CN103320454A

CN103320454A - 野生茄子5型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶基因StPP5的应用

Info

Publication number: CN103320454A
Application number: CN2013101444397A
Authority: CN
Inventors: 杨清; 谢超; 陈敏; 决登伟
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2013-04-23
Filing date: 2013-04-23
Publication date: 2013-09-25

Abstract

本发明公开野生茄子5型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶基因StPP5的应用。本发明从野生茄子中克隆出StPP5基因。经SA和大丽轮枝菌诱导后，与对照相比，野生茄子StPP5基因表达量显著上升。将StPP5基因插入植物表达载体pCMBIA1304的Nco Ⅰ和Spe Ⅰ酶切位点间构建转烟草表达载体，并进一步获得的再生植株经PCR、q-RT-PCR检测出转基因植株，在此基础上，提取转基因烟草的粗蛋白进行进行抑菌试验，结果表明过量表达StPP5的转基因烟草粗蛋白提取物能降低大丽轮枝菌得生长率。因此，该基因转化烟草等作物的感病品种，有望提高其黄萎病抗性。

Description

野生茄子5型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶基因StPP5的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及野生茄子5型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶基因StPP5的应用。

背景技术

黄萎病（Verticillium wilt）是一种经由土壤传播的、危害植物维管束的真菌性病害。由于其病原菌分布较广、寄主较多，而导致多种经济作物均易发生黄萎病变，进而导致作物的产量与品质下降，造成巨大的经济损失（Cirulli，1981）。野生茄子中含有许多重要的遗传资源，对其研究和利用已被研究者高度重视。研究表明，茄科(Solanaceae)的茄属(Solanum)中已鉴定出Solanum torvum等野生种对黄萎病有高抗甚至接近免疫的抗性(Jadari et al.,1992；肖蕴华和林柏青，1995；采俊香等，2000)。

通过对抗病品种与感病品种的对比研究，发现了植物抗病的相关基因分为抗病基因和防卫基因两大类。植物的抗病基因（Resistance genes，R gene），指基因对基因假说中的寄主植物中与病原物无毒基因表现非亲和性互作的基因。这些基因的克隆为人们从分子水平上揭示植物抗病的内在机理以及植物的信号传递机制，并通过基因工程利用R基因快速培育新的抗病作物品种奠定了基础。目前，可将已经克隆得到的R基因分为6大类：

第1类植物抗病基因编码NBS-LRR型胞内受体蛋白，这些蛋白具有一定数量的完全或不完全的富含亮氨酸重复以及一个核苷酸结合位点。第2类植物抗病基因是番茄抗丁香假单胞菌基因Pto，它编码的是一个胞内丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase,S/TPK)。丝氨酸/苏氨酸磷酸酶在植物体内起着可逆蛋白质磷酸化作用，是细胞生命活动的调控中心。蛋白的可逆磷酸化是生物体内普遍存在的信号转导调节方式，几乎参与所有的生理和病理过程，如糖代谢、细胞生长、细胞周期、基因表达和神经递质的合成与释放，甚至癌变等等。干旱、高盐和感病等逆境胁迫可诱导多种蛋白质激酶的上调表达，而对催化其可逆反应的蛋白磷酸酶与防卫反应和抗病性关系的报道却不多，且不一致。丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶是催化蛋白质去磷酸化的主要酶类之一（Broz et al，2001），在拟南芥和山毛榉（Fagus sylvatica）等植物上发现与脱落酸调控的抗逆信号转导有关（Schweighofer et al，2004）。第3类植物抗病基因是番茄抗叶霉菌基因家族成员Cf-9、Cf-4、Cf-2和Cf-5，编码具LRR结构域和跨膜域的胞外蛋白。第4类植物抗病基因为水稻抗黄单胞菌基因Xa21，其蛋白产物是一个具LRR结构域的跨膜蛋白激酶。第5类植物抗病基因是玉米抗圆斑病基因Hm1，它编码一个真菌毒素胞内还原酶。第6类植物抗病基因是大麦抗Erysiphe graminis f.sp.hordei的基因mlo，它编码一个G蛋白偶连的跨膜受体。

