JP2007527717A - ウイルス性疾患に耐性がある接木植物及びその生成法 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)以下のものに動作可能に連結した少なくとも1つの植物の発現可能なプロモーター、
(b)少なくとも1つの二本鎖RNAを形成するRNA配列をコードする核酸配列であって、二本鎖RNA分子がウイルスゲノムの標的セグメントのセンスヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも20個の隣接ヌクレオチドの第1ヌクレオチド配列、及び前記ウイルスゲノムの前記標的セグメントのセンスヌクレオチド配列の相補配列と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも20個の隣接ヌクレオチドの第2ヌクレオチド配列を含む核酸配列、及び場合によっては、
(c)転写終了シグナルを含む。
(a)以下のものに動作可能に連結した少なくとも1つの植物の発現可能なプロモーター、
(b)ステム−ループの形の少なくとも1つの二本鎖RNAを形成するRNA配列をコードする核酸配列であって、二本鎖RNA分子がウイルスゲノムの標的セグメントのセンスヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも20個の隣接ヌクレオチドの第1ヌクレオチド配列;前記ウイルスゲノムの前記標的セグメントのセンスヌクレオチド配列の相補配列と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも20個の隣接ヌクレオチドの第2ヌクレオチド配列を含む核酸配列;及びスペーサー配列;及び場合によっては、
(c)転写終了シグナルを含む。
本発明は、根茎及び接ぎ穂を含む、ウイルス性疾患に耐性がある接木植物に関する。抗ウイルスタンパク質の発現による以外の植物ウイルスに対する耐性を与えるDNA構築体を用いて形質転換した植物は、根茎の供給源として働き、ウイルス性疾患に対して感受性がある植物は、接ぎ穂の供給源として働く。接ぎ穂を根茎に接木することによって、その植物全体がウイルス感染から保護される。
用語「植物」は、その最も広い意味で本明細書において使用する。植物は任意の種類の樹木、草本、多年生又は一年生植物を含むが、これらだけには限られない。植物はさらに、植物の分化の任意の段階に存在する構造体に大部分は分化した複数の植物細胞を指す。このような構造体には根、茎、苗条、葉、花、花弁、果実などがあるが、これらだけには限られない。
(a)以下のものに動作可能に連結した少なくとも1つの植物の発現可能なプロモーター、
(b)少なくとも1つの二本鎖RNAを形成するRNA配列をコードする核酸配列であって、二本鎖RNA分子がウイルスゲノムの標的セグメントのセンスヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも20個の隣接ヌクレオチドの第1ヌクレオチド配列、及び前記ウイルスゲノムの前記標的セグメントのセンスヌクレオチド配列の相補配列と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも20個の隣接ヌクレオチドの第2ヌクレオチド配列を含む核酸配列、及び場合によっては、
(c)転写終了シグナルを含む。
(a)以下のものに動作可能に連結した少なくとも1つの植物の発現可能なプロモーター、
(b)ステム−ループの形の少なくとも1つの二本鎖RNAを形成するRNA配列をコードする核酸配列であって、二本鎖RNA分子がウイルスゲノムの標的セグメントのセンスヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも20個の隣接ヌクレオチドの第1ヌクレオチド配列;前記ウイルスゲノムの前記標的セグメントのセンスヌクレオチド配列の相補配列と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも20個の隣接ヌクレオチドの第2ヌクレオチド配列を含む核酸配列;及びスペーサー配列;及び場合によっては、
(c)転写終了シグナルを含む。
バイナリーベクターpCAMSV54−kDaの構築
位置3629のAUGの上流に他の22個のヌクレオチドを有する推定54kDaのコード配列(図1A)を、Antignusら、上記によって作製した完全長クローンを使用して、pCambia2301バイナリーベクター(受託番号AF234316;Hajdukiewiczら、1994.Plant Mol Biol 25:989〜994)にクローニングした。この54kDaのコード配列は、その5’端においてZYMVの非コード領域(NCR)と、及びその3’端(T)においてNOSポリ−Aターミネーターと融合させた(図1B)。クローン遺伝子及びNPTIIマーカー遺伝子を、それぞれ切断型イチゴベインバンディングカリモウイルス(SVBV)プロモーター(したがってSVと表す)及び完全長SVBVプロモーターの下流にクローニングした(Wangら、2000.「ウイルス遺伝子(Virus Genes)」20:11〜17(図1B)。このDNA構築体を、T−DNAの左(LB)と右(RB)境界の間にクローニングした(図1B)。ZYMVの5’NCRと結合したSVプロモーターは、SVセンスプライマー(配列番号5:5’CGCTAGCTATCACTGAAAAGACAGC3’)及びNcoI部位(下線部)を有するZYMV NCRアンチセンスプライマー(配列番号6:
)を用いて、鋳型ΔSVBVpr−ZYMV−FLCクローン(Wangら、上記)からPCR増幅した。PCR断片(470bp)は、pGEM−Tベクター(Promega、Madison、WI、USA)にクローニングし、さらにpΔSVBVpr−NCRzyと表した。
(下線を引いたNcoI部位を有する54kDaのセンスプライマー、配列番号7)、
(下線を引いたBstEII部位を有する54kDaのアンチセンスプライマー、配列番号8)を用いて、クローンpUC3’−3.3kbからPCRによって増幅させた。推定54kDaのPCR断片(1461bp)はNcoI/BstEIIによって事前に消化し、NcoI/BstEIIによって消化したpΔSVBV−NCRzyにクローニングした。得られたクローンpΔSVBV−NCR54−kDaはEcoRI/BstEIIによって二重消化し、生成した挿入体はバイナリーベクターpCAMBIA2301にクローニングし、これをクローニング前にEcoRI/BstEIIによって二重消化した。pCAM35S−SV54−kDa由来の35Sプロモーター(NPTII遺伝子の上流に位置する)は、以下のように完全SVBVプロモーターで置換し:以前にpGEM−TにクローニングしSVBVprと呼ぶ(Wantら、上記)SVBVプロモーターは、EcoRI/BglII部位の二重消化によって切除し、ここでpCAMSV54−kDaと表すバイナリーベクター中の同じ部位にクローニングした。この最終構築体(図1B)はアグロバクテリア菌tumefaciensEHA105菌株中に導入し、これを使用して所望の植物を形質転換した。
