CN1180084C - 核酸片段、含该片段的重组载体以及使用该片段促使结构基因的表达方法 - Google Patents

核酸片段、含该片段的重组载体以及使用该片段促使结构基因的表达方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1180084C
CN1180084C CNB008020353A CN00802035A CN1180084C CN 1180084 C CN1180084 C CN 1180084C CN B008020353 A CNB008020353 A CN B008020353A CN 00802035 A CN00802035 A CN 00802035A CN 1180084 C CN1180084 C CN 1180084C
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
expression
acid fragment
fragment
structural gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB008020353A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1322245A (zh
Inventor
植木润
二
森冈真二
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Japan Tobacco Inc
Original Assignee
Japan Tobacco Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan Tobacco Inc filed Critical Japan Tobacco Inc
Publication of CN1322245A publication Critical patent/CN1322245A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1180084C publication Critical patent/CN1180084C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

公开一种新的核酸片段，它具有优异的、促使位于下游的结构基因表达的作用；公开一种方法利用该核酸片段促使位于下游的结构基因的表达。该核酸片段具有序列表中SEQ ID NO：1所示碱基序列的核酸片段或者是在该碱基序列中有一个或多个碱基被置换、缺失、插入或附加的核酸片段，并且具有促使位于下游的结构基因表达作用的核酸片段。