发明内容

核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的StPP5基因在构建抗黄萎病转基因烟草中的应用。

氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的StPP5基因编码的蛋白在构建抗黄萎病转基因烟草中的应用。

含有所述的StPP5基因的表达载体在构建抗黄萎病转基因烟草中的应用。

含有所述的StPP5基因的表达载体是以pCMBIA1304为出发载体，将权利要求1所述的StPP5基因插入pCMBIA1304的Nco Ⅰ和Spe Ⅰ酶切位点间所得。

有益效果：

本发明从野生茄子中克隆出StPP5基因的克隆、重组及功能分析及验证。以野生茄子托鲁巴姆（Solanum torvum Swartz）为材料,从幼嫩叶片中提取总RNA，合成cDNA，采用同源克隆法扩增StPP5基因。经SA和大丽轮枝菌诱导后，与对照相比，野生茄子StPP5基因表达量显著上升。将StPP5基因插入植物表达载体pCMBIA1304的Nco Ⅰ和Spe Ⅰ酶切位点间构建转烟草表达载体，以烟草NC89为供体，进行农杆菌侵染，获得的再生植株经PCR、q-RT-PCR检测出转基因植株，在此基础上，提取转基因烟草的粗蛋白进行进行抑菌试验，结果表明过量表达StPP5的转基因烟草粗蛋白提取物能降低大丽轮枝菌得生长率。因此，该基因转化烟草等作物的感病品种，有望提高其黄萎病抗性。

附图说明

图1植物表达载体1304-StPP5的构建

图2转基因烟草StPP5表达的q-RT-PCR分析

c：未转基因烟草；OX-1：转StPP5基因烟草株系P6;ox-2:转StPP5基因烟草株系P7

图3利用转基因烟草蛋白提取物研究StPP5抗病效应

a：水对照；b：野生型烟草；c：转StPP5基因烟草P6

图4转StPP5基因烟草抑菌率

图5经过水杨酸处理的野生茄子托鲁巴姆不同器官中StPP5的表达分析

图6经过大丽轮枝菌菌液处理的托鲁巴姆不同器官中StPP5的表达分析

具体实施方式

实施例1 野生茄子托鲁巴姆StPP5基因的克隆

根据GenBank中已有的马铃薯、烟草、番茄、甜椒PP5基因保守区段序列设计引物，分别扩增。以野生茄子幼叶cDNA第一链为模板，进行RT-PCR。测序得到长约800bp的中间片段，根据获得的中间片段序列，分别设计不同基因特异性引物，进行野生茄子PP5基因cDNA两个末端的扩增。扩增得到大小分别约为1100bp和1150bp两端序列，两个扩增产物测序结果中均可以找到与中间保守区段的重叠区，这表明所获得片段均为同一基因的两端序列。将3个片段的序列进行拼接，根据拼接的序列设计引物，进行PCR特异性扩增，得到大小约为1500bp的核酸序列。经过blastn比对，证实该序列与已经报道的其他物种的PP5序列有较高的同源性，氨基酸序列分析表明该基因含有PP5蛋白所特有的结构域，因此将它命名为StPP5。具体步骤如下：

1 StPP5 cDNA中间保守区域的扩增

利用DNAssist2.0软件对GenBank中已有的马铃薯、烟草、番茄、甜椒PP5mRNA序列进行多重比对，根据比对结果设计中间保守序列引物P1：5'-AAAGATGCACTCAAGGATTTTCAACAGGT-3'（SEQ ID NO.3）和P2：5'-GTTTACTAGGTCCTCTACCAGGCTGAG G-3'（SEQ ID NO.4），以野生茄子幼叶cDNA第一链为模板，进行RT-PCR。

