KR101219013B1

KR101219013B1 - Ａｂｆ3 유전자로 형질전환된 가뭄 저항성 조롱박 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR101219013B1
Application number: KR1020100099285A
Authority: KR
Inventors: 한지학; 이소연; 정민; 신윤섭
Original assignee: 농업회사법인 주식회사 농우바이오
Priority date: 2010-10-12
Filing date: 2010-10-12
Publication date: 2013-01-09
Also published as: KR20120037678A

Abstract

본 발명은 애기장대 유래의 ABF3(Abscisic acid responsive elements-binding factor 3) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 가뭄 저항성을 갖는 조롱박 식물체 및 이의 종자, 상기 재조합 벡터를 식물에 형질전환하여 식물의 가뭄 저항성을 증가시키는 방법 및 상기 재조합 벡터로 조롱박 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 가뭄 저항성을 갖는 조롱박 식물체의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

ＡＢＦ3 유전자로 형질전환된 가뭄 저항성 조롱박 및 이의 제조 방법{Bottle gourds resistant to drought transformed with ABF3 gene and production method thereof}

박과 작물은 묘(접수)를 키워서 대목묘와 접목을 한 다음 접목묘를 가식하고 약 1달 뒤 포장에 정식을 하여 재배한다. 즉 박과 작물의 근력과 초세가 약해서 종자를 직파하지 않고 접목을 하여 재배하게 된다. 현재 우리나라의 대목 시장은 대부분 plug묘 시장이며 plug묘 총 시장은 1100억 원이고 그 중에서 박과 작물의 plug묘 시장은 약 300억 원 정도가 된다. 수박의 생산물 시장은 국내만 약 7000억 원의 시장이 형성되어 있기 때문에 우수한 대목을 개발한다는 것은 수박품종 육성 및 생산에 지대한 영향을 미친다. 수박 대목으로는 참박을 사용하는데 대목의 생리적, 유전적 형질에 따라 수박 품종의 생장과 果 품질이 달라진다. 특히 내가뭄성 대목 개발은 매우 중요하다. 여름에 온도가 섭씨 30도 상승하면 역시 초세나 뿌리형성이 약해져 내한발성 대목이 필요하지만 이에 대한 내가뭄성 유전자원이 없는 실정이다.

따라서 생명공학을 이용하여 고부가가치 가뭄 저항 대목을 개발하는 기술이 요구되며 현재 이러한 기술개발은 국제적으로도 보고된 바가 없다. 따라서 산업적으로도 독보적이어서 연구개발이 매우 필요한 상태이다. 대목은 일본과 대만에서도 많이 이용하고 있으며, 그리고 중국에서도 시장이 형성되고 있어 앞으로 고부가가치 대목은 수출 품목으로 기대가 된다. 현재 세계 어느 누구도 참박의 형질전환은 성공하지 못하고 있다. 반면에 조롱박은 성공하였다 (Han et al., Plant Cell Rep. 2005, 23: 692-8).

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명에서는 조롱박에 ABF3 유전자를 넣어서 가뭄에 저항성을 갖는 조롱박을 먼저 개발함으로써, 이를 향후 참박에 교배하여 가뭄에 저항성을 갖는 참박 개발을 위한 대목으로서 이용하고자 한다. 형질전환체인 대목은 GMO이지만 접수인 수확작물은 non-GMO이기 때문에 GMO에 대한 사회적 비판을 피해 갈 수 있다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 애기장대 유래의 ABF3(Abscisic acid responsive elements-binding factor 3) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 가뭄 저항성을 갖는 조롱박 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 애기장대 유래의 ABF3 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질전환하여 ABF3 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 가뭄 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 애기장대 유래의 ABF3 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 조롱박 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 가뭄 저항성을 갖는 조롱박 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명에 의해 생산되는 ABF3 유전자가 도입되어 가뭄 저항성을 갖는 조롱박은 향후 시장 가치(marketing value)가 큰 대목으로 사용할 수 있다.