ウイルスコートタンパク質及び3’非コード領域(NCR)をコードする完全遺伝子を含むZYMVゲノムの3’端(配列番号2、受託番号M35095)を、BamHI及びKpnI部位を有するプライマー(センスプライマー、5’ATGGATCCCTGCAGTCAGGCACTCAGCCAACTGTGGC3’、配列番号10)、及びNarI及びPstI部位を有するアンチセンスプライマー(5’ATGGCGCCGGTACCAGGCTTGCAAACGGAGTC3’、配列番号11)を用いてPCR増幅させた。このセグメントはZYMVイスラエル単離体から単離し、受託番号NC_0033224を有するZYMVゲノムの位置8538〜9588の核酸配列(配列番号9)と相同性がある。
アグロバクテリア菌の培養物を、適切な選択抗生物質及び100μMのアセトシリンゴンを含むLB培地において28℃で一晩増殖させ、次いで抗生物質を含まない培地中で同じ条件下において4時間継代培養した。0.5ODの最終濃度で3%のスクロースを含む液体MS培地(Murashige、T.及びSkoog、F.1962.Physiology Plantarum 15:473〜497)中に、細菌を沈殿及び再懸濁させた。形質転換法は、依然に記載されたもの(Tabeiら、1998.「植物細胞の報告書(Plant cell report)」17:159−164)と同様であり、幾つかの変更を行った。
改良種「Ilan」(Zeraim Gedera Co.、イスラエル)の内果皮除去したキュウリの種子を、70%エタノール中で1分間、次いで2%次亜塩素酸中で20分間のインキュベーションによって表面滅菌した。充分に洗浄した後、暗所中25℃で3%スクロース及び0.8%のOxoid寒天を含むMS培地において1〜2日間、種子をインキュベートした。種子胚を切り裂き、個々の子葉は、200μMのアセトシリンゴンを補った再生培地(MS培地、3%のスクロース、2mg/lのベンジルアミノプリン(BAP)、1mg/lのアブシジン酸(ABA)、0.8%のOxoid寒天)で、暗所中25℃において1〜2日間インキュベートした。子葉はアグロバクテリア菌の懸濁液に5分間浸し、濾紙上で乾燥させ、暗所中で2日間同時培養するために同じプレートに戻した。次いで外植片を選択培地(500mg/lのセファトキシム及び100mg/lのカナマイシンを補った再生培地)に移し、2週間に1回継代培養しながら16/8時間の光周期体制でインキュベートした。再生した若枝は切除し、生長培地(MS、3%のスクロース、1mg/lのジベレリン酸、0.1mg/lのBAP、0.1mg/lのABA、0.8%のOxoid寒天、500mg/lのセファトキシム及び100mg/lのカナマイシン)に移した。若枝の発根は、MS、3%のスクロース、0.5mg/lのインドール酪酸、0.8%のOxoid寒天、500mg/lのセファトキシム及び100mg/lのカナマイシン中で誘導した。発根した外植片は、さらなる増殖のために温室に移す前に、無感覚状態にするためにジフィー7ピートペレットに移植した。
無菌植物由来の葉の外植片を、200μMのアセトシリンゴンを補った再生培地(MS培地、3%のスクロース、1mg/lのベンジルアミノプリン(BAP)、0.1mg/lのナフタレン酢酸(NAA)、0.8%のOxoid寒天)で、暗所中25℃において1〜2日間インキュベートした。外植片はアグロバクテリア菌の懸濁液に5分間浸し、濾紙上で乾燥させ、暗所中で2日間同時培養するために同じプレートに戻した。次いで外植片を選択培地(500mg/lのセファトキシム及び250mg/lのカナマイシンを補った再生培地)に移し、2週間に1回継代培養しながら16/8時間の光周期体制でインキュベートした。再生した若枝は切除し、発根用培地(MS、3%のスクロース、0.8%のOxoid寒天、500mg/lのセファトキシム及び250mg/lのカナマイシン)に移した。発根した外植片は、さらなる増殖のために温室に移す前に、無感覚状態にするためにジフィー7ピートペレットに移植した。
個々の形質転換植物からの子孫を、以下のようにDNA構築体の分離に関してスクリーニングした:R1種子は表面滅菌し、100mg/lのカナマイシンの存在下で前に記載したのと同様に発芽させた。トランスジェニック種子(NPTII遺伝子を有する)は正常な根の分化を示し、一方で非トランスジェニック子孫の植物は、それらの萎縮した無枝の根によって容易に検出した。カナマイシン耐性/感受性の比を記録し、トランスジェニック実生苗木は他の実験において使用した。
カナマイシン耐性のR1実生苗木を、温室条件下においてウイルス耐性に関してスクリーニングした。
カナマイシン耐性のキュウリ植物に、50mMのリン酸バッファー(pH7.4)中に1mg/mlの精製CFMMV、又は50mMのリン酸バッファー(pH8.0)中に400μg/mlのウイルスRNAを機械的に接種した。大部分のトランスジェニック子孫に関して、10を超える実生苗木を接種によって最初にスクリーニングした。接種した実生苗木は、温室条件下に数週間保った。接種に対する応答性は症状を肉眼で調べることによって決定し、CFMMVの存在に関しては、1:1,000の希釈で調製した特異的な抗血清を用いるDAS−ELISAによって決定した(Antignusら、上記)。他の耐性分析は、接種後3週間でのタバコ属ベンサミアナ系及びシロバナヨウシュチョウセンアサガオへの機械的な戻し接種によって行った。
カナマイシン耐性のGUS発現タバコ植物に、ZYMVの全身伝播を得るためのヘルパーとして働いた、キュウリ緑斑モザイクウイルス(CGMMV)として仮に同定したトバモウイルスとZYMVを同時感染させた、タバコ植物由来の1:5の比で希釈した樹液を機械的に接種した。大部分のトランスジェニック子孫に関して、10を超える実生苗木を接種によって最初にスクリーニングした。接種した実生苗木は、温室条件下に数週間保った。接種に対する応答性は、1:2,000の希釈で調製した特異的なZYMV−CP抗血清を用いるELISAによって決定した。
キュウリの実生苗木は、CFMMV KGMMV、ZGMMV CGMMV及びキュウリ葉脈黄化ウイルス(CVYV)の培養を維持するための供給源植物として使用した。カボチャ植物は、ZYMV及びCMV−Fnyの接種源として使用した。蒸留水中で供給源植物の若葉をすり潰すことによって、接種物を調製した。
ウイルスRNAの転写を、発芽後3週間の実生苗木から抽出した全RNAのノーザンブロッティング及びRT−PCR分析によって測定した。若葉組織(300mg)を液体窒素中に微粉状体にすり潰し、製造者の教示書に従いTRI−REAGENTキット(Molecular Research Center、Inc.、Cincinnati、OH、USA)を用いてRNAを抽出した。RNA濃度はGeneQuaut(Pharmacia Biotech)によって測定し、異なる供給源由来の匹敵する量のRNAをゲル上に載せた。約30μgのそれぞれのサンプルを、ホルムアルデヒドを含む変性1.5%アガロースゲルに施した。ゲル中で分離したRNAは次いでHybond−NX膜(Amersham、NJ、USA)にブロッティングし、80WのUVランプ(Vilber Lourmat BLX−254、フランス)に2分間曝すことによって固定した。Rapid−hybバッファー(Amersham Pharmacia)を用いたプレハイブリダイゼーションを2時間行った。CFMMVの54kDa遺伝子(ヌクレオチド3824〜4693)の32P標識cDNAプローブ、及びランダムにプライマー処理した32P標識DNAプローブ(ランダムプライマーDNA標識混合キット;Biological Industries、Beit HaEmek、イスラエル)とのハイブリダイゼーションによって、形質転換植物においてCFMMVのRNAを検出した。接種植物中のCFMMVのRNAを検出するためのRT−PCRは、54kDa遺伝子の特異的プライマー(センス:5’GCTACGGAGCGTCCGCGG3’、配列番号12、及びアンチセンス:5’CGCGGTCGACTGTATGTCAT3’、配列番号13)を用いて、Araziら(2001.J Biotechnol 87:67〜82)に従い2〜5μgの合計RNAを用いる1−チューブ1−ステップ法で行った。RT−PCRサイクルは以下の通りであった:46℃で30分間;94℃で2分間、次に94℃、58℃及び72℃、それぞれ30秒間で35サイクル、並びに72℃において5分間の最後の1サイクル。さまざまなトバモウイルスの感染性アッセイ(図3)のためのRT−PCRは、以下のウイルスのCPゲノムの特異的プライマーを用いて2ステップで行った:
CGMMV(5’TCTGACCAGACTACCGAAAA3’、配列番号14、及び5’ATGGCTTACAATCCGATCAC3’、配列番号15);
KGMMV(5’GAGAGGATCCATGTTTCTAAGTCAGGTCCT3’、配列番号16、及び5’GAGAGAATTCTCACTTTGAGGAAGTAGCGCT3’、配列番号17);
ZGMMV(5’TCTATCGCTTAACGCAGC3’、配列番号18、及び5’ATGTCTTACTCTACTTCTGG3’、配列番号19);並びに
CFMMV(5’CAAGACGAGGTAGACGAAC3’、配列番号20、及び5’ATGCCTTACTCTACCAGCG3’、配列番号21)。RT−PCRは、i−サイクラー(Bio−Rad)においてRT−PCR AmpTaqキット(Perkin Elmer)によって行い、サイクリングステップは、37℃で1時間、及び1分間94℃の30サイクル、53℃(KGMMV)、52℃(ZGMMV、CGMMV)又は44℃(CFMMV)のアニーリング温度で40秒、1分間72℃、及び最後に72℃において10分間であった。
全ゲノムDNAを、CTAB法(Chen、D.H.及びRonald、P.C.1999.Plant Mol Biol Reporter 17:53〜57)によって(発芽後3週間で)若葉から抽出した。DNA溶液(1μl)を、CFMMVの54kDa遺伝子の配列(受託番号AF321057、配列番号4)に従うプライマーを含む25μlのPCR反応混合物に希釈した。2組のプライマー:位置3824及び4693に設定した第1プライマー(配列番号12及び配列番号13;図4)、及び位置3785及び4479に設定した第2プライマー(5’GAAAAAGGAGTTTTTGATCCCGCT3’、配列番号22、及び5’ACTGATATGCGTCTTCTTATGCCC3’、配列番号23;図3)を、54kDaの遺伝子を検出するために使用した。PCR条件は:94℃で2分間の1サイクル、並びに94、58及び72℃、それぞれ30秒、及び最後に72℃において5分間で35サイクルであった。
耐性のあるキュウリ系の同定及び特徴付け
pCAMSVの54kDa構築体を用いたアグロバクテリア菌仲介形質転換の後に、個々のR0形質転換体を成熟状態まで増殖させ、自家受粉させてR1種子を得た。植物ゲノム内のCFMMVの54kDa遺伝子の存在は、表1中に示す全てのカナマイシン耐性R1系に関するPCR分析によって確認した。耐性スクリーニングの後、14のR1系のうち8系が完全な耐性応答を示した(表1)。残りの系の幾つかは完全に感受性があり;他の系は部分的に耐性があるとして特徴付けた。接種した子葉中のCFMMVのRNAの蓄積を評価するための試みは一切行わなかった。しかしながら、ELISA及び戻し接種アッセイによって大部分の系において示されたように、8個の耐性レプリカーゼ系の上葉においてウイルスの蓄積は検出されなかった。同様に、高温(30〜35℃)で植物を栽培すると、耐性応答は変わらなかった。
同型I44系における耐性の特徴付け
さらに広範囲の試験を行って、1個のNPTII挿入による推定予想した分離を示す系R44の耐性を特徴付けた(表1)。遺伝的一貫性のために、系R44の10個の異なるR1植物由来の種子を、本明細書で前に記載したのと同様にカナマイシンの存在下で発芽させ、トランスジェニック遺伝子座に関して分離しないR2同型系(したがって系I44と表す)を同定し、さらなる試験用に使用した。I44植物は、本来の栽培品種(「Ilan」)と区別がつかない正常な表現型及び正常な果実の分化を示した。
I44耐性系の分子の特徴付け
系I44のゲノム中のウイルス核酸配列の存在は、PCR(図4C)及びサザンブロッティング(データ示さず)によって確認した。54kDaのコード配列の転写は、接種又は非接種I44植物においてRT−PCRによって検出した(図4A)。反対に、I44植物由来の全RNA調製物に関するPCR反応は陰性であり(図4C)、図4A中に示す増幅RT−PCRバンドは、RNA調製物中の汚染したDNA残留物によるものではなかったことが示された。RT−PCRアッセイを行って、CFMMVを接種した系I44における症状の欠如が、ウイルス蓄積の欠如によるものであったかどうかを評価した。「Ilan」接種植物における陽性CPバンドの存在とは対照的に、I44系においてCFMMVコートタンパク質(CP)用の特異的プライマーを用いて、増幅バンドは観察されなかった(図4B)。これらの結果によって、I44植物においてウイルス蓄積の形跡を検出することができない観察結果がさらに確かになる。
他のトバモウイルスに対する耐性に関するスクリーニング
レプリカーゼ仲介の耐性が高い配列特異性を示すことは、以前から示されてきている。したがって、さまざまなウリ科感染トバモウイルスの感染に対するI44系の応答性を調べた。系I44及び非形質転換「Ilan」栽培品種には、3つの他のトバモウイルス:KGMMV、ZGMMV及びCGMMVを接種した。非形質転換改良種「Ilan」は、接種後日数(dpi)8日からKGMMV及びZGMMVに関して症状を示し、CFMMV及びCGMMVに関しては2日遅れて症状を示した(表3)。症状出現の有意な遅れを系I44において観察した:症状は14dpiではCGMMV及びZGMMVに関してのみ、20dpiではKGMMVに関して眼に見える状態であった。さらに、非形質転換植物によって示された重度の症状と対照的に、全実験中(30dpi)CGMMVを感染させたI44植物において症状の顕著な低下を観察した(表3)。トバモウイルス感染に対する系I44の応答性は、精製ビリオンを検出するためのSDS−PAGEによって、及びウイルスRNA用のRT−PCRによって確認した(図3)。ZGMMV、CGMMV及びKGMMVビリオンの蓄積は、I44と対照「Ilan」植物の両方においてはっきりと検出した;しかしながらCFMMVビリオンは、これらの後者の植物においてのみ検出した(図3A)。さらに、I44植物、及び非形質転換対照植物において、RT−PCRによりCGMMV、KGMMV及びZGMMVのウイルスRNAを検出した一方で、CFMMVのRNAは対照「Ilan」植物においてのみ発見した(図3B)。
ウイルス接種した植物における形質転換された核酸配列の転写
