CN102459615A

CN102459615A - 耐旱植物

Info

Publication number: CN102459615A
Application number: CN2010800349050A
Authority: CN
Inventors: W·H·弗里森; L·尼奇
Original assignee: Nunhems BV
Current assignee: Nunhems BV
Priority date: 2009-06-08
Filing date: 2010-06-07
Publication date: 2012-05-16
Anticipated expiration: 2030-06-07
Also published as: EP2440664A1; EA025000B1; EA201270001A1; MX2011013147A; AU2010257761B2; EP2440664B1; CN102459615B; UA110774C2; ZA201108957B; WO2010142465A1; US20120084881A1; US9532520B2; ES2879599T3; IL216838B; BRPI1010843A2; CA2764528A1; MX336182B; AU2010257761A1; IL216838A0

Abstract

本发明涉及具有新表型的转基因和非转基因植物领域。本发明所提供的是番茄丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2C(SlPP2C1)蛋白质和编码其的核酸序列，其用于赋予植物新表型，尤其是耐旱性。

Description

耐旱植物

技术领域

本发明涉及植物生物技术和植物育种领域。所提供的是耐旱植物，尤其是耐旱蔬菜物种，如番茄(Solanum lycopersicum)，及用于产生遗传上修饰的耐旱植物或突变体耐旱植物的方法。本发明提供称为SlPP2C1的新基因，该基因编码he SIPP2C蛋白质，该蛋白质是脱落酸(absisic acid，ABA)反应的负调节物。SlPP2C1基因的下调、敲除或沉默导致植物具有显著提高的耐旱性。还提供在其基因组中包含突变体SlPP2C1等位基因且具有显著提高的耐旱性的植物、种子、果实和植物部分。在另一实施方案中，本文中提供用于产生在其基因组中包含一个或多个突变体SlPP2C1等位基因的耐旱植物的方法。

背景技术

植物激素脱落酸(abscisic acid，ABA)对调节非生物胁迫反应(如干旱、盐度、冷休克、创伤、病原体侵袭)及种子发育和休眠很重要。已多次使用针对具有改变的非生物胁迫反应或种子休眠的突变体的筛选，并导致了对ABA生物合成和ABA信号转导重要的基因的鉴定。通过这种筛选，已鉴定了拟南芥属(Arabidopsis)ABA不敏感突变体abi1-1和abi2-1(Koornneef等1984，Physiol Plantarum 61：377-383)。

AtABI1基因的克隆和表征揭示，它编码2C型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2C，Leung等1994，Science 264：1448-1452；Meyer等1994，Science264：1452-1455)。AtABI2也编码2C型蛋白磷酸酶。abi1-1和abi2-1突变体在AtABI1和AtABI2基因中携带突变，该突变在等同的位置上导致相同的Gly至Asp的取代(Leung等1997，Plant Cell 9：759-771)。已显示两种突变体都具有降低的磷酸酶活性(Bertauche等1996，Eur J Biochem241：193-200；Leung等1997，上文)，这暗示AtABI1和AtABI2是ABA敏感性的正调节物。但是，AtABI1的组成性过量表达抑制了ABA在玉米原生质体中的作用，且已显示AtABI1和AtABI2的功能降低突变体对ABA具有高敏反应(hypersensitive response)(Scheen 1998，PNAS 95：975-980；Gosti等1999，Plant Cell 11：1897-1909；Merlot等2001，Plant J25：295-303)。总之，因此得出结论，AtABI1和AtABI2是ABA反应的负调节物。虽然abi1-1和abi2-1中的突变诱导ABA不敏感性的确切机制仍未知，但它可能与突变蛋白质的优先核定位相关(Moes等2008，Plant J 54：806-819)。AtABI1和AtABI2对种子休眠以及幼苗生长和气孔开张度(stomatal aperture)的调节很重要，暗示这些蛋白质在控制组织特异性ABA信号级联放大的主分支点之前发挥作用(Leung等1997，上文)。

已在拟南芥属中鉴定了76个PP2C，其中一个亚组(亚组PP2C-A，由9个基因组成)已与ABA信号转导相关(Schweighofer等2004，Trendsin Plant Science第9卷：236-243)。还发现隶属于此组的几个拟南芥属基因编码ABA反应的负调节物。例如，AtP2C-HA(Rodriguez等1998，PlantMol Biol 38：879-883)(也称为AtHAB1，Saez等2004，Plant J 37：354-369)是调节诸如气孔关闭、种子萌发和营养生长抑制的许多ABA反应的ABA信号传导途径的阻抑物。HAB2似乎也具有相似的调节作用。还已将AtPP2CA(Kuhn等2006，Plant Physiol 140：127-139)描述为ABA的负调节物，具有显示ABA高敏性的突变体。有趣地，基因破坏突变体显示ABA高敏性气孔关闭反应，而突变体的蒸腾作用(水分丧失)与野生型植物中并无不同。Yoshida等(2006，Plant Physiology 140：115-126)还研究了AtPP2CA中的错义功能丧失突变，其具有野生型的1/100蛋白磷酸酶活性，突变体拟南芥属植物由此在种子萌发期间显示ABA高敏性，但突变体植物与野生型相比未显示任何耐旱性变化(124页，LH Column，最后一段)。

ABI1和ABI2是调节诸如气孔关闭、质膜的渗透透水性、干旱诱导的抗性和生根、对葡萄糖的反应、高光胁迫、种子萌发和营养生长抑制的许多ABA反应的ABA信号传导途径的阻抑物。AHG1(At5g51760)是种子萌发期间的ABA负调节物(Nishimura等2007，Plant J 50：935-949)，而AHG3(At3g11410)是种子萌发和冷适应期间的ABA负调节物。另外三种(At5g9220、At2g29380和At1g07430)终究未涉及ABA信号发放，因为无效突变未显示对ABA的敏感性的任何改变(Yoshida等，2006：PlantPhysiology 140：115-126)。

因此，ABA生物合成和信号发放极其复杂，虽然已在拟南芥属中鉴定了似乎涉及其中的多种基因(PP2C-A组)，但它们在ABA依赖性反应，如非生物胁迫、种子休眠和幼苗生长中的作用在很大程度上仍不清楚。此外，蛋白质序列显示少许保守性，氨基酸序列具有少许序列同一性。基于蛋白质结构域(或基序)，如通常定位在蛋白质C端的催化结构域(蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸酶样结构域)，将基因按系统发生分组在一起。N端显著不同，且可以在底物结合中发挥作用或提供信号发放复合物的特异性附着位点。除体内功能不清楚外，关于这些酶的亚细胞定位、底物和特异性或在体内如何调节这些单体酶也知之甚少。

WO2007/088234描述了ABI1和HAB1的组合失活增强了对ABA的反应，产生对盐度和水分胁迫(hydric stress)具有抗性的拟南芥属植物。图6和7中显示了ABI1(SGN-U231558)和HAB1(SGN-U217609)的番茄直向同源物。还见Saez等2006，Plant Physiol 141：1389-1399。

虽然abi1 hab1双突变体在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中导致耐旱性，但仍存在提供适合用于在作物植物中，尤其是在大田作物(例如稻、玉米、大豆、小麦、大麦、黑麦、高粱、芸苔属(Brassica)等)和蔬菜作物(例如番茄、黄瓜、洋葱、胡萝卜、卷心菜、花椰菜、椰菜、西瓜、甜瓜、莴苣、韭葱、菠菜、萝卜、马铃薯、朝鲜蓟、野莴苣、南瓜(pumpkin)、倭瓜(squash)、豆、豌豆、辣椒等)中产生耐旱性的基因的需要。尤其是在蔬菜作物中，水分不足可以是大问题，因为许多作物的根浅，且许多产品通常新鲜出售，水分不足可以导致降低的蔬菜质量和降低的产率。果实和种子蔬菜，如番茄在开花期间及果实和种子发育期间对水分不足敏感。果实发育期间水分不足可以严重减少果实形成。应付潜在的水分胁迫环境的常见实践是灌溉作物和/或种植具有耐旱性的栽培种或变种，只要这些是可得的。还可以使用覆盖物和行遮盖物(row covers)。

尽管有育种的努力，番茄植物仍对干旱敏感，且无市售耐旱栽培种可得。

本发明提供适合用于产生耐旱作物植物，尤其是番茄植物和其他蔬菜植物的称为SlPP2C1的新基因。本发明还提供产生耐旱植物的方法。还提供耐旱植物、它们自身的种子和植物部分(收获的果实等)。

一般定义

术语“核酸序列”(或核酸分子)指单链或双链形式的DNA或RNA分子，尤其是编码本发明的蛋白质或蛋白质片段的DNA。“分离的核酸序列”指不再处于其所分离自的天然环境中的核酸序列，例如细菌宿主细胞中或植物核基因组或质体基因组中的核酸序列。

术语“蛋白质”或“多肽”可互换使用，指由氨基酸链组成的分子，而不涉及具体的作用方式、大小、三维结构或来源。因此，SlPP2C1蛋白质的“片段”或“部分”仍可以称为“蛋白质”。用“分离的蛋白质”来指不再处于其天然环境中的蛋白质，例如在体外或在重组细菌或植物宿主细胞中。

术语“基因”意指包含与适宜调节区(例如启动子)有效连接的在细胞中转录为RNA分子(例如mRNA)的区域(转录区)的DNA序列。因此，基因可以包含几个有效连接的序列，如启动子、含有例如涉及翻译起始的序列的5’前导序列、(蛋白质)编码区(cDNA或基因组DNA)和含有例如转录终止位点的3’非翻译序列。

“嵌合基因”(或重组基因)指正常情况下不天然见于物种中的任意基因，尤其是其中存在在自然界中不相互结合的一个或多个核酸序列的部分的基因。例如，启动子在自然界中不与部分或全部转录区或与另一调节区结合。术语“嵌合基因”理解为包含这样的表达构建体，其中启动子或转录调节序列与一个或多个编码序列或与反义序列(有义链的反向互补链)或反向重复序列(有义链和反义链，RNA转录物由此在转录时形成双链RNA)有效连接。“顺式基因”是嵌合基因，其中优选全部基因序列，但至少转录序列来自在性别上与该基因所引入的物种相容的植物物种。

“基因的表达”指其中与适当的调节区，尤其是启动子有效连接的DNA区域转录为RNA的过程，该RNA具有生物活性，即能够翻译为具有生物活性的蛋白质或肽(或活性肽片段)，或者自身具有活性(例如在转录后基因沉默或RNAi中)。编码序列可以处于有义取向，且编码希望的具有生物活性的蛋白质或肽，或活性肽片段。在基因沉默方法中，DNA序列优选以反义DNA或反向重复DNA的形式存在，其以反义取向或以正义和反义取向(反向重复)包含靶基因的短序列。“异位表达”指基因正常情况下不在其中表达的组织中的表达。

“活性蛋白质”或“功能蛋白质”是具有可以例如通过体外活性测定在体外测量和/或例如通过该蛋白质所赋予的表型在体内测量的蛋白质活性的蛋白质。“野生型”蛋白质是存在于野生型植物中的全功能蛋白质。本文中的“突变体蛋白质”是这样的蛋白质，在编码该蛋白质的核酸序列中包含一个或多个突变，该突变由此导致(突变体核酸分子编码)例如可以通过体外(例如通过活性测定来与野生型蛋白质的活性比较)和/或体内(例如通过该突变体等位基因所赋予的表型)蛋白质活性来测量的“功能降低”或“功能丧失”的蛋白质。

编码蛋白质的核酸分子中的“突变”是与野生型序列相比，例如通过一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入来改变一个或多个核苷酸。“点突变”是单个核苷酸的取代，或单个核苷酸的插入或缺失。

“无义”突变是编码蛋白质的核酸序列中的(点)突变，密码子由此变为终止密码子。这产生存在于mRNA中和截短蛋白质中的过早终止密码子(premature stop codon)。截短蛋白质可以具有减少的功能或功能的丧失。

“错义”突变是编码蛋白质的核酸序列中的(点)突变，密码子由此改变为编码不同的氨基酸。产生的蛋白质可以具有减少的功能或功能的丧失。

“剪接位点”突变是编码蛋白质的核酸序列中的突变，前mRNA的RNA剪接由此改变，产生与野生型相比具有不同核苷酸序列的mRNA和具有不同氨基酸序列的蛋白质。产生的蛋白质可以具有减少的功能或功能的丧失。

“移码”突变是编码蛋白质的核酸序列中的突变，mRNA的阅读框由此改变，产生不同的氨基酸序列。产生的蛋白质可以具有减少的功能或功能的丧失。

调节序列中，例如基因的启动子中的突变是与野生型序列相比，例如通过一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入来改变一个或多个核苷酸，导致例如产生减少的基因的mRNA转录物或不产生基因的mRNA转录物。

“沉默”指下调或完全抑制靶基因或基因家族的基因表达。

基因沉默方法中的“靶基因”是基因或基因家族(或基因的一个或多个具体等位基因)，其内源基因表达在嵌合沉默基因(或“嵌合RNAi基因”)表达和例如产生沉默RNA转录物(例如能够沉默内源靶基因表达的dsRNA或发夹RNA)时下调或完全抑制(沉默)。在诱变方法中，靶基因是待突变，以导致基因表达的改变(减少或丧失)或所编码的蛋白质的功能的改变(减少或丧失)的内源基因。

一般通过将启动子与双链DNA分子有效连接来产生“有义”RNA转录物，其中该DNA分子的有义链(编码链)为5’至3’取向，使得转录时转录出与有义DNA链具有相同的核苷酸序列(除RNA中通过U取代T外)的有义RNA。一般通过将启动子与有义DNA的互补链(反义链)有效连接，使得转录时转录出反义RNA来产生“反义”RNA转录物。

“转录调节序列”在本文中定义为能够调节与该转录调节序列有效连接的(编码)序列的转录速率的核酸序列。因此，本文中定义的转录调节序列将包含起始转录(启动子元件)、维持和调节转录所必需的所有序列元件，其包括例如弱化子或增强子。虽然大多数情况下指编码序列的上游(5’)转录调节序列，但此定义还涵盖见于编码序列下游(3’)的调节序列。

本文中使用的术语“启动子”指核酸片段，其发挥作用来控制一个或多个基因的转录，就基因的转录起始位点的转录方向而言定位在上游，且通过依赖于DNA的RNA聚合酶的结合部位、转录起始位点和任意其他DNA序列的存在在结构上鉴定，该任意其他DNA序列包括但不限于转录因子结合部位、阻抑蛋白和激活蛋白结合部位，及本领域技术人员已知的直接或间接发挥作用来调节来自该启动子的转录量的任意其他核苷酸序列。“组成型”启动子是在大多数生理和发育条件下在大多数组织中具有活性的启动子。“诱导型”启动子是在生理上(例如通过外部应用某些化合物)或发育上受调节的启动子。“组织特异性”启动子是仅在特定类型的组织或细胞中具有活性的启动子。

本文中使用的术语“有效连接”指多核苷酸元件处于功能关系中的连接。在将它置于与另一核酸序列的功能关系中时，核酸“有效连接”。例如，如果启动子或转录调节序列影响编码序列的转录，则它与该编码序列有效连接。有效连接意指所连接的DNA序列通常相邻，且在必需连接两个蛋白质编码区时相邻且处于阅读框中，以产生“嵌合蛋白质”。“嵌合蛋白质”或“杂合蛋白质”是由多种蛋白质“结构域”(或基序)组成的蛋白质，在自然界中未发现该结构域这样连接，但其连接形成功能蛋白质，该功能蛋白质显示所连接的结构域的功能性。嵌合蛋白质还可以是存在于自然界中的两种或多种蛋白质的融合蛋白质。

本文中使用的术语“结构域”意指具有特定结构或功能的蛋白质的任意一个或多个部分或一个或多个结构域，其可以转移至另一蛋白质，以提供至少具有该结构域的功能特征的新的杂合蛋白质。还可以用特定结构域来鉴定隶属于蛋白质SlPP2C1组的蛋白质成员，如来自其他植物物种的SlPP2C1直向同源物。见于SlPP2C1蛋白质中的结构域的实例是包含在SEQ ID NO：2的约氨基酸84-391内的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶2C(PP2C或PP2C样)催化结构域或SlPP2C蛋白质的N端区域(SEQ ID No：2的氨基酸1-83)。

术语“引导肽(target peptide)”指将蛋白质靶向至胞内细胞器，如质体，优选叶绿体、线粒体，或靶向至胞外间隙(分泌信号肽)的氨基酸序列。可以将编码引导肽的核酸序列融合(框内)至编码蛋白质氨基末端(N末端)的核酸序列。

“核酸构建体”或“载体”在本文中理解为意指源自重组DNA技术的使用，并用于将外源DNA递送入宿主细胞的人工核酸分子。载体主链可以是例如本领域已知且描述于本文中其他地方的二元或超二元载体(见例如US5591616、US2002138879和WO9506722)、共整合载体或T-DNA载体，其中整合入嵌合基因，或者如果其中已存在适宜的转录调节序列，则仅将希望的核酸序列(例如编码序列、反义序列或反相重复序列)整合在转录调节序列下游。载体通常包含其他遗传元件来便于它们在分子克隆中的使用，如例如选择标记、多克隆位点等(见下文)。

“宿主细胞”或“重组宿主细胞”或“转化细胞”是指由于已将至少一个核酸分子引入该细胞中而产生的新的个体细胞的术语，该核酸分子尤其包含编码希望的蛋白质的嵌合基因或转录时产生用于沉默靶基因/基因家族的反义RNA或反向重复RNA(或发夹RNA)的核酸序列。宿主细胞优选是植物细胞或细菌细胞。宿主细胞可以作为染色体外(附加型)复制分子包含核酸构建体，或者更优选地，包含整合入宿主细胞的核基因组或质体基因组中的嵌合基因。

