ES2259191T3 - Metodo para expresar genes foraneos y vectores para ello. - Google Patents
Metodo para expresar genes foraneos y vectores para ello.Info
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- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
Abstract
SE DESCRIBE UN METODO PARA LA EXPRESION DE UN GEN FORANEO MEDIANTE EL CUAL LOS GENES FORANEOS PUEDEN EXPRESARSE CON MAYOR INTENSIDAD QUE MEDIANTE LOS METODOS CONVENCIONALES, ASI COMO UN VECTOR RECOMBINANTE AL EFECTO. EN EL METODO DE EXPRESION DE UN GEN FORANEO DE CONFORMIDAD CON LA PRESENTE INVENCION, EL GEN FORANEO SE INSERTA EN UN SITIO CORRIENTE ABAJO DE UN PROMOTOR Y EL GEN FORANEO SE EXPRESA EN UNA CELULA, DE MODO QUE UNA PLURALIDAD DE FRAGMENTOS DE DNA ORIGINADOS POR INTRON QUE SON IGUALES O DIFERENTES Y QUE SON CAPACES DE PROMOVER LA EXPRESION DE LOS GENES FORANEOS SE INSERTAN EN UNO O MAS SITIOS CORRIENTE ARRIBA DE DICHO GEN FORANEO, Y DICHO GEN FORANEO SE EXPRESA.
Description
Método para expresar genes foráneos y vectores
para ello.
La presente invención se refiere a un método
para expresar un gen foráneo y a un vector para ello. Más en
particular, la presente invención se refiere a un método para
expresar un gen foráneo en procesos de ingeniería genética, siendo
con dicho método la expresión del gen foráneo promovida en mayor
medida que en el caso de los métodos convencionales, y a un vector
para ello.
La promoción de la expresión de genes foráneos
es una de las técnicas más necesarias en los procesos de ingeniería
genética, especialmente cuando los procesos de ingeniería genética
son aplicados a las plantas.
En calidad de uno de tales métodos, es conocida
la técnica de insertar un fragmento de DNA (DNA = ácido
desoxirribunucleico) originado a partir de un intrón en un sitio
localizado en el lado de cabeza con respecto al gen foráneo. Por
ejemplo, la Copia Impresa de las Piezas de la Solicitud de Patente
Japonesa (Kokai) (Kokai = sin examinar) Nº 3-103182
Distribuida al Público describe que la expresión de un gen foráneo
es promovida insertando un fragmento de DNA originado a partir de un
intrón de gen de catalasa (CAT-1) de ricino en un
sitio localizado en el lado de cabeza con respecto al gen foráneo, y
expresando el gen foráneo. Se ha informado sobre fenómenos similares
para varios fragmentos de DNA originados a partir de intrones.
A pesar de que los intrones han sido utilizados
con la finalidad de promover la expresión de genes foráneos, no ha
llegado a popularizarse el uso de una pluralidad de intrones, y no
ha llegado a ser reconocido el efecto ventajoso del mismo. Por
ejemplo, a pesar de que el primer intrón y el 6º intrón del gen de
la deshidrogenasa de alcohol de maíz promueven individualmente la
expresión del gen, si se ligan estos intrones el efecto es menor que
el que se produce en el caso en el que se usa el 6º intrón en
solitario (Mascarenhas et al. Plant Mol. Biol., 15,
913-920 (1990)). Análogamente, en los casos en los
que se ligan dos terceros intrones de actina de maíz, el efecto es
menor que el que se produce en el caso en el que se usa solamente un
intrón (Luehrsen et al., Mol. Gen. Genet., 225,
81-93
(1991)).
(1991)).
Son conocidos en la técnica varios métodos para
expresar un gen foráneo. Mascarenhas et al. (Plant Molecular
Biology, vol. 15, (1990), pp. 913-920,
"Intron-Mediated Enhancement of Heterologous Gene
Expression in Maize") describe constructos en los cuales se
insertaron los intrones 2 y 6 del gen Adh1 de maíz en el lado
5' en el lado de cabeza con respecto a la región codificante de
CAT.
Luehrsen et al., (Mol. Gen. Genet., vol.