系I44によって示されたCFMMV感染に対する特異性及び顕著な耐性は、RNAの発現抑制とおそらく関係がある、RNA仲介の耐性機構の優勢を示す可能性がある。この仮説を試験するために、CFMMV接種の前後に系I44及び「Ilan」植物から全RNAを抽出した。等量の全RNAを有するサンプルを、標識54kDaプローブを用いるノーザンブロットハイブリダイゼーションによって分析した。このプローブは、CFMMVゲノムRNA(上側バンド)、54kDaを有する推定サブゲノムRNAI1、及び54kDaのトランス遺伝子転写産物とハイブリダイズした。予想通り、I44植物における転写産物は、感染状態の対照植物において検出したI1サブゲノムRNAより短かった(図6)。54kDaの転写産物は系I44植物においてのみ観察し、転写産物蓄積のレベルは、CFMMV又はZYMVをI44植物に事前接種することによって実質的に影響を受けなかった(図6)。発現抑制仲介のウイルス耐性は、ウイルスで植物を攻撃する前にポチウイルスを接種することによって(Savenkov、E.I.及びValkonen、J.P.2002.J Gen Virol83:2325〜2335)、或いは温度条件を変えることによって(Szittyaら、2003.EMBO J22:633〜640)、抑制され得ることが示されてきている。以下のポチウイルス:ZYMV、ズッキーニ小斑モザイクウイルス(ZFMV)及びキュウリ葉脈黄化ウイルス(CVYV、サツマイモウイルス属;ポチウイルス科)、又はキュウリモザイクウイルス(CMV)の1つを事前に接種した後に、CFMMVに対する耐性に関して系I44の植物を評価した(表4)。ELISA及びシロバナヨウシュチョウセンアサガオへの戻し接種によって確認したように、I44植物は個々のポチウイルス又はCMVの典型的な症状を示したが、一連の感染においてCFMMVに対しては依然として耐性があった。さらに、CFMMV感染に対する系I44の耐性が、異なる温度(20、28又は35℃)において栽培チャンバー中で接種植物を栽培することによって影響を受けることはなかった。
I44根茎による感受性のある接ぎ穂の保護
トバモウイルス粒子は土壌中で長期間生存し、感染した土壌中の根を介したCFMMV感染は一般的な現象である。系I44はCFMMVの土壌接種に対して耐性を示したので(表2)、非形質転換接ぎ穂用の防御根茎として働くためのこの系の適性を試験した。
耐性のあるタバコ属ベンサミアナ系根茎による感受性のある接ぎ穂の保護
本明細書で前に記載したのと同様に、pCddCP−ZY構築体を有するアグロバクテリア菌tumefaciensを用いてタバコ属ベンサミアナ系の葉盤を形質転換した。再生培地での選択の後、個々の推定形質転換体をGUS発現によって同定した。確認した形質転換体は自家受粉させて、R1世代が生じた。個々の形質転換植物からの子孫を、以下のようにDNA構築体の分離に関してスクリーニングした:R1種子は表面滅菌し、250mg/lのカナマイシンの存在下で発芽させた。トランスジェニック種子(NPTII遺伝子を有する)は正常な根の分化を示し、一方で非トランスジェニック子孫の植物は、それらの萎縮した無枝の根によって容易に検出した。カナマイシン耐性/感受性の比を記録し、トランスジェニック実生苗木は接種の実験において使用した。
Claims (67)
- 抗ウイルスタンパク質の発現による以外のウイルス性疾患に耐性があるトランスジェニック根茎、及びウイルス性疾患に対して感受性がある接ぎ穂を含む植物であって、接木植物が前記ウイルス性疾患に耐性がある植物。
- ウイルス性疾患に耐性があるトランスジェニック根茎が、ウイルスゲノムの少なくとも1つのセグメントと少なくとも90%の同一性を有する核酸配列を含む、請求項1に記載の植物。
- ウイルス性疾患に耐性があるトランスジェニック根茎が、ウイルスゲノムの少なくとも1つのセグメントを標的とするsiRNAを作製するために設計したDNA構築体を含む、請求項2に記載の植物。
- ウイルスゲノムの少なくとも1つのセグメントが、ウイルスタンパク質又はその一部分をコードする、請求項2に記載の植物。
- ウイルスタンパク質がウイルスコートタンパク質、ウイルス複製タンパク質、ウイルス運動性タンパク質又はその一部分からなる群から選択される、請求項4に記載の植物。
- ウイルスタンパク質がウイルス複製タンパク質又はその一部分である、請求項5に記載の植物。
- トランスジェニック根茎が、土壌伝染性ウイルスによって引き起こされる疾患に耐性がある、請求項6に記載の植物。
- 線虫伝播性ウイルス:ネポウイルス:アラビノモザイクウイルス、ブドウファンリーフウイルス、トマト黒色輪点ウイルス、イチゴ舌輪点ウイルス、トマト輪点ウイルス、及びタバコ輪点ウイルス;トブラウイルス:Pea early browningウイルス、タバコラットルウイルス及びコショウ輪点ウイルス;真菌伝播性ウイルス:キュウリ緑斑ウイルス、キュウリ黄化えそ病ウイルス、メロンえそ斑点ウイルス、アカクローバえそモザイク病ウイルス、カボチャえそウイルス、タバコ黄斑えそ病サテライトウイルス、レタスビッグベインウイルス、ペッパーイエローベインウイルス、ビートえそ性葉脈黄化ウイルス、ビート土壌伝染性ウイルス、オートムギ縞萎縮病ウイルス、ナンキンマメ斑紋ウイルス、ジャガイモモップトップウイルス、イネ縞葉枯病壊死ウイルス、土壌伝染性コムギ縞萎縮病ウイルス、オオムギマイルドモザイクウイルス、オオムギ黄萎ウイルス、オートムギモザイクウイルス、イネ壊死モザイクウイルス、コムギ条斑病モザイクウイルス及びコムギ黄萎モザイクウイルス;根の損傷によって伝播するウイルス:トバモウイルス属:タバコモザイクウイルス、トマトモザイクウイルス、キュウリ緑斑モザイクトバモウイルス、キュウリ果斑モザイクウイルス、キュウリ緑斑モザイクウイルス、オンドグロッサムリングスポットウイルス、パプリカ弱斑ウイルス、コショウ弱斑ウイルス、オオバコモザイクウイルス及びタバコ弱緑斑モザイクウイルス;及び未知の経路によって伝播するウイルス:オランダガラシ黄斑ウイルス、ソラマメネクロティックウイルトウイルス、ピーチロゼットモザイクウイルス及びサトウキビ退録条斑病ウイルスからなる群から選択される土壌伝染性ウイルスによって引き起こされる疾患から保護されている、請求項7に記載の植物。
- ウイルスゲノムの少なくとも1つのセグメントが、キュウリ果斑モザイクウイルス(CFMMV)の複製タンパク質の断片である推定54kDaのタンパク質をコードする、請求項4に記載の植物。
- 推定54kDaのタンパク質をコードするウイルスゲノムの少なくとも1つのセグメントが配列番号1に記載の配列を有する、請求項9に記載の植物。
- トバモウイルス属の土壌伝染性ウイルスによって引き起こされる疾患から保護されている、請求項10に記載の植物。
- CFMMVによって引き起こされる疾患から保護されている、請求項11に記載の植物。
- ウリ科である、請求項12に記載の植物。
- キュウリ属植物である、請求項13に記載の植物。
- DNA構築体が少なくとも1つの二本鎖RNA分子を形成するRNA配列をコードする核酸配列を含み、二本鎖RNA分子がウイルスゲノムの少なくとも1つのセグメントの切断を仲介する、請求項3に記載の植物。
- DNA構築体が、
a.以下のものに動作可能に連結した少なくとも1つの植物の発現可能なプロモーター、
b.少なくとも1つの二本鎖RNAを形成するRNA配列をコードする核酸配列であって、二本鎖RNA分子がウイルスゲノムの標的セグメントのセンスヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも20個の隣接ヌクレオチドの第1ヌクレオチド配列、及び前記ウイルスゲノムの前記標的セグメントのセンスヌクレオチド配列の相補配列と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも20個の隣接ヌクレオチドの第2ヌクレオチド配列を含む核酸配列、及び場合によっては、