PCR产物经1.0%的琼脂糖电泳后用宝生物公司的胶回收试剂盒回收，连接到pMD18-T Vector，转化大肠杆菌DH5α，PCR检测单克隆，阳性克隆进行测序。

2 StPP5 cDNA5′末端区域的扩增

根据野生茄子StPP5 cDNA中间片段序列在NCBI上的blastn比对结果，依据序列（AY182777.1）5′端设计引物P3：5'-TTAAGAAAAACATGCGAAGGAAGTTGTT GG-3'（SEQ ID NO.5）。以野生茄子幼叶cDNA第一链为模板,利用引物P2和P3进行扩增，

PCR产物经1.0%的琼脂糖电泳后用宝生物公司的胶回收试剂盒回收，连接到pMD18-T Vector，转化大肠杆菌DH5α，PCR检测单克隆，送阳性克隆测序。

3 StPP5 cDNA3′末端区域的扩增

根据马铃薯StPP5 cDNA中间片段序列在NCBI上的blastn比对结果，依据序列（AY182777.1）3′端设计引物P4：5'-ATGCCCGGTATGGAAGCTGAG-3'（SEQ ID NO.6）。以野生茄子幼叶cDNA第一链为模板，利用引物P1和P4进行扩增，

PCR产物经1.0%的琼脂糖电泳后用宝生物公司的胶回收试剂盒回收，连接到pMD18-T Vector，转化大肠杆菌DH5α，PCR检测单克隆，送阳性克隆进行测序。

4 StPP5 cDNA全长的扩增

拼接中间片段和两端的序列，得到全长序列。以野生茄子幼叶cDNA第一链为模板模板进行基因全长序列的扩增，利用引物P3和P4进行PCR，

PCR产物经1.0%的琼脂糖电泳后用宝生物公司的胶回收试剂盒回收，连接到pMD18-T Vector，转化大肠杆菌DH5α，经测序正确后保存备用。

5 StPP5核苷酸序列分析

用DNAssist软件对测序结果进行分析，StPP5基因ORF为1458bp，序列如SEQ ID NO.1所示，起始密码子ATG；终止密码子TAA；cDNA编码一个由485个氨基酸残基组成的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；蛋白分子量为54.63kDa；理论等电点为5.66。

实施例2 胁迫诱导下StPP5基因表达上升

采用水杨酸（SA）化学试剂来胁迫其诱导上调表达，取生长整齐、健康无病的9～10叶期幼苗进行化学处理如下：水杨酸溶于水使得终浓度为50mM，对照处理为Tween20/水，以使其与相应的化学处理条件相似。所有植株在处理后于0h、12h、24h、48h、72h采样叶片并全部冻存与-70℃冰箱中。提取RNA用于半定量反转录PCR（RT-PCR）分析，内参采用组成型表达的GAPDH基因，引物分别为GAPDH1：5′-CAAGGACTGGAGAGGTGG-3′（SEQ ID NO.7）和GAPDH2：5′-TTCACTCGTTGTCG TAC-3′（SEQ ID NO.8)。PCR条件为：94℃预变性5min，然后94℃40s；53℃40s；72℃40s，最后72℃10min，循环数为26个。

取茄子黄萎病病原菌（Verticillium dahliae Kleb）强致病菌株，用以下两种方法培养：①在PDA固体培养基上25℃恒温培养2周，用灭菌水收集孢子制成孢子悬浮液（浓度5×10⁷/mL）；②菌落在PDA培养基上长至直径为3～5cm，从边缘打取直径0.4cm的菌片，移入Czapeck’s液体培养基中，每瓶移入2个菌片，于25℃恒温下振荡（120rpm）培养2周后，用8层纱布过滤，以考马斯亮蓝法测定并调整粗毒素浓度至8mg/mL。混合两种液体进行植株侵染以达到最强致病效果。侵染过程：从基质中小心取出整株幼苗用自来水洗净，将第1片真叶以下部分置于5mL离心管中，加入上述混合液直至与管口平，用封口膜密封管口，以防止液体蒸发。以无菌水处理为对照，接种苗置于25℃恒温生长箱，12h光照/12h黑暗，光照度为200mmol/(m·s)。接种后于0h、12h、24h、48h、72h采样叶片并全部冻存与-70℃冰箱中，提取RNA用于半定量反转录PCR（RT-PCR）分析，内参采用组成型表达的GAPDH基因。