225, (1991), pp. 81-93. "Intron Enhancement of
Gene Expression and the Splicing Efficiency of Introns in Maize
Cells") describe métodos para la expresión de la albúmina de
suero humano (HSA) usando vectores que constan de un promotor de
\beta-lactoglobulina (BLG) que activa la expresión
de HSA y comprende específicos subconjuntos de intrones, conduciendo
los usos de determinados subconjuntos específicos a una más alta
expresión de HSA.
Hurwitz et al., (Transgenic Research,
vol. 3, no. 6, 1 noviembre 1994, pp. 376-375),
también describe una serie de vectores de expresión que constan cada
uno de un promotor de BLG que activa a uno de los de una variedad de
minigenes de HSA o a todo el gen.
Christensen et al., (Plant Molecular
Biology, vol. 18, (1992), pp. 675-689, "Maize
Polyubiquitin Genes: Structure, Thermal Perturbation of Expression
and Transcript Splicing and Promoter Activity Following Transfer
Protoplasts by Electroporation"), describe la acrecentada
expresión de cDNA (cDNA = DNA complementario) de lactoferrina humana
usando intrones heterólogos.
Kim et al., (Journal of Biochemistry and
Molecular Biology, vol. 1, no. 28, 31 enero 1995, pp.
57-61), describe que la expresión de una
lactoferrina humana recombinante en células epiteliales mamarias
HC11 de ratón se lograba poniendo a su cDNA bajo el control del gen
de la \beta-caseína bovina. Para mejorar el nivel
de expresión de la lactoferrina humana en un sistema de cultivo
celular, fueron también introducidos dos intrones artificiales para
construir vectores de expresión. Un intrón era una señal de
hibridación que constaba del intrón I de
\beta-caseína bovina y del intrón II de
\beta-globina de conejo. El otro intrón era un
fragmento de DNA que abarca el intrón VIII del gen de la
\beta-caseína
bovina.
bovina.
El documento EP 0 342 926 (Lubrizol Genetics,
Inc.) describe una región promotora de la ubiquitina de maíz que
comprende elementos consenso de shock térmico e inicia y regula la
transcripción de los genes puestos bajo su control.
A pesar de que los métodos conocidos en los
cuales se inserta un fragmento de DNA originado a partir de un
intrón son eficaces, los efectos de promoción de la expresión son a
menudo insuficientes. Así, es de desear un método mediante el cual
la expresión génica se vea promovida en mayor medida.
En consecuencia, un objeto de la presente
invención es el de aportar un método para expresar genes foráneos
mediante el cual los genes foráneos sean expresados en mayor medida
que mediante los métodos conocidos, y aportar vectores recombinantes
para ello.
Los presentes inventores han llevado a cabo
intensivos estudios para descubrir que la expresión de genes
foráneos se ve promovida en mucho mayor medida insertando en uno o
varios sitios en el lado de cabeza con respecto al gen foráneo una
pluralidad de fragmentos de DNA que han sido originados a partir de
intrones, son iguales o distintos y son capaces de promover la
expresión de genes foráneos al ser insertados en un sitio ubicado en
el lado de cabeza con respecto al gen foráneo, en comparación con
los métodos conocidos en los cuales se inserta un único fragmento de
DNA originado a partir de un intrón, habiendo con ello logrado
llevar a cabo la presente invención.
Esto quiere decir que la presente invención
aporta un método que es para expresar un gen foráneo y comprende los
pasos de insertar a dicho gen foráneo en un sitio ubicado en el lado
de cola con respecto a un promotor, y expresar dicho gen foráneo en
una célula; estando dicho método caracterizado por el hecho de que
los de una pluralidad de fragmentos de DNA que han sido originados a
partir de intrones, son iguales o distintos y son capaces de
promover la expresión de genes foráneos son insertados en uno o
varios sitios ubicados en el lado de cabeza con respecto a dicho gen
foráneo y dicho gen foráneo es expresado, comprendiendo al menos
uno de los de dicha pluralidad de fragmentos de DNA originados a
partir de intrones la secuencia que se indica en la ID SEC Nº: 1 en
el Listado de Secuencias o una variante funcional de la misma.
