453)、多毛番茄倍半萜合酶1(ShSTS1；AF279455)的组织特异性表达水平。在不存在毛状体的情况下无ShSTS1基因的表达(图1)。在多种植物器官中确认了倍半萜合酶1表达(STS1)(图2)。在多种有毛状体的组织中检测到SlSTS1转录物，所述组织例如花分生组织和嫩叶。在果实和根组织中无表达。

启动子序列分离

为了得到启动子序列，在基因组DNA上进行染色体步查(chromosome walk)。从番茄(Moneymaker)和多毛番茄(LA1777)分离总基因组DNA。依照标准步骤，将2μg的gDNA以多种识别6碱基的平端切口限制性酶(SmaI、HinCII、EcoRV、PmiI、DraI、PvuII、SspI、ScaI)单独消化，以苯酚∶氯仿∶异戊醇提取，并且在乙醇中沉淀。将10μl长链适体(100μM)与10μl短链适体(100μM)混合，之后通过如下方式退火所述适体链：加热至95℃，持续2分钟，然后缓慢冷却至室温。在4℃下将过量适体过夜连接至所述基因组DNA片段。

基于核酸序列AY840091、AF279453和AF279455的5’序列信息，设计特异性反向引物序列。

引物名	5’-3’序列
		适体长链	CTAATACGACTCACTATAGGACTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT
适体短链	ACCTGCCCGGGC
		适体引物	CTAATACGACTCACTATAGGGC
巢式适体引物	TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT
		ShSTS1启动子(8)	CCCCAAACAGTTGGGTGAAAATTAGCC
ShSTS1巢式(9)	GGACGAGACTTATTAGCAGAAGAAGCAGCC
		SISTS1启动子(43)	TTCATGAGTATAAGAAAGGAAATGATATCC
SISTS1巢式(44)	GGAAATGATATCCCCAAACAGATGGGTG
		SIMTS1启动子(54)	GGTAAATAATGATGGTCTCTTGAAGG
SIMTS1巢式(55)	GACCACCATCATCCCTATGTTACTC

以适体和特异性引物在不同基因组DNA片段上进行的巢式PCR产生了新型的启动子序列片段。使用质粒

以来自Invitrogen BV的

试剂盒进行PCR产物的克隆。在测序后，可以在新型启动子片段序列上设计新的反向引物。以包含用于克隆的合适限制酶位点的引物在基因组DNA上进行的PCR产生了最终的DNA调节核酸片段。

它们显示于SEQ ID NO：1、2、3中。

引物序列

SEQ ID NO 1：‘1.5kb(1426bp)ShSTS1启动子

SEQ ID NO 2：‘1.9kb(1907bp)SlSTS1启动子

SEQ ID NO 3：‘1.2kb(1253bp)SlMTS1启动子

引物名	5’-3’序列
		ShSTS1全长正向	CCCTCGAGTATCTATAGACCATATC
ShSTS1全长反向	GCAGAAGAAGCAGCCATGGCTTGTTC
		SISTS1全长正向	TTAATTAAGCATATATATATATATCATAACTAGTAG
SISTS1全长反向	GCGGCCGCTGCTTGTTTGCTTTTTTTCAAGC

SIMTS1全长正向	GCGGCCGCGTTTCATTCAAAGTAGTGGTGTC
		SIMTS1全长反向	CCATGGTTTATTTGTTCTGCTCAATTAC

转化构建体

将最终的启动子序列[SEQ ID NO：1、2和3]置于pKG1662载体中GUS-A标记基因的前面(图3)。然后使启动子和标记基因穿梭至二元pBIN+载体的多克隆位点中(Van Engelen et al.，1995，Transgenic Res，288)。然后依照Koornneef等人(1986.Transformation of tomato.In：Nevins D.J.and R.A.Jones，eds.Tomato Biotechnology.New York，NY，USA，Alan R.Liss，Inc.pp169-178.)描述的方法，将该构建体引入根癌农杆菌变种GV3101中并用于转化番茄变种Moneymaker。将构建体在卡那霉素选择条件下转化并再生，并培育原代再生物(T₀)至产生种子。

作为对照，另外将含有来自拟南芥的CER6启动子的构建体转化至番茄中。在拟南芥和普通烟草(Nicotiana tabacum)中，CER6启动子均被证明可高效地指导表皮特异性表达(Hooker et al.，2002Plant Physiol 129，1568)。该表皮启动子在普通烟草的毛状体组织中也是有活性的。

转化体的表达分析

在T₁植物上进行了定量和定性β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)活性分析。

使用GUS组织学测定法进行了启动子活性的定性分析。在存在环境氧气氛的情况下，使溶于磷酸盐缓冲液(K₂HPO₄，40mM，KH₂PO₄，10mM，pH 7.2，0.2％Triton X-100)中的Xgluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸苷环己基胺盐)底物(1mg/ml)在37℃下与多个植物部位一起孵育过夜。通过以乙醇重复洗涤将所述样品脱色。将非转基因植物用作阴性对照。具有ShSST1p:GUS和SlMTS1:GUS的转基因植物的毛状体显示出浅蓝的毛状体，而这些转基因植物的非毛状体组织和非转基因对照植物的毛状体未显色。

使用GUS荧光测定法进行启动子活性的定量分析。从嫩叶材料制备总蛋白样品；用来自每个测试植物不同部位的大约相同大小和发育阶段的混合叶块制备样品。使用金属珠在磷酸盐缓冲液(Na₂HPO₄，77.4mM，NaH₂PO₄，22.6mM)中磨碎新鲜叶材料，然后离心并收集上清液。

Claims

1.一种转基因植物、植物细胞、植物组织或植物器官，其包含整合至其基因组中的嵌合基因，其特征在于所述嵌合基因包含一个可操作地连接于一个同源核酸序列或异源核酸序列的组成型启动子，其中所述启动子选自：

(a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的核酸序列；

(b)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的功能片段；

(c)与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3有至少70％序列同一性的核酸序列；

(d)所述(c)的核酸序列的功能片段。

2.权利要求1的植物、植物细胞、植物组织或植物器官，其中所述启动子活性是指特异性地在毛状体中具有活性，优选仅特异地在腺毛状体中具有活性。

3.权利要求1或2的植物、植物细胞、植物组织或植物器官，其中当所述植物、细胞、组织或器官暴露于一种或多种生物胁迫和/或非生物胁迫时，所述启动子活性不显著降低。

4.权利要求1-3任一项的转基因植物、植物细胞、植物组织或植物器官，其中所述植物属于茄科。

5.一种在导入植物细胞时具有毛状体特异性启动子活性的分离核酸序列，其中所述核酸序列包含选自如下的序列：

(a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的核酸序列；

(b)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的片段；

(d)所述(c)的核酸序列的功能片段。

6.权利要求1(d)或5(d)的片段，其中所述片段包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的至少200个连续核苷酸。

7.一种嵌合基因，所述嵌合基因包含权利要求5或6的核酸序列，所述核酸序列可操作地连接至一个同源核酸序列或异源核酸序列以及任选的3’UTR序列。

8.一种载体，所述载体包含权利要求5或6的核酸序列或者包含权利要求7的嵌合基因。

9.一种转基因植物或植物细胞，包含权利要求7或8的嵌合基因。

10.一种制备转基因植物或植物细胞的方法，包括步骤：

(a)产生权利要求7的嵌合基因，或者权利要求8的载体；

(c)再生转基因植物。