水杨酸和大丽轮枝菌都可以诱导植物病程相关蛋白基因表达。分别取野生型茄子的茎和叶子作为材料，用SA和大丽轮枝菌菌液分别处理植株，然后在0h、12h、24h、48h、72h后检测StPP5转录表达水平，半定量结果显示：StPP5在未处理的野生茄子茎和叶子中均有一定量的表达，经SA处理后，叶中表达量随着处理时间的增加而增加，12h后表达量达到最高，并一直持续至48h，72h后降为本底水平。在茎中12h表达上升，但是在24h后表达量有所下降，随后48h表达又增加，72h后降为本底水平，处理后叶中的表达量多于茎中（图5）。经大丽轮枝菌侵染的茎中12h表达上升，一直保持到24h后，48h后表达有所下降，72h后降为本底水平，叶中表达量随着处理时间的增加而增加，24h后表达量达到最高，之后随时间推移而降低（图6）。

实施例3 野生茄子托鲁巴姆StPP5基因过表达载体的构建

根据同源序列作为模板，设计引物，克隆出带有酶切位点的全长，回收产物与PMD18-T Vector连接，转入大肠杆菌中扩增，提取质粒进行双酶切，将酶切产物回收并纯化，得到带酶切位点的目的片段，将目的基因片段与经过相应的双酶切后回收的pCAMBIA1304载体大片段连接，转化至大肠杆菌DH5α中，PCR挑取阳性单克隆菌落进行摇菌并提质粒，测序。测序结果表明目的基因已成功插入pCAMBIA1304载体。具体步骤如下：

在StPP5基因片段的cDNA正反向两端分别加上Nco Ⅰ、Spe Ⅰ酶切位点，StPP5的正向引物为P-S：5′-CATGCCATGGATGCCCGGTATGGAAGCTGAG-3′（SEQ ID NO.9），反向引物为P-A：5′-GGACTAGTTTAAGAAAACATGCGAAGGAAGTTGTTG G-3′（SEQ ID NO.10）。

对加酶切位点的PCR产物电泳后，用胶回收试剂盒纯化回收，回收产物与pMD18-T Vector相连，然后转入大肠杆菌DH5α感受态中，挑取单克隆进行检测，将得到的阳性菌落进行摇菌并提取质粒，用Nco Ⅰ和Spe Ⅰ酶于37℃进行双酶切，双酶切完全后电泳，用胶回收试剂盒纯化回收带有各自酶切位点粘性末端的目的基因，用于与载体的连接。

将提取的过表达载体pCAMBIA1304质粒用Nco Ⅰ和Spe Ⅰ两种内切酶于37℃进行双酶切，电泳，回收得大片段即为带Nco Ⅰ和Spe Ⅰ酶切位点粘性末端的重组载体的质粒部分。

将目的基因的双酶切产物与载体pCAMBIA1304双酶切产物按照摩尔比为(3～10):1混合，在T4连接酶的作用下于16℃下过夜连接，连接产物直接用于转化感受态大肠杆菌DH5α，PCR检测单克隆，选取阳性单克隆进行摇菌，提取重组质粒，经测序验证后命名为重组质粒1304-StPP5。

实施例4 利用农杆菌介导的转化法获得转StPP5基因烟草

采用农杆菌介导的基因转化方法，取烟草子叶先进行预培养2d，然后用农杆菌悬浮液侵染5min，在共培养培养基上共培养2d。将烟草叶片外植体用农杆菌侵染后，转到愈伤分化培养基上，15d左右产生愈伤组织，20d左右出现不定芽，随后将所有形成的不定芽转入含25mg/L Hyg B的MS培养基中进行二次筛选，非转化芽因为没有抗生素抗性，最终白化死亡。随后将得到的阳性植株转入MS培养基中扩繁，经荧光定量PCR验证，最终获得转基因烟草植株。具体步骤如下：