La presente invención también aporta un vector
recombinante que comprende un promotor, un gen foráneo insertado en
un sitio ubicado en el lado de cola con respecto a dicho promotor, y
una pluralidad de fragmentos de DNA que han sido originados a partir
de intrones, son iguales o distintos y son capaces de promover la
expresión de genes foráneos, siendo dichos fragmentos de DNA
insertados en uno o varios sitios en el lado de cabeza con respecto
a dicho gen foráneo, comprendiendo al menos uno de los de dicha
pluralidad de fragmentos de DNA originados a partir de intrones la
secuencia que se indica en la ID SEC Nº: 1 en el Listado de
Secuencias o una variante funcional de la misma.
Mediante la presente invención se han aportado
métodos para expresar genes foráneos por medio de los cuales la
expresión de los genes foráneos se ve promovida en mucho mayor
medida que en el caso de los métodos conocidos, así como vectores
recombinantes para ello. Con la presente invención, puesto que se
promueve la expresión de genes foráneos introducidos mediante
procesos de ingeniería genética, es de esperar que la presente
invención constituirá una enorme contribución al campo de la
ingeniería genética.
El método de la presente invención está
caracterizado por el paso de insertar dos o más fragmentos de DNA
que han sido originados a partir de intrones y son capaces de
promover la expresión de genes foráneos en uno o varios sitios en el
lado de cabeza con respecto a un gen foráneo a expresar, para así
promover la expresión del gen foráneo.
Aquí, la expresión "fragmento de DNA que ha
sido originado a partir de un intrón y tiene el efecto de promover
la expresión de genes foráneos" significa un fragmento de DNA que
ha sido originado a partir de un intrón y es capaz de promover la
expresión de genes foráneos en grado detectable en comparación con
el caso en el que el gen foráneo es expresado sin insertar el
fragmento de DNA originado a partir de un intrón. Son conocidos
per se varios fragmentos de DNA originados a partir de
intrones de este tipo. Los ejemplos de tales fragmentos de DNA
originados a partir de intrones incluyen el primer intrón del gen de
catalasa (CAT-1) de ricino (Copia Impresa de las
Piezas de la Solicitud de Patente Japonesa (Kokai) Nº
3-103182; Tanaka et al. Nucleic Acids Res.
18, 6767-6770 (1990)); el intrón de flavonol
glicosiltransferasa:UDP-glucosa de maíz (Callis
et al., Genes & Develop. 1, 1183-1200
(1987)); el primer intrón de la deshidrogenasa-1 de
alcohol de maíz (Callis et al., Genes & Develop. 1,
1183-1200 (1987)); el segundo y el sexto intrón de
deshidrogenasa-1 de alcohol de maíz (Mascarenhas
et al., Plant Mol. Biol. 15, 913-920 (1990));
el primer intrón del "shrunken-1"
("encogido-1") de maíz (Vasil et al.,
Plant Physiol. 91, 1575-1579 (1989)); el primer
intrón del factor EF-1 alfa de alargamiento de la
traducción de Arabidopsis thaliana; y el primer intrón de la actina
de arroz (McElroy et al., Plant Cell 2,
163-171 (1990)). Hay que señalar, sin embargo, que
los fragmentos de DNA que están originados a partir de intrones y
pueden ser empleados en la presente invención no quedan limitados a
la enumeración anterior, y pueden emplearse cualesquiera fragmentos
de DNA que hayan sido originados a partir de intrones y puedan
promover la expresión de genes foráneos en el lado de cola con
respecto a los mismos.
Los presentes inventores descubrieron
anteriormente intrones del gen PLD del arroz comparando las
secuencias de nucleotidos del cDNA y del DNA genómico del gen de la
fosfolipasa D (PLD) del arroz, descubrieron que uno de estos
intrones promueve prominentemente la expresión de genes en el lado
de cola con respecto al mismo, y presentaron una solicitud de
patente relacionada con ello (PCT/JP96/00812). La secuencia de
nucleótidos de este intrón está indicada en la ID SEC Nº: 1 en el
Listado de Secuencias. En la presente invención puede emplearse este
fragmento de DNA originado a partir de un intrón y que se indica en
la ID SEC Nº: 1. Además, pueden también emplearse preferiblemente la
secuencia intrón del gen de catalasa de ricino, indicada en la ID
SEC Nº: 2 en el Listado de Secuencias y la secuencia intrón que se
presenta en el gen de la ubiquitina de maíz y tiene la secuencia de
nucleótidos que se indica en la ID SEC Nº: 3.