c.転写終了シグナル
を含む、請求項15に記載の植物。 - 第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列がスペーサー配列によって隔てられている、請求項16に記載の植物。
- スペーサー配列がイントロンの配列を含む、請求項17に記載の植物。
- スペーサー配列が、配列番号3に記載の配列を有するヒマカタラーゼ遺伝子のイントロンを含む、請求項18に記載の植物。
- DNA構築体が、同一プロモーターと動作可能に連結した第1及び第2ヌクレオチド配列を含む、請求項19に記載の植物。
- 土壌伝染性ウイルス及び植物の気生部分に影響を与えるベクターによって伝播するウイルスからなる群から選択されるウイルスに耐性がある、請求項20に記載の植物。
- 土壌伝染性ウイルスが線虫伝播性ウイルス:ネポウイルス:アラビノモザイクウイルス、ブドウファンリーフウイルス、トマト黒色輪点ウイルス、イチゴ舌輪点ウイルス、トマト輪点ウイルス、及びタバコ輪点ウイルス;トブラウイルス:Pea early browningウイルス、タバコラットルウイルス及びコショウ輪点ウイルス;真菌伝播性ウイルス:キュウリ緑斑ウイルス、キュウリ黄化えそ病ウイルス、メロンえそ斑点ウイルス、アカクローバえそモザイク病ウイルス、カボチャえそウイルス、タバコ黄斑えそ病サテライトウイルス、レタスビッグベインウイルス、ペッパーイエローベインウイルス、ビートえそ性葉脈黄化ウイルス、ビート土壌伝染性ウイルス、オートムギ縞萎縮病ウイルス、ナンキンマメ斑紋ウイルス、ジャガイモモップトップウイルス、イネ縞葉枯病壊死ウイルス、土壌伝染性コムギ縞萎縮病ウイルス、オオムギマイルドモザイクウイルス、オオムギ黄萎ウイルス、オートムギモザイクウイルス、イネ壊死モザイクウイルス、コムギ条斑病モザイクウイルス及びコムギ黄萎モザイクウイルス;根の損傷によって伝播するウイルス:トバモウイルス属:タバコモザイクウイルス、トマトモザイクウイルス、キュウリ緑斑モザイクトバモウイルス、キュウリ果斑モザイクウイルス、キュウリ緑斑モザイクウイルス、オンドグロッサムリングスポットウイルス、パプリカ弱斑ウイルス、コショウ弱斑ウイルス、オオバコモザイクウイルス及びタバコ弱緑斑モザイクウイルス;及び未知の経路によって伝播するウイルス:オランダガラシ黄斑ウイルス、ソラマメネクロティックウイルトウイルス、ピーチロゼットモザイクウイルス及びサトウキビ退録条斑病ウイルスからなる群から選択される、請求項21に記載の植物。
- 植物の気生部分に影響を与えるベクターによって伝播するウイルスがカリモウイルス科、ジェミニウイルス科、サーコウイルス科、レオウイルス科、タルチチウイルス科、ブロモウイルス科、コモウイルス科、ポチウイルス科、トンブスウイルス科、セクイウイルス科、クロストロウイルス科及びルテオウイルス科;トバモウイルス、トブラウイルス、ポテックスウイルス、カルラウイルス、アレクシウイルス、カピロウイルス、フォベアウイルス、トリコウイルス、ブドウウイルス、フロウイルス、ペクルウイルス、ポモウイルス、ベニーウイルス、ホルデイウイルス、ソベモウイルス、マラフィウイルス、チモウイルス、イダエオウイルス、オウルミウイルス、ウンブラウイルスからなる群から選択される科である、請求項21に記載の植物。
- ウイルスゲノムの少なくとも1つのセグメントが、ズッキーニ黄化モザイクウイルス(ZYMV)のゲノムの3’端を含む、請求項15に記載の植物。
- ウイルスゲノムの少なくとも1つのセグメントが配列番号2に記載の核酸配列を含む、請求項24に記載の植物。
- 第1ヌクレオチド配列が、配列番号2に記載のヌクレオチド配列及びその断片と少なくとも90%の同一性を有する核酸配列を含む、請求項16に記載の植物。
- 第2ヌクレオチド配列が、配列番号2に記載のヌクレオチド配列の相補配列及びその断片と少なくとも90%の同一性を有する核酸配列を含む、請求項26に記載の植物。
- ポチウイルス科由来のウイルスによって引き起こされる疾患に耐性がある、請求項27に記載の植物。
- ZYMVに耐性がある、請求項28に記載の植物。
- 核酸配列がプロモーター、エンハンサー、転写因子、スプライシングシグナル及び終了配列からなる群から選択される少なくとも1つの発現制御配列をさらに含む、請求項2に記載の植物。
- プロモーターが構成性プロモーターである、請求項30に記載の植物。
- 核酸配列が選択可能なマーカーをさらに含む、請求項3に記載の植物。
- 選択可能なマーカーが抗生物質耐性を与える産物をコードするポリヌクレオチド配列、及び検出可能な産物をコードするレポーター遺伝子から選択される、請求項32に記載の植物。
- 転写終了シグナルがNOSターミネーターである、請求項30に記載の植物。
- ウイルス性疾患に耐性がある植物を生成するための方法であって、
a.抗ウイルスタンパク質の発現による以外のウイルス性疾患に耐性があるトランスジェニック根茎を提供すること、
b.前記ウイルス性疾患に対して感受性がある接ぎ穂を提供すること、及び
c.接ぎ穂を根茎に接木させて前記ウイルス性疾患に耐性がある接木植物を得ること
を含む方法。 - 根茎をウイルスゲノムの少なくとも1つのセグメントと少なくとも90%の同一性を有する核酸配列を用いて形質転換して、ウイルス性疾患に耐性があるトランスジェニック根茎を生成する、請求項35に記載の方法。
- ウイルスゲノムの少なくとも1つのセグメントを標的とするsiRNAを作製するために設計したDNA構築体を用いて根茎を形質転換する、請求項36に記載の方法。
- ウイルスゲノムの少なくとも1つのセグメントが、ウイルスタンパク質又はその一部分をコードする、請求項36に記載の方法。
- ウイルスタンパク質がウイルスコートタンパク質、ウイルス複製タンパク質、ウイルス運動性タンパク質又はその一部分からなる群から選択される、請求項38に記載の方法。
- ウイルスタンパク質がウイルス複製タンパク質又はその一部分である、請求項39に記載の方法。
- トランスジェニック根茎が、土壌伝染性ウイルスによって引き起こされる疾患に耐性がある、請求項40に記載の方法。
- 線虫伝播性ウイルス:ネポウイルス:アラビノモザイクウイルス、ブドウファンリーフウイルス、トマト黒色輪点ウイルス、イチゴ舌輪点ウイルス、トマト輪点ウイルス、及びタバコ輪点ウイルス;トブラウイルス:Pea early browningウイルス、タバコラットルウイルス及びコショウ輪点ウイルス;真菌伝播性ウイルス:キュウリ緑斑ウイルス、キュウリ黄化えそ病ウイルス、メロンえそ斑点ウイルス、アカクローバえそモザイク病ウイルス、カボチャえそウイルス、タバコ黄斑えそ病サテライトウイルス、レタスビッグベインウイルス、ペッパーイエローベインウイルス、ビートえそ性葉脈黄化ウイルス、ビート土壌伝染性ウイルス、オートムギ縞萎縮病ウイルス、ナンキンマメ斑紋ウイルス、ジャガイモモップトップウイルス、イネ縞葉枯病壊死ウイルス、土壌伝染性コムギ縞萎縮病ウイルス、オオムギマイルドモザイクウイルス、オオムギ黄萎ウイルス、オートムギモザイクウイルス、イネ壊死モザイクウイルス、コムギ条斑病モザイクウイルス及びコムギ黄萎モザイクウイルス;根の損傷によって伝播するウイルス:トバモウイルス属:タバコモザイクウイルス、トマトモザイクウイルス、キュウリ緑斑モザイクトバモウイルス、キュウリ果斑モザイクウイルス、キュウリ緑斑モザイクウイルス、オンドグロッサムリングスポットウイルス、パプリカ弱斑ウイルス、コショウ弱斑ウイルス、オオバコモザイクウイルス及びタバコ弱緑斑モザイクウイルス;及び未知の経路によって伝播するウイルス:オランダガラシ黄斑ウイルス、ソラマメネクロティックウイルトウイルス、ピーチロゼットモザイクウイルス及びサトウキビ退録条斑病ウイルスからなる群から選択される土壌伝染性ウイルスによって引き起こされる疾患から植物を保護する、請求項41に記載の方法。