术语“选择标记”是本领域普通技术人员熟知的术语，在本文中用来描述任意遗传实体，其在表达时可以用来选择包含该选择标记的一个或多个细胞。选择标记基因产物赋予例如抗生素抗性，或者更优选地，除草剂抗性或另一可选择的性状，如表型性状(例如色素形成的变化)或营养需要。术语“报道基因”主要用来指可见标记，如绿色荧光蛋白(GFP)、eGFP、荧光素酶、GUS等。

术语基因或蛋白质的“直向同源物”在本文中指见于另一物种中的同源基因或蛋白质，其具有与该基因或蛋白质相同的功能，但序列(通常)从具有该基因的物种趋异的时间点开始趋异(即通过物种形成进化自共同祖先的基因)。因此，可以基于序列比较(例如基于整个序列内和/或特定结构域内的百分比序列同一性)和/或功能分析二者，在其他植物物种中鉴定番茄SlPP2C1基因的直向同源物。

术语“同源的”和“异源的”指核酸或氨基酸序列与它的宿主细胞或生物之间的关系，尤其是在转基因生物的背景中。因此，同源序列天然见于宿主物种中(例如用番茄基因转化的番茄植物)，而异源序列并非天然见于宿主细胞中(例如用来自马铃薯植物的序列转化的番茄植物)。取决于背景，术语“同系物”或“同源物”还可以指传承自共同祖先序列的序列(例如它们可以是直向同源物)。

可以用“严格杂交条件”来鉴定与给定的核苷酸序列基本上同一的核苷酸序列。严格条件是序列依赖性的，且在不同环境中将不同。一般而言，选择严格条件为比具体序列在确定的离子强度和pH下的热解链温度(thermal melting point，T_m)低约5℃。T_m是(在确定的离子强度和pH下)50％的靶序列杂交至完全配对的探针的温度。通常将选择这样的严格条件，其中pH 7下的盐浓度为约0.02摩尔，温度为至少60℃。降低盐浓度和/或增加温度可提高严格性。用于RNA-DNA杂交(使用例如100nt的探针的Northern印迹)的严格条件是例如包括在63℃下在0.2×SSC中进行20分钟的至少一次洗涤的那些，或等同的条件。用于DNA-DNA杂交(使用例如100nt的探针的Southern印迹)的严格条件是例如包括在至少50℃、通常约55℃的温度下在0.2×SSC中进行20分钟的至少一次洗涤(通常为两次)的那些，或等同的条件。还见Sambrook等(1989)；Sambrook和Russell(2001)。

可以通过用总体或局部对比算法比对两个肽序列或两个核苷酸序列来测定“序列同一性”和“序列相似性”。然后可以在序列(在通过例如程序GAP或BESTFIT或Emboss程序“Needle”(使用默认参数，见下文)最佳比对时)具有至少某最小百分比的序列同一性(如下文进一步定义)时将它们称为“基本上同一”或“基本上相似”。这些程序用Needleman和Wunsch总体对比算法来在它们的全长内比对两个序列，最大化匹配数，而最小化缺口数。一般而言，使用默认参数，缺口产生罚分＝10，缺口延伸罚分＝0.5(对核苷酸和蛋白质比对二者而言)。对于核苷酸，所使用的默认评分矩阵是nwsgapdna，对于蛋白质，默认评分矩阵是Blosum62(Henikoff & Henikoff，1992，PNAS 89，915-919)。例如可以用计算机程序，如可从Accelrys Inc.，9685 Scranton Road，San Diego，CA 92121-3752USA或EMBOSS(http://www.ebi.ac.uk/Tools/webservices/services/emboss)获得的GCG Wisconsin Package，Version 10.3来测定用于百分比序列同一性的序列比对和得分。备选地，可以通过针对诸如FASTA、BLAST等的数据库搜索来测定百分比相似性或同一性，但应返回命中序列并比对配对来比较序列同一性。

在此文件中及其权利要求中，以它的非限制性含义用动词“包含”及其词形变化来指包括该词后的项目，但不排除未明确提到的项目。此外，除非上下文清楚地要求有且仅有元件中的一个，通过不定冠词“一”或“一个”提到元件不排除存在一个以上元件的可能性。因此，不定冠词“一”或“一个”通常意指“至少一个”。还应理解，在本文中提到“序列”时，一般提到具有某亚单位(例如氨基酸)序列的实际的物理分子。

本文中使用的术语“植物”包括整株植物或其任意部分或衍生物，如植物器官(例如收获或不收获的贮藏器官、鳞茎、块茎、果实、叶等)、植物细胞、植物原生质体、可从其再生整株植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物细胞团块和植物中完整的植物细胞，或植物的部分，如胚、花粉、胚珠、果实(例如收获的组织或器官，如收获的番茄等)、块茎(例如马铃薯)、花、叶、种子、块茎、鳞茎、通过克隆繁殖的植物、根、根状茎、茎、根尖等。还包括任意发育阶段，如幼苗、未成熟和成熟等。

“植物变种”是已知的最低等级的同一植物分类群内的一组植物，其(不考虑承认植物育种者的权利的条件是否得到满足)可以根据源自某种基因型或基因型组合的特征的表达来定义，可以通过那些特征中的至少一种的表达来与任意其他组的植物区分，且可以视为实体，因为它可以无任何改变地繁殖。因此，如果它们全都表征为存在1个基因座或基因(或由此单基因座或基因引起的一系列表型特征)，但就其他基因座或基因而言可以在其他方面彼此非常不同，则即使它们属于同一类型，也不可用术语“植物变种”来指该组植物。

“F1、F2等”指两种亲本植物或亲本品系间杂交后的连续相关世代。从两种植物或品系杂交产生的种子长出的植物称为F1代。F1植物自交产生F2代等。“F1杂种”植物(或F1种子)是从两个近交亲本品系杂交获得的世代。“M1群体”是某个植物品系或栽培种的多个诱变种子/植物。“M1、M2、M3、M4等”指第一诱变种子/植物(M1)自交后获得的连续世代。

术语“一个或多个等位基因”意指具体基因座上的基因的一种或多种备选形式中的任一种，该等位基因全都涉及具体基因座上的一种性状或特征。在生物的二倍体细胞中，给定基因的等位基因定位在染色体上的具体位置或基因座。同源染色体对的每条染色体上存在一个等位基因。二倍体植物物种可以在具体基因座上包含许多不同的等位基因。这些可以是基因的同一等位基因(纯合)或两个不同的等位基因(杂合)。

术语“基因座”意指在染色体上发现例如基因或遗传标记的具体的一个或多个位置或部位。因此，SlPP2C1基因座是在基因组中发现SlPP2C1基因的位置。

“野生型等位基因”(WT)在本文中指编码功能蛋白质(野生型蛋白质)的基因的形式。野生型SlPP2C1等位基因例如显示于SEQ ID NO：1中。“突变体等位基因”在本文中指与野生型等位基因相比在编码序列(mRNA或cDNA)或基因组序列中包含一个或多个突变的等位基因。这种(类)突变(例如一个或多个核苷酸的插入、倒位、缺失和/或取代)可以导致所编码的蛋白质具有减少的体外和/或体内功能性(减少的功能)或无体外和/或体内功能性(功能丧失)，例如由于蛋白质例如截短或具有其中缺失、插入或取代了一个或多个氨基酸的氨基酸序列。这类改变可以导致蛋白质具有不同的三维构象、靶向至不同的亚细胞区室、具有改变的催化结构域、具有改变的底物亲和力和/或特异性等。

“耐旱性”或“显著增强的耐旱性”或“耐旱植物”在本文中指与适宜的对照植物(例如野生型植物)相比，植物品系、栽培种或变种抵抗水分不足/水分胁迫/干旱的能力(平均)显著增强，即与暴露于相同的水分胁迫条件的对照相比，耐旱植物中与水分胁迫相关的症状(例如叶萎蔫)(统计上)显著减少，和/或与对照植物，如野生型植物相比，暴露于水分不足/水分胁迫/干旱条件后植物的(平均)恢复率和/或存活率和/或可收获产率显著增加。如将在本文中其他地方解释，存在多种用于测定植物是否耐旱的方法。优选地，耐旱植物在所有发育阶段期间，但至少在以下发育阶段之一期间具有显著增强的耐旱性：作为成熟植物，开花期间或开花期、果实形成和果实发育期间、种子发育期间、果实成熟期间。优选地，此外，植物还至少在种子阶段和/或幼苗阶段和/或从幼苗阶段至(且包括)成熟植物期间具有耐旱性。

“野生型植物”在本文中指包含编码功能蛋白质的野生型(WT)SlPP2C1等位基因的植物(例如与包含突变体SlPP2C1等位基因的“突变体植物”相反)。这类植物是在表型测定中适宜的对照。优选地，野生型和/或突变体植物是“栽培植物”，即由人类栽培且具有良好农学特征的物种的变种、育种品系或栽培种；优选地，这类植物不是“野生植物”，即一般具有比栽培植物差的产率和比栽培植物差的农学特征，且例如天然生长在野生群体中的植物。“野生植物”包括例如物种的生态型、PI(植物引种)品系、当地品种或野生品种(wild accession)或野生亲缘品种，或者所谓的祖传变种(heirloom varieties)或栽培种，即在人类历史的较早时期普遍种植，但不用于现代农业中的变种或栽培种。

“干旱”优选指短期水分不足或胁迫(人工的，例如无土壤灌溉，和/或自然的，例如无降雨)和/或长期水分不足或胁迫(人工的，例如无土壤灌溉，和/或自然的，例如无降雨)二者，短期水分不足或胁迫例如等于或少于30天、20天、15天、14天、10天、9、8、7、6、5天或更少天数，长期水分不足或胁迫例如等于或多于31天、35天、40天、45天、50天、60天、70天、80天、90天或更多天数。

SlPP2C1基因或蛋白质的“变体”包含见于物种番茄中的天然等位基因变体，以及见于其他植物物种，如其他双子叶植物物种或单子叶植物物种中的直向同源物二者。

发明详述

本发明人通过进行授粉的子房和GA₃(赤霉酸)处理的子房的转录物组分析(cDNA-AFLP)来研究在番茄果实形成期间差异表达的基因(Vriezen等2008，New Phytologist 177：60-76)。通过产生转基因植物进一步表征了与ABA(脱落酸)水平(未授粉的子房中高，授粉后低)相关的一个基因(其在未授粉的子房中相对高表达，在授粉的子房中表达较少)，以研究此基因在ABA信号发放中的作用。将该番茄基因命名为SlPP2C1(番茄PP2C1)，因为它编码397个氨基酸的蛋白质，该蛋白质在约氨基酸84至391之间的C端区域中包含丝氨酸/苏氨酸磷酸酶2C催化结构域(如通过InterProScan测定)。

发现SlPP2C1涉及ABA信号发放，且在CaMV 35S启动子的控制下过量表达此基因产生比野生型植物对植物激素ABA更不敏感的植物，而共抑制此基因(至少在叶组织中具有显著低于野生型植物的SlPP2C1转录物水平)的植物具有更高的ABA敏感性(见实施例)。因此，降低的(野生型)SlPP2C1蛋白质水平增强了ABA敏感性，意味着SlPP2C1蛋白质是ABA信号发放的负调节物。

令人惊奇地，还发现，与野生型植物相比，SlPP2C1转录物水平显著降低的番茄植物在9天的水剥夺后丝毫未显示萎蔫，而野生型植物具有萎蔫叶，且过量表达SlPP2C1的植物显示严重的萎蔫迹象。这甚至更令人惊奇，因为SlPP2C1基因和SlPP2C1蛋白质与已显示在拟南芥属的耐旱性中发挥作用的任意已知的ABA负调节物，如ABI1和HAB1，或与A组的蛋白质(见下文表1)中的任一种都不具有任何显著的序列同一性。

表1-涉及ABA信号发放的拟南芥属蛋白质(假定的)(Schweigerhofer等2004，上文，见其中的图1，A组)与SlPP2C1蛋白质之间的序列同一性

拟南芥属PP2C亚组A	SlPP2C1蛋白质(％序列同一性)
		At5g51760(AHG1)	32.3
At3g11410(AtPP2CA，AHG3)	38.8
		At5g59220	38.6
At1g07430(AIP1)	37.5
		At2g29380	39.8
At1g17550(HAB2)	33.5
		At1g72770(HAB1)	32.0
At4g26080(ABI1)	36.0
		At5g57050(ABI2)	37.6

以Needle(Emboss)、Blossum 62矩阵、缺口开放罚分＝10、缺口延伸罚分＝0.5，用全长范围内的配对比对测定序列同一性。

因此，SlPP2C1与拟南芥属PP2C亚组A蛋白质的序列同一性低。尤其是，发现最高相似性的蛋白质At2g29380中的无效突变(T-DNA插入，由此通过RT-PCR检测不到mRNA)在拟南芥属中未显示任何ABA敏感性变化(Yoshida等，2006，Plant Physiology 140：115-126)。此外，此基因在拟南芥属的根和长角果中表达，但在叶和花序中不表达(见Xue等2008.BMC Genomics 9：550的图5)。

SlPP2C1涉及番茄中的耐旱性的发现可以用来产生具有增强的耐旱性和优选具有希望的农学特征的转基因和/或非转基因植物。本文下文中和非限制性实施例中描述了本发明的不同实施方案。除非另有说明，本文中所述的适用于转基因方法的部分一般也适用于非转基因方法，反之亦然。

在一个实施方案中，提供至少在叶组织中下调或沉默内源SlPP2C1表达，且具有耐旱性的转基因植物。在另一实施方案中，本文中提供非转基因植物，其包含一个或多个突变体SlPP2C1等位基因(以纯合或杂合形式)，且其中该一个或多个突变体等位基因编码与野生型蛋白质相比具有减少的体外和/或体内功能性，或甚至无功能性的SlPP2C1蛋白质，该突变由此导致植物(突变体品系或其后代)与缺乏该一个或多个突变体等位基因的植物(野生型植物)相比具有显著增强的耐旱性。在本发明的一个实施方案中，用TILLING或Eco-TILLING产生这类非转基因耐旱植物，但也可以用其他已知的诱变方法与育种方法组合来产生。因此，在一个实施方案中，由人类用诱变技术诱导和鉴定突变体SlPP2C1等位基因(“诱发突变体”)，而在本发明的另一实施方案中，突变体SlPP2C1等位基因是“自然突变体”，这是指它见于自然植物群体中。“诱发突变体”优选在栽培生殖质中产生，并因此直接以农学上有价值的品系存在。另一方面，“自然突变体”或“自发突变体”或“自然变体”或“自然等位基因变体/变异”基于见于物种中的自然变异(多态性/突变)，并因此很可能存在于农学质量较低、在现代农业中不栽培的植物材料，例如野生植物中。于是需要将后一类等位基因转入具有良好农学特征的栽培植物中，这是本发明的实施方案。

在世界范围内，干旱胁迫或脱水胁迫是植物必须应对的最严重的非生物胁迫之一。全世界十分之四的耕地位于干旱或半干旱地区。此外，在降水量相对高的地区种植的植物也可以在整个生长季节中经受多次干旱。许多农业地区具有低降雨量，依赖灌溉来保持产率和产品质量。赋予或增强作物植物对短期和长期干旱的耐受性和减少灌溉农业中种植的作物的水分需求无疑很重要。在经历短干旱期或较长干旱期的地区种植时，本文中提供的植物具有更低的灌溉需求和/或更高的产率和/或更高的百分比存活。

本发明的核酸序列和蛋白质

在本发明的一个实施方案中，提供SlPP2C1的核酸序列和氨基酸序列，以及用于在该物种(番茄)内或茄属(Solanum)内分离或鉴定其“变体”，例如等位基因变体，或其它植物物种，如其他蔬菜物种或大田作物物种的SlPP2C1直向同源物的方法。

野生型SlPP2C1蛋白质(源自番茄栽培种Moneymaker)显示于SEQID NO：2中。它是397个氨基酸的蛋白质，在约氨基酸84至391之间的C端区域中包含(假定的)丝氨酸/苏氨酸磷酸酶2C催化结构域。具体而言，该结构域包含氨基酸Asp-Xaa-Phe-Leu-Ile-Leu-Ala-Ser-Asp-Gly-Leu-Trp-Asp-Val(Xaa是任意氨基酸，但优选Glu，见SEQ ID NO：2的氨基酸307-320)。还存在从氨基酸147至149的(假定的)天冬氨酸锰/镁结合部位(DGH或Asp-Gly-His，其中Asp结合镁或锰)。备选地，包含氨基酸144至150，即GVXDGHG(其中X是任意氨基酸，优选Y)，或由氨基酸144至150组成的结构域可以涉及与蛋白激酶相互作用。

可以通过它们在全长范围内与SEQ ID NO：2的氨基酸序列同一性来定义“SlPP2C1蛋白质”(包括其“变体”，如由基因的等位基因变体或由基因的直向同源物编码的蛋白质)，即与SEQ ID NO：2具有至少约47％、48％、49％、50％或更多(如但不限于55％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多)序列同一性(如通过用Emboss“Needle”、Blossum 62矩阵、缺口开放罚分＝10、缺口延伸罚分＝0.5配对比对来测定)，且具有与SlPP2C1的体内功能基本上相似的体内功能的蛋白质。

本文中还包含其他地方所述的野生型SlPP2C1蛋白质(或其上文定义的变体)的功能丧失突变体或野生型SlPP2C1蛋白质(或其变体)的功能降低突变体，及包含一个或多个编码这类突变体的核苷酸，且与包含编码野生型蛋白质的核酸序列的植物相比具有增强的耐旱性的植物或植物部分。