Es perfectamente sabido en la técnica que hay
casos en los que la actividad fisiológica de una secuencia de DNA
fisiológicamente activa se mantiene aunque sean añadidos,
insertados, suprimidos o sustituidos uno o varios nucleótidos. En la
presente invención están incluidos en la expresión "fragmentos de
DNA originados a partir de intrones" en el sentido en el que la
misma es usada en la presente los fragmentos de DNA resultantes de
una modificación de este tipo de los anteriormente descritos y
conocidos fragmentos de DNA originados a partir de intrones o de la
secuencia que se indica en la ID SEC Nº: 1 que como tales
fragmentos de DNA promuevan la expresión del gen en el lado de cola
con respecto a los mismos. Esto quiere decir que están también
incluidos en la expresión "fragmentos de DNA originados a partir
de intrones" en la presente invención los fragmentos de DNA que
tienen las mismas secuencias de nucleótidos como los anteriormente
mencionados y conocidos fragmentos de DNA originados a partir de
intrones o el fragmento de DNA que ha sido originado a partir de un
intrón y tiene la secuencia de nucleótidos que se indica en la ID
SEC Nº: 1, exceptuando el hecho de que están añadidos, suprimidos o
sustituidos uno o varios nucleótidos, que como tales fragmentos de
DNA promuevan la expresión de un gen en el lado de cola con
respecto a los mismos. Aquí, un fragmento de DNA de este tipo
modificado y originado a partir de un intrón tiene preferiblemente
una homología de no menos de un 70%, y más preferiblemente de no
menos de un 90%, con respecto al fragmento de DNA original y
originado a partir de un intrón. Análogamente, la expresión
"variante funcional" que se utiliza en la redacción de las
reivindicaciones significa el fragmento de DNA que tiene la misma
secuencia de nucleótidos como la secuencia original exceptuando el
hecho de que están añadidos, suprimidos o sustituidos uno o varios
nucleótidos, y que como tal fragmento de DNA promueve la expresión
de un gen en el lado de cola con respecto al mismo y tiene
preferiblemente una homología de no menos de un 70%, y más
preferiblemente de no menos de un 90%, con respecto a la secuencia
original. Por ejemplo, la expresión "variante funcional de la
secuencia que se indica en la ID SEC Nº: 1" significa el
fragmento de DNA que tiene la misma secuencia de nucleótidos como la
que se indica en la ID SEC Nº: 1 exceptuando el hecho de que están
añadidos, suprimidos o sustituidos uno o varios nucleótidos, y que
como tal fragmento de DNA promueve la expresión de un gen en el lado
de cola con respecto al mismo y tiene preferiblemente una homología
de no menos de un 70%, y más preferiblemente de no menos de un 90%,
con respecto a la secuencia original.
Cada uno de los fragmentos de DNA anteriormente
descritos puede ser preparado fácilmente mediante el método
convencional de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) puesto
que son conocidas la secuencia de nucleótidos y la fuente original
de la misma. Además, los que tengan unos tamaños de no más de
aproximadamente 200 pares de bases (bp) pueden ser sintetizados
químicamente. Los susodichos fragmentos de DNA originados a partir
de intrones y modificados pueden ser preparados fácilmente por el
método de la mutagénesis específica de sitio o bien mediante
síntesis química.
En el método de la presente invención, los de
una pluralidad de fragmentos de DNA originados a partir de intrones
y anteriormente mencionados son insertados en uno o varios sitios en
el lado de cabeza con respecto al gen foráneo a expresar, es decir
en uno o varios sitios en el lado de cabeza con respecto a la región
de transcripción, y más preferiblemente, en el extremo 5' de la
región de transcripción. Los fragmentos de DNA originados a partir
de intrones pueden ser preferiblemente insertados entre el promotor
y el gen foráneo. Los fragmentos de DNA originados a partir de
intrones pueden ser insertados en un sitio ubicado inmediatamente en
el lado de cabeza con respecto al gen foráneo a expresar, o bien
puede existir otra secuencia entre los fragmentos de DNA originados
a partir de intrones y el gen foráneo. La longitud de esta secuencia
intermedia no está limitada y es habitualmente de 0 a 1000 bp. El
promotor y los fragmentos de DNA originados a partir de intrones
pueden estar conectados directamente, o bien puede existir otra
secuencia entremedio. La longitud de esta secuencia intermedia no
está limitada y es habitualmente de 0 a 1000 bp.