- トランスジェニック根茎が、キュウリ果斑モザイクウイルス(CFMMV)の複製タンパク質の断片である推定54kDaのタンパク質をコードする核酸配列を含む、請求項38に記載の方法。
- トランスジェニック根茎が、配列番号1に記載の配列を有する推定54kDaのタンパク質をコードする核酸配列を含む、請求項43に記載の方法。
- トバモウイルス属の土壌伝染性ウイルスによって引き起こされる疾患から植物を保護する、請求項44に記載の方法。
- CFMMVによって引き起こされる疾患から植物を保護する、請求項45に記載の方法。
- 植物がウリ科である、請求項46に記載の方法。
- 植物がキュウリ属植物である、請求項47に記載の方法。
- DNA構築体が少なくとも1つの二本鎖RNA分子を形成するRNA配列をコードする核酸配列を含み、二本鎖RNA分子がウイルスゲノムの少なくとも1つのセグメントの切断を仲介する、請求項37に記載の方法。
- DNA構築体が、
a.以下のものに動作可能に連結した少なくとも1つの植物の発現可能なプロモーター、
b.少なくとも1つの二本鎖RNAを形成するRNA配列をコードする核酸配列であって、二本鎖RNA分子がウイルスゲノムの標的セグメントのセンスヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも20個の隣接ヌクレオチドの第1ヌクレオチド配列、及び前記ウイルスゲノムの前記標的セグメントのセンスヌクレオチド配列の相補配列と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも20個の隣接ヌクレオチドの第2ヌクレオチド配列を含む核酸配列、及び場合によっては、
c.転写終了シグナル
を含む、請求項49に記載の方法。 - 第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列がスペーサー配列によって隔てられている、請求項50に記載の方法。
- スペーサー配列がイントロンの配列を含む、請求項51に記載の方法。
- スペーサー配列が配列番号3に記載の配列を有するヒマカタラーゼ遺伝子のイントロンを含む、請求項52に記載の方法。
- DNA構築体が同一プロモーターと動作可能に連結した第1及び第2ヌクレオチド配列を含む、請求項53に記載の方法。
- 植物が土壌伝染性ウイルス及び植物の気生部分に影響を与えるベクターによって伝播するウイルスからなる群から選択されるウイルスに対して耐性がある、請求項54に記載の方法。
- 土壌伝染性ウイルスが線虫伝播性ウイルス:ネポウイルス:アラビノモザイクウイルス、ブドウファンリーフウイルス、トマト黒色輪点ウイルス、イチゴ舌輪点ウイルス、トマト輪点ウイルス、及びタバコ輪点ウイルス;トブラウイルス:Pea early browningウイルス、タバコラットルウイルス及びコショウ輪点ウイルス;真菌伝播性ウイルス:キュウリ緑斑ウイルス、キュウリ黄化えそ病ウイルス、メロンえそ斑点ウイルス、アカクローバえそモザイク病ウイルス、カボチャえそウイルス、タバコ黄斑えそ病サテライトウイルス、レタスビッグベインウイルス、ペッパーイエローベインウイルス、ビートえそ性葉脈黄化ウイルス、ビート土壌伝染性ウイルス、オートムギ縞萎縮病ウイルス、ナンキンマメ斑紋ウイルス、ジャガイモモップトップウイルス、イネ縞葉枯病壊死ウイルス、土壌伝染性コムギ縞萎縮病ウイルス、オオムギマイルドモザイクウイルス、オオムギ黄萎ウイルス、オートムギモザイクウイルス、イネ壊死モザイクウイルス、コムギ条斑病モザイクウイルス及びコムギ黄萎モザイクウイルス;根の損傷によって伝播するウイルス:トバモウイルス属:タバコモザイクウイルス、トマトモザイクウイルス、キュウリ緑斑モザイクトバモウイルス、キュウリ果斑モザイクウイルス、キュウリ緑斑モザイクウイルス、オンドグロッサムリングスポットウイルス、パプリカ弱斑ウイルス、コショウ弱斑ウイルス、オオバコモザイクウイルス及びタバコ弱緑斑モザイクウイルス;及び未知の経路によって伝播するウイルス:オランダガラシ黄斑ウイルス、ソラマメネクロティックウイルトウイルス、ピーチロゼットモザイクウイルス及びサトウキビ退録条斑病ウイルスからなる群から選択される、請求項65に記載の方法。
- 植物の気生部分に影響を与えるベクターによって伝播するウイルスがカリモウイルス科、ジェミニウイルス科、サーコウイルス科、レオウイルス科、タルチチウイルス科、ブロモウイルス科、コモウイルス科、ポチウイルス科、トンブスウイルス科、セクイウイルス科、クロストロウイルス科及びルテオウイルス科;トバモウイルス、トブラウイルス、ポテックスウイルス、カルラウイルス、アレクシウイルス、カピロウイルス、フォベアウイルス、トリコウイルス、ブドウウイルス、フロウイルス、ペクルウイルス、ポモウイルス、ベニーウイルス、ホルデイウイルス、ソベモウイルス、マラフィウイルス、チモウイルス、イダエオウイルス、オウルミウイルス、ウンブラウイルスからなる群から選択される科である、請求項55に記載の方法。
- ウイルスゲノムの少なくとも1つのセグメントが、ズッキーニ黄化モザイクウイルス(ZYMV)のゲノムの3’端を含む、請求項49に記載の方法。
- ウイルスゲノムの少なくとも1つのセグメントが配列番号2に記載の核酸配列を含む、請求項49に記載の方法。
- 第1ヌクレオチド配列が、配列番号2に記載のヌクレオチド配列及びその断片と少なくとも90%の同一性を有する核酸配列を含む、請求項50に記載の方法。
- 第2ヌクレオチド配列が、配列番号2に記載のヌクレオチド配列の相補配列及びその断片と少なくとも90%の同一性を有する核酸配列を含む、請求項50に記載の方法。
- 植物がポチウイルス科由来のウイルスによって引き起こされる疾患に耐性がある、請求項61に記載の方法。
- 植物がZYMVに耐性がある、請求項62に記載の方法。
- 請求項35から63までのいずれか一項に記載の方法によって生成される接木植物。
- 土壌伝染性ウイルス及び植物の気生部分に影響を与えるベクターによって伝播するウイルスからなる群から選択されるウイルスに耐性がある、請求項64に記載の植物。
- 線虫伝播性ウイルス:ネポウイルス:アラビノモザイクウイルス、ブドウファンリーフウイルス、トマト黒色輪点ウイルス、イチゴ舌輪点ウイルス、トマト輪点ウイルス、及びタバコ輪点ウイルス;トブラウイルス:Pea early browningウイルス、タバコラットルウイルス及びコショウ輪点ウイルス;真菌伝播性ウイルス:キュウリ緑斑ウイルス、キュウリ黄化えそ病ウイルス、メロンえそ斑点ウイルス、アカクローバえそモザイク病ウイルス、カボチャえそウイルス、タバコ黄斑えそ病サテライトウイルス、レタスビッグベインウイルス、ペッパーイエローベインウイルス、ビートえそ性葉脈黄化ウイルス、ビート土壌伝染性ウイルス、オートムギ縞萎縮病ウイルス、ナンキンマメ斑紋ウイルス、ジャガイモモップトップウイルス、イネ縞葉枯病壊死ウイルス、土壌伝染性コムギ縞萎縮病ウイルス、オオムギマイルドモザイクウイルス、オオムギ黄萎ウイルス、オートムギモザイクウイルス、イネ壊死モザイクウイルス、コムギ条斑病モザイクウイルス及びコムギ黄萎モザイクウイルス;根の損傷によって伝播するウイルス:トバモウイルス属:タバコモザイクウイルス、トマトモザイクウイルス、キュウリ緑斑モザイクトバモウイルス、キュウリ果斑モザイクウイルス、キュウリ緑斑モザイクウイルス、オンドグロッサムリングスポットウイルス、パプリカ弱斑ウイルス、コショウ弱斑ウイルス、オオバコモザイクウイルス及びタバコ弱緑斑モザイクウイルス;及び未知の経路によって伝播するウイルス:オランダガラシ黄斑ウイルス、ソラマメネクロティックウイルトウイルス、ピーチロゼットモザイクウイルス及びサトウキビ退録条斑病ウイルスからなる群から選択される土壌伝染性ウイルスに耐性がある、請求項65に記載の植物。
