KR101039184B1 - ＰｅｐＭｏＶ에 대한 내성이 증진된 고추의 형질전환체 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 PepMoV(pepper mottle virus) 유래의 HC-Pro(helper component-proteinase) 유전자를 포함하는 재조합 식물 RNAi 발현 벡터로 형질전환되어, PepMoV에 의한 바이러스병에 대한 내성이 증진된 식물체 및 이의 종자, 및 상기 벡터를 식물에 형질전환하여, HC - Pro 유전자의 유전자 침묵(gene-silencing)을 유도하는 단계를 포함하는 PepMoV에 의한 바이러스병에 대한 식물의 내성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
PepMoV, 고추, 내성, 아그로박테리움, 형질전환체

Description

ＰｅｐＭｏＶ에 대한 내성이 증진된 고추의 형질전환체 및 그 제조방법 {Transgenic pepper with enhanced tolerance to PepMoV and production method thereof}
본 발명은 고추얼룩바이러스(PepMoV: Pepper Mottle Virus) 유래의 HC - Pro 유전자로 형질전환하여 PepMoV에 의한 바이러스병에 대한 식물의 내성이 증진된 고추의 형질전환체 및 그 제조방법에 관한 것이다.
세계적으로 고추에 발생하여 피해를 주고 있는 바이러스는 50여 종 이상이며 한국에서 고추에 발생하는 바이러스 종류로는 담배모자이크바이러스(Tobacco mosaic virus: TMV) 군에 속하는 고추연한얼룩바이러스(Pepper mild mottle virus: PMMOV)와 담배연한모자이크바이러스(Tobacco mild green mosaic virus: TMGMV), 오이모자이크바이러스(Cucumber mosaic virus: CMV), 잠두위조바이러스(Broad bean wilt virus: BWV), 고추얼룩바이러스(Pepper mottle virus: PepMoV), 및 토마토반점위조바이러스(Tomato spotted wilt virus : TSWV) 등 6 종이 발생하고 있다.
고추작물은 육묘기에서부터 바이러스에 의한 피해를 입을 수 있는데 최근 포티바이러스(potyvirus)의 일종인 PepMoV에 의한 성장저해 또는 고추열매 피해가 증 가하고 있다. PepMoV는 진딧물에 의해 전이되며, 1991년 이후 국내에서 가장 많이 동정되는 potyvirus이다. 그러나 이 바이러스 자체만으로는 고추 피해가 cucumo virus인 CMV 보다 심하지 않으나, 대개의 경우 CMV, potyvirus인 PVY, tobamo virus인 PMMoV 등과의 복합감염에 의하여 피해가 더 커지는 경향이 있다.
PepMoV에 의해 유발되는 바이러스병에 대한 내성 육종자원이 없으므로, 일반적인 관행육종 방법을 통하여 PepMoV 내성 고추 품종을 개발하기는 매우 어렵다.
HC - Pro 유전자는 진딧물의 소화기관 내벽에 바이러스 외피 단백질과의 결합을 도움으로서 진딧물이 바이러스의 매개체가 되게 하는 역할을 한다. 이외에도 바이러스 단백질 프로세싱, 바이러스의 장거리 이동, RNA 복제, 유전자침묵 억제 등 여러 기능이 있다. 특히 HC - Pro 유전자 내 시스테인 단백질가수분해효소 도메인(cysteine proteinase domain)은 HC - Pro 유전자의 카르복실 말단에 위치하면서 유전적 보존성이 높다. HC - Pro 유전자가 들어 있는 형질전환 고추에 PepMoV가 침입하게 되면 상기 바이러스의 HC - Pro 유전자의 역할을 억제하여 고추 내 PepMoV 바이러스가 증식되지 않게 됨으로써 고추가 PepMoV 바이러스에 대한 내성을 가지게 된다.
RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 현상은 1998년에 선충(Caenorhabditis elegans)에서 최초 보고되었다 (Tavernarakis et al. 2000, Nat Genet. 24: 180-3). 그 후에 RNAi 현상은 선충은 물론 곤충, 식물, 균류 등의 다양한 생물종에 보존되어 있는 것으로 밝혀졌으며 생물에 공통적으로 포함되어 있는 핵산 차원에서의 방어 시스템임이 밝혀졌다. 이들 생물에서는 외부로부터 특정 dsRNA를 도입할 경우 표적 유전자 발현 억제가 확인되었으며, 특정 유전자가 녹-다운된 개체를 생산하는 방법으로도 이용되고 있다. RNA 간섭은 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA와 이에 대한 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA로 구성되는 이중나선 RNA(double strand RNA, dsRNA)를 세포 등에 도입하여 표적 유전자 mRNA의 분해를 유도함으로써 단백질의 발현을 억제할 수 있는 현상이다. RNAi를 이용한 유전자 녹-다운 방법은 간편하고 유전자의 발현 억제 효과가 우수하기 때문에, 최근에 각광받고 있는 방법이다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명에서는 HC - Pro 유전자의 유전자 침묵(gene-silencing)을 유도하는 재조합 식물 RNAi 발현 벡터를 식물에 형질전환하여, 형질전환 식물체가 PepMoV에 대해 야생형 식물체에 비해 상당한 내성의 증진을 보이는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 PepMoV 유래의 HC - Pro 유전자를 포함하는 재조합 식물 RNAi 발현 벡터로 형질전환 되어, PepMoV에 의한 바이러스병에 대한 내성이 증진된 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 HC - Pro 유전자를 포함하는 재조합 식물 RNAi 발현 벡터를 식물에 형질전환하여, HC - Pro 유전자의 유전자 침묵(gene-silencing)을 유도하는 단계를 포함하는 PepMoV에 의한 바이러스병에 대한 식물의 내성을 증진시키는 방법을 제공한다.
고추는 세계 채소 재배면적의 약 10%를 차지하며, 3 번째로 큰 시장을 점유하고 있으며, 바이러스에 의한 고추의 피해는 전체 고추작물의 병충해 피해 중 30%를 차지한다. 따라서, 시장 가치(marketing value)가 큰 고추에 PepMoV에 대한 내성을 갖는 고추를 개발함으로써 바이러스 피해를 줄일 뿐 아니라 진딧물 방제에 농약 사용 및 노동력 절감 효과를 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명은 작물산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PepMoV 유래의 HC - Pro 유전자를 포함하는 재조합 식물 RNAi 발현 벡터로 형질전환되어, PepMoV에 의한 바이러스병에 대한 내성이 증진된 식물체를 제공한다.
상기 HC - Pro 유전자는 HC - Pro 유전자 내 시스테인 단백질가수분해효소 도메인(cysteine proteinase domain)을 포함하는 서열을 말하며, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 재조합 식물 RNAi 발현 벡터는 예를 들면, 도 1에 기재된 pK7GWIWG2(II)::HC-Pro 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화 하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 식물 발현 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러 한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직배양 기간을 가질 필요는 없다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 7274; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 10991102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.
식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물이다.
"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
본 발명에서 형질전환 식물은 전체 식물체뿐만 아니라 그로부터 수득될 수 있는 조직, 세포 또는 종자를 포함할 수 있다.
본 발명의 HC - Pro 융합유전자로 형질전환된 식물은 PepMoV에 의한 바이러스병에 대한 탁월한 내성을 갖는다.
상기 식물은 바람직하게는 애기장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 고추(Capsicum annuum)이다.
본 발명은 또한, 상기 식물체의 종자를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1로 표시된 염기서열로 이루어지는 HC - Pro 유전자를 포함하는 재조합 식물 RNAi 발현 벡터를 식물에 형질전환하여, HC - Pro 유전자의 유전자 침묵(gene-silencing)을 유도하는 단계를 포함하는 PepMoV에 의한 바이러스병에 대한 식물의 내성을 증진시키는 방법을 제공한다.
HC - Pro 유전자의 유전자 침묵을 유도하는 방법으로는 당업계에 공지된 여러 가지 방법을 이용할 수 있다. 본 발명에서는 식물 바이러스 유전자 쪽으로 향하는 유전자 침묵 구축물로서 식물을 형질전환함으로써 식물체가 바이러스에 대한 내성을 가지는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: HC - Pro 유전자를 발현하는 식물 발현 RNAi 벡터의 제조
고추에 형질전환시키기 위한 식물 발현 RNAi 벡터 pK7GWIWG2(II)::HC-Pro (도 1)를 제조하였다.