En el método de la presente invención se inserta
una pluralidad de preferiblemente 2 a 5, y más preferiblemente de 2
o 3, de los anteriormente descritos fragmentos de DNA originados a
partir de intrones. Los fragmentos de DNA originados a partir de
intrones a insertar pueden tener la misma secuencia de nucleótidos o
bien secuencias de nucleótidos distintas. Los de la pluralidad de
fragmentos de DNA originados a partir de intrones pueden estar
directamente conectados, o bien puede existir otra secuencia
entremedio. La longitud de esta secuencia intermedia no está
limitada y es habitualmente de 0 a 1000 bp.
Puede emplearse como promotor todo promotor que
pueda expresar el gen foráneo situado en el lado de cola con
respecto al mismo. Un ejemplo preferido del promotor es el promotor
35S, si bien el promotor no queda limitado a éste.
La presente invención también aporta un vector
recombinante al cual se aplica el método de la presente invención
que ha sido descrito anteriormente. Esto quiere decir que la
presente invención aporta un vector recombinante que comprende un
promotor, un gen foráneo insertado en un sitio en el lado de cola
con respecto al promotor, y una pluralidad de fragmentos de DNA que
han sido originados a partir de intrones, son iguales o distintos,
son capaces de promover la expresión de genes foráneos y son
insertados en uno o varios sitios en el lado de cabeza con respecto
al gen foráneo. Un vector de este tipo puede ser obtenido insertando
la anteriormente descrita pluralidad de fragmentos de DNA
originados a partir de intrones y el gen foráneo en un apropiado
vector de expresión. La inserción puede ser efectuada fácilmente
usando apropiadas enzimas de restricción y ligadores, de ser
necesario, porque es conocida la secuencia de nucleótidos del sitio
de clonación del vector de expresión.
Son conocidos en la técnica y están disponibles
comercialmente varios vectores de expresión de este tipo. Estos
vectores de expresión comprenden al menos un origen de replicación
para la replicación en la célula huésped, un promotor, un sitio de
clonación que proporciona sitios de restricción para insertar un gen
foráneo, y un marcador de selección tal como un marcador de
resistencia a los fármacos. Dichos vectores de expresión comprenden
habitualmente un terminador para terminar con estabilidad la
transcripción y una secuencia SD en los casos en los que la célula
huésped es una célula bacteriana. En el método de la presente
invención pueden emplearse cualesquiera de estos vectores de
expresión conocidos.
Los presentes inventores descubrieron que aunque
se inserte en un gen foráneo una única secuencia intrón del gen de
la ubiquitina de maíz, que tiene la secuencia de nucleótidos que se
indica en la ID SEC Nº: 3 en el Listado de Secuencias, es promovida
la expresión del gen foráneo. Sin embargo, incluso en los casos en
los que se emplea la secuencia que está indicada en la ID SEC Nº: 3,
el efecto es mayor cuando se inserta una pluralidad de secuencias, y
el efecto es especialmente marcado cuando la secuencia que se indica
en la ID SEC Nº: 3 es insertada junto con la secuencia intrón del
gen PLD del arroz, que está indicada en la ID SEC Nº: 1.
Se describe a continuación más concretamente la
invención por medio de ejemplos de la misma. Hay que señalar, sin
embargo, que la presente invención no queda limitada a los ejemplos
siguientes.