Description

核酸片段、含该片段的重组载体以及使用 该片段促使结构基因的表达方法
技术领域
本发明涉及核酸片段，该片段具有促使位于下游的结构基因表达的功能，它还涉及含此核酸片段的重组载体以及使用该片段进行结构基因表达的方法，它又涉及一种根据表达方法促使所要结构基因表达的植物。
背景技术
将遗传工程的手法应用于植物研究时促进外源基因的表达是必不可少的技术。其中一个技术就是利用DNA片段促使基因的表达并产生表达效果。作为促使外源基因表述的DNA片段，已知有若干内含子(Simpson andFilipowicz 1996.Plant Mol.Biol. 32：1-41)，主要有玉米的乙醇脱氢酶的内含子(Callis et al.Gene&Development  1，1183-1200，1987)，还有水稻磷脂酶(以下称「PLD」)的第一内含子(国际专利WO96/30510)。另外有关来自内含子的DNA片段曾有这样报道事例：将内含子的内部序列删除一部分或者是在内含子的内部插入同一内含子均对基因表达具有促进作用(Mascarenhas et al.Plant Mol.Biol. 15，913-920 1990；Clancy etal.Plant Sci. 98，151-161 1994)。
然而，事实上能够利用的DNA片段的种类很有限，每个DNA片段的作用因植物种类不同而不同，即使是同一种植物因其器官或者是组织的不同而各有差异(Simpson and Filipowicz 1996.Plant Mol.Biol. 32：1-41)，从这些理由来看，要求存在具有促进各种表达作用的DNA片段。现有的DNA片段，很多促进表达的效果不充分，因此我们期待能发挥更大作用的DNA片段。
发明公开
本发明的目的是，提供一种新的核酸片段，它具有优异的、促使位于下游的结构基因表达的作用；同时提供一种利用该核酸片段促使位于下游的结构基因表达的方法。
本发明人经过反复钻研终于研究出水稻PLD第二内含子具有优异的、促使基因表达的作用，从而完成本发明任务。
即，本发明提供一种核酸片段，该核酸片段具有促使位于下游的结构基因表达的作用，它具有序列表中SEQ ID NO：1所示的碱基序列的核酸片段或者是在该碱基序列中置换、缺失一个或多个碱基、或者在该碱基序列中插入或附加一个或多个碱基的核酸片段。本发明又提供一种具有促使位于下游的结构基因表达的作用的核酸片段，它具有序列表中SEQ ID NO：1所示碱基序列的核酸片段或者在严谨条件下与该核酸片段杂交的核酸片段。本发明进一步提供一种重组载体，它至少包含上述本发明的核酸片段和位于该核酸片段下游的结构基因，通过所述核酸片段促使该结构基因的表达。本发明提供结构基因表达的促进方法，由在结构基因的上游中插入本发明所述的核酸片段而构成。本发明提供能促使所要结构基因进行表达的植物或者是维持该植物性状的后代。
通过本发明提供一种新的核酸片段，该片段具有优异的、促使结构基因表达的作用。正如下面实施例所示，本发明的核酸片段与具有同样功能的公知的水稻PLD第一内含子相比其下游的结构基因的表达促进作用相差很大。总之，将本发明的核酸片段插入到结构基因的上游能大幅度地促使该结构基因的表达，因此，本发明大大地促使使用重组载体的外源基因的表达，有待于在遗传工程学等方面做出贡献。
实施发明的最佳方案
如上所述，本发明的核酸片段是具有序列表中SEQ ID NO：1所示的碱基序列的核酸片段或者是在该碱基序列中有一个或多个碱基被置换、缺失、或在该碱基序列中插入或附加一个或多个碱基的核酸片段，同时，它又具有促使位于其下游的结构基因表达作用的核酸片段。
本发明的范围包括：序列表中SEQ ID NO：1所示碱基序列的核酸片段或者是在该碱基序列中有一个或多个碱基被置换、缺失、或者在该碱基序列中插入或附加一个或多个碱基的核酸片段，还包括具有促使位于下游的结构基因表达作用的核酸片段(以下为方便称作「修饰核酸片段」)。此时，修饰核酸片段中的与SEQ ID NO：1所示序列对应的部分，优选的是其与SEQID NO：1所示序列的同源性为70％以上，更优选85％以上，再优选95％以上。另外碱基序列的同源性可通过众所周知的FASTA微机软件而简便地算出。这些修饰核酸具有SEQ ID NO：1所示的碱基序列核酸并最好在严谨条件下(用一般的杂交溶液即，5×Denhardt’s reagent，6×SSC，0.5％SDS或者0.1％SDS，温度在50℃-65℃之间，优选在50℃和60℃的两个温度段，或者在四个温度段如50℃，55℃，60℃，65℃)进行杂交。
本发明还包括这样一种具有SEQ ID NO：1所示碱基序列核酸片段的一部分，并且具有促使位于下游的结构基因表达作用的核酸片段。本发明还包括由数个上述本发明核酸片段相连而成的核酸片段。此时，核酸片段的连接可以是直接连接也可以在它们之间有其它序列。
本发明的核酸既可以是DNA也可以是RNA，但从核酸稳定性考虑优选DNA。
通过本发明已弄清本发明核酸片段的碱基序列，它来自于水稻基因组，所以，以水稻基因组DNA为模板根据PCR等核酸扩增法易于进行制备。在本领域中，众所周知的PCR反应均可通过厂家的试剂盒及其装置简便地实施。所述修饰核酸片段通过众所周知的定位诱变法很容易地制备所要的核酸片段。
将数个本发明核酸片段连接时，可以预先将数个本发明的核酸片段连接，也可以将本发明核酸片段插入本发明的含核酸片段区域。
通过在结构基因的上游插入本发明所述的核酸片段，可以促使该结构基因的表达。结构基因受位于上游的启动子控制，本发明的核酸片段可以插入启动子和结构基因之间，也可以插入启动子的上游，优选前者。这时优选的是本发明的核酸片段和结构基因之间的距离为0bp-1000bp，同时启动子和本发明核酸片段之间的距离为0bp-1000bp也是优选的。
本发明提供的重组载体是将本发明所述方法应用于表达载体而获得的。本发明的重组载体通过在市售的表达载体的克隆位点中插入本发明核酸片段和能促进表达的结构基因是易于制备获得的。这种表达载体优选是植物用表达载体，在本领域有已知的各种各样的载体，还有市售的。这些表达载体至少包括以下几个部分：为在宿主细胞内复制的复制起始点、启动子、为插入外源基因而给出的限制性内切酶的位点的克隆位点、和抗药性基因等的选择标记，通常表达载体还包括使转录顺利终止的终止子。在本发明方法中，均可采用公知的表达载体。
通过使用上述重组载体按照常规方法转化植物可以获得促使所要结构基因表达的植物。植物的转化方法在本领域中是周知的，通过原生质体的电穿孔法或者是土壤杆菌法等众所周知的方法实施。
实施例
下面根据实施例具体地阐述本发明，但本发明并不限于下述实施例。
用下面的引物以公知的水稻基因组克隆(WO95/0934的SEQ ID NO：5)为模板，用水稻PLD基因的第二内含子以及两端各含有37个碱基外显子的DNA片段(其碱基序列于SEQ ID NO：2所示)进行PCR扩增。