优选地，本发明的SlPP2C1蛋白质在C端区域中还至少包含丝氨酸/苏氨酸磷酸酶催化结构域，即包含与SEQ ID NO：2的氨基酸84至391至少60％、70％、80％、90％、或优选至少95％、98％、99％或更多氨基酸序列同一性(如通过用Emboss“Needle”、Blossum 62矩阵、缺口开放罚分＝10、缺口延伸罚分＝0.5配对比对来测定)的结构域。在一个实施方案中，本发明的SlPP2C1蛋白质包含序列Asp-Xaa-Phe-Leu-Ile-Leu-Ala-Ser-Asp-Gly-Leu-Trp-Asp-Val(Xaa为任意氨基酸，优选Glu)或与此序列具有90％或95％或98％或更多序列同一性的序列(如通过用Emboss “Needle”、Blossum 62矩阵、缺口开放罚分＝10、缺口延伸罚分＝0.5配对比对来测定)。优选地，SlPP2C1蛋白质进一步包含至少一个DGH基序，即至少一个DGH序列或GVXDGHG序列(其中X是任意氨基酸，优选Y)。

“与SlPP2C1的功能基本相似的功能”在本文中指蛋白质在对干旱胁迫的敏感性/耐受性中和/或在决定植物组织的ABA敏感性中具有已证明的功能。至少在叶组织中过量表达SlPP2C1或其变体的植物显著比野生型植物更易受干旱胁迫影响和/或与对照(例如野生型植物或用空载体转化的植物)相比具有显著降低的ABA敏感性。反之，至少在叶组织中具有降低水平的全功能(野生型)SlPP2C1蛋白质或其变体的植物显著比野生型植物更不易受干旱胁迫影响和/或与对照相比具有显著增强的ABA敏感性。

因此，可以用多种已知的方法测试(假定的)SlPP2C1蛋白质的功能，优选通过将组成性表达所测试的蛋白质的转化体的表型与相同宿主物种(和变种)的过量表达SlPP2C1的转化体(优选包含稳定整合入宿主基因组中的嵌合SlPP2C1编码基因)的表型相比较，允许直接比较对转化体的表型的功能作用。

类似地，可以用其中SlPP2C1基因(或变体)沉默或下调(例如与野生型或对照转化体相比，SlPP2C1的mRNA至少在叶组织中显著减少)的转化体来测定功能。SlPP2C1转录物的mRNA的“显著减少”指靶mRNA以低于或等于见于野生型或对照转化体(例如空载体转化体)中的转录物水平的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或更少(10％、5％或0％)的水平存在。应理解，在任意转化实验中，通常由于基因组中的位置效应和/或由于拷贝数，观察到转化体表型的某种程度的变异。技术人员将知道如何将转化体相互比较，例如通过选择单拷贝数事件并分析它们的表型。测定或确认体内基因/蛋白质功能的其他方法包括产生敲除突变体或功能降低突变体或瞬时表达研究。启动子-报道基因表达研究也可以提供关于蛋白质的时空表达图示和作用的信息。

与野生型植物或对照转化体相比，SlPP2C1基因或编码其变体的基因的组成性(过量)表达应导致以下表型变化中的一种或多种：

-显著增加的对水分胁迫的敏感性(即显著减低的耐旱性)；和/或

-显著降低的ABA敏感性。

“显著增加的对水分胁迫的敏感性”或“显著降低的耐旱性”指与对照水平相比，包含SlPP2C1等位基因的多种植物的叶萎蔫症状平均统计上显著地增加至少10％，且可以例如按实施例中所述或用等同的实验来测试。简言之，在实验开始时，用水饱和相同年龄(例如成熟植物)的多种(例如至少10、15、20或更多转基因品系)转化植物和对照植物，然后在延长的时期，例如至少约7、8、9、10、11、12、13、14天或更多天数，例如3周或4周或更多周(取决于植物物种)内不浇水。对照植物开始显示叶萎蔫(“轻度萎蔫”或“中度萎蔫”)时，用例如目测评估针对叶萎蔫迹象，评估所有植物。可以例如在4-1的量表(scale)上对叶的萎蔫症状进行评分，“高度/严重萎蔫”(4)，“中度萎蔫”(3)，“轻度萎蔫”(2)，或“无萎蔫”(1)。如果与野生型(或空载体转化的)对照相比，(平均)萎蔫增加至少10％，优选至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，则称植物具有显著降低的耐旱性。备选地或此外，可以进行大田试验来测试和/或确认是否可在多次(spell)水分胁迫下在大田中观察到显著降低的耐旱性。

当然，可以使用其他测定。例如，可以在一段时间的水剥夺后跟随一段时间的恢复(浇水)，且可以评估植物存活的百分比，见例如Zheng等(2009，Biochemical and Biophysical Research Communications 379：986，LH Column)。如果与野生型(或空载体转化的)对照相比，百分比存活降低至少10％，优选至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，则称植物具有显著降低的耐旱性。还见Xiong等2006(PlantPhysiology 142：1065-1074)和Yu等2008(The Plant Cell 20：1134-1151)。

还可以通过测试一种或多种不同ABA浓度上的种子萌发百分比和/或一种或多种不同ABA浓度上的根伸长，按实施例中所述测试“显著降低的ABA敏感性”。概括而言，在相同的ABA浓度上，过量表达SlPP2C1的转化体在包含ABA的培养基上的种子萌发比对照种子高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或更多。例如，在1或3μM ABA上，50％的野生型种子萌发，而55％、60％或更多的转化(过量表达SlPP2C1)种子萌发。因此，过量表达转化体的种子萌发更少地受ABA抑制。过量表达转化体的根生长/伸长也更少地受ABA抑制。

与野生型植物或对照转化体相比，下调或沉默SlPP2C1基因或编码变体成员的基因应导致以下表型变化中的一种或多种：

-显著降低的对水分胁迫的敏感性(即显著增强的耐旱性)；和/或

-显著增强的ABA敏感性。

“显著降低的对水分胁迫的敏感性”或“显著增强的耐旱性”指与对照水平(例如野生型植物或空载体转化体)相比，其中SlPP2C1基因下调或沉默的多种植物的叶萎蔫症状平均统计上显著地减少至少10％，且可以例如按实施例中所述或用等同的实验来测试。简言之，在实验开始时，用水饱和相同年龄的多种转化植物(例如至少10、15、20或更多个转基因品系)和对照，然后在延长的时期，例如至少约7、8、9、10、11、12、13、14天或更多天数，例如3周或4周或更多周(取决于植物物种)内不浇水。对照植物开始显示叶萎蔫(“轻度萎蔫”或“中度萎蔫”)时，用例如目测评估针对叶萎蔫迹象评估所有植物。可以例如在1至4的量表上对叶萎蔫症状进行评分，“高度/严重萎蔫”(4)，“中度萎蔫”(3)，“轻度萎蔫”(2)，或“无萎蔫”(1)。如果与对照植物相比，(平均)萎蔫减少至少10％，优选至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，则称植物具有显著增强的耐旱性。备选地或此外，可以用大田试验来测定一个或多个内源SlPP2C1基因的下调或沉默是否赋予显著增强的耐旱性。

当然，可以使用其他测定。例如，可以在一段时间的水剥夺后跟随一段时间的恢复(浇水)，且可以评估植物存活的百分比，见例如Zheng等(2009，Biochemical and Biophysical Research Communications 379：986，LH Column)。如果与野生型(或空载体转化的)对照相比，百分比存活增强至少10％，优选至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，则称植物具有显著增强的耐旱性。还见Xiong等2006(PlantPhysiology 142：1065-1074)和Yu等2008(The Plant Cell 20：1134-1151)。

如将在下文中进一步描述，还可以用以上测定或等同的测定来测定包含突变体SlPP2C1等位基因(例如功能丧失或功能降低突变体)的植物是否具有显著增强的耐旱性。

还可以按实施例中所述测试“显著增强的ABA敏感性”。概括而言，在相同的ABA浓度上，SlPP2C1下调或沉默的转化体在包含ABA的培养基上的平均种子萌发比对照植物(例如野生型)低至少10％、20％、30％、40％、50％或更多。例如，在1或3μM ABA上，50％的野生型种子萌发，而少于40％、35％、30％或更少的转化(SlPP2C1沉默)种子萌发。因此，下调或沉默转化体的种子萌发更多地受ABA抑制。下调或沉默转化体的根生长也更多地受ABA抑制。

取决于例如植物物种，所使用的确切方法可以不同。用于在蔬菜物种或大田作物中测定耐旱性和/或ABA敏感性的测定为本领域已知。还应理解，存在备选方法来评估表型。这类方法在技术人员的知识范围之内。

可以用以上方法来测试任意假定的SlPP2C1基因，如来自野生或栽培番茄植物或来自番茄育种品系或PI(植物引种)品系或来自不同物种(例如烟草或其他蔬菜物种或来自大田作物物种)的等位基因是否确实是SlPP2C1变体，然后可以用该变体来产生与适宜的对照，如野生型植物相比具有(显著)增强的耐旱性的转基因和/或非转基因植物。应理解，就转基因植物而言，优选转化和再生具有良好农学特征的植物，即栽培植物(例如高产率栽培种或育种品系)，且最适宜的对照是相同品系的空载体转化体或像这样的非转化品系的多种植物。

此外，可以进行体外磷酸酶活性测定来测试蛋白质活性/功能性，见例如Gosti等1999，Plant Cell 11：1897-1910，Material and Methods-PP2CActivities，第1907页，其中在大肠杆菌(E.coli)中表达蛋白质，并用32P标记的酪蛋白作为底物来测定酶活性。这类活性测定还适合用于测定具体类型的突变体SlPP2C1蛋白质(例如通过TILLING或其他方法产生，见本文中其他地方)或嵌合蛋白质是否保留了全部或部分功能性。还见Bertauche等，1996，Eur.J.Biochem 241：磷酸酶测定见195页，大肠杆菌中的表达见194页。

如果突变体蛋白质去磷酸化³²P-酪蛋白的百分比等于或低于野生型蛋白质的70％(在相同的测定条件下，例如在存在20mM醋酸镁和存在冈田酸的情况下，1或2μg蛋白质在30℃下与³²P-酪蛋白孵育2小时)，优选等于或低于野生型蛋白质的约60％、50％、40％、30％、20％、10％(“功能降低”)或约0％(即完全的“功能丧失”)，则SlPP2C1蛋白质具有“减少的体外功能”。可以用具有减少的体外功能的蛋白质来推断该蛋白质也具有“减少的体内功能或无体内功能”，即在植物中(in planta)，例如至少在叶组织和/或果实组织中。例如，植物包含一个(纯合)或两个(杂合)编码具有减少的体外功能或无体外功能的突变体蛋白质的等位基因导致该植物具有显著增强的耐旱性(与缺乏突变体等位基因/具有野生型等位基因的植物相比)，并因此还具有减少的体内功能或无体内功能。通过突变体等位基因为纯合或杂合的植物的耐旱性测定(例如在大田中或按实施例中所述)来确认蛋白质的体内功能降低或功能丧失。

可以通过计算机模拟(in silico)来鉴定其他假定的SlPP2C1基因/蛋白质，例如通过在现有核酸或蛋白质数据库(例如GENBANK、SWISSPROT、TrEMBL)中鉴定核酸或蛋白质序列，并使用标准的序列分析软件，如序列相似性搜索工具(BLASTN、BLASTP、BLASTX、TBLAST、FASTA等)。选择、克隆或从头合成假定的包含或编码SlPP2C1蛋白质(如上文定义)的氨基酸序列或核酸序列，并通过例如在植物宿主中过量表达或沉默来测试体内功能性。应注意，命名SlPP2C1在本文中还用于源自番茄以外的物种的蛋白质，即前缀SI在本文中并非将蛋白质限制为来自特定物种。

番茄SlPP2C1基因和蛋白质的一种假定的直向同源物是SEQ ID NO：15的马铃薯蛋白质(StPP2C1)，其由SEQ ID NO：14的cDNA(StPP2C1)编码。StPP2C1蛋白质与SlPP2C1具有89.1％氨基酸序列同一性，与SlPP2C1具有91.5％核苷酸序列同一性(使用Emboss-Needle，缺口开放＝10.0、缺口延伸＝0.5，Blosum62用于蛋白质或dnafull用于核酸)。

本发明的SlPP2C1蛋白质可以从天然来源分离、通过化学合成从头合成(使用例如Applied Biosystems提供的肽合成仪)或通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌)产生。可以用本发明的SlPP2C1蛋白质来产生单克隆或多克隆抗体，其可以例如用来检测组织样品，如叶中的SlPP2C1蛋白质(免疫化学分析法和试剂盒)。

在一个实施方案中，提供功能降低或功能丧失的突变体SlPP2C1蛋白质，及包含一个或多个编码功能降低或功能丧失突变体的SlPP2C1等位基因的植物和植物部分。任意类型的突变都可以导致所编码的蛋白质的功能降低或功能丧失，例如cDNA(SEQ ID NO：1，或变体)中或对应的基因组SlPP2C1序列(SEQ ID NO：11，或变体)中插入、缺失或取代一个或多个核苷酸。“对应的基因组序列”是从其转录SEQ ID NO：1mRNA(DNA)或变体mRNA的内源DNA序列(SEQ ID NO：11中所示，或其变体)。转录为mRNA的野生型基因组区域包含核苷酸2591至5050，其包含5’UTR(SEQ ID NO：11的核苷酸2591-2675)、两个内含子和3’UTR(SEQ ID NO：11的核苷酸4976-5050)。可以按上文所述测试这类蛋白质的体外和/或体内功能。如下文进一步描述，可以例如用TILLING产生或用EcoTILLING鉴定包含编码这类突变体功能降低或功能丧失蛋白质的核酸序列，且具有增强的耐旱性的植物。

在本发明的一个实施方案中，编码这类突变体蛋白质的(cDNA或基因组)核酸序列包含一个或多个无义和/或错义突变，例如转换(用另一嘌呤取代嘌呤

或用另一嘧啶取代嘧啶

)或颠换(用嘧啶取代嘌呤，或反之

)。在一个实施方案中，该一个或多个无义和/或错义突变在编码C端区域的核苷酸序列中，优选在SEQ ID NO：2的氨基酸84至391的(假定的)催化结构域中(或变体SlPP2C1蛋白质中基本上类似的结构域中，即在包含与此结构域至少80％、90％、95％、98％、99％氨基酸同一性的结构域中)。在另一实施方案中，该一个或多个无义和/或错义突变在编码SEQ ID NO：2(或其变体)的氨基酸307-320的核酸序列中。在另一实施方案中，该一个或多个无义和/或错义突变在编码假定的镁结合部位，即Asp-Gly-His(SEQ ID NO：2或其变体的氨基酸147-149)的核酸序列中，和/或在编码假定的蛋白激酶相互作用结构域(SEQ ID NO：2的氨基酸144-150或变体SlPP2C1蛋白质中基本上类似的结构域)的核酸序列中。

在具体实施方案中，编码这类突变体蛋白质的核酸序列在SEQ ID NO：2的氨基酸Gly148、Ser171、Ala155、Gly132(或变体SlPP2C1蛋白质中的等同氨基酸)中包含一个或多个错义突变。本文中还涵盖包含一个或多个上述错义突变，且具有显著增强的胁迫耐受性，尤其是耐旱性的突变体植物、种子和植物部分。

在本发明的具体实施方案中，提供包含突变体功能丧失或功能降低SlPP2C1等位基因的耐旱植物，例如该突变体等位基因由此在编码GVXDGHG(X是任意氨基酸，优选Y)或基本相似的序列(包含与此结构域至少80％、90％、95％、98％、99％氨基酸同一性)的核苷酸序列中包含错义突变，导致至少一个氨基酸被取代，例如产生例如DVXDGHG或GVXDGHD或DVXDGHD或GVXDDHG。

可以通过在SlPP2C1蛋白质中缺失一个或多个结构域的全部或部分，或在结构域中引入一个或多个突变，并分析对SlPP2C1蛋白质功能产生的影响来分析具体结构域，如N端结构域或催化结构域或镁结合结构域和/或蛋白激酶相互作用结构域的功能。同样，可以针对包含突变的植物的突变和表型，尤其是耐旱性分析包含自发突变或诱发突变(例如通过TILLING产生或通过EcoTILLING鉴定)的植物。

在一个实施方案中，功能丧失或功能降低的SlPP2C1蛋白质是截短蛋白质，即上文进一步定义的SlPP2C1蛋白质(包括其变体)中的任一种的蛋白质片段。一般而言，EMS(甲基磺酸乙酯)诱导鸟嘌呤/胞嘧啶至腺嘌呤/胸腺嘧啶的取代。在谷氨酰胺(Gln或Q，由核苷酸CAA或CAG编码)或精氨酸(Arg或R，由核苷酸CGA编码)密码子的情况下，胸腺嘧啶取代胞嘧啶可以导致在阅读框内引入终止密码子(例如CAA/CAG/CGA至TAA/TAG/TGA)，产生截短蛋白质。截短蛋白质可以例如包含氨基酸1至SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：2的变体的起始密码子下游的Gln(由CAA或CAG编码)或Arg氨基酸(由CGA编码)中任一个。备选地，截短蛋白质可以例如包含SEQ ID NO：2的氨基酸1-5、1-1-20、1-28、1-33.1-35、1-36、1-40、1-43、1-44、1-46、1-48、1-49、1-5-.1-51、1-54、1-57、1-66、1-70、1-71、1-72、1-73、1-83或由其组成，或包含SlPP2C1(SEQ ID NO：2)或其变体的氨基酸1-85、1-88、1-91、1-93、1-94、1-97、1-104、1-106、1-110、1-1201-130、1-141、1-149、1-151、1-160、1-170、1-200、1-301、1-302、1-305、1-307或其他截短蛋白质或由其组成。

