JP3413207B2 - 外来遺伝子の発現方法及びそのためのベクター - Google Patents

外来遺伝子の発現方法及びそのためのベクター

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、外来遺伝子の発現方法及びそのための組換
えベクターに関する。さらに詳細には、本発明は、遺伝
子工学的手法により細胞中で外来遺伝子を発現させる際
に、該外来遺伝子の発現を従来法よりも促進することが
できる、外来遺伝子の発現方法及びそのためのベクター
に関する。
背景技術 外来遺伝子の発現を促進することは、遺伝子工学の手
法において、特に遺伝子工学の手法を植物に適用する際
に最も必要とされる技術のひとつである。
その方法のひとつとして、外来遺伝子の上流にイント
ロン由来DNA断片を挿入する方法が知られている。例え
ば、特開平３−103182号公報には、ヒマカタラーゼ遺伝
子（CAT−１）のイントロン由来DNA断片を外来遺伝子の
上流に挿入して該外来遺伝子を発現させることにより、
該外来遺伝子の発現が促進されることが記載されてい
る。同様な現象は種々のイントロン由来DNA断片につい
て報告されている。
外来遺伝子の発現を促進する目的でイントロンが利用
されてきたが、複数イントロンの利用は一般的でなく、
その効果も認められていなかった。例えば、トウモロコ
シのアルコールデヒドロゲナーゼ−１の第１イントロン
と第６イントロンはそれぞれ単独で遺伝子発現促進効果
を示すが、両者を連結した場合の効果は第６イントロン
の単独使用に及ばない（Mascarenhas et al.Plant Mol.
Biol.,15,913−920（1990））。また、トウモロコシの
アクチンの第３イントロンを２つ連結した場合にも、そ
の効果は単独使用に及ばない（Luehrsen et al.,Mol.Ge
n.Genet.,225,81−93（1991））。
イントロン由来のDNA断片を挿入する従来の方法は有
効であるが、発現促進の効果が不十分な場合も多く、よ
り強い発現を可能とする方法が望まれていた。
発明の開示 従って、本発明の目的は、従来の方法よりも外来遺伝
子を強く発現させることができる、外来遺伝子の発現方
法及びそのための組換えベクターを提供することであ
る。
本願発明者らは、鋭意研究の結果、外来遺伝子の上流
に挿入された場合に外来遺伝子の発現を促進する効果を
有する特定の同一又は異なる複数のイントロン由来DNA
断片を外来遺伝子の上流に挿入することにより、イント
ロン由来DNA断片を１個挿入する従来の方法に比較して
顕著に外来遺伝子の発現が高まることを見出し本発明を
完成した。
すなわち、本発明は、プロモーターの下流に外来遺伝
子を挿入し、細胞中で該外来遺伝子を発現させる外来遺
伝子の発現方法において、該外来遺伝子の上流に、外来
遺伝子の発現を促進する効果を有する、同一又は異なる
イントロン由来DNA断片を複数挿入して前記外来遺伝子
を発現させる方法であって、前記複数のイントロン由来
DNA断片の配列が、配列表の配列番号１ないし３で示さ
れる配列から選択される（ただし、配列番号２で示され
る配列のみを複数含む場合を除く）ことを特徴とする、
外来遺伝子の発現方法を提供する。
また、本発明は、プロモーターと、その下流に連結さ
れた発現すべき外来遺伝子と、該外来遺伝子の上流に挿
入された、外来遺伝子の発現を促進する効果を有する、
同一又は異なる複数のイントロン由来DNA断片とを含む
組換えベクターであって、該DNA断片の配列が、配列表
の配列番号１ないし３で示される配列から選択されるこ
とを特徴とする組換えベクター（ただし、配列番号２で
示される配列のみを複数含む場合を除く）を提供する。
本発明により、外来遺伝子の発現が従来の方法に比べ
て顕著に促進された外来遺伝子の発現方法及びそのため
の組換えベクターが提供された。本発明によれば、遺伝
子工学的手法により導入した外来遺伝子の発現が促進さ
れるので、本発明は遺伝子工学の分野に大いに寄与する
ものと期待される。
発明を実施するための最良の形態 本発明の方法は、発現すべき外来遺伝子の上流に、外
来遺伝子の発現を促進する効果を有するイントロン由来
DNA断片を２個以上挿入することにより、外来遺伝子の
発現を促進することを特徴とする。
ここで、「外来遺伝子の発現を促進する効果を有する
イントロン由来DNA断片」とは、これを挿入せずに外来
遺伝子を発現させた場合に比べて、外来遺伝子の発現を
検出可能な程度に増加させる効果を有するイントロン由
来DNA断片を意味する。外来遺伝子の発現を促進する効
果を有するイントロン由来DNA断片の配列は、配列表の
配列番号１ないし３で示される配列から選択される（た
だし、配列番号２で示される配列のみを複数含む場合を
除く）。
また、本願発明者らは、先にイネのホスホリパーゼＤ
（PLD）遺伝子のcDNAとゲノムDNAの塩基配列を比較する
ことによりイネPLD遺伝子のイントロンを見出し、か
つ、これらのイントロンのうちの１つがその下流の遺伝
子の発現を顕著に促進する効果を有することを見出し、
特許出願した（PCT/JP96/00812）。このイントロンの塩
基配列を配列表の配列番号１に示す。本発明では、この
配列番号１に示すイントロン由来DNA断片を用いること
もできる。また、配列表の配列番号２に示されるヒマカ
タラーゼイントロン配列や配列番