1 烟草无菌苗的获得

1)挑选少许饱满的烟草种子于1.5mL离心管中，先用无菌水洗3次。

2)取适量70%的酒精浸泡30s，弃上清，用无菌水洗1次。

3)取适量10%的NaClO，将种子放入其中摇动消毒10min，弃上清。

4)无菌水冲洗3～4次。

5)将种子播种于MS固体培养基上。

6)一周后种子萌发，三周左右烟草长出两片子叶。

2 烟草叶片在转化前的预培养

1)选取长势良好的烟草植株，切去子叶的两端，用剪刀剪成约0.5cm²的小块。

2)放于MS培养基上在培养箱内进行2天预培养。

3 农杆菌菌液的制备

将重组载体成功转化到农杆菌GV3101的菌液涂布平板，挑取单菌落，接种到1mL加有抗生素的LB液体培养基（含50mg/L Kan+50mg/L Rif）中进行活化，于28℃、200rpm条件下避光振荡培养24h。随后取200μL摇出的菌液加入到20mL的液体LB液体培养基（含50mg/L Kan+50mg/L Rif）中，于28℃、200rpm条件下振荡培养。在菌液到对数生长期（OD₆₀₀=0.5～0.6）时，4,000g离心10min，收集的菌体用MS液体培养基重悬，再离心收集菌体，最后用MS液体培养基稀释成OD₆₀₀=0.5～0.7的工程菌液（图1）。

4 烟草组织与农杆菌共培养

1)将预培养的烟草子叶放入农杆菌菌液悬浮液中侵染5min。

2)用无菌滤纸吸干叶片上的液体，置于共培养培养基（MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/L NAA）中。

3)28℃黑暗条件下共培养2d。

5 烟草植株的再生培养

1)筛选较好的子叶，用含250mg/L Cef的MS液体培养冲洗4～5次，除去多余的菌体。

2)取出子叶，放在无菌滤纸上面晾干液体，转入愈伤培养基（MS+2mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+250mg/L Cef+10mg/L Hyg B）中。

3)待愈伤长出后转入芽分化培养基（MS+3mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+250mg/L Cef+20mg/L Hyg B）中，4～5周可以看到愈伤分化出小芽。

4)每两周更换一次培养基，待芽长至1.5～2.0cm时，将芽切下插入生根培养基（MS+2mg/L NAA+250mg/L Cef+25mg/L Hyg B）中。一般情况1～2周后可长出1～4条根，并有4～6片叶子。

6 再生植株的抗性筛选

待植株长高后，把每棵苗的主茎从叶片的腋芽之间切开，插入生根培养基（MS+2mg/L NAA+250mg/L Cef+25mg/L Hyg B）中培养进行转基因植株的筛选。

7 转基因植株的扩繁

待转基因植株长高后，剪取带有腋芽的茎段，插入生根培养基中进行扩大繁殖，准备足够的材料进行下一步的检测。

同时设计对照试验，即没有经过农杆菌侵染的烟草，其它培养条件均相同。

8 转基因烟草的PCR分子检测

依据1304载体序列与目的片段序列设计一对跨载体与目的片段的引物来进行DNA烟草的PCR检测，1304-StPP5的引物为：S:5'-TTGGGGGAGATGTTACTAAAAGAT-3'（SEQ ID NO.11），A:5'-CCATAAGAGAAAGT AGTGACAAGTG-3'（SEQ ID NO.12）。以转化植株的基因组DNA为模板，未转化植株总DNA作为阴性对照进行扩增。1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。