还提供编码SlPP2C1蛋白质，例如SEQ ID NO：2中所示的SlPP2C1或其上文定义的变体(包括所述的任意嵌合或杂合蛋白质或突变蛋白质或截短蛋白质)，或来自另一物种的任意SlPP2C1蛋白质的核酸序列(基因组DNA、cDNA、RNA)。由于遗传密码的简并性，多种核酸序列可以编码相同的氨基酸序列。编码SlPP2C1蛋白质(如上文定义，包括其变体)的任意核酸序列在本文中都称为SlPP2C1。所提供的核酸序列包含天然存在的核酸序列、人工核酸序列或合成核酸序列。SEQ ID NO：1(来自番茄的cDNA序列)和SEQ ID NO：11(来自番茄的编码野生型SlPP2C1蛋白质的基因组DNA)中提供了编码SlPP2C1的核酸序列。可以用常规方法，如使用基于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：11的特异性引物或简并引物的PCR来分离对应的基因组序列。

应理解，作为DNA序列显示序列时，同时也提到了RNA，除用尿嘧啶(U)取代胸腺嘧啶(T)的不同外，RNA分子的实际碱基序列相同。

还提供编码上文所述的突变体SlPP2C1蛋白质，即功能降低或功能丧失的SlPP2C1蛋白质的核酸序列(基因组DNA、cDNA、RNA)。例如，在野生型SlPP2C1编码序列中包含一个或多个无义和/或错义突变，使得所编码的蛋白质在体内和/或体外无功能或具有减少的功能的SlPP2C1核酸序列。还提供具有其他突变的序列，如剪接位点突变体，即基因组S1PP2C1序列中的突变导致前mRNA的异常剪接，和/或移码突变，和/或一个或多个核酸的插入和/或缺失。

还包含SlPP2C1核酸序列的变体和片段，如在所定义的严格杂交条件下杂交至SlPP2C1核酸序列，例如杂交至SEQ ID NO：1的核酸序列。SlPP2C1核酸序列的变体还包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：11(核苷酸2676-4975)具有至少50％或更多，优选至少55％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多序列同一性(如使用默认参数，即缺口产生罚分＝10、缺口延伸罚分＝0.5、评分矩阵nwsgapdna，通过Emboss“needle”测定)的核酸序列。显然，可以用许多方法来鉴定、合成或分离SlPP2C1核酸序列的变体或片段，如核酸杂交、PCR技术、计算机模拟分析和核酸合成等。SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：11(核苷酸2676-4975)的变体可以编码野生型功能性SlPP2C1蛋白质(例如来自其他番茄变种或育种品系或野生生殖质的等位基因，或来自番茄以外的其他物种的直向同源物)，或者它们可以编码这些中的任意种的例如通过诸如TILLING或EcoTILLING的方法或其他方法产生或鉴定的功能降低或功能丧失的突变体等位基因。

片段包含以上SlPP2C1核酸序列(或变体)中的任意种的部分，其可以例如用作引物或探针或用于基因沉默构建体中。部分可以是编码链(有义链)或互补链(反义链)的长度为至少约10、15、19、20、21、22、23、25、50、60、100、200、300、450、500、600、700、800、900或更多个核苷酸的连续序列(stretch)。因此，还包含SlPP2C1核酸序列的片段，长度为至少约20、30、40、50、60、100、150、200、300、450、500、600、700、800、900个核苷酸的片段由此包含与约相同长度的SlPP2C1核酸序列的另一片段至少50、60、70、75％，更优选至少80、90、95、98、99％或更多(100％)核酸序列同一性(如使用默认参数，即缺口产生罚分＝10、缺口延伸罚分＝0.5、评分矩阵nwsgapdna，用Emboss“needle”通过配对比对测定)。

可以用于从植物组织DNA样品PCR扩增SlPP2C1转录物(mRNA或对应的cDNA)的引物对例如显示于SEQ ID NO：3和4中，及SEQ IDNO：9和10的引物对中。这类引物对可以用来检测和定量植物组织中，例如番茄叶组织中的SlPP2C1表达。同样，可以基于SEQ ID NO：1或SEQID NO：11(核苷酸2676-4975)设计其他特异性引物或简并引物，并用来从其他番茄品系或从其他物种扩增SlPP2C1的变体等位基因。

一旦产生和/或鉴定(例如通过TILLING或EcoTILLING)了具体的突变体SlPP2C1等位基因，还可以设计对该突变体等位基因特异的引物或探针，并可以研发检测该突变体等位基因在植物或植物组织中的存在和/或缺乏的测定(使用等位基因特异的检测测定)。可以研发用于检测和/或转移突变体等位基因的分子标记测定(例如通过MAS，标记辅助选择)。例如，可以研发SNP检测测定或CAPS标记，其检测突变体SlPP2C1核酸序列在植物DNA中的存在和/或可以用来将等位基因转入其他植物。

在一个实施方案中，提供突变体核酸序列，SlPP2C1核酸序列由此包含一个或多个突变，该突变导致SlPP2C1蛋白质的功能丧失突变体或SlPP2C1蛋白质的功能降低突变体。将在本文中其他地方更详细地描述本发明的此方面。

还可以鉴定或产生(例如通过同源重组，或通过插入、缺失或取代一个或多个核苷酸等)这样的植物，其在一个或多个SlPP2C1调节区，例如启动子中具有一个或多个突变，该植物中的SlPP2C1基因表达，即(SEQID NO：1或变体的)mRNA水平由此与野生型相比显著降低，且该植物由此具有显著增强的耐旱性。

可以将编码本发明的SlPP2C1蛋白质的上述核酸序列或其片段，尤其是DNA序列(或这些的变体)插入表达载体中(在共抑制方法中)或基因沉默载体中来产生耐旱植物。

在本发明的一个实施方案中，通过例如其他地方所述的RNAi方法下调宿主细胞、植物或一种或多种具体组织中的SlPP2C1基因表达。

在另一实施方案中，提供包含一个或多个突变体SlPP2C1等位基因的植物，与缺乏该一个或多个突变体等位基因的植物相比，该一个或多个突变由此赋予植物增强的耐旱性。优选通过诱变植物或种子，并通过鉴定在一个或多个靶PP2C1等位基因中包含一个或多个突变，该突变由此导致转录或翻译的废止(使得不产生SlPP2C1蛋白质)或导致功能降低或功能丧失的SlPP2C1蛋白质的翻译的那些植物或种子来产生突变体等位基因。功能性野生型SlPP2C1蛋白质至少在叶组织中的减少赋予植物、植物部分或种子增强的耐旱性。

在本发明的另一实施方案中，提供用于检测SlPP2C1 DNA序列的PCR引物和/或探针和试剂盒。可以按本领域已知(见Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR Primer：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press；和McPherson等(2000)PCR-Basics：From Backgroundto Bench，第一版，Springer Verlag，德国)，基于SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：11(例如基于核苷酸2676-4975或2591-5050)合成从样品扩增SlPP2C1DNA的简并PCR引物对或特异性PCR引物对。同样，可以用SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：11(或其变体)的DNA片段作为杂交探针。SlPP2C1检测试剂盒可以包含SlPP2C1特异性引物和/或SlPP2C1特异性探针，及用该引物或探针来检测样品中的SlPP2C1 DNA的相关流程。这种检测试剂盒可以例如用来测定是否已用本发明的SlPP2C1基因(或其部分)转化了植物或植物是否包含一个或多个突变体SlPP2C1等位基因。由于遗传密码的简并性，可以用其他密码子取代一些氨基酸密码子而不改变蛋白质的氨基酸序列。

在另一实施方案中，提供特异性结合本发明的SlPP2C1蛋白质或突变体SlPP2C1蛋白质的抗体。具体而言，本文中涵盖结合SlPP2C1或其片段或变体(例如突变体蛋白质)的单克隆或多克隆抗体。可以使用本领域中已知，例如Harlow和Lane“Using Antibodies：A laboratorymanual”(New York：Cold Spring Harbor Press 1998)中及Liddell和Cryer“A Practical Guide to Monoclonal Antibodies”(Wiley和Sons，1991)中所述的方法，用本发明的SlPP2C1蛋白质作为抗原在动物中制备抗体。随后可以用抗体来分离、鉴定、表征或纯化它结合的SlPP2C1蛋白质，例如以检测允许形成免疫复合物并通过例如ELISA(酶联免疫测定)或免疫印迹分析检测免疫复合物的存在的样品中的SlPP2C1蛋白质。还提供用于检测所提供的样品中的SlPP2C1蛋白质、蛋白质片段或表位的免疫学试剂盒。样品可以是细胞、细胞上清、细胞悬液、组织等。这种试剂盒至少包含结合SlPP2C1蛋白质的抗体和一种或多种免疫检测试剂。还可以例如通过ELISA或Western印迹用抗体来分离/鉴定其他SlPP2C1蛋白质。

显然，可以用许多方法来鉴定、合成或分离SlPP2C1核酸序列的变体或片段，如核酸杂交、PCR技术、计算机模拟分析和核酸合成等。因此，SlPP2C1蛋白质编码核酸序列可以是化学合成的序列或从任意植物物种克隆的序列。

转基因耐旱植物

提供转基因植物、种子和植物部分，其中优选至少在叶组织或气生组织中沉默SlPP2C1，且与野生型(非转基因)对照植物或其他对照植物(例如空载体转化体)相比，其具有增强的耐旱性。

在本发明的一个实施方案中，用同源或异源核酸序列来沉默待转化的宿主物种的一个或多个内源SlPP2C1基因。例如，可以用马铃薯SlPP2C1基因，如SEQ ID NO：14的StPP2C1(或其变体或片段)来沉默转基因番茄或茄子植物中的SlPP2C1基因表达。备选地，可以使用同源SlPP2C1核酸序列。例如，将源自特定植物物种(例如源自番茄)的序列重新引入该物种(番茄)中。因此，在一个实施方案中，SlPP2C1 DNA对应于转化中用作宿主物种的物种的内源SlPP2C1 DNA，或是其修饰/变体。因此，优选用番茄SlPP2C1 cDNA或基因组DNA(或其变体或片段)来转化番茄植物。此外(由于法规批准和公众接受的原因)，可以将同源或异源核酸序列有效连接至转录调节序列，尤其是启动子，其也源自植物物种或甚至源自待转化的相同植物。

为了产生包含表达时导致沉默内源SlPP2C1基因或基因家族的表达的嵌合基因，可以使用本领域已知的方法。

“基因沉默”指在宿主细胞或组织中下调或完全抑制一个或多个靶基因，例如SlPP2C1基因的基因表达。应理解，在任意转化实验中，由于基因组中的位置效应和/或由于拷贝数，通常在转化体的表型中观察到某种程度的表型变异。一般而言，在本文中区分“弱”和“强”基因沉默植物(其全都是本发明的实施方案)，其中“弱”基因沉默(RNAi)事件指与对照组织相比，其中内源靶基因表达减少约15、20或30％的植物或植物部分，而“强”基因沉默(RNAi)事件指与对照组织(例如野生型)相比，其中内源靶基因表达减少至少约50、60、70、80、90％或更多的植物或植物部分。可以例如通过定量靶基因的转录物水平(例如使用定量RT-PCR)和/或通过测定和可选地定量靶SlPP2C1蛋白质的酶活性和/或通过评估和可选地定量产生的表型(增强的耐旱性和/或增强的ABA敏感性)来定量沉默。

不限制本发明的范围，可以选择具有最适沉默水平的植物，使得产生的植物在它们在大田中暴露的气候条件下具有显著增强的耐旱性，同时与对照相比具有最小的副作用，如减少的产率、减少的果实数等。优选地，耐旱植物中存活和/或产率增加。

本领域中已良好地建立了抑制性RNA减少或废止基因表达的用途，且其是几篇综述的主题(例如Baulcombe 1996，Plant Cell 8(2)：179-188；Depicker和Van Montagu，1997，Curr Opin Cell Biol.9(3)：373-82)。存在许多可获得的技术来在植物中达到基因沉默，如产生全部或部分靶基因的反义RNA(见例如EP 0140308 B1、EP 0240208 B1和EP 0223399 B1)，或产生靶基因的有义RNA(也称为“共抑制”，见EP 0465572 B1)的嵌合基因。

但是，迄今最成功的方法产生靶基因的有义和反义RNA二者(“反相重复序列”)，其在细胞中形成双链RNA(dsRNA)或茎-环结构(发夹RNA，hpRNA)，并在从上游启动子转录时沉默一个或多个靶基因。EP 1068311、EP 983370 A1、EP 1042462 A1、EP 1071762 A1和EP 1080208 A1中描述了用于dsRNA和hpRNA产生及基因沉默的方法和载体。

因此，用于植物转化的嵌合基因可以包含在植物细胞中具有活性的转录调节区，其与SLPP2C1靶基因或基因家族的有义和/或反义DNA片段(或完整的核酸序列)有效连接，或与SLPP2C1靶基因或基因家族互补或基本相似。

一般而言，靶基因序列的短的(有义和反义)一段序列，如靶基因的编码和/或非编码序列的17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个核苷酸是足够的。还可以使用更长的序列，如至少约50、100、200、250、500、1000或更多个核苷酸。甚至可以用对应于完整的转录物RNA或mRNA或与完整的转录物RNA或mRNA互补的DNA来产生有义和/或反义构建体。优选地，用间隔区序列，如内含子将有义和反义片段/序列分开，其在dsRNA形成时形成环(或发夹)。

一般而言，可以靶向任意SlPP2C1基因或基因家族。例如，可以通过选择它们的对这些等位基因特异的初级转录物或mRNA转录物的核酸区来沉默一个或几个特异性SlPP2C1等位基因(以器官特异的方式进行等位基因特异性沉默，参见Byzova等Plant 2004 218：379-387)。类似地，通过选择转录物的一个或多个保守区来产生沉默构建体，可以靶向整个基因家族进行沉默。如上文所述，以有义和/或反义取向使用的DNA区无需是编码区的部分，而是还可以对应于初级转录物(包含5’和3’非翻译序列及内含子，如SEQ ID NO：11的核苷酸2591-5050中所示)的部分或mRNA转录物(其中已去除了任意内含子和添加了聚腺苷酸尾)的部分，或与上述初级转录物的部分或mRNA转录物的部分互补。应理解，在对应于RNA序列的DNA序列中，T取代了U。还应注意，在宿主细胞中转录时转录出靶向能够沉默SlPP2C1基因表达的dsRNA或hpRNA的嵌合基因中，有义和反义区无需具有相等的长度，且一个区域可以比其他区域长。

因此，可以用例如上文所述的SEQ ID NO：1或其变体、或这些中的任意片段、或SEQ ID NO：1的基因组序列或初级转录物序列(如SEQ IDNO：11的核苷酸2591至5050中所示)来产生SlPP2C1基因沉默基因和载体，及其中在全部或一些组织或器官中，或在诱导时沉默一个或多个SlPP2C1基因的转基因植物(见例如Wielopolska等Plant Biotechnol J.2005 6：583-90)。产生发夹构建体的常规方式将使用通用载体，如基于

技术的pHANNIBAL、pHELLSGATE、pSTARGATE载体(见Wesley等2004，Methods Mol Biol.265：117-30；Wesley等2003，MethodsMol Biol.236：273-86；和Helliwell & Waterhouse 2003，Methods30(4)：289-95)，其在此引用作为参考。其他基因沉默载体，如诱导型沉默载体和用于沉默多个靶基因的载体，及可以用来找到用于沉默靶基因的最佳序列的程序MatchPoint还见http://www.pi.csiro.au/rnai/。

通过选择保守核酸序列，可以沉默宿主植物中的所有SlPP2C1基因家族成员。沉默宿主植物的所有家族成员是具体实施方案。

在一个实施方案中，与有义和/或反义核酸序列有效连接(来产生嵌合沉默/RNAi基因)的启动子选自组成型启动子、诱导型启动子(例如胁迫诱导型、光诱导型、化学诱导型等)、激素诱导型启动子(例如乙烯或ABA诱导型等)、叶特异性启动子或在气生组织中具有活性的启动子。本文中还涵盖早期脱水反应启动子，如RD2，以及其他胁迫诱导型启动子，如RD29(Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki 1993，Mol Gen Genet 236：331-340)。

在某些实施方案中，果实特异性启动子可以是适宜的。还可以将SlPP2C基因自身的启动子用于沉默方法。来自番茄的启动子包含于SEQID NO：11的核苷酸1-2675中，尤其是，启动子包含SEQ ID NO：11的位置2676-2679的ATG翻译起始密码子上游的约2000个核苷酸或其功能片段(例如ATG上游1500bp、1000bp或更少)，或由其组成。可选地，可以将3’UTR有效连接至嵌合基因的3’端，使得有效连接的DNA元件包含启动子-SlPP2C1 RNAi基因-3’UTR。

优选的组成型启动子包含：分离群CM 1841的花椰菜花叶病毒(CaMV)强组成型35S启动子或增强型35S启动子(“35S启动子”)(Gardner等，1981，Nucleic Acids Research 9，2871-2887)；CabbB-S(Franck等，1980，Cell 21，285-294)和CabbB-JI(Hull和Howell，1987，Virology 86，482-493)；Odell等(1985，Nature 313，810-812)或US5164316中所述的35S启动子；来自泛素家族的启动子(例如Christensen等，1992，Plant Mol.Biol.18，675-689、EP 0 342 926的玉米泛素启动子，还见Cornejo等1993，Plant Mol.Biol.23，567-581)；gos2启动子(de Pater等，1992PlantJ.2，834-844)；emu启动子(Last等，1990，Theor.Appl.Genet.81，581-588)；拟南芥属肌动蛋白启动子，如An等(1996，Plant J.10，107.)所述的启动子；稻肌动蛋白启动子，如Zhang等(1991，The Plant Cell 3，1155-1165)所述的启动子和US 5,641,876中所述的启动子或WO070067中所述的稻肌动蛋白2启动子；木薯叶脉花叶病毒的启动子(WO 97/48819；Verdaguer等1998，Plant Mol.Biol.37，1055-1067)；来自地下三叶草矮化病毒的pPLEX系列启动子(WO 96/06932，尤其是S7启动子)；醇脱氢酶启动子，例如pAdh1S(GenBank检索号X04049、X00581)；分别驱动T-DNA的1′和2′基因表达的TR1′启动子和TR2′启动子(分别为“TR1′promoter”和“TR2′promoter”)(Velten等，1984，EMBO J 3，2723-2730)；US6051753中和EP426641中所述的玄参花叶病毒启动子；组蛋白基因启动子，如来自拟南芥属的Ph4a748启动子(PMB 8：179-191)；或其他。