Ejemplo
1
En el gen PLD del arroz existe un primer intrón
con un tamaño de 173 bp en la región que corresponde a la región no
codificante del extremo 5' del mRNA (mRNA = ácido ribonucleico
mensajero) (ID SEC Nº: 1, WO 95/09234). El intrón fue verificado
para determinar su influencia en la expresión génica en las células
vegetales. Fueron sintetizados cebadores de 20mero
(5'-TCACCACCCGGTAAGCCCAG-3',
3'-CCCCCGCGTCCATCCCGCTC-5'), cada
uno de los cuales contiene una región de 10 nucleótidos originada a
partir de un exón, y la reacción en cadena de la polimerasa fue
llevada a cabo usando clon genómico de arroz como plantilla. La
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue llevada a cabo usando
una mezcla de 50 pmoles de cada uno de los cebadores, 200 \muM de
dATP, dCTP, dGTP y dTTP, 1 x tampón de PCR (que es suministrado
comercialmente por la TAKARA SHUZO) y 2,5 U de AmpliTap DNA
polimerasa (TAKARA SHUZO), siendo de 50 \mul el volumen total de
la mezcla de reacción. La reacción fue efectuada según las
condiciones térmicas que se indican a continuación, y el ciclo fue
repetido 30 veces. Dichas condiciones fueron, en un DNA THERMOCYCLER
(suministrado comercialmente por la PARKIN ELMER CETUS), las de 94ºC
por espacio de 1 minuto, 40ºC por espacio de 1 minuto y 72ºC por
espacio de 2 minutos y 30 segundos.
El producto de la PCR fue subclonado en el
vector PCR II (suministrado comercialmente por la INVITROGEN), y se
cortó un fragmento con EcoRI. El fragmento se hizo romo y fue
insertado en el sitio SmaI de pBI221 (un plásmido vector en
el cual un gen de \beta-glucuronidasa (llamado
"GUS" de aquí en adelante) está insertado en un sitio en el
lado de cola con respecto a un promotor 35S (llamado "35S pro"
de aquí en adelante)), que es suministrado comercialmente por la
TOYOBO CO., LTD., para obtener un vector pBI221P (35S pro, intrón de
PLD, GUS). Este plásmido fue sometido a digestión con BamHI y
los fragmentos resultantes se hicieron romos, siendo a continuación
efectuada la incorpo-
ración del fragmento anteriormente descrito para construir un vector pBI221PP (35S pro, intrón de PLD x 2, GUS).
ración del fragmento anteriormente descrito para construir un vector pBI221PP (35S pro, intrón de PLD x 2, GUS).
El pIG221 (que tenía el intrón (ID SEC Nº: 2)
del gen de catalasa de ricino y GUS en el orden mencionado, en una
región del lado de cola con respecto al 35S pro) que está descrito
en la Copia Impresa de las Piezas de la Solicitud de Patente
Japonesa Distribuida al Público (Kokai) Nº 3-103182
fue sometido a digestión con XbaI, y los fragmentos
resultantes se hicieron romos, siendo a continuación efectuada la
inserción de la secuencia intrón de PLD anteriormente descrita para
construir un vector pIG221P (35S pro, intrón de PLD, intrón de
Catalasa, GUS).
Células cultivadas de arroz fueron preparadas a
partir del embrión inmaduro de la variedad Nihonbare de arroz
Japónica (Hiei et al., The Plant Journal, 6,
271-282 (1994)), el gen anteriormente descrito fue
introducido en las células según un método divulgado (Shimamoto
et al. Nature, 338, 274-276 (1989)), y fueron
medidas las actividades de \beta-glucuronidasa
(GUS). Los resultados están indicados en la Tabla 1.
Como se indica en la Tabla 1, mediante la
introducción de dos intrones iguales o distintos la actividad de GUS
fue marcadamente incrementada en comparación con los casos en los
que se usó un único intrón. Quedó también demostrado que el
fragmento de DNA que tiene la secuencia de nucleótidos del intrón de
PLD es el fragmento de DNA que produce el efecto de fomento de la
expresión génica cuando se usan dos o más de los fragmentos de
DNA.
| Plásmido | Actividad de GUS | |
| Ninguno | 7,2 | |
| pBI221 | (35S pro, GUS) | 14 |
| pBI221P | (35S pro, Intrón de PLD, GUS) | 180 |
| pBI221PP | (35S pro, Intrón de PLD x 2, GUS) | 430 |
| pIG221 | (35S pro, Intrón de Catalasa, GUS) | 160 |
| pIG221P | (35S pro, Intrón de PLD, Intrón de Catalasa, GUS) | 680 |
Ejemplo
2
Se comprobó también para el intrón del gen de la
ubiquitina de maíz (Ubi-1:Christensen A.H. et
al. Plant Mol. Biol., 18, 675-689 (1982)) el
efecto de promover la expresión de genes foráneos. Se usaron dos
clases de vectores.