5′-aagtcccccgggccgcgccagcggaag-3′
3′-gacacccacagccgtctatagttcgta-5′
CLONTECH公司制备的载体pBI221的SmaI位点上插入用SmaI和EcoRV消化所得PCR扩增片段，该载体pBI221在35S启动子的下游配置有β-Glucuronidase(GUS)基因。通过此操作过程，将上述扩增的片段配置于35S启动子和GUS基因之间。依照Sheen的方法(Sheen，Plant Cell  3：225-245 1991)研究瞬时基因的表达。即通过电穿孔法将构建的质粒导入到由玉米黄化叶分离的原生质体中，用所述方法测定GUS的瞬时表达。
为了比较，根据国际专利WO96/30510所述方法，通过PCR使水稻PLD基因的第一内含子(序列表中SEQ ID NO：3所示)进行扩增，同上所述，将水稻PLD基因的第一内含子插入到pBI221的Sma I位点上，导入玉米的原生质体中研究其GUS的表达。其表达结果于表1所示。
表1
质粒     GUS活性(4-MU pmol/107细胞/分)
pBI221(35S启动子、GUS)(比较例)pBI221+PLD第一内含子(比较例)pBI221+PLD第二内含子(实施例)     14063011,000
正如本结果所表明的，本发明的核酸片段，与具有同样功能的公知的水稻PLD第一内含子相比，促进其下游的结构基因的表达相差很大。
                             序列表
<110>日本烟草产业株式会社(Japan Tobacco INC.)
<120>核酸片段、含该片段的重组载体以及使用该片段促使结构基因的表达方法
<130>00PF210-PCT
<160>5
<210>1
<211>540
<212>DNA
<213>稻(Oryza sativa)
<400>1
gttcggaccc ttctccttaa tctactcgtc tttgctcttg ctctttttct tttgtgtccc    60
tttcttgtgt gtgcgtttgc atgagcccga atttgatctg ctagtgcaca gtacagtcag    120
atacactgaa acgatctgga aattctggat tattaggaaa aataaagagg tagtagacaa    180
gaattggaga tactttctat caagattggt ctattatgct tggccatttc ttgtttgacc    240
caagtacttc tttgaatcta gagtttgctg tgtgtgatgt ggtgtgtgtt tgtgtcacca    300
aaaatcttca ttagctaaaa ctgaaatttt atttattaac tgacctacta aaaatgtaga    360
gttctctgtg tgtgatgtgt gcttgtgtca ccaaaaatct tgatttgata gagtttttat    420
ttatttatta actgacctac tacaaatcta ttgctgtatg ctatgtgtgt ctgtatcacc    480
tgaaatgcaa tgtcttcttc tttgttgttc ttgatctaac acgtgagctc atgtcaacag    540
<210>2
<211>614
<212>DNA
<213>稻(Oryza sativa)
<400>2
ccgcgccagc ggaagcgccc ccaagttcat ccgcaaggtt cggacccttc tccttaatct    60
actcgtcttt gctcttgctc tttttctttt gtgtcccttt cttgtgtgtg cgtttgcatg    120
agcccgaatt tgatctgcta gtgcacagta cagtcagata cactgaaacg atctggaaat    180
tctggattat taggaaaaat aaagaggtag tagacaagaa ttggagatac tttctatcaa    240
gattggtcta ttatgcttgg ccatttcttg tttgacccaa gtacttcttt gaatctagag    300
tttgctgtgt gtgatgtggt gtgtgtttgt gtcaccaaaa atcttcatta gctaaaactg    360
aaattttatt tattaactga cctactaaaa atgtagagtt ctctgtgtgt gatgtgtgct    420
tgtgtcacca aaaatcttga tttgatagag tttttattta tttattaact gacctactac    480
aaatctattg ctgtatgcta tgtgtgtctg tatcacctga aatgcaatgt cttcttcttt    540
gttgttcttg atctaacacg tgagctcatg tcaacagttt gtggagggga ttgaggacac    600
tgtgggtgtc ggca                                                      614
<210>3
<211>173
<212>DNA
<213>稻(Oryza sativa)
<400>3
gtaagcccag tgtgcttagg ctaagcgcac tagagcttct tgctcgcttg cttcttctcc    60
gctcagatct gcttgcttgc ttgcttcgct agaaccctac tctgtgctgc gagtgtcgct    120
gcttcgtctt ccttcctcaa gttcgatctg attgtgtgtg tgggggggcg cag           173
<210>4
<211>27
<212>DNA
<213>稻(Oryza sativa)
<400>4
aagtcccccg ggccgcgcca gcggaag                                        27
<210>5
<211>27
<212>DNA
<213>稻(Oryza sativa)
<400>5
atgcttgata tctgccgaca cccacag                                        27