备选地，可以利用不是组成型，而是对植物的一种或多种组织或器官特异的启动子(组织优选/组织特异性启动子，包括发育调节启动子)。例如，可以使用在叶组织或气生植物部分中具有活性的启动子，或表皮特异性启动子或保卫细胞特异性启动子。

表皮特异性启动子，例如拟南芥属LTP1启动子(Thoma等，1994，PlantPhysiol.105(1)：35-45)、CER1启动子(Aarts等1995.Plant Cell.7：2115-27)和CER6启动子(Hooker等2002，Plant Physiol 129：1568-80)及直向同源的番茄LeCER6(Vogg等，2004，J.Exp Bot.55：1401-10)，在以上地下表皮表面中提供特异性表达。

叶或光合组织特异性启动子也是适宜的，如来自拟南芥属(如US5034322中所述)或来自向日葵、来自豌豆(US 5254799)或来自玉米(Zea mays)的光诱导型核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基启动子(Pssu)；番茄的茎和叶特异性ST-LS1启动子(Stockhaus等1987，Nucleic AcidsRes.15(8)：3479-91)；叶绿素a/b结合蛋白(CAB)的启动子。

可以使用保卫细胞特异性启动子，如DGP1启动子(Li等，Sci China CLife Sci.2005 48(2)：181-6)，或干旱胁迫诱导型启动子，如RD29(Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki 1993，上文)，其在水分缺乏期间在蔬菜植物的几乎所有器官和组织中具有活性。

技术人员可以容易地针对它们的特异性和在本发明的方法中的适合性测试多种启动子。此外，可以通过缺失、添加或取代启动子序列的部分来修饰启动子的特异性。可以将这类修饰启动子有效连接至报道基因，以测试它们在转基因植物中的时空活性。

另一备选方案是使用其表达可诱导的启动子。诱导型启动子的实例是化学诱导型启动子，如Aoyama和Chua(1997，Plant Journal 11：605-612)和US6063985中所述的地塞米松，或通过四环素(TOPFREE或TOP 10启动子，见Gatz，1997，Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol.48：89-108；和Love等2000，Plant J.21：579-88)。其他诱导型启动子例如可通过温度变化诱导，如US 5,447,858中所述的热休克启动子，可通过缺氧条件诱导(例如玉米ADH1S启动子)，可通过光诱导(US6455760)，可通过病原体诱导(例如EP759085或EP309862)，或通过衰老诱导(SAG12和SAG13，见US5689042)或通过干旱诱导(见上文)。显然，存在一系列其他可获得的启动子。其他诱导型启动子的实例是可通过低氧胁迫或冷胁迫诱导的Adh1启动子、可通过热胁迫诱导的Hsp70启动子和可通过光诱导的PPDK启动子。一种优选的启动子是Ait-ali等(2001，Plant Biotechnology Journal1，337-343)中所述的乙醇诱导型启动子系统，其中乙醇处理激活alcR，alcR转而诱导alc:35S启动子的表达。还见Deveaux等(2003，The ethanolswitch：a tool for tissue-specific gene induction during plant development.Plant J.36，918-930)。

可选地，启动子-SlPP2C1 RNAi基因可以进一步包含3′端转录调节信号(“3’端”或“3’UTR”)(即转录物形成和多腺苷酸化信号)。多腺苷酸化信号和转录物形成信号包含胭脂氨酸合成酶基因(“3’nos”)(Depicker等，1982J.Molec.Appl.Genetics 1，561-573)、章鱼碱合酶基因(“3’ocs”)(Gielen等，1984，EMBO J 3，835-845)和T-DNA基因7(“3’基因7”)(Velten和Schell，1985，Nucleic Acids Research 13，6981-6998)的那些，其在转化植物细胞中作为3′非翻译DNA序列等。

可以以常规方式将嵌合SlPP2C1沉默基因(即启动子有效连接至在植物细胞中转录时能够沉默内源SlPP2C1基因表达的核酸序列)稳定插入单个植物细胞的核基因组中，且可以以常规方式用这样转化的植物细胞产生由于SlPP2C1在某个时间点在某些细胞中的沉默而具有改变的表型的转化植物。在此方面，可以将包含与有义和/或反义SlPP2C1序列(和可选的3’UTR)有效连接的启动子的T-DNA载体引入根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中，并用来转化植物细胞，然后可以用描述于例如EP 0 116 718、EP 0 270 822、PCT公开WO84/02913和公开的欧洲专利申请EP 0 242 246中及Gould等(1991，Plant Physiol.95，426-434)中的方法从转化的植物细胞再生转化植物。用于土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的植物转化的T-DNA载体的构建为本领域公知。T-DNA载体可以是EP 0 120 561和EP 0 120 515中所述的二元载体，或EP 0 116 718中所述的可以通过同源重组整合入农杆菌属Ti质粒中的共整合载体。

优选的T-DNA载体各包含T-DNA边缘序列之间，或至少定位在右边缘序列左侧的与SlPP2C1沉默基因有效连接的启动子。边缘序列描述于Gielen等(1984，EMBO J 3，835-845)中。当然，可以使用诸如直接基因转移(描述于例如EP 0 223 247中)、花粉介导的转化(描述于例如EP 0 270356和WO85/01856中)、描述于例如US 4,684,611中的原生质体转化、植物RNA病毒介导的转化(描述于例如EP 0 067 553和US 4,407,956中)、脂质体介导的转化(描述于例如US 4,536,475中)的方法，及其他方法，如针对转化某些品系的玉米(例如US 6,140,553；Fromm等，1990，Bio/Technology 8，833-839；Gordon-Kamm等，1990，The Plant Cell 2，603-618)和稻(Shimamoto等，1989，Nature 338，274-276；Datta等1990，Bio/Technology 8，736-740)描述的那些方法，及广泛用于转化单子叶植物的方法(PCT公开WO92/09696)，用其他类型的载体来转化植物细胞。对于棉花转化，还可参见WO 00/71733，对于稻转化，还可参见W092/09696、W094/00977和W095/06722中描述的方法。对于高粱转化，还可参见Jeoung JM等，2002，Hereditas 137：20-8或Zhao ZY等，2000，Plant Mol Biol.44：789-98)。对于番茄或烟草转化，还可参见An G.等，1986，Plant Physiol.81：301-305；Horsch R.B.等，1988，在Plant MolecularBiology Manual A5，Dordrecht，Netherlands，Kluwer Academic Publishers.1-9页中；Koornneef M.等，1986，在Nevins D.J.和R.A.Jones编辑TomatoBiotechnology，New York，NY，USA，Alan R.Liss，Inc.169-178页中。对于马铃薯转化，参见例如Sherman和Bevan(1988，Plant Cell Rep.7：13-16)。还可以按照De Jong等(2008)Plant Journal 57：160-170和Sun等(2006)Plant Cell Physiol.47：426-431进行番茄转化和再生。

同样，从转化细胞选择和再生转化植物为本领域公知。显然，对于不同物种和甚至对于单个物种的不同变种或栽培种，具体地修改流程来以高频率再生转化体。

除核基因组的转化外，质体基因组，优选叶绿体基因组的转化也包含于本发明。质体基因组转化的一个优势是可以降低一个或多个转基因的传播风险。可以按本领域已知进行质体基因组转化，见例如Sidorov VA等1999，Plant J.19：209-216或Lutz KA等2004，Plant J.37(6)：906-13。

任意植物都可以是适宜的宿主，如单子叶植物或双子叶植物，但最优选将从耐旱受益的植物，如但不限于番茄、辣椒、黄瓜、茄子、莴苣、朝鲜蓟、韭葱、甜瓜、西瓜、胡萝卜、芸苔属(甘蓝(B.oleracea)、油菜(B.napus)、芥菜(B.juncea))、洋葱、野莴苣(lamb’s lettuce)、朝鲜蓟、马铃薯、菠菜、葡萄、豌豆、豆、大豆等。

优选的宿主属于茄科(Solanaceae)，如茄属的物种，例如番茄(S.lycopersicum)、树番茄(S.betaceum、syn.Cyphomandra betaceae)和其他茄属物种，如茄子(aubergine)/茄子(eggplant)(Solanum melongena)、马铃薯(Solanum tuberosum)、茄瓜(S.muricatum)、无柄花茄(S.sessiliflorum)和基多茄(S.quitoense)。茄科还包含辣椒(辣椒(Capsicumannuum)、小米椒(Capsicum frutescens))。

在优选实施方案中，宿主属于茄科。在更优选的实施方案中，宿主属于茄属。在甚至更优选的实施方案中，宿主属于物种番茄。优选地，宿主是物种番茄的栽培番茄，即产生高产率的品系或变种，如至少50g平均鲜重或更多，例如至少约80g、90g、100g、200g、300g或甚至高达600g(大番茄型)的果实。还涵盖小的类型，如樱桃番茄或鸡尾酒番茄，以及全果肉番茄，如Nunhems变种Intense，例如种皮(seed cavities)中缺乏凝胶。宿主番茄植物可以是定型的(determinate)或不定型的，具有多种果实大小和形状，如Roma型、簇型、圆形。它可以是加工型番茄或新鲜上市型。本文中还涵盖开放传粉种和杂种二者。在一个实施方案中，耐旱番茄植物是从F1杂种种子长出的F1杂种植物。为了产生本发明的转基因植物的F1杂种种子，可以产生各在其基因组中包含一拷贝转基因的近交亲本系。在使这些植物异花受精时，收集F1种子，其由于转基因而产生具有高产率和耐旱性的转基因F1杂种植物。

本文中针对“宿主”植物描述的实施方案也适用于本文中其他地方所述的非转基因突变体植物，其由此内源地存在突变体SlPP2C1等位基因，而不是转基因。

其他适宜的宿主是其他蔬菜物种和多种具有肉果的物种(葡萄、桃子、李子、草莓、芒果、木瓜等)。葫芦科(Cucurbitaceae)，如甜瓜(西瓜(Citrulluslanatus)、香瓜(Cucumis melo))和黄瓜(Cucumis sativus)及倭瓜和西葫芦(南瓜属(Cucurbita))也是适宜的宿主。蔷薇科(Rosaceae)也是适宜的宿主，如苹果、梨、李子等。

本发明还提供具有增强的耐旱性的大田作物。例如玉米(maize)/玉米(corn)(玉蜀黍属(Zea)物种，例如玉米、Z.diploperennis(chapule)、Zea luxurians(Guatemalan teosinte)、Zea mays subsp.huehuetenangensis(San Antonio Huista teosinte)、Z.mays subsp.mexicana(Mexicanteosinte)、Z.mays subsp.parviglumis(Balsas teosinte)、Z.perennis(perennial teosinte)和Z.ramosa)、小麦(小麦属(Triticum)物种)、大麦(例如大麦(Hordeum vulgare))、燕麦(例如燕麦(Avena sativa))、高粱(Sorghum bicolor)、黑麦(Secale cereale)、大豆(大豆属物种(Glycinespp.)，例如大豆(G.max))、棉花(棉属(Gossypium)物种，例如陆地棉(G.hirsutum)、海岛棉(G.barbadense))、芸苔属物种(Brassica spp.)(例如油菜、芥菜、甘蓝、芜菁(B.rapa)等)、向日葵(Helianthus annus)、烟草(烟草属(Nicotiana)物种)、苜蓿(Medicago sativa)、稻(稻属(Oryza)物种，例如稻(O.sativa)印度栽培种或日本栽培种)、饲草、珍珠粟(狼尾草属物种(Pennisetum spp.)，例如珍珠狼尾草(P.glaucum))。

其他宿主包含观赏物种(例如蔷薇属(Rose)、矮牵牛属(Petunia)、菊属(Chrysanthemum)、百合属(Lily)、大丁草属(Gerbera)物种)；木本树(例如杨属(Populus)、柳属(Salix)、栎属(Quercus)、桉属(Eucalyptus)的物种)；纤维物种，例如棉花、亚麻(Linum usitatissimum)和大麻(Cannabis sativa)。

一般而言，任意作物植物物种都是适宜的。作物植物或栽培植物在本文中指由人类栽培和培育的植物物种，并排除了杂草，如拟南芥或野生亲缘品种，如番茄亲缘品种Solanum pennellii、Solanum chilense、Solanumchmielewskii、Solanum habrochaites、Solanum pimpinellifolium等(虽然突变体SlPP2C1等位基因可以源自这类植物并通过育种方法转入栽培番茄中，见下文)。可以为了食物目的(例如蔬菜作物或大田作物)或为了观赏目的(例如生产用于扦插的花、用于草坪的草等)而栽培作物植物。本文中定义的作物植物还包含从其收获非食物产物，如燃料用油、塑料聚合物、药物产物、软木、纤维等的植物。

因此，在本发明的一个实施方案中，转基因植物包含与核酸分子有效连接的转录调节元件(尤其是上文所述的启动子)，该核酸分子转录时能够在宿主细胞中沉默内源SlPP2C1基因表达。

优选用于将SlPP2C1沉默基因稳定引入宿主细胞基因组中的嵌合基因和载体的构建一般为本领域已知。为了产生嵌合基因，用标准分子生物学技术将有义和/或反义SlPP2C序列有效连接至适合用于在宿主细胞中表达的启动子序列。启动子序列可以已经存在于载体中，以便简单地在启动子序列下游将核酸序列插入载体中。然后用载体转化宿主细胞，将嵌合基因插入核基因组中或插入质体、线粒体或叶绿体基因组中，并用适宜的启动子在此处表达(例如Mc Bride等，1995 Bio/Technology 13，362；US 5,693,507)。

可以将产生的转化植物用于常规植物育种方案，以产生具有相同特征的更多转化植物，或将基因部分引入相同或相关的植物物种的其他变种中。可以选择“原种事件”，其是使转基因插入基因组中特定位置的转化事件，其导致所希望的表型(例如最适沉默和耐旱性)的良好表达。

在本发明的一个实施方案中，希望通过在至少这类组织中过量表达SlPP2C1来增强水分丧失，即降低特定组织的耐旱性和/或降低特定组织，例如果实的ABA敏感性。例如，为了获得具有增加的水分丧失，并因此具有更结实的果肉和/或增强的味道的果实(例如番茄)，与编码功能性SlPP2C蛋白质(SEQ ID NO：2或其变体)的核酸序列有效连接的果实特异性启动子或果实优选启动子是适宜的。为了赋予果实表达，可以使用番茄果实和果皮特异性启动子，例如β-半乳糖苷酶II(Smith等，1998，PlantPhysiol 117：417-23)或番茄上表皮蜡启动子LeCER6(Vogg等，2004，上文)。或者本领域技术人员可以用微阵列鉴定和分离果皮或表皮启动子，并通过转化启动子报告基因融合来确认。这类启动子还可以用于特定组织，如果实中的SlPP2C1沉默。

其中SlPP2C1沉默的转基因植物或其部分具有显著增强的耐旱性。本文中用显著增强的耐旱性(如上文所述)来指转化体(与野生型或对照转化体相比)耐受上文定义的一个或多个干旱期(例如在对照植物中导致可见的叶萎蔫症状的水剥夺/缺乏)的增强的能力。优选地，随后植物能够恢复，从而导致减少的总体产率损失，因为每平方米更多的植物存活和/或存活植物的产率未显著降低。

可以按上文所述或使用等同的方法，在受控的环境(温室或生长室)中评估显著增强的耐旱性。例如，备选方法如下：将每个转化事件的至少约10个转化体和至少10株对照植物放入不对它们进行浇水的环境中多种时期(从几小时到1-4周或更多)，直至在对照植物上引起叶萎蔫或膨压(turgor)丧失，随后再次对植物进行浇水例如至少1周、2周或更长时间，同时分析它们的恢复表型。具有增强的耐旱性的转化体在不浇水的情况下比相同条件下的对照转化体(例如用空载体转化)或野生型植物存活长至少2、3、4、5、6、7天，优选至少2-5天，且对照转化体或野生型植物显示不可逆的组织损伤。备选地，可以在某个时间点计算％存活，耐旱植物由此具有比对照的％存活高至少10％、20％、30％或更多的％存活。还可以用此备选方法来测定突变体植物(即包含一个或多个突变体SlPP2C1等位基因的非转基因植物)是否具有显著增强的耐旱性。应理解，在针对它们的表型分析突变体植物时，对照植物优选是该突变体的近等基因系，其包含一个或多个野生型等位基因。取决于植物物种，水剥夺/胁迫期和恢复期可以不同。例如，在稻中，水分胁迫9.5小时后恢复(浇水)10天适合用于测定植物品系或转化事件与对照相比是否具有增强的耐旱性，因为耐旱品系中百分比存活显著增加(见例如Zheng等Biochemicaland Biophysical Research Communications 2009，985-989)。

最后，用大田试验来显示转化体(或下文进一步描述的突变体植物)与野生型植物相比具有显著增强的耐旱性。

如已述，可以通过例如分析拷贝数(Southern印迹分析)、mRNA转录物水平(例如使用SlPP2C1引物对的RT-PCR)或通过分析SlPP2C1蛋白质在多种组织中的存在和/或水平(例如SDS-PAGE、ELISA测定等)来选择具有最适沉默水平的转化体。然后用最适转基因事件进行进一步的杂交/回交/自交，直至获得具有稳定转基因的高表现原种事件。在一个实施方案中，尤其提供源自这类植物的转基因种子，其可以作为“耐旱”种子出售。