- カリモウイルス科、ジェミニウイルス科、サーコウイルス科、レオウイルス科、タルチチウイルス科、ブロモウイルス科、コモウイルス科、ポチウイルス科、トンブスウイルス科、セクイウイルス科、クロストロウイルス科及びルテオウイルス科;トバモウイルス、トブラウイルス、ポテックスウイルス、カルラウイルス、アレクシウイルス、カピロウイルス、フォベアウイルス、トリコウイルス、ブドウウイルス、フロウイルス、ペクルウイルス、ポモウイルス、ベニーウイルス、ホルデイウイルス、ソベモウイルス、マラフィウイルス、チモウイルス、イダエオウイルス、オウルミウイルス、ウンブラウイルスからなる群から選択される科の、植物の気生部分に影響を与えるベクターによって伝播するウイルスに耐性がある、請求項65に記載の植物。
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102498956A (zh) * | 2011-11-29 | 2012-06-20 | 红云红河烟草(集团)有限责任公司 | 一种改良云烟87烤烟品种的方法 |
CN102498955A (zh) * | 2011-11-29 | 2012-06-20 | 红云红河烟草(集团)有限责任公司 | 一种改良云烟85烤烟品种的方法 |
JP2014513942A (ja) * | 2011-04-20 | 2014-06-19 | シンジェンタ パーティシペーションズ アクチェンゲゼルシャフト | ポティウイルスに耐性のカボチャ属(Cucurbita)植物 |
Families Citing this family (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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CN103952433B (zh) * | 2011-10-17 | 2016-08-17 | 湖南农业大学 | 一种使接穗品种获得病毒抗性的方法及RNA干扰载体pCAMBIA2300-2A与转基因方法 |
CN103952434B (zh) * | 2011-10-17 | 2016-08-17 | 湖南农业大学 | 一种使接穗品种获得病毒抗性的方法及RNA干扰载体pCAMBIA2300-2B与转基因方法 |
CN103947462B (zh) * | 2011-10-17 | 2016-11-23 | 湖南农业大学 | 一种使接穗品种获得病毒抗性的方法及RNA干扰载体pCAMBIA2300-3A与转基因方法 |
CL2011002884A1 (es) * | 2011-11-16 | 2012-07-20 | Univ Pontificia Catolica Chile | Plasmido que comprende secuencias del genoma de virus gflv, celula que comprende dichas construcciones moleculares, y procedimiento para conferir resistencia y saneamiento al virus de la hoja en abanico de la vid (gflv) en vides no transgenicas. |
CN102498954B (zh) * | 2011-11-29 | 2013-04-03 | 红云红河烟草(集团)有限责任公司 | 一种改良k326烤烟品种的方法 |
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EP3041345B1 (de) * | 2013-09-04 | 2024-05-01 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Helminthosporium turcicum-resistente pflanze |
CN103828613B (zh) * | 2014-03-17 | 2015-09-09 | 昆明理工大学 | 病毒诱导的花叶滇山茶的叶色调控方法 |
CN107517740B (zh) * | 2016-06-20 | 2022-07-29 | 陈耕石 | 生产马铃薯脱毒种薯的方法 |
MX2016008991A (es) | 2016-07-08 | 2018-01-08 | Centro De Investig Cientifica De Yucatan A C | Factores de transcripcion aislados de carica papaya y su aplicacion para obtener plantas tolerantes a temperaturas extremas. |
CN108207368A (zh) * | 2017-11-24 | 2018-06-29 | 桂阳金盾南方苹果有限公司 | 南方苹果火病防治方法 |
CN109197338B (zh) * | 2018-09-30 | 2020-08-11 | 西南大学 | 一种促进黄脉病柠檬树正常结果的方法 |
JP2023546008A (ja) * | 2020-10-07 | 2023-11-01 | カリックス インコーポレイテッド | ゲノム編集試薬を送達するための接ぎ木植物 |
CN114317460B (zh) * | 2022-01-10 | 2023-10-13 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 瓜蒌斑驳花叶病毒及其侵染性克隆载体、构建方法和应用 |
CN114561424B (zh) * | 2022-03-24 | 2024-01-26 | 浙江中医药大学 | 一种丹参黄瓜花叶病毒病苗期注射接种的方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002204694A (ja) * | 1990-03-12 | 2002-07-23 | Cornell Research Foundation Inc | 非構造植物ウイルス遺伝子配列による植物の形質転換 |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0429483B1 (en) * | 1988-08-19 | 1997-11-12 | Seminis Vegetable Seeds, Inc. | Potyvirus coat protein genes and plants transformed therewith |