도 1은 pK2GW7-ABF3 벡터의 모식도이다.
도 2는 형질전환된 조롱박 식물체의 발생 단계를 보여준다. A: 선발 배지, B: 신초 신장, C: 뿌리유도, D: Jiffy 순화, E: 개체성장, F: 과실성숙, G: 수확과실.
도 3은 형질전환 조롱박 식물체의 PCR 분석 결과를 보여준다. M: 분자마커; P: 양성 대조구; 형질전환하지 않은 식물체; 형질전환체: ABF3 (13)- T₂, ABF3 (248)-BC₁T₁
도 4는 형질전환된 조롱박 식물체의 서던 블럿 분석 결과이다. N: 형질전환하지 않은 식물체; 1-13: 형질전환체.
도 5는 형질전환 조롱박의 T₂, BC₁T₁의 가뭄 저항성 실험을 보여준다.
도 6은 형질전환 조롱박과 대조구와의 가뭄 저항성 정도를 수치화한 데이터(2009)이다.
도 7은 형질전환 조롱박과 대조구와의 가뭄 저항성 정도를 그래프로 나타낸 데이터(2009)이다.
도 8은 형질전환 조롱박과 대조구와의 가뭄 저항성 정도를 수치화한 데이터(2010)이다.
도 9는 형질전환 조롱박과 대조구와의 가뭄 저항성 정도를 그래프로 나타낸 데이터(2010)이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 애기장대 유래의 ABF3(Abscisic acid responsive elements-binding factor 3) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 가뭄 저항성을 갖는 조롱박 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

상기 ABF3 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, ABF3 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.

폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 식물체는 조롱박에 한정되지 않고, 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료작물류일 수 있다. 바람직하게는, 상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 조롱박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 또는 완두 등의 쌍자엽식물일 수 있으며, 가장 바람직하게는 조롱박이다.

본 발명은 또한, 상기 식물체의 종자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 종자는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 조롱박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 또는 완두 등의 쌍자엽식물의 종자이며, 가장 바람직하게는 조롱박의 종자이다.

상기 재조합 벡터는 바람직하게는 도 1에 기재된 pK2GW7-ABF3 벡터일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

본 발명의 재조합 벡터는 식물 발현 벡터일 수 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 ABF3 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

상기 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 재조합 벡터를 식물에 형질전환하여 ABF3 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 가뭄 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명에서 용어 "가뭄 저항성"은 정상 상황에 비해 물 이용가능성의 감소에 의해 유도된 스트레스에 대한 식물의 증가된 저항성 또는 내성, 및 물이 보다 적은 환경에서 생존하고, 비교적 우수한 방식으로 수행하는 식물의 능력을 나타내는 의미로 사용된다. 식물 함수량, 총 수분 포텐셜 (water potential), 삼투 포텐셜 (osmotic potential), 및 팽압에 유리한 영향을 주는 ABF3 유전자의 발현은 가뭄에 견디는 식물의 능력을 향상시킬 수 있다.

본 발명은 또한, 애기장대 유래의 ABF3 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 조롱박 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 조롱박 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 가뭄 저항성을 갖는 조롱박 식물체의 제조 방법을 제공한다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다. 바람직하게는, 상기 식물체는 조롱박이다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

형질전환에 이용되는 재조합 벡터 및 숙주 세포로 이용될 수 있는 식물은 전술한 바와 같다.

또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 딸기 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: ABF3 유전자를 발현하는 식물 발현 벡터의 제조

조롱박에 형질전환시키기 위한 식물 발현 벡터 (도 1)를 제조하였다.

선별 마커로 카나마이신(kanamycin)을 사용하는 pK2GW7 벡터에 ABF3 유전자 서열을 CaMV 35S 프로모터에 정방향으로 결합시켜 제조하였다. 이때, ABF3 유전자는 SpeI 및 NcoI 제한효소부위에 삽입되어 있었다. 제조된 프라이머로 PCR을 수행하여 클로닝이 정상적으로 되었는지 ABF3 유전자를 증폭시켰다. 이때, PCR은 전반응(precycling reaction)으로 94℃에서 5분간 변성시킨 다음, 94℃에서 1분, 60℃에서 1분 및 72℃에서 1분 20초의 순서로 35회 반응을 반복한 후, 마지막 반응에서 72℃에서 5분간 반응시킴으로서 PCR 반응을 종료시켰다.