本发明的表达一个或多个SlPP2C1基因的转化体还可以包含其他转基因，如赋予耐旱性或赋予对其他生物或非生物胁迫的耐受性的其他基因。为了获得这类具有“累积”转基因的植物，可以使其他转基因渐渗入SlPP2C1转化体，或者随后可以用一个或多个其他基因转化转化体，或者备选地，可以用几个嵌合基因来转化植物品系或变种。例如，几个嵌合基因可以存在于单个载体上，或者可以存在于共转化的不同载体上。

在一个实施方案中，将以下基因与本发明的SlPP2C1沉默组合：编码其他AP2/EREBP型转录因子的基因，优选在植物对环境胁迫的应答中发挥作用的基因，例如来自拟南芥属的CBF1、CBF2、CBF3和/或CBF4编码基因(Jaglo-Ottosen等1998，Science 280，104-106，1998；Kasuga等1999 Nat.Biotechnol.17，287-291)或其来自其他物种的直向同源物(Dubouzet等2003，Plant J.33：751)；昆虫抗性基因，如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒素基因(编码杀虫蛋白质，如cry基因、vip基因等，可获得的基因的列表见http://www.biols.susx.ac.uk/home/)；真菌抗性基因；除草剂抗性基因；或其他基因。

因此，累积转化体可以对例如盐度、冷胁迫、昆虫抗性、病原体抗性、热胁迫、水分胁迫等具有甚至更宽的环境胁迫耐受性。

上文所述的转化植物中的任意种的整株植物、种子、细胞、组织和后代(如F1、F2种子/植物等)都包含于本文中，且可以例如通过PCR分析，通过转基因在DNA中的存在来鉴定。还可以研发“事件特异性”PCR诊断方法，其中PCR引物基于所插入的嵌合基因侧翼的植物DNA，见US6563026。类似地，可以研发事件特异性AFLP指纹或RFLP指纹，其鉴定转基因植物或从其衍生的任意植物、种子、组织或细胞。

应理解，本发明的转基因植物优选不显示不希望的表型，如产率降低、每株植物更少的果实、增强的疾病易感性或不希望的结构变化(矮化、变形)等，如果在初级转化体中观察到这类表型，则可以通过正常的育种和选择方法(杂交/回交/自交等)来去除这些表型。本文中所述的转基因植物中的任意种就转基因而言可以是纯合子或半合子。

非转基因耐旱植物和用于产生非转基因耐旱植物的方法

使用非转基因方法，例如靶突变体产生和鉴定系统，如TILLING(定向诱导基因组局部突变；McCallum等，2000，Nat Biotech 18：455；McCallum等2000，Plant Physiol.123，439-442；Henikoff等2004，PlantPhysiol.135：630-636；在此引用作为参考)和选择来产生植物品系也是本发明的实施方案，该植物品系在内源SlPP2C1等位基因中包含至少一个突变，与缺乏突变体等位基因(在SlPP2C1基因座上具有一个或多个野生型等位基因)的植物相比，以杂合或纯合形式包含突变体SlPP2C1等位基因的植物由此具有显著增强的耐旱性和/或显著增强的对ABA的敏感性。因此，在本发明的一个实施方案中，本文中提供在基因组中包含一个或多个突变体SlPP2C1等位基因，且与缺乏该一个或多个突变体等位基因，但包含野生型等位基因的植物相比具有显著增强的耐旱性的植物，以及植物部分(例如收获的果实、收获的叶等)、种子、这类植物的克隆繁殖、包含突变体等位基因的这类植物的后代。

“显著降低的对水分胁迫的敏感性”或“显著增强的耐旱性”指与对照水平(例如缺乏突变体等位基因的相同植物，如非突变植物)相比，包含一个或多个突变体等位基因的多株植物的叶萎蔫症状(统计上显著地)减少至少10％，且可以例如按本文中针对转基因植物所述或用等同的备选方法来测试。简言之，在实验开始时，用水饱和相同年龄的多株突变体植物(在SlPP2C1等位基因中包含特定突变的品系的优选至少10、15、20或更多株植物)和对照，然后在延长的时期，例如7、8、9、10、11、12、13、14、15天或更多天数内不浇水。对照开始显示叶萎蔫(“轻度萎蔫”或“中度萎蔫”)时，用例如目测评估针对叶萎蔫迹象评估所有植物。可以在1至4的量表上将叶萎蔫症状评分为例如“高度萎蔫”(4)、“中度萎蔫”(3)、“轻度萎蔫”(2)、或“无萎蔫”(1)。如果与野生型对照植物相比，(平均)萎蔫减少至少10％，优选至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，则称突变体植物具有显著增强的耐旱性。例如，如果每个品系针对萎蔫症状(w)评分10株植物，则对照可以具有w＝40/10＝4.0的平均得分，而耐旱品系可以具有w＝36/10＝3.6或更少，例如w＝3.4、3.2、2.0、1.4或1.0的平均得分。

备选地或此外，可以用大田试验来测定突变体SlPP2C1等位基因是否赋予品系显著增强的耐旱性。例如，将包含特定突变体SlPP2C1等位基因的多株植物(优选品系的至少10、20、30或更多株植物)与对照植物一起种植在大田中，并在延长的时期，如1、2、3、4周或更长时间内不浇水。对照植物显示萎蔫时，可以按上文所述评估萎蔫症状。备选地，可以评估提供水(恢复)后的％恢复和/或％存活。在对照植物上引起叶萎蔫或膨压丧失时，再次对植物进行浇水(例如1周、2周或更长时间)，同时分析它们的恢复表型。具有增强的耐旱性的突变体在不浇水的情况下比相同条件下的对照植物(例如野生型或近等基因系)存活长至少2、3、4、5、6、7天，优选至少2-5天，且对照植物显示不可逆的组织损伤。类似地，可以计算％存活，与对照的％存活相比，耐旱突变体植物具有增加了至少10％、20％、30％或更多的(平均)％存活。

如之前已述，可以使用其他耐旱性测定。对于不同的作物物种，最适宜的测定可以不同，即不同的测定可以适用于番茄植物而不适用于莴苣或稻。例如，与缺乏突变体等位基因的植物相比，可以测量从干旱期恢复的植物(包含突变体等位基因)的统计上显著的增加和/或可以在包含突变体等位基因的植物中测量干旱期后显著降低的植物死亡率。见例如Zheng等(2009，上文)；Yu等(2008，上文)；或Xiong等2006(上文)中所述的方法。

还可以按实施例中针对转基因植物所述来测试“显著增强的ABA敏感性”。概括而言，包含SlPP2C1突变体等位基因的植物在包含ABA的培养基上的平均种子萌发比相同ABA浓度上的对照低至少10％、20％、30％、40％、50％或更多。例如，在1或3μM ABA上，50％的野生型种子萌发，而少于40％、35％、30％或更少的突变体种子萌发。因此，包含突变体等位基因的植物的种子萌发更多地受ABA抑制。包含突变体等位基因的植物的根生长也更多地受ABA抑制。

优选地，按上文所述针对耐旱性和/或ABA敏感性进行表型分析的植物为突变体SlPP2C1等位基因纯合，虽然也可以对杂合植物进行表型分析，且也可以显示增强的耐旱性和/或增强的ABA敏感性。为了产生以纯合形式包含突变体等位基因的植物，可以使用可选地与基因型分析(例如通过使用等位基因特异性引物的PCR和/或测序来检测突变体等位基因的存在)组合的自交。如果使用TILLING群体，则优选使突变体植物(M1)自交一次或多次，以产生例如M2群体或优选M3或M4群体进行基因型分析。在M2群体中，突变体等位基因以1(突变体等位基因纯合)：2(突变体等位基因杂合)：1(野生型等位基因纯合)的比存在。耐旱性的分离应与突变体等位基因的分离相关。

包含突变体SlPP2C1等位基因或其变体，且具有增强的耐旱性的植物可以属于任意物种，如下文进一步描述，可以用本文中提供的番茄序列来产生和鉴定在基因的同源物和直向同源物中包含突变的植物。可以鉴定植物中的内源SlPP2C1变体核酸序列，然后可以在包含SlPP2C1变体的突变体等位基因的植物的产生和/或鉴定中将其用作靶基因。因此，突变体耐旱植物可以是双子叶或单子叶物种。优选地，植物是栽培植物，虽然在野生植物或非栽培植物中鉴定突变体等位基因，并通过育种技术将这些突变体等位基因转入栽培植物也是本文中的实施方案。

在一个实施方案中，包含至少一个突变体SlPP2C1等位基因(以纯合或杂合形式)且具有显著增强的耐旱性(和/或显著提高的对ABA的敏感性)的植物属于茄科，即包含茄属、辣椒属(Capsicum)、烟草属等。在另一实施方案中，植物属于茄属，例如包含栽培的番茄、马铃薯、茄子等。

在一个实施方案中，耐旱马铃薯植物包含编码功能降低或功能丧失蛋白质(例如SEQ ID NO：15的功能降低或功能丧失StPP2C1蛋白质或其变体)的突变体SlPP2C1等位基因(例如SEQ ID NO：14的SlPP2C1或其变体)。

在具体实施方案中，植物属于物种番茄。可以产生和/或鉴定在其基因组中具有至少一个突变体SlPP2C1等位基因且耐旱的任意番茄。因此，番茄植物可以是任意栽培番茄、任意商业变种、任意育种品系等，它可以是产生任意形状和大小的果实的定型或不定型的开放传粉种或杂种。可以通过育种(与包含突变体等位基因的植物杂交，然后选择包含突变体等位基因的后代)容易地将在特定番茄植物中、或在性别上相容的亲缘植物中产生和/或鉴定的突变体等位基因转入任意其他番茄植物。

植物可以是茄科或茄属的任意物种，诱变处理该物种自身以产生突变体等位基因(例如通过TILLING)，或者例如通过Ecotilling在其中鉴定了SlPP2C1基因(或变体)中的一个或多个自然或自发突变。

在一个实施方案中，在栽培植物中产生或鉴定，但也可以在野生植物或非栽培植物中产生和/或鉴定突变体等位基因，然后用例如杂交和选择(可选地以例如胚胎拯救使用种间杂交来转移突变体等位基因)转入栽培植物中。因此，可以在包含例如S.cheesmanii、S.chilense、S.habrochaites、S.chmielewskii、S.lycopersicum x S.peruvianum、S.glandulosum、S.hirsutum、S.minutum、S.parviflorum、S.pennellii、S.peruvianum、S.peruvianum var.humifusum和S.pimpinellifolium的其他茄属物种中产生(用诱变技术来诱变靶SlPP2C1基因或其变体的人诱导突变)和/或鉴定(自发或自然等位基因变异)突变体SlPP2C1等位基因，然后通过传统育种技术转入栽培茄属植物，例如番茄中。术语“传统育种技术”在本文中涵盖育种者已知的杂交、自交、选择、双单倍体产生、胚胎拯救、原生质体融合等，即可以通过其来转移等位基因的除遗传修饰以外的方法。

优选地，如上文所述，与缺乏一个或多个突变体等位基因(即包含野生型SlPP2C1等位基因)的植物相比，SlPP2C1等位基因中的一个或多个突变导致植物具有显著增强的耐旱性和/或显著增强的ABA敏感性。

不限制本发明，SlPP2C1(SEQ ID NO：1或其变体，或对应的基因组序列，例如从SEQ ID NO：11的核苷酸2676至4975或其变体中)中的突变例如通过一个或多个单碱基转换、错义或无意突变、或一个或多个氨基酸的插入或缺失、或编码序列中的移码导致SlPP2C1蛋白质的减少的功能性或功能丧失，其转而导致改变的表型。可以通过用SlPP2C1特异性引物测序基因来分析一个或多个突变的存在和类型。优选在突变体等位基因杂合或优选纯合的植物中通过表型(即显著增强的耐旱性)体内间接测定SlPP2C1蛋白质功能性的“显著减少”。耐旱表型与突变体等位基因共分离。但是，还可以通过蛋白磷酸酶测定体外测定蛋白质功能性的“显著减少”，突变体SlPP2C1蛋白质磷酸酶活性由此降低至少10、20、30、40、50、60、70、80、90(功能降低)或100％(功能丧失)。为了这样做，克隆并在例如大肠杆菌中表达突变体等位基因，然后进行例如Gosti等1999，Plant Cell 11：1897-1910，Material and Methods-PP2C Activities，1907所述的体外磷酸酶测定。

在本发明的一个实施方案中，提供植物(尤其是番茄植物)，其在SEQID NO：1或SEQ ID NO：11(从核苷酸2676至4975)中，或在与SEQ IDNO：1(如所定义)或包含与SEQ ID NO：11(从核苷酸2676至4975)至少约45％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或更多序列同一性的核苷酸序列中，或在这些中的任一种的对应的基因组序列中包含一个或多个突变，该突变由此导致所编码的SlPP2C1蛋白质(或变体)在体内和/或体外具有降低的活性(与野生型功能蛋白质相比)或无活性，其中与包含编码野生型SlPP2C1蛋白质(或变体)的核酸序列的植物(优选番茄)相比，该植物包含显著增强的耐旱性。

在一个实施方案中，提供植物(优选番茄植物)，其在编码SEQ ID NO：2的蛋白质，或包含与SEQ ID NO：2(如所定义)至少45％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多序列同一性的蛋白质的核苷酸序列中包含一个或多个突变，其中与缺乏该一个或多个突变的(番茄)植物相比，该(番茄)植物包含显著增强的耐旱性。

在一个实施方案中，提供包含突变体SlPP2C1等位基因的耐旱植物(优选番茄植物)，其表征为该突变是所编码的SlPP2C1蛋白质的功能丧失或功能降低突变，该蛋白质是包含与SEQ ID NO：2至少45％、48％、49％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多氨基酸序列同一性的蛋白质。

优选该植物(例如番茄植物)为突变体SlPP2C1等位基因纯合。

可以通过分子方法，如存在于SlPP2C1基因组DNA或mRNA(cDNA)中的一个或多个突变、SlPP2C1蛋白质水平和/或蛋白质活性等，及通过与野生型相比修饰的表型特征来区分突变体植物和非突变体。可以用传统杂交和选择将突变体等位基因转入在性别上与突变体植物相容的其他植物中。因此，可以用突变体等位基因来产生任意类型的耐旱番茄变种，例如开放授粉变种、杂种变种、F1杂种、Roma型、樱桃型、定型或不定型型等。在一个实施方案中，包含突变体SlPP2C1等位基因且具有增强的耐旱性的植物(优选番茄)是F1杂种植物或从其长出F1杂种植物的F1种子。用来产生F杂种的近交亲本优选都以纯合形式在它们的基因组中包含相同的突变体SlPP2C1等位基因。

在另一实施方案中，使包含突变体SlPP2C1等位基因的植物(例如番茄)与相同物种或密切相关的物种的另一植物杂交，以产生包含突变体SlPP2C1等位基因的杂种植物(杂种种子)。这种杂种植物也是本发明的实施方案。还提供用于将突变体SlPP2C1等位基因转移至另一植物的方法，其包括提供在其基因组中包含突变体SlPP2C1等位基因的植物、使该植物与另一植物杂交和获得该杂交的种子。可选地，可以使从这些种子获得的植物进一步自交和/或杂交，所选择的后代包含突变体等位基因且具有增强的耐旱性。

在一个实施方案中，用来产生F1杂种的亲本以纯合形式包含不同的突变体SlPP2C1等位基因，使得杂种包含两个不同的突变体SlPP2C1等位基因。例如，亲本1包含功能丧失突变体，而亲本2包含功能降低突变体。然后F1杂种包含来自各亲本的一个等位基因。因此，本文中还提供在SlPP2C1基因座上包含两个不同的突变体SlPP2C1等位基因且具有增强的耐旱性的番茄植物。

可以通过使用诱变方法或通过针对SlPP2C1等位基因中的自然变体筛选自然群体来产生和/或鉴定包含编码功能丧失或功能降低蛋白质(例如由于无义突变而截短的蛋白质，例如由于错义突变、移码突变和/或剪接位点突变而具有修饰的氨基酸序列，产生例如修饰的催化部位、修饰的折叠等的蛋白质)的突变体SlPP2C1等位基因的植物。在本发明的一个实施方案中，用TILLING来产生这类植物和/或鉴定这类诱变诱导的突变，和/或用EcoTILLING来鉴定在SlPP2C1基因中包含自然(自发)突变的植物，如野生植物或非栽培植物，然后可以通过传统育种技术将其转入栽培植物中。但是，可以使用任意其他诱变方法，且应理解，本文中涵盖人诱导突变体、UV或X射线诱变、化学诱变剂等，以及通过传统育种在栽培植物或作物植物中产生或转入栽培植物或作物植物中的SlPP2C1基因的自发突变体二者。

在本发明的一个具体实施方案中，耐旱突变体植物是不同于番茄的物种的植物，例如单子叶栽培植物，优选在其基因组中包含突变体SlPP2C1等位基因的稻、玉米、小麦或大麦植物。在使用诸如TILLING的方法时，靶基因片段的扩增可以基于SEQ ID NO：1或其片段(例如使用例如基于SlPP2C1的一个或多个保守结构域设计的特异性引物或简并引物)，或者可以首先分离SlPP2C1直向同源物，并基于直向同源序列设计引物。