Primeramente fue construido utilizando el método
que se indica a continuación un vector para examinar el efecto del
intrón cuando se inserta un único intrón. Lo que se hizo fue separar
por corte con PstI la región del promotor y del intrón del
gen de la ubiquitina, y el fragmento obtenido (ID SEC Nº: 3) fue
insertado en el sitio PstI del vector pUC18. La región intrón
fue separada por corte con BglII y BamHI, y el
fragmento obtenido fue insertado en el sitio BamHI del vector
pBI221 para obtener un vector pBI221U (35S pro, intrón de
Ubiquitina, GUS).
Luego fue construido empleando el método que se
indica a continuación un vector para examinar el efecto del intrón
cuando se inserta una pluralidad de intrones. Lo que se hizo fue
separar por corte con BglII y BamHI la región intrón,
y se hizo romo el fragmento obtenido, siendo a continuación
efectuada la inserción del fragmento resultante en el sitio
SmaI del vector pBI221. Se hizo romo el sitio BamHI de
este vector, y el intrón de PLD anteriormente descrito fue insertado
ahí para obtener un vector pBI221PU (35S pro, intrón de PLD, intrón
de Ubiquitina, GUS). Los vectores fueron introducidos en los
protoplastos utilizando el método anteriormente mencionado, y se
midieron las actividades de GUS.
Como se indica en la Tabla 2, se observó que
cuando se usaba un único intrón de ubiquitina era promovida la
expresión de GUS. Se observó un más marcado efecto de promoción al
emplear tanto el intrón de PLD como el intrón de ubiquitina, en
comparación con los casos en los que fue usado individualmente cada
uno de los intrones.
| Plásmido | Actividad de GUS | |
| (pmol MU/min./mg | ||
| de proteína) | ||
| Ninguno | 3,3 | |
| pBI221 | (35S pro, GUS) | 13 |
| pBI221 | (35S pro, Intrón de PLD, GUS) | 100 |
| pBI221 | (35S pro, Intrón de Ubiquitina, GUS) | 360 |
| pBI221 | (35S pro, Intrón de PLD, Intrón de Ubiquitina, GUS) | 780 |
ID SEC Nº: 1
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 173 |
| TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico |
| TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico |
| FUENTE ORIGINAL |
| ORGANISMO: Oryza sativa |
| TOPOLOGÍA: lineal |
| ORIENTACIÓN: doble |
| DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ID SEC Nº: 2
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 217 |
| TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico |
| TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico |
| FUENTE ORIGINAL |
| ORGANISMO: ricino |
| TOPOLOGÍA: lineal |
| ORIENTACIÓN: doble |
| DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ID SEC Nº: 3
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1010 |
| TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico |
| TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico |
| FUENTE ORIGINAL |
| ORGANISMO: maíz |
| TOPOLOGÍA: lineal |
| ORIENTACIÓN: doble |
| DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA |
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Japan Tobacco Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 2-1, Toranomon 2-chome, Minato-ku,
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Tokyo 105
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO O PROVINCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Japón
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Método para Expresar Genes Foráneos y Vectores para Ello.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: Compatible con PC IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: Windows 95
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOPORTE LÓGICO INFORMÁTICO: Word
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 97926233.4
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 12 de junio de 1997
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 173
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ORIENTACIÓN: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 217
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ORIENTACIÓN: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1010
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ORIENTACIÓN: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (12)
1. Método que es para expresar un gen foráneo y
comprende los pasos de insertar a dicho gen foráneo en un sitio en
el lado de cola con respecto a un promotor y expresar dicho gen
foráneo en una célula; caracterizado por el hecho de que los
de una pluralidad de fragmentos de DNA que han sido originados a
partir de intrones, son iguales o distintos y son capaces de
promover la expresión de genes foráneos son insertados en uno o
varios sitios en el lado de cabeza con respecto a dicho gen foráneo
y dicho gen foráneo es expresado, comprendiendo al menos uno de los
de dicha pluralidad de fragmentos de DNA originados a partir de
intrones la secuencia que se indica en la ID SEC Nº: 1 en el
Listado de Secuencias o una variante funcional de la misma que tiene
una homología de no menos de un 90% con respecto a la ID SEC Nº:
1.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha pluralidad de fragmentos de DNA originados a partir de
intrones comprende dos secuencias indicadas en la ID SEC Nº: 1 en
el Listado de Secuencias o una variante funcional de las mismas que
tiene una homología de no menos de un 90% con respecto a la ID SEC
Nº: 1.