상기와 같이 제조된 각 벡터의 플라스미드 pK2GW7-ABF3을 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA105 (Agrobacterium tumefaciens EHA105)로 도입하고 식물의 형질전환에 사용하였다.

실시예 2: 아그로박테리아를 이용한 ABF3 유전자의 조롱박 형질전환

조롱박은 G5 inbred line의 자엽을 이용하였다. 생장점이 배제되도록 절단한 자엽을 아그로박테리움 배양액(100 μM acetosyringone, 20 ㎖ MS 액체배지)이 들어 있는 코니칼튜브(cornical tube)에 넣고, 100 rpm으로 20분 동안 흔들어 주면서 배축에 전반적으로 균이 도포되게 하였다. MS 액체 배지는 버리고, 과도한 MS 용액은 멸균된 여과지로 제거하였다. 아그로박테리움을 감염시킨 조롱박의 자엽을 MS 공동배양(cocultivation) 배지(MS, 3% sucrose, 3 mg/L BA, 0.001 mg/L AV, 50 μM acetosyringone)에 7개씩 놓고 7일 동안 광조건 하에서 배양하였다. 이후 세척액(1/2 MS, 2% sucrose, 500 mg/L cefotaxime)이 담긴 입구가 큰 용기에 자엽 절편을 넣고 교반(110 rpm)하여 아가(agar)와 균을 제거하였다.

형질전환된 자엽을 선발하기 위하여 선발 배지(MS, 3% sucrose, 3 mg/L BA, 0.5 mg/L AgN0₃, 100 mg/L kanamycin, 500 mg/L cefotaxime)에서 25℃, 광조건 하에서 배양하였다. 자엽으로부터 신초(shoot)가 형성되면 이를 신장 배지 (MS, 3% sucrose, 500 mg/L cefotaxime, 50 mg/L Kanamycin)에서 신장시키고, 발근배지(MS, 3% sucrose, 0.1 mg/L IAA, 500 mg/L cefotaxime + 50 mg/L Kanamycin)에서 뿌리를 유기시켰다. 발근된 녹색 식물체들은 지피포트에 옮겨 심고, 1-2 주일간 순화(acclimation)시킨 후, 토양 포트에 옮겨 온실에서 재배하였다.

ABF3 유전자가 형질전환된 형질전환 조롱박들은 순화 후 비닐하우스에서 신장을 더 시킨 다음 자가수분시켜 후대 종자를 획득하였다.

도 2는 형질전환된 조롱박 식물체의 발생 단계별 그림이다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 형질전환된 조롱박 식물체는 정상적인 식물체로 성장하는 것으로 나타났다.

이렇게 형질전환시킨 조롱박 식물체의 형질전환율을 분석한 결과, PCR 양성 반응을 보인 신초는 0.91%를 나타내었다 (표 1).

조롱박 형질전환 효율

배양절편의 수	신초의 수 (%)	PCR 양성인 신초 (%)
1,315	285(21.7)	12(0.91)

실시예 3: 형질전환 조롱박의 PCR 분석

형질전환 후 ABF3 유전자가 식물체 내로 도입되었는지 여부를 확인하기 위하여, 중합효소연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction)을 수행하였다. 구체적으로, 선발된 소식물체의 잎 절편으로부터 염색체 DNA를 분리한 후, 정방향 프라이머 5'-ATG ACG CAC AAT CCC ACT AT-3'(서열번호 2: 35S 프로모터 부위)와 역방향 프라이머 5'-AGG GCG CTC TTT GGA GTC AG-3'(서열번호 3: ABF3 유전자 부위)를 PCR 반응에 이용하였다. 이때, PCR은 전반응(precycling reaction)으로 94℃에서 5분간 변성시킨 다음, 94℃에서 1분 60℃에서 1분 72℃에서 1분 20초의 순서로 35회 반응을 반복한 후, 마지막 반응에서 72℃에서 5분간 반응시킴으로서 PCR 반응을 종료시켰다. 도 3은 형질전환 조롱박 식물체의 PCR 분석 결과를 나타내는 그림이다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 형질전환된 조롱박 식물체에서는 1.6 kb의 PCR 산물을 관찰할 수 있었으며, T₁, T₂ 세대에서 유전자가 삽입된 개체들을 선발하였다.