선별 마커로는 카나마이신(kanamycin)을 사용하여 서열번호 1로 기재되는 HC-Pro 유전자 2 copy를 RNAi 시스템을 위하여 상호 역방향으로 결합시켜 제조하였다. 제조된 프라이머로 PCR을 수행하여 클로닝이 정상적으로 되었는지 확인하기 위하여 HC - Pro 유전자의 일부분에서 35S 프로모터의 일부분에 걸친 부위를 증폭시켰다. 이때, PCR은 전반응(precycling reaction)으로 94℃에서 5분간 변성시킨 다음, 94℃에서 30초, 58℃에서 30초 및 72℃에서 30초의 순서로 35회 반응을 반복한 후, 마지막 반응에서 72℃에서 5분간 연장반응시킴으로서 PCR 반응을 종료시켰다.
상기와 같이 제조된 각 벡터의 플라스미드 pK7GWIWG2(II)::HC-Pro를 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA105 (Agrobacterium tumefaciens EHA105)로 도입하여 식물의 형질전환에 사용하였다.
실시예 2: HC - Pro 유전자를 이용한 고추의 형질전환
고추 계통으로 THK와 C15를 형질전환에 사용하였다. 고추 형질전환 방법은 특허(등록:10-0522437)에 따라 수행하였으며, 다른 계통을 사용하였으므로 약간 수정하였다.
자엽이 약 45°정도 벌어졌을 때, 생장점이 따라오지 않도록 하여, 자엽의 양쪽을 절단하여 20㎖의 MS 액체 배지가 들어 있는 코니칼튜브(cornical tube)에 넣고, 2㎖의 아그로박테리움 용액을 첨가한 다음, 이를 약 15분 동안 흔들어 주면서 전체에 걸쳐 균이 도포되게 하였다. 여과지에 올려 절편체의 수분을 제거하여 약간 건조시켜 치상한 다음 48시간 동안 광배양하였다. 아그로박테리움을 제거하기 위해서 세정 버퍼로는 1/2 MS, 수크로스 1.5%, pH 5.8를 사용하여, 세포탁심(cefotaxime) 800mg/L에서 2회, 500mg/L에서 2회 총 4회 세정하였다. 여과지를 이용해 절편체를 완전히 건조시킨 후 선발배지에 치상하여 3~4주 간격으로 계대배양하여 캘루스(callus)가 형성되고 신초가 나올 때까지 배양하였다. 캘루스에서 자란 잎 (재분화된 잎의 길이가 1cm 이상)을 선발, 이를 신장 배지 (MS, 수크로스 3%, 아가(agar) 0.8%, pH 5.7, 제아틴(Zeatin) 1.0mg/L, Km 60~100mg/L, Cef 300mg/L)에서 신장시키고, 뿌리 유기 배지 (MS, 수크로스 3%, agar 0.8%, pH 5.8- Km 0-20mg/L, Cef 300 mg/L)에서 뿌리를 유기시켰다. 뿌리가 유기된 녹색 식물체들은 버미큐라이트, 퍼라이트, 피트모스 (2:1:1)를 혼합한 상토에 옮겨 심고, 미리 물에 불려 놓은 지피포트(jiffy pot)에 뿌리에 상처가 나지 않도록 옮겨 심었으며, 10~14일 정도 배양실에서 순화하였다. 식물체 지상부가 10㎝이상 성장하고, 뿌리가 jiffy pot에 활착되면 온실(육묘장)로 옮겨주었다.
도 2는 형질전환된 고추 식물체의 발생 단계를 보여준다. 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 형질전환된 고추 식물체는 정상적인 식물체로 성장하는 것으로 나타났다.
상기와 같이 형질전환시킨 고추 식물체의 형질전환율을 분석한 결과, PCR 양성 반응을 보인 신초는 0.4%를 나타내었다 (표 1).
표 1. 고추 형질전환 효율
Number of explants Number of shoots (%) PCR positive shoots (%)
1600 72(4.5%) 6(0.4%)
실시예 3: 형질전환 고추의 PCR 분석
형질전환 후 HC - Pro 유전자가 식물체 내로 도입되었는지 여부를 확인하기 위하여, 중합효소연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction)을 수행하였다. 선발된 소식물의 잎 절편으로부터 DNA를 분리한 후, 프라이머쌍 (35S: F 5'-atgacgcacaatcccactat-3' <서열번호 2>; HC-Pro: R 5'-agaaagctgggtaccaactctatagtgcttta-3' <서열번호 3>)을 이용하여 PCR을 수행하였다. 이때, PCR은 전반응(precycling reaction)으로 94℃에서 5분간 변성시킨 다음, 94℃에서 30초, 58℃에서 30초 및 72℃에서 30초의 순서로 35회 반응을 반복한 후, 마지막 반응에서 72℃에서 5분간 연장반응시킴으로서 PCR 반응을 종료시켰다. 도 3은 형질전환 고추 식물체의 PCR 분석 결과를 보여준다. 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 형질전환 고추 식물체에서는 300bp의 PCR 산물을 관찰할 수 있었다.