Claims (2)

1.一种核酸片段，它具有序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，并且具有促使位于其下游的结构基因表达的活性。
2.权利要求1所述的核酸片段，其具有序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
CNB008020353A 1999-09-27 2000-09-25 核酸片段、含该片段的重组载体以及使用该片段促使结构基因的表达方法 Expired - Fee Related CN1180084C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP271762/1999 1999-09-27
JP27176299 1999-09-27

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1322245A CN1322245A (zh) 2001-11-14
CN1180084C true CN1180084C (zh) 2004-12-15

Family

ID=17504496

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB008020353A Expired - Fee Related CN1180084C (zh) 1999-09-27 2000-09-25 核酸片段、含该片段的重组载体以及使用该片段促使结构基因的表达方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US6998477B1 (zh)
EP (1) EP1134285A4 (zh)
KR (1) KR100842130B1 (zh)
CN (1) CN1180084C (zh)
AU (1) AU784292B2 (zh)
CA (1) CA2352602A1 (zh)
WO (1) WO2001023544A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2011202966B2 (en) * 2005-03-08 2012-06-21 Basf Plant Science Gmbh Expression enhancing intron sequences
EP2166099B1 (en) * 2005-03-08 2012-12-19 BASF Plant Science GmbH Expression enhancing intron sequences
US10800396B2 (en) 2017-12-13 2020-10-13 Ford Global Technologies, Llc Methods and system for adapting operation of a driveline disconnect clutch

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5747327A (en) 1993-09-30 1998-05-05 Japan Tobacco Inc. Phospholipase D gene originated from plant
US5801016A (en) 1995-03-29 1998-09-01 Japan Tobacco Inc. DNA fragment, recombinant vector containing the same and method for expressing foreign genes using the same
EP0823477A4 (en) 1996-02-21 2004-11-24 Japan Tobacco Inc METHOD FOR CHANGING PHOSPHOLIDE COMPOSITION TO A LIVING BODY AND RECOMBINANT VECTOR THEREFOR
JP3413207B2 (ja) 1996-06-12 2003-06-03 日本たばこ産業株式会社 外来遺伝子の発現方法及びそのためのベクター
JP2000152785A (ja) 1998-11-19 2000-06-06 Japan Tobacco Inc 核酸断片、それを含む組換えベクター及びそれを用いた構造遺伝子の発現促進方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP1134285A4 (en) 2004-07-28
CN1322245A (zh) 2001-11-14
AU784292B2 (en) 2006-03-02
EP1134285A1 (en) 2001-09-19
KR100842130B1 (ko) 2008-06-27
US6998477B1 (en) 2006-02-14
WO2001023544A1 (fr) 2001-04-05
CA2352602A1 (en) 2001-04-05
KR20020009551A (ko) 2002-02-01
AU7443900A (en) 2001-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1279172C (zh) 转化水稻植物的方法
CN108546716A (zh) 一种基因组编辑方法
WO2019207274A1 (en) Gene replacement in plants
EP0571741A2 (en) An expression plasmid for seeds
CN109371040B (zh) 水稻OsARF6基因在调控水稻种子粒型中的应用
CN1196753A (zh) 根皮层特异性基因启动子
CN110144353A (zh) 一种橡胶树U6基因启动子proHbU6.6及其克隆与应用
CN101063135A (zh) 植物胚乳特异性表达启动子及其应用
CN101063136A (zh) 植物胚乳特异性启动子及其应用
Xin et al. Amplification of miniature inverted-repeat transposable elements and the associated impact on gene regulation and alternative splicing in mulberry (Morus notabilis)
CN1180084C (zh) 核酸片段、含该片段的重组载体以及使用该片段促使结构基因的表达方法
CN112980847B (zh) 一种橡胶树泛素基因启动子proHbUBI3及其克隆与应用
CN1715412A (zh) 一个与棉纤维发育相关的基因及其编码蛋白与应用
CN1782074A (zh) 一种扩增水稻t－dna插入位点侧翼序列的方法
CN1151262C (zh) 表达异源基因的方法及其所用的载体
CN1908172A (zh) 糜子抗旱调控基因myb类转录因子基因及其用途
CN1273594C (zh) 获得雄性不育小麦的方法及其专用质粒与功能核苷酸片段
CN100347305C (zh) 一种增强小麦抗旱性的方法
CN116254267B (zh) 橡胶草乳管特异性表达启动子及其应用
CN1198926C (zh) 核酸片段、含它的重组载体和其启动结构基因表达的方法
CN115927300B (zh) 靶向HBA基因的sgRNA及食蟹猴HBA基因敲除的方法
US20090222945A1 (en) Brittle stalk 2 polynucleotides, polypeptides, and uses thereof
CN112646015B (zh) 改变玉米开花期的基因及方法
JP7220604B2 (ja) イチイ由来のプロモーター及びその用途
CN101063137A (zh) 一种植物胚乳特异性表达启动子及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20041215

Termination date: 20091026