TILLING(定向诱导基因组局部突变)是一般的反向遗传学技术，其用传统化学诱变法来产生诱变个体的文库，然后对文库进行高通量筛选来发现突变。TILLING将化学诱变与混合PCR产物的突变筛选组合，导致靶基因的错义和无义突变体等位基因的分离。因此，TILLING使用传统化学诱变(例如EMS或MNU诱变)或其他诱变方法(例如辐射，如UV)，然后针对具体靶基因，如本发明的SlPP2C1中的突变进行高通量筛选。用S1核酸酶，如CEL1或ENDO1来切割突变体和野生型靶DNA的异源双链体，并用电泳，如LI-COR凝胶分析系统检测切割产物，见例如Henikoff等Plant Physiology 2004，135：630-636。已将TILLING应用于许多植物物种，如番茄(见http://tilling.ucdavis.edu/index.php/Tomato_Tilling)、稻(Till等2007，BMC Plant Biol 7：19)、拟南芥属(Till等2006，MethodsMol Biol 323：127-35)、芸苔属、玉米(Till等2004，BMC Plant Biol 4：12)等。还已广泛使用检测自然群体中的突变的EcoTILLING，见Till等2006(Nat Protoc 1：2465-77)和Comai等2004(Plant J 37：778-86)。在本文中的一个实施方案中，改进了经典TILLING，可以使用之前已在人类中使用的两个不同的高通量检测系统，而不是使用基于酶的突变体检测(单链特异性核酸酶酶促消化和高分辨聚丙烯酰胺凝胶电泳)。这些检测流程是CSCE(构象敏感毛细管电泳，见Rozycka等2000，Genomics 70，34-40)或HRM(高分辨熔解，见Clin Chem 49，853-860)的修改。还见实施例。

因此，本文中涵盖在一种或多种组织中包含突变体SlPP2C1等位基因，且包含由本发明的功能降低或功能丧失SlPP2C1蛋白质赋予的一种或多种表型(例如上文所述的增强的耐旱性)的非转基因植物、种子和组织，及用于产生和鉴定这类植物的方法。

还提供用于产生和/或鉴定适合用于产生耐旱植物的突变体SlPP2C1等位基因的方法，和/或用于产生包含增强的耐旱性的植物的方法，其包括以下步骤：

(a)诱变植物种子(例如通过EMS诱变)来产生M1群体，或提供诱变的植物种子，或提供包含自然变异的植物；

(b)可选地使(a)的植物自交一次或多次来产生M2、M3或M4家族；

(c)制备(a)或(b)的植物的DNA，并混合个体的DNA；

(d)从DNA库PCR扩增全部或部分SlPP2C1靶基因(基因组或cDNA)或其变体；

(e)检测突变的一个或多个SlPP2C1等位基因在PCR扩增产物中的存在，从而还检测在DNA库中的存在；

(f)选择对应的包含一个或多个突变体SlPP2C1等位基因的个体植物；

(g)可选地测序植物的突变体SlPP2C1等位基因；

(h)针对耐旱性和/或ABA敏感性对(f)的植物或其后代进行表型分析；和

(i)选择耐旱植物；并可选地

(j)用(i)的植物育种，以产生具有良好农学特征的栽培耐旱植物。

步骤(a)还可以是简单地提供这类植物。

在步骤(c)中，备选地，可以混合植物组织，并用分离自混合组织样品的DNA来提供不同个体的DNA库。

在步骤(d)中，用标准方法，如CODDLE(http://www.proweb.org/doddle)设计扩增全部或部分靶基因SlPP2C1(SEQ ID NO：1)或其变体的引物。可以设计引物来扩增靶基因，即SEQID NO：1，或SEQ ID NO：1的变体，或SEQ ID NO：1的基因组序列(即进一步包含内含子，例如对番茄而言为SEQ ID NO：11的核苷酸2676-4975)的例如至少约100、200、250、300、400、500、600、800bp、或至少约1000bp或更多。可以按实施例中所述容易地分离基因组序列并测定其序列。优选地，通过引物扩增包含SlPP2C1蛋白质的全部或部分保守结构域的片段，例如所述C端结构域或假定的镁结合结构域。

对于除番茄外的植物物种，为了能够设计良好的引物序列，可以希望首先鉴定内源SlPP2C1基因的序列。可以计算机模拟或通过例如设计简并PCR引物并从植物物种的基因组扩增全部或部分SlPP2C1基因变体(番茄SlPP2C1基因的直向同源物)来鉴定序列。然后优选用内源SlPP2C1基因的序列来设计适合用于TILLING的引物。

步骤(e)可以利用S1核酸酶，如CEL1来检测PCR扩增产物间，即形成异源双链体的野生型SlPP2C1 PCR产物和突变体SlPP2C1 PCR产物间的错配。备选地，步骤(e)可以用CSCE或HRM进行检测。在CSCE中，形成同源双链(WT/WT或突变体/突变体片段)和异源双链体(突变体/WT片段)。由于所形成的错配，异源双链体以不同于同源双链的速度迁移通过毛细管，从而允许鉴定在靶片段内包含突变的库。HRM也是非酶促技术。在靶基因片段的PCR扩增期间，在双链DNA分子的各复性碱基对间掺入捕获在分子中时将发射荧光的LCgreen Plus+TM分子。LightScanner记录荧光强度，同时逐渐加热平板。PCR产物在某温度下开始解链并释放LCgreen Plus+TM，荧光由此减少。由于它们的熔解温度低于同源双链的熔解温度而鉴定出包含突变的DNA库(异源双链体)。

步骤(j)可以涉及传统育种法及表型和/或标记辅助选择法。可以以这种方式产生许多不同的耐旱变种。

已公开了用于进行TILLING 的大量流程，见例如http://blocks.fhcrc.org/％7Esteveh/TILLING_publications.html；和Till等(2006)Nature Protocols 1：2465-2477；Till等(2006)Methods Mol Biol.323：127-135；和Till等(2003)Methods Mol Biol.236：205-220；全部在此引用作为参考。

一旦鉴定出包含赋予希望的表型的突变体等位基因的植物，即可以通过传统育种技术，例如通过使该植物与其他植物杂交并收集杂交后代来将此等位基因转移至其他植物。在步骤(j)中，因此可以用等位基因来产生耐旱且提供良好农学特征的植物。

如所述，应理解，同样可以用其他诱变和/或选择方法来产生本发明的突变体植物。可以例如辐射或化学处理种子来产生突变体群体。还可以用SlPP2C1的直接基因测序来针对突变体等位基因筛选诱变的植物群体。例如，KeyPoint筛选是基于序列的方法，其可以用来鉴定包含突变体SlPP2C1等位基因的植物(Rigola等PloS One，2009年3月，卷4(3)：e4761)。

因此，提供非转基因突变体植物，例如由于一个或多个内源SlPP2C1等位基因中的突变，该非转基因突变体植物在一种或多种组织中(尤其是至少在叶组织中)产生更低水平的(功能性)野生型SlPP2C1蛋白质，或在特定组织中完全缺乏功能性SlPP2C1蛋白质，或在某些组织中产生非功能性SlPP2C1蛋白质。这些突变体可以通过诱变方法，如TILLING或其变通形式来产生，或者它们可以通过EcoTILLING或通过任意其他方法来鉴定。可以分离并测序编码无功能或功能降低的SlPP2C1蛋白质的SlPP2C1等位基因，或者可以通过传统育种方法将其转移至其他植物。

在一个实施方案中，提供由于基因组中存在实施例4的番茄植物2、3、5、7或10的突变体等位基因而具有增强的耐旱性的植物，及其包含等位基因的后代和部分。

提供植物或其耐旱后代的任意部分，包括收获的果实、收获的组织或器官、种子、花粉、花等。

还提供用于检测植物是否包含本发明的突变体SlPP2C1等位基因的试剂盒。这种试剂盒可以包含在组织样品中检测等位基因的PCR引物或探针。

可以作为具有(增强的)“耐旱性”或作为“耐旱的”销售和/或标记包含本发明的一个或多个突变体SlPP2C1等位基因的植物(和对应的种子)。

优选地，耐旱突变体植物还具有良好的其他农学特征，即它们与野生型植物相比不具有减少的果实数和/或降低的产率和/或产品质量未降低。优选地，这类植物在长期和/或短期干旱胁迫下的产率和/或存活率都更高。在优选实施方案中，植物是番茄植物，而果实是番茄果实，如任意形状或大小或颜色的处理番茄、新鲜上市的番茄。因此，还提供包含一个或多个突变体SlPP2C1等位基因的收获的植物产物或植物部分。这包含下游加工产品，如番茄糊、番茄酱、番茄汁、切开的番茄果实、罐装果实、干燥果实、去皮果实等。相同的情况适用于其他植物物种。

包含一个或多个突变体SlPP2C1等位基因且耐旱的植物或植物部分可以是大田作物(例如稻、玉米、大豆、小麦、大麦、黑麦、高粱、芸苔属等)或蔬菜作物(例如番茄、黄瓜、洋葱、胡萝卜、卷心菜、花椰菜、椰菜、西瓜、甜瓜、莴苣、韭葱、菠菜、萝卜、马铃薯、朝鲜蓟、野莴苣、南瓜、倭瓜、豆、豌豆、辣椒等)。

野生型SlPP2C1等位基因(或变体，包括直向同源物)的不同的体内表达也可以导致植物具有显著增强的耐旱性。例如，可以(例如在番茄的野生亲缘品种中)鉴定包含与见于栽培番茄植物中的等位基因相比具有不同表达模式，尤其是降低的表达的启动子的野生型SlPP2C1等位基因，并渐渗(通过杂交转移)入栽培番茄。或者可以鉴定或产生SlPP2C1启动子中具有突变的等位基因，并用来产生具有增强的耐旱性的植物。

序列

SEQ ID NO 1：来自番茄的野生型SlPP2C1等位基因的cDNA序列

SEQ ID NO 2：由SEQ ID NO：1编码的SlPP2C1蛋白质的蛋白质序列

SEQ ID NO 3和4：用于扩增SlPP2C1 cDNA的引物1和2(Q PCR)

SEQ ID NO 5和6：用于扩增肌动蛋白cDNA的引物对

SEQ ID NO 7和8：用于扩增泛素cDNA的引物对

SEQ ID NO 9和10：用于扩增全长SlPP2C1 cDNA的引物对

SEQ ID NO 11：来自番茄的野生型SlPP2C1等位基因的基因组序列；转录调节元件(例如启动子元件)包含在核苷酸1-2675中；蛋白质编码序列(外显子)由核苷酸2676-3419(外显子1)、4247-4351(外显子2)和4632-4975(外显子3)组成。初级RNA显示于核苷酸2591-5050中。

SEQ ID NO 12和13：用来在诱变的番茄植物中检测SlPP2C1突变的引物(见实施例4)。

SEQ ID NO 14：假定的马铃薯SlPP2C1 cDNA(本文中称为StPP2C1)

SEQ ID NO 15：假定的马铃薯SlPP2C1蛋白质(本文中称为StPP2C1)

附图简述

图1：A)转基因品系(T6_OE、T34_OE、T55_OE)叶中SlPP2C1的相对mRNA水平(深灰色条)比野生型(Wt)高25倍。B)T55_OE授粉子房中SlPP2C1的相对mRNA水平(浅灰色条)与野生型相似，而T6_OE和T34_OE中的水平低于野生型。C)与野生型和T18相比，转基因品系T12_CS和T35_CS中的相对mRNA水平在叶(深灰色条)和未授粉子房(浅灰色条)中都低。以SE显示生物学重复的平均值，将野生型水平设为1。

图2：A)与野生型(Wt)相比，种子萌发在过量表达品系T6_OE和T55_OE中更少地受ABA抑制，在共抑制品系T12_CS和T35_CS中更多地受ABA抑制。品系T34_OE非典型地表现。深灰色线条代表过量表达品系，浅灰色线条代表共抑制品系，黑色线条代表野生型。B)与T18(深灰色)和野生型(黑色)相比，根生长在共抑制品系T12_CS(白色)和T35_CS(浅灰色)中更多地受ABA抑制。C)与野生型(黑色)相比，根生长在过量表达品系T34_OE(深灰色)中更少地受ABA抑制，但在T6_OE(白色)和T55_OE(浅灰色)中更多地受ABA抑制。以SD显示平均根生长百分比。D)开始水分抑制后9天，共抑制品系一点也不萎蔫，而野生型显示中度萎蔫，过量表达品系显示严重萎蔫。

以下非限制性实施例描述了SlPP2C1基因在修饰植物表型中的用途。除非实施例中另有说明，按照Sambrook等(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press；和Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY中；及Ausubel等(1994)Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols，USA的卷1和2中所述的标准流程进行所有重组DNA技术。用于植物分子操作的标准材料和方法描述于由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和BlackwellScientific Publications，UK联合出版的R.D.D.Croy的Plant MolecularBiology Labfax(1993)中。

实施例

实施例1-SlPP2C1的分离和表征

1.1材料和方法

1.1.1植物材料

在16小时/8小时的昼夜节律下从3月至10月在温室条件下培养番茄植物(Solanum lycopersicum L.cv.Moneymaker)。补光灯(600瓦特高压钠灯，Philips，Eindhoven，荷兰)在200W/m²以下开启，在300W/m²以上关闭。用PRIVA Integro versie 724系统保持温度在光照期期间高于20℃，在黑暗期期间为17℃。植物每天浇水，每周施肥。从成熟番茄植物剖分叶和子房组织，从10日龄幼苗剖分根和下胚轴。在11.00小时和13.00小时之间收获组织，并直接冷冻在液氮中。

1.1.2SlPP2C1基因表达分析和Q-PCR

按Vriezen等(2008，New Phytologist，177：60-76，见61和62页)中所述进行cDNA-AFLP，将授粉的子房与赤霉酸(GA₃)处理的子房相比较。从凝胶切出326bp的差异表达片段，并在与选择性扩增相同的条件下再扩增洗脱的DNA。将片段连接入具有T尾的EcoRV消化的噬菌粒pBluescriptII SK(+)(Stratagene，La Jolla，CA，美国)中，并用CEQ DTCSQuick Start Kit和CEQ2000 DNA Analysis System(Beckman Coulter，Fullerton，CA，美国)测序。

对于定量PCR分析，用Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA，美国)分离RNA。进行光度RNA测量来平衡不同样品的RNA浓度。用无RNA酶的DNA酶(RQ1，Promega，Madison，美国)对等量的RNA进行DNA酶处理。按流程用cDNA合成试剂盒(iScrip^tm，Bio-rad Laboratories，Hercules，CA，美国)反转录(RT)RNA(0.5μg)。

用计算机程序(Beacon Designer Software，Premier BiosoftInternational，CA，美国)设计用于定量SlPP2C1 mRNA转录物水平的实时定量PCR(Q-PCR)引物，并检查与其他PP2C序列的残余同源。

引物1：5’-TCGGAAGGAGAAGATTACG-3’(SEQ ID NO：3)

引物2：5’-TCCACAATTCGCAACAAC-3’(SEQ ID NO：4)

引物1和2扩增SlPP2C1转录物的以下片段(174bp)：

5′TCGGAAGGAGAAGATTACGATGGGAAGAGTATTAACTGGGAGAAAGTTATGACGGAGAGTTTCCGTAAAATGGACGAAAAGGTGAACAAGGAAGGGGCGGAGATGGCGACGATAGGATCAACGGCGGTGGTAGCGGTGGTGGGAGTGGAGGAATTTGTTGTTGCGAATTGTGGA3′

用SYBR green混合物(iB-SYBR Green supermix，Bio-radlaboratories)在96孔循环变温器(Bio-Rad iCycler，Bio-rad laboratories)中进行PCR反应。PCR程序以95℃3分钟起始，然后是40个由95℃15秒和57℃45秒组成的循环，最后测定扩增产物的熔解温度来确认特异性产物的存在。每个样品使用5微升25倍稀释的cDNA。总是进行技术重复和生物学重复。

用肌动蛋白mRNA和泛素二者作为内部对照基因。

肌动蛋白引物1：5’-GGACTCTGGTGATGGTGTTAG-3’(SEQ IDNO：5)

肌动蛋白引物2：5’-CCGTTCAGCAGTAGTGGTG-3’(SEQ ID NO：6)

泛素引物1：5’-CCCTGGCTGATTACAACATTC-3’(SEQ ID NO：7)

泛素引物2：5’-TGGTGTCAGTGGGTTCAATG-3’(SEQ ID NO：8)

还在Q-PCR中包含稀释的DNA酶处理的RNA作为基因组DNA污染的对照。

1.1.3植物转化

为了产生转基因SlPP2C1品系，PCR扩增SlPP2C1的编码区(SEQ IDNO：1)，并克隆入pDONR载体。设计用于扩增完整的SlPP2C1 cDNA的PCR引物如下：

引物1(正向)：5’CACCTGCAGTCACCGTCTTCACATTAAAAT 3’(SEQ ID NO：9)

引物2(反向)：5’ATTTGTATGGGAAGCTTAACTATCA 3’(SEQ IDNO：10)

使用Gateway克隆，将SlPP2C1克隆在pAD625载体(de Folter等2006，The Plant Journal 47：934-946)中的花椰菜花叶病毒35S启动子之后，该载体还包含胭脂氨酸合成酶终止子(3’nos)。通过De Jong等(2008，上文)中所述的根瘤土壤杆菌介导的转化和组织培养来产生转基因番茄植物。

1.1.4水分胁迫实验

实验开始时用水饱和相同年龄和大小的野生型和SlPP2C1转基因品系的花盆。每个品系使用几株植物。对植物停止浇水10天。分别在第8天和第9天在野生型对照中最初观察到萎蔫迹象(轻度萎蔫或中度萎蔫)时通过目测评估叶萎蔫。使用1-4的量表，4为严重萎蔫，3为中度萎蔫，2为轻度萎蔫，1为显示无叶萎蔫迹象。

起始实验后9天拍摄了图2D中所示的照片。

1.1.5种子萌发测定和根生长测定

种子萌发：

收获、干燥转基因品系的种子，并保存在4℃。在包含0.1％(v/v)Tween-20的稀释漂白剂(4％(w/v)次氯酸盐)中消毒种子、洗涤并播种在包含0、1、3、10或30μM ABA(Acros，Geel，比利时)的1/2MS培养基(补充1％(w/v)蔗糖的2.25mg MS基础盐和Nitsch维生素，Duchefa，Haarlem，荷兰)上。每个ABA浓度使用至少40粒种子。