9 荧光定量q-RT-PCR分析

从PCR鉴定结果为阳性的转基因植株中，取两种转基因植株各两株，未转基因烟草作为对照，剪取叶片提取RNA并反转录成cDNA，稀释6倍后用作q-RT-PCR的模板，根据StPP5基因序列设计荧光定量特异引物QP-S：5'-TCAAATAGTACTGCAAACA AGA-3'（SEQ ID NO.13），QP-A：5'-ATGCACTTGAAGGCAAATAATG-3'（SEQ ID NO.14）。以GAPDH为内参照进行实时荧光定量PCR（q-RT-PCR）分析，扩增程序：94℃1min，40×（95℃15s，54℃20s）

相对表达量的计算：在进行完q-RT-PCR后，可根据得到的CT值计算目标基因在不同物种，不同组织中的相对表达量，即2^-△△CT。其中：

△△CT＝（C_T.Target－C_T.GAPDH）×X－（C_T.Target－C_T.GAPDH）×0

X表示各物种的不同组织，0表示经GAPDH校正后1倍量的目标基因表达量。

转基因烟草StPP5表达的q-RT-PCR分析结果见图2。结果显示：与野生型对照相比，转基因植株P6中StPP5基因mRNA表达量高于对照23倍，P7的StPP5基因mRNA表达量高于对照4倍。

实施例5 转StPP5基因烟草抗病性分析

2.3.1 总蛋白的提取及浓度测定

1)目的蛋白粗提液的提取：按照李合生(2000)的方法，将转基因植株与野生型植株的叶片各称取1g剪碎，分别加入5ml磷酸缓冲液(0.05mol/L，含1％聚乙烯吡咯烷酮，pH7.0)，再加少量石英砂冰浴研磨。匀浆在15000g下离心10分钟，上清液即为总蛋白提取液。

2)标准曲线的制作：在试管中分别加入0、20、40、80、100μg蛋白标准溶液(BSA)，用水补足到100μl，加入3ml的染色液，混匀后室温放置15min。在595nm波长比色，读出吸光度，以各管的标准蛋白浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘出标准曲线。

3)蛋白含量的测定：取不同蛋白样品100μl加入3ml的染色液，摇匀，混匀后室温放置15min，在595nm下测定吸收值，代入标准曲线即可计算出样品蛋白含量。

利用转基因烟草蛋白粗提液进行大丽轮枝菌培养实验。用菌饼法（Quiroga，2001；刘浩，2009）检测转基因烟草蛋白提取液对V.dahiae的体外抑菌抑制活性。将提取的转基因植株和未转基因植株蛋白粗提液过滤灭菌，等蛋白量的涂布到PDA培养基上，用接种针或镊子将菌饼菌丝面朝下，移植到等蛋白单位培养基上，1个培养皿（直径90mm）中央接1个菌饼（直径5mm），在大丽轮枝菌适宜的生长条件下（25℃）培养7-10天，观察菌落的生长状况，测量抑菌圈直径，计算抑菌率，每板3个重复。实验设空白对照（水），阴性对照（未转基因植株）、和阳性（转基因植株），平行三个处理，每个处理重复3次，观察菌丝形态及菌柄大小变化。

抑菌率＝[对照菌落直径(mm)－处理菌落直径(mm)]/对照菌落直径(mm)

在10天培养后，涂有StPP5转基因烟草蛋白提取液的平板上，形成的大丽轮枝菌落要小于在涂有野生型烟草蛋白提取液平板上的菌落（图3）。采用测量比较直径的方法，对菌落生长进行了统计，含StPP5的转基因株系蛋白的抑菌率为72%（图4），表明含StPP5基因具有一定的抗病性。

Claims

1.核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的StPP5基因在构建抗黄萎病转基因烟草中的应用。

2.氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的StPP5基因编码的蛋白在构建抗黄萎病转基因烟草中的应用。

3.含有所述的StPP5基因的表达载体在构建抗黄萎病转基因烟草中的应用。

4.根据权利要求4所述的应用，其特征在于含有所述的StPP5基因的表达载体是以pCMBIA1304为出发载体，将权利要求1所述的StPP5基因插入pCMBIA1304的Nco Ⅰ和Spe Ⅰ酶切位点间所得。