US5596132A (en) * | 1990-03-12 | 1997-01-21 | Cornell Research Foundation, Inc. | Induction of resistance to virus diseases by transformation of plants with a portion of a plant virus genome involving a read-through replicase gene |
ES2166361T3 (es) * | 1992-02-19 | 2002-04-16 | State Of Oregon Acting By & Th | Produccion de plantas resistentes a los virus a traves de la introduccion de rna viral intraducible de sentido positivo. |
ES2259191T3 (es) * | 1996-06-12 | 2006-09-16 | Japan Tobacco Inc. | Metodo para expresar genes foraneos y vectores para ello. |
AR016939A1 (es) * | 1997-09-29 | 2001-08-01 | Cornell Res Foundation Inc | Metodo para seleccionar una vid transgenica o componente de una vid que tiene una resistencia aumentada a la enfermedad de ''fanleaf'' y una celulade planta transformada con un vector de expresion. |
EP0922767A1 (en) * | 1997-12-03 | 1999-06-16 | Gene Shears Pty Limited | Ribozymes capable of conferring resistance to potyvirus infection, and plants expressing said ribozymes |
CN1202246C (zh) * | 1998-04-08 | 2005-05-18 | 联邦科学和工业研究组织 | 获得修饰表型的方法和措施 |
US7019195B1 (en) * | 1998-05-26 | 2006-03-28 | Syngenta Participations Ag | Method for conferring resistance or tolerance aganist furovirus, potyvirus, tospovirus, and cucomovirus to plant cells |
IL128111A (en) * | 1999-01-18 | 2007-03-08 | Yissum Res Dev Co | A method of silencing expression of a target sequence in a plant genome |
WO2001005221A1 (en) * | 1999-07-20 | 2001-01-25 | Ges. Für Erwerb Und Verwertung Von Schutzrechten-Gvs Mbh | Novel method for the generation and selection of transgenic linseed/flax plants |
EP1198572A2 (en) * | 1999-08-02 | 2002-04-24 | Keygene N.V. | Method for generating cgmmv resistant plants, genetic constructs, and obtained cgmmv-resistant plants |
CA2427347C (en) * | 2000-10-31 | 2011-01-18 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Method and means for producing barley yellow dwarf virus resistant cereal plants |
KR100475308B1 (ko) * | 2003-01-18 | 2005-03-10 | 주식회사 농우바이오 | Cgmmv-저항성 형질전환 박과 작물을 제조하는 방법 |
JP3919705B2 (ja) * | 2003-06-27 | 2007-05-30 | 株式会社玉俊工業所 | 棚板等の受け具の基部構造 |
-
2005
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-
2006
- 2006-09-21 MA MA29332A patent/MA28477B1/fr unknown
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002204694A (ja) * | 1990-03-12 | 2002-07-23 | Cornell Research Foundation Inc | 非構造植物ウイルス遺伝子配列による植物の形質転換 |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014513942A (ja) * | 2011-04-20 | 2014-06-19 | シンジェンタ パーティシペーションズ アクチェンゲゼルシャフト | ポティウイルスに耐性のカボチャ属(Cucurbita)植物 |
JP2017143833A (ja) * | 2011-04-20 | 2017-08-24 | シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー | ポティウイルスに耐性のカボチャ属(Cucurbita)植物 |
US10351874B2 (en) | 2011-04-20 | 2019-07-16 | Syngenta Participations Ag | Cucurbita plant resistant to potyvirus |
US10717987B2 (en) | 2011-04-20 | 2020-07-21 | Syngenta Participations Ag | Cucurbita plant resistant to potyvirus |
US11186846B2 (en) | 2011-04-20 | 2021-11-30 | Syngenta Participations Ag | Cucurbita plant resistant to potyvirus |
CN102498956A (zh) * | 2011-11-29 | 2012-06-20 | 红云红河烟草(集团)有限责任公司 | 一种改良云烟87烤烟品种的方法 |
CN102498955A (zh) * | 2011-11-29 | 2012-06-20 | 红云红河烟草(集团)有限责任公司 | 一种改良云烟85烤烟品种的方法 |
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