실시예 4: 형질전환된 조롱박 식물체의 서던 블럿 분석

형질전환 후 ABF3 유전자가 식물 내로 도입되었는지 여부를 확인하기 위하여, 서던 블럿 분석을 수행하였다. 구체적으로, 선발된 소식물의 잎 절편으로부터 염색체 DNA를 분리한 후, Kpn I으로 절단하고, 절단 산물을 아가로스 겔 전기영동을 수행하고, ABF3 유전자를 프로브로 이용하여 통상적인 서던 블럿 분석 절차에 따라 서던 블럿 분석을 수행하였다.

도 4는 형질전환된 조롱박 식물체의 서던 블럿 분석 결과이다. 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 형질전환 조롱박 식물체에서 1, 2 레인(lane)은 같은 유래(origin)로 단일 카피(single copy), 그리고 13 레인은 다른 유래(origin)로 단일 카피임을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 형질전환된 조롱박 식물체의 가뭄 저항성 시험

가뭄 저항성 검정을 위해서 조롱박 BC₁T₁, T₂ 총 100점을 온실에서 재배하였다. 정식 후 45일 이후부터 조롱박에 15일간 물을 주지 않았다. 15일 후 물을 7일간 주기 시작하여 45일간 더 관찰하였다. 대조구는 두 그룹으로 나누어 물을 계속 주는 그룹과 형질전환체와 같은 조건으로 가는 그룹으로 실험을 하였으며, 각 그룹당 20점을 재배하였다(2009년 실험).

도 5는 형질전환 조롱박 및 비형질전환 조롱박 간에 가뭄에 대한 저항성 결과를 보여준다. 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 형질전환 조롱박의 경우 잎이 전혀 손상되지 않은 개체들이 선발된 반면, 비형질전환 조롱박은 100% 고사하였다. 형질전환 조롱박의 각 조롱박 BC₁T₁, T₂ 중에서 약 20%, 30% 수준에서 가뭄에 저항성인 개체들을 선발할 수 있었다. 도 6은 가뭄의 정도를 수치화하기 위해서 잎 1cm x 1cm 면적의 생중량(fresh weight)을 측정하였다. 그 수치를 그래프로 전환한 그림이 도 7로서 형질전환체의 가뭄에 대한 저항성 및 정상으로 회복되는 과정을 볼 수 있다. 도 8과 9는 2009년에 선발한 가뭄 저항성 개체들을 대상으로 자가수분과 여교배를 실시하여 2010년에 그 다음 세대들을 확보하였고, 그 세대들로부터 다시 반복실험을 한 결과로서 2009년처럼 가뭄에 강한 같은 결과를 보여 주었다.

따라서, ABF3 유전자가 형질전환된 조롱박은 가뭄에 대해 매우 강한 저항성을 보인다는 것을 알 수 있었다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 애기장대 유래의 ABF3(Abscisic acid responsive elements-binding factor 3) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 가뭄 저항성을 갖는 조롱박 식물체.
삭제
제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 도 1에 기재된 pK2GW7-ABF3 벡터인 것을 특징으로 하는 조롱박 식물체.
제1항에 따른 조롱박 식물체의 종자.
삭제
서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 애기장대 유래의 ABF3(Abscisic acid responsive elements-binding factor 3) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 조롱박 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 조롱박 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 가뭄 저항성을 갖는 조롱박 식물체의 제조 방법.