将植物放入16小时/8小时昼夜节律下的25℃生长室中。10天后对种子萌发(胚根伸出)进行评分，并计算种子萌发百分比。

根生长：

按上文所述消毒种子，并播种在含1μM GA₃的水中。胚根伸出后，将各品系的10粒种子放置在包含0、5、10或40μM ABA的1/2MS培养基上。测量根，并以垂直位放置平板，在上文所述的条件下培养。转移后7天，再次测量根的长度，并将根生长计算为与无ABA(100％)的1/2MS培养基相比的根生长百分比。实验进行3次，显示平均值加SD。进行斯氏t检验来检验显著性(p＜0.05)。

1.2.结果

1.2.1SlPP2C1在果实形成期间的表达(数据未显示)

SlPP2C1基因在果实形成期间差异表达(Vriezen等2008，上文)。SlPP2C1在未授粉子房的果皮中表达最高，授粉和GA₃处理后较低。胚珠/胎座中的表达似乎未改变。我们通过定量PCR确认了SlPP2C1在番茄子房组织内的表达。同样观察到，在对照组织中，果皮中的SlPP2C1 mRNA水平高于胚珠或胎座中。在果皮中，但还在胎座中，授粉后3天发现了更低的SlPP2C1 mRNA水平。在胚珠中，mRNA水平未改变。与营养组织，如叶、根和下胚轴相比，SlPP2C1基因以相对高的水平在开花期表达在成熟的未授粉子房中。在开花前3天的花芽和子房中，SlPP2C1 mRNA水平与叶相当，且低于开花期的子房中(对照，Ct)。授粉后3天，子房中的SlPP2C1 mRNA水平降低至未授粉子房中的水平的约50％。

1.2.2SlPP2C1的功能分析

SlPP2C1的过量表达

过量表达(OE)方法产生叶中SlPP2C1 mRNA水平平均高25倍的三个转基因番茄品系(过量表达品系T6_OE、T34_OE和T55_OE，图1A)。在授粉子房中，这些品系的SlPP2C1 mRNA水平不比野生型高(图1B)。相反，与野生型相比，T6_OE和T3_4OE显示SlPP2C1 mRNA水平的强降低。在授粉子房中，T55_OE具有类似于野生型的mRNA水平。这些转基因品系的未授粉子房中的SlPP2C1 mRNA水平与授粉子房中的mRNA水平相当，未在此显示。

SlPP2C1的沉默

此外，获得了与野生型相比在叶和未授粉子房中具有更低的SlPP2C1mRNA水平的两个品系(共抑制品系T12_CS和T35_CS)(图1C)，表明过量表达构建体在这些品系中导致SlPP2C1的共抑制。品系T18在两种组织中都具有与野生型相当的mRNA水平。

对ABA的敏感性

转基因品系的表型表征揭示了改变的ABA敏感性。图2A显示包含不同浓度ABA的培养基上的种子萌发百分比。共抑制品系T12_CS和T35_CS在1μM和3μM ABA上具有低于野生型的萌发百分比，而过量表达品系T6_OE和T55_OE具有略高于野生型的萌发百分比。品系T34_OE(在叶中过量表达的品系)表现得与其他过量表达品系不同，与野生型相比在ABA上显示更低的种子萌发。

在野生型中，ABA减少了萌发后的根生长。在图2B中可以看到，共抑制品系T12_CS和T35_CS中的根生长比野生型或T18中更强地受抑制。过量表达品系T34_OE比野生型对ABA根生长抑制更不敏感(图2C)。品系T6_OE和T55_OE的根生长对ABA更敏感。

因此，SlPP2C1的共抑制导致植物与野生型相比具有显著增强的ABA敏感性(种子萌发比野生型中更受抑制，根生长比野生型中更受抑制)，而过量表达导致植物具有降低的ABA敏感性，表明SlPP2C1编码ABA的负调节物。

耐旱性

图2D显示，在第9天，野生型植物具有中度萎蔫，共抑制品系显示无萎蔫，而过量表达品系显示严重萎蔫。在第9天，过量表达品系严重萎蔫(平均萎蔫得分＝3.6)，而共抑制品系显示少许萎蔫(得分1.25)，对照显示中度萎蔫(得分＝3.0)。实验重复一次(数据未显示)。因此，与野生型对照相比，萎蔫在共抑制品系中减少58％。

这些数据表明，SlPP2C1的下调导致植物与野生型相比具有显著增强的耐旱性。

讨论

具有过量表达构建体的转基因品系中的两种在叶和子房中都具有更低水平的SlPP2C1mRNA。虽然未完全理解其机制，但共抑制沉默RNA是广为接受的现象。已提出，共抑制由来自产生掺入RNAi途径的siRNA的反向重复转基因拷贝的发夹RNA转录物诱导(Tomita等2004，FEBS Lett.2004Aug 27；573(1-3)：117-20；Wang和Metzlaff 2005，Curr Opin Plant Biol.8(2)：216-22)。Southern印迹分析(数据未显示)揭示，SlPP2C1的两个共抑制品系中存在多个插入，其可能已导致可以沉默内源SlPP2C1基因的发夹样结构。

叶中具有高25倍的SlPP2C1 mRNA水平的三个品系在子房中不具有更高的mRNA水平。这可以通过子房中相对高的内源基因mRNA水平来部分解释，该内源基因mRNA水平比叶中高7倍。因此，转基因对子房中的SlPP2C1总表达水平的贡献可能非常小。值得注意的是，在品系T6_OE和T34_OE中，子房中的SlPP2C1 mRNA水平甚至比野生型中低(10-50％)。但是，之前已报道了转基因对内源mRNA水平的组织特异性控制。Tomita等(2004，上文)显示，在同一植物中，NtFAD3基因在叶中共抑制，但在根中过量表达，在叶和根中导致等同的表型。发生共抑制的组织特异性调节的机制未知，但内源转录物的水平似乎很重要(Tomita等2004，上文)。

叶和子房中具有降低的mRNA水平的两个番茄转基因品系还在种子萌发和根生长期间显示ABA高敏反应，及增强的对水分胁迫的耐受性。这表明，SlPP2C1基因是番茄中ABA信号级联放大的负调节物。此外，叶中具有相对高的SlPP2C1 mRNA水平的三个转基因品系也更强地萎蔫。

实施例2-包含增强的耐旱性且包含突变体SlPP2C1等位基因的TILLING突变体

2.1番茄TILLING群体

按以下流程用商业处理的番茄育种中使用的高度纯合的近交系进行诱变处理。种子在潮湿

纸上萌发24小时后，将～20,000粒种子(分为各2500粒种子的8个批次)浸泡在锥形瓶中的100ml超纯水和浓度为1％的甲基磺酸乙酯(EMS)中。室温下轻轻摇动锥形瓶16小时。最后，在流动水下漂洗去EMS。EMS处理后，将种子直接播种在温室中。在萌发的60％的种子中，将10600株小植株移栽在大田中。从挂果的8810个M1品系每株植物收获两个果实。从来自第一果实的种子分离DNA，构建M2群体DNA库。使这些自交，从果实分离M3种子，并用种子进行DNA分离，构建M3群体DNA库。

2.2来自TILLING群体的用于PCR扩增的靶SlPP2C1基因

以基因组番茄DNA为模板，使用在番茄SlPP2C1序列侧翼上设计的引物，用PCR测定包含完整转录区的基因组序列，该完整转录区包含编码区(COD)、不翻译的5’端区域(5’UTR)和3’端区域(3’UTR)。通过比较基因组序列和SlPP2C1 cDNA序列来测定此基因中的内含子和外显子的位置、数目和大小。

基因组序列显示在SEQ ID NO：11中。初级RNA(转录区)从核苷酸2591至5050，包含5’UTR(2591-2675)、外显子1(2676-3419)、内含子1(3420-4246)、外显子2(4247-4351)、内含子2(4352-4631)、外显子3(4632-4975)和3’UTR(4976-5050)。

然后针对SlPP2C1靶基因中的单核苷酸多态性筛选上述番茄TILLING群体的DNA。为了此目的，设计PCR引物对来从SlPP2C1基因的编码(外显子)序列(SEQ ID NO：1)或包含全部或部分编码SlPP2C1蛋白质C端(因为催化结构域中的突变很可能导致蛋白质的功能降低或功能丧失)，即编码SEQ ID NO：2的氨基酸84-391的核酸扩增约400-500bp的重叠片段。见下文实施例4，其中鉴定了氨基酸101-192中的突变。

用引物对来从TILLING群体的M2或M3DNA扩增靶序列，并用上文所述的CSCE或HRM检测突变体和野生型靶序列间的异源双链体。DNA样品的ID编号与以杂合或纯合形式携带野生型等位基因或突变等位基因的植物的种子批次相联系。

使种子萌发，并使用突变位点侧翼的引物，以这些植物的基因组DNA为模板，通过PCR确认特定突变在个体植物中的存在。片段的DNA测序鉴定出所期望的突变为纯合和杂合的突变体。自交且随后选择后选择或获得纯合突变体，并测定突变对对应的蛋白质和植物表型的作用。

使用例如上文所述的测定和/或大田评估，针对耐旱性通过表型筛选在靶序列中包含一个或多个突变的植物。

2.3构象敏感毛细管电泳(CSCE)

用0.15ng 4倍混合的基因组DNA在10μl体积中进行多重PCR反应。向PCR主混合物中加入标记引物至比非标记引物的浓度低5倍的浓度(1μM)。PCR后，将样品稀释10倍。进行CSCE之前，将2μl稀释产物加至38μl MQ水中。

将样品上样在填充了以下组成的半变性聚合物的来自ABI 3130xl仪器的50cm毛细管(注射时间和电压：16秒、10千伏；运行电压：15千伏)上：5g构象分析聚合物(CAP)(Applied Biosystems，434037，9％)、2,16g尿素、0,45g 20×TTE(national diagnostics，EC-871)，用MQ水补足至9g。用1×稀释的TTE和10％甘油配制电泳缓冲液。将温箱温度设为18℃。

用来自BioNumerics的HeteroDuplex Analysis(HDA)软件分析原始数据。该程序区分异源双链体(突变体)和同源双链分子(野生型)的峰模式，从而提供选择包含靶基因中突变的个体品系的DNA库的可能性。

2.4高分辨熔解曲线分析(HRM)

在FramStar 96孔板中在8×flat pools上进行LCgreen PCR。按厂家的建议将2μl(15ng)混合的DNA与2μl F-524 Phire^TM 5×反应缓冲液(FINNZYMES，芬兰)、0.1μl Phire^TM Hot Start DNA聚合酶(FINNZYMES，芬兰)、1μl LCGreen^TM Plus+(BioChem，美国)、0.25μl5mM引物混合，并用MQ水补足至10μl。用

System(IdahoTechnology Inc.，美国)筛选包含突变的库。通过分析熔解温度谱来选择阳性库；库包含突变时，它将显示更低的熔解温度。

实施例3-突变体SlPP2C1等位基因转入番茄栽培种

使包含突变体SlPP2C1等位基因的TILLING突变体与不同番茄品系杂交来将突变体等位基因转入这些品系，产生具有良好的农学特征和显著增强的耐旱性的番茄植物。

开发了

SNP Genotyping Assays(Applied Biosystems)标记来鉴定修饰核苷酸的存在。用此测定进行标记辅助前景选择，其对隐性基因转移至所需背景，例如商业番茄亲本品系有效，因为它们的经典转移需要其他反复自交世代(recurrent selfing generations，Ribaut等PlantMolecular Biology Reporter 15：154-162)。

实施例4

针对SlPP2C1靶基因(如2.2中所述)中的单核苷酸多态性，尤其是针对编码氨基酸101至192的序列中的突变筛选实施例2.1中所述的M2TILLING群体的DNA。

为了此目的，设计以下PCR引物对来扩增SEQ ID NO：1的核苷酸301-577的277bp片段：

正向引物：“3863”5’-GTGACGTGCTGTTCACATGGATC-3’(SEQID NO：12)

反向引物：“3861”5’-TACGGAAACTCTCCGTCATAAC-3’(SEQ IDNO：13)

用此引物对从Tilling群体的M2DNA扩增靶序列。扩增的靶序列包含SEQ ID NO：1的核苷酸301至577，即编码SEQ ID NO：2的氨基酸101至192的区域。用实施例2.3(或2.4)中所述的HRM鉴定突变体和野生型靶序列间的异源双链体。

鉴定了靶区域中包含SNP的10株植物，并测序靶序列的PCR产物，以测定SNP的性质和位置。结果显示在以下表2中。

表2

基于SIFT分析(Pauline C.Ng和Henikoff 2003，Nucleic AcidResearch 31卷，3812-3814页)，预测了对蛋白质功能的作用，见表2。

三株植物(1、4和6号植物)在SlPP2C1基因中包含沉默突变，而五株植物(2、3、5、7和10号植物)包含导致氨基酸取代的SNP。植物5和10包含相同的突变。基于SIFT分析，预测2、5和10号植物在SlPP2C1等位基因中包含突变，其减少或废除了PP2C1蛋白质功能，从而赋予增强的耐旱性。应注意，见于植物2中的突变体SlPP2C1等位基因在Asp-Gly-His(DGH)结构域中。

3和7号植物也可以包含赋予增强的耐旱性的突变体等位基因。

为了测试植物2、3、5、7和10对干旱和/或其他非生物胁迫的反应，对14日龄幼苗进行选自以下处理中的一种或多种的多种形式的胁迫处理。

1.可以按一般描述、以上实施例中所述，和/或通过在MS上体外培养幼苗21天(以获得同源群体)，然后将它们转移至包含沙质土壤的花盆来施加干旱胁迫。转移后两周，停止浇水6天，然后一次性加入50ml 水/植物。不成对的(azygous)植物和对照植物变黄时对结果进行评分(修改自The Plant Journal，2004，41，95-106)。

2.通过在包含250mM NaCl的MS培养基上培养幼苗0至48小时来施加盐度胁迫。

3.可以通过在加入75mM甘露糖醇或加入0.1或1.0mM ABA的MS培养基上培养幼苗来施加渗透胁迫。植物生长期间长出的总根长和侧根量分别是胁迫耐受性和ABA敏感性的度量(修改自Xion等，Plant Physiology，2006，142，1065-1074)。

用与对照相比包含显著增强的胁迫耐受性，尤其是耐旱性的植物来产生例如实施例3中所述的具有良好农学特征的番茄栽培种。此外或备选地，与对照相比，具有显著增强的耐旱性的植物还可以包含显著增强的盐度和/或渗透胁迫耐受性。

Claims

1.非转基因植物，其基因组中包含SlPP2C1等位基因，SlPP2C1等位基因由此是编码包含与SEQ ID NO：2至少60％氨基酸序列同一性的蛋白质的等位基因，其特征在于所述SlPP2C1等位基因在其核苷酸序列中包含一个或多个突变，且由此由于所述一个或多个突变，在其基因组中包含所述突变体等位基因的植物与在其基因组中包含野生型SlPP2C1等位基因的植物相比，具有显著增强的耐旱性。

2.权利要求1的植物，其特征在于所述一个或多个突变赋予所编码的SlPP2C1蛋白质功能丧失或功能降低。

3.权利要求1或2的植物，其中所述突变体SlPP2C1等位基因以纯合形式存在。

4.前述权利要求中任一项的植物，其中所述植物属于茄科、属于茄属、或属于番茄物种。

5.前述权利要求中任一项的植物，其中将植物暴露于相同的干旱胁迫时，与在其基因组中包含野生型SlPP2C1等位基因的植物的叶萎蔫症状相比，所述植物的叶萎蔫症状减少至少10％。

6.前述权利要求中任一项的植物，其中所述植物是杂种植物。

7.前述权利要求中任一项的植物的果实或种子或部分。

8.编码SlPP2C1蛋白质的核酸序列在产生具有增强的耐旱性的转基因植物或非转基因植物中的用途，其特征在于所述SlPP2C1蛋白质包含与SEQ ID NO：2至少60％氨基酸序列同一性。

9.转基因植物，其包含整合入其基因组中的嵌合基因，其中所述嵌合基因包含与核酸序列有效连接的在植物细胞中具有活性的启动子，所述核酸序列包含转录时沉默内源SlPP2C1基因表达的SlPP2C1基因的有义和/或反义序列，且其中所述植物与缺乏所述嵌合基因的植物相比包含显著增强的耐旱性。

10.权利要求9的植物，其中所述内源SlPP2C1基因编码蛋白质，所述蛋白质包含与SEQ ID NO：2至少60％氨基酸序列同一性。

11.权利要求8或9的植物，其中所述转录调节序列选自组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子和发育调节启动子。

12.权利要求9-11中任一项的植物，其中所述植物选自以下属：茄属、香瓜属(Cucumis)、西瓜属(Citrullus)、莴苣属(Lactuca)、胡萝卜属(Daucus)、葱属(Allium)、辣椒属、玉蜀黍属、稻属、小麦属、大麦属(Hordeum)、芸苔属、大豆属、菜豆属(Phaseolus)、燕麦属(Avena)、高粱属(Sorghum)、棉属、杨属、栎属、柳属。

13.权利要求9-12中任一项的植物的种子或果实或部分，其包含所述嵌合基因。

14.嵌合基因，其包含在植物细胞中具有活性的组织特异性、诱导型或发育调节启动子，所述启动子与核酸序列有效连接，所述核酸序列包含转录时沉默内源SlPP2C1基因的SlPP2C1基因的有义和/或反义片段，其特征在于所述内源SlPP2C1基因包含与SEQ ID NO：1至少60％序列同一性。

15.非转基因耐旱番茄植物或其种子、后代或番茄果实，所述植物可通过TILLING获得，在其基因组中包含突变体SlPP2C1等位基因，其特征在于所述突变体等位基因编码与野生型SlPP2C1蛋白质相比具有功能降低或功能丧失的SlPP2C1蛋白质。

16.权利要求15的植物，其中所述SlPP2C1蛋白质在Gly148、Ser171、Ala155或Gly132上包含氨基酸取代。