실시예 4: 형질전환된 고추 식물체의 서던 블럿 분석
형질전환 후 HC - Pro 유전자가 식물 내로 도입되었는지 여부를 확인하기 위하여, 서던 블럿 분석을 수행하였다. 구체적으로, 선발된 소식물의 잎 절편으로부터 염색체 DNA를 분리한 후, EcoRI 및 XbaI로 절단하고, 절단 산물을 아가로스 겔 전 기영동을 수행하고, HC - Pro 유전자를 프로브로 이용하여 통상적인 서던 블럿 분석 절차에 따라 서던 블럿 분석을 수행하였다.
도 4는 형질전환된 고추 식물체의 서던 블럿 분석 결과를 보여준다. 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 형질전환 고추 식물체 T20에서 EcoRI 절단 시 1, 2 및 3 시료에서는 2.8kb 밴드가, 4, 5 및 6 시료에서는 3.6 kb 밴드가 나타났으며, 형질전환 고추 식물체 M6에서는 XbaI 절단 시 1, 2 및 3 시료에서는 1.4kb 및 6.0kb 밴드가, 4, 5 및 6 시료에서는 1.4 kb 밴드만 나타났다. 따라서 시료 1, 2 및 3은 같은 origin이며 시료 4, 5 및 6도 같은 origin으로서 각각 HC - Pro 유전자가 단일 copy로 삽입되었음을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 형질전환된 고추 식물체의 PepMoV 내성 시험
PepMoV 내성 시험을 위해서 고추 T1 각 200 점을 온실에 육묘로 재배하였다. 파종 후 본엽 2 개가 나왔을 때 (약 3~4주 후) PepMoV를 엽면에 접종하였으며 (접종원:버퍼 = 1:4 비율의 농도), 접종 3~4주 후 내성의 유무를 관찰하였다. 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 합성 HC - Pro 유전자 형질전환 고추의 경우 PepMoV 의해 고추 잎이 전혀 손상되지 않은데 반해, 비형질전환 고추의 잎은 모자이크 무늬의 질병이 발생한 것을 알 수 있다.
도 6a, b에서 보이는 바와 같이 접종 후 선발한 형질전환체를 약 3개월간 유지하였을 때 내성을 가진 고추 형질전환체는 정상적으로 발육하였고, 비형질전환체 고추는 바이러스 피해로 인하여 정상적으로 발육이 되지 않았다.
도 7은 각각 T20과 M6 고추 형질전환체 중 PepMoV에 강선발한 개체들을 자가수분을 하여 T3 세대 종자를 확보한 뒤, 각각의 GM 고추 T3 세대당 100 점의 육묘를 재배하여 접종시험을 하였다. 각 형질전환체 계통에서 98 점이 PepMoV에 대한 내성을 가지는 것으로 나타남으로써 매우 내성이 높은 GM고추가 개발된 것을 확인하였다.
도 1은 pK7GWIWG2(II)::HC-Pro 벡터의 모식도이다.
도 2는 형질전환된 고추 식물체의 발생 단계별 그림이다. A: 선발 배지, B: 신초 유도, C: 뿌리유도, D: 순화, E: 토양순화.
도 3은 형질전환 고추 식물체의 PCR 분석 결과를 나타내는 그림이다. N1: 비형질전환체; 1~30: 형질전환체; P1: pK7GWIWG2(II)::HC-Pro 벡터; P2, P3: 양성 대조구로서 pK7GWIWG2(II)::HC-Pro 벡터가 들어있는 아그로박테리움 세포 배양.
도 4는 형질전환된 고추 식물체의 서던 블럿 분석 결과이다. 형질전환체: 1~3 (T20, THK 계통); 4~6 (M6, C15 계통); 비형질전환체: N1, N2.
도 5는 형질전환 고추 (순화 후 1개월)에 PepMoV 접종 약 2~3주 후, 이병성일 경우 잎에 바이러스로 인한 모자이크 무늬의 질병의 발생이 관찰되는 현상을 보여준다. Tolerant: 내성; Susceptible: 이병성. M6 및 T20: 형질전환체; Control: 비형질전환체.