3. Método según la reivindicación 1, en el que
al menos uno de los de dicha pluralidad de fragmentos de DNA
originados a partir de intrones comprende la secuencia que está
indicada en la ID SEC Nº: 2 en el Listado de Secuencias o una
variante funcional de la misma que tiene una homología de no menos
de un 90% con respecto a la ID SEC Nº: 2.
4. Método según la reivindicación 3, en el que
dicha pluralidad de fragmentos de DNA originados a partir de
intrones comprende la secuencia indicada en la ID SEC Nº: 1 o una
variante funcional de la misma y la secuencia indicada en la ID SEC
Nº: 2 o una variante funcional de la misma, teniendo las variantes
funcionales una homología de no menos de un 90% con respecto a la
secuencia original.
5. Método según la reivindicación 1, en el que
al menos uno de los de dicha pluralidad de fragmentos de DNA
originados a partir de intrones comprende la secuencia que está
indicada en la ID SEC Nº: 3 en el Listado de Secuencias o una
variante funcional de la misma que tiene una homología de no menos
de un 90% con respecto a la ID SEC Nº: 3.
6. Método según la reivindicación 5, en el que
dicha pluralidad de fragmentos de DNA originados a partir de
intrones comprende la secuencia que está indicada en la ID SEC Nº:
1 o una variante funcional de la misma y la secuencia que está
indicada en la ID SEC Nº: 3 o una variante funcional de la misma,
teniendo las variantes funcionales una homología de no menos de un
90% con respecto a la secuencia original.
7. Vector recombinante que comprende un
promotor, un gen foráneo insertado en un sitio en el lado de cola
con respecto a dicho promotor, y una pluralidad de fragmentos de DNA
que han sido originados a partir de intrones, son iguales o
distintos, son capaces de promover la expresión de genes foráneos y
son insertados en uno o varios sitios en el lado de cabeza con
respecto a dicho gen foráneo, comprendiendo al menos uno de los de
dicha pluralidad de fragmentos de DNA originados a partir de
intrones la secuencia que está indicada en la ID SEC Nº: 1 en el
Listado de Secuencias o una variante funcional de la misma que tiene
una homología de no menos de un 90% con respecto a la ID SEC Nº:
1.
8. Vector recombinante según la reivindicación
7, en el que dicha pluralidad de fragmentos de DNA originados a
partir de intrones la constituyen dos secuencias indicadas en la ID
SEC Nº: 1 en el Listado de Secuencias o una variante funcional de
las mismas que tiene una homología de no menos de un 90% con
respecto a la ID SEC Nº: 1.
9. Vector recombinante según la reivindicación
7, en el que al menos uno de los de dicha pluralidad de fragmentos
de DNA originados a partir de intrones comprende la secuencia que
está indicada en la ID SEC Nº: 2 en el Listado de Secuencias o una
variante funcional de la misma que tiene una homología de no menos
de un 90% con respecto a la ID SEC Nº: 2.
10. Vector recombinante según la reivindicación
9, en el que dicha pluralidad de fragmentos de DNA originados a
partir de intrones comprende la secuencia que está indicada en la ID
SEC Nº: 1 o una variante funcional de la misma y la secuencia que
está indicada en la ID SEC Nº: 2 o una variante funcional de la
misma, teniendo las variantes funcionales una homología de no menos
de un 90% con respecto a la secuencia original.
11. Vector recombinante según la reivindicación
7, en el que al menos uno de los dicha pluralidad de fragmentos de
DNA originados a partir de intrones comprende la secuencia que está
indicada en la ID SEC Nº: 3 en el Listado de Secuencias o una
variante funcional de la misma que tiene una homología de no menos
de un 90% con respecto a la ID SEC Nº: 3.
12. Vector recombinante según la reivindicación
11, en el que dicha pluralidad de fragmentos de DNA originados a
partir de intrones comprende la secuencia que está indicada en la ID
SEC Nº: 1 o una variante funcional de la misma y la secuencia que
está indicada en la ID SEC Nº: 3 o una variante funcional de la
misma, teniendo las variantes funcionales una homología de no menos
de un 90% con respecto a la secuencia original.
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