도 6은 형질전환 고추 (순화 후 3개월) 및 비형질전환 고추의 PepMoV에 대한 내성의 결과를 보여준다. 도 6a: M6; 도 6b: T20.
도 7은 형질전환 고추를 각 3 세대에 걸쳐 선발한 후 내성의 정도를 조사한 결과를 보여준다. C15는 M6의 대조구 계통이며 THK는 T20의 대조구 계통이다.
<110> NONG WOO BIO CO., LTD <120> Transgenic pepper with enhanced tolerance to PepMoV and production method thereof <130> PN09233 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1308 <212> DNA <213> HC-Pro of PepMoV <400> 1 tcaacatctg aagcattttg gagcggtcta gagaagaagt ggagcgtgat gcgcaagcca 60 accgcgcata cttgtaaacc gacgtattcg gtttcgaatt gtggggaagt agccgctatt 120 atagcgcaag ccttatttcc gtgccacaag ttgacgtgtg gtgaatgctc gaaagagatt 180 tgcgatctca cttcgagtga atgcgtgcaa gagttataca agaatatctc tttggcactg 240 gaaaggatga acaatctaca tcccgaattt caacacattg ttaaggtgtt gagcgttgtt 300 aggcagctca ctgaagcatc caatcatggg atggaagtat tcgatgaaat cttcaaaatg 360 attggatcca aaacacagag tcctttcact catttaaata agctcaatga atttatgttg 420 aaagggaacg agaatacaag tgaggaatgg ttgactgctc gacaacgctt aaaggagctg 480 gtgagatttc agaagaatag aactgataat ataaagaaag gtgacttggc atcattcaga 540 aataagcttt ctgctcgtgc acagtacaat ttgtatttat catgcgataa tcagcttgac 600 aagaatgcta gttttctatg gggtcagcga gaataccatg cacgtcggtt tttcctaaac 660 ttctttcaac aaatagaccc atcaaaaggt tatttgtcgt atgaagatcg gaccatacca 720 aatggttctc gaaagttagc tataggcaac ttaattgttc cactcgattt agctgaattc 780 cgaaaacgca tgaaaggcat cgacactcag caaccaccaa ttggcaagta ctgtacaagc 840 caattggatg ggaattttgt gtatccgtgc tgctgcacga cgcttgatga tggccaacca 900 attcgatcag ctgtttacgc accgactaag aaacatttag ttgttggtaa cacaggagac 960 acaaagtaca tcaacttgcc taaaggagat acagagatgc tatatattgc actcgatggc 1020 tattgttaca ttaacattta tctggcaatg ttggtcaata taagcgagga agaggccaag 1080 gacttcacaa agaaagttcg ggatattttc atgccaaagc ttgggaagtg gccaacattg 1140 atggatttgg ctacgacatg tgctcaactt cggatattcc accctgatgt acatgacgca 1200 gagctgcctc gtattctagt ggatcacaac acacaaacat gtcatgtggt cgattcatat 1260 ggatcaatta gtactgggta tcacattctg aaagctgcaa ctgtttca 1308 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 35S F <400> 2 atgacgcaca atcccactat 20 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HC-Pro R <400> 3 agaaagctgg gtaccaactc tatagtgctt ta 32

Claims (7)

  1. PepMoV(pepper mottle virus) 유래의 HC - Pro(helper component-proteinase) 유전자를 포함하는 재조합 식물 RNAi 발현 벡터로 형질전환되어, PepMoV에 의한 바이러스병에 대한 내성이 증진된 식물체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 HC - Pro 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 식물체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 재조합 식물 RNAi 발현 벡터는 도 1에 기재된 pK7GWIWG2(II)::HC-Pro 벡터인 것을 특징으로 하는 식물체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 식물체는 고추인 것을 특징으로 하는 식물체.
  5. 제1항에 따른 식물체의 종자.
  6. PepMoV 유래의 HC - Pro 유전자를 포함하는 재조합 식물 RNAi 발현 벡터를 식물에 형질전환하여, HC - Pro 유전자의 유전자 침묵(gene-silencing)을 유도하는 단계를 포함하는 PepMoV에 의한 바이러스병에 대한 식물의 내성을 증진시키는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 식물은 고추인 것을 특징으로 하는 방법.
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Virology, Vol.320, pp.107-120, 2004
Virus Genes Vol.25, No.1, pp.45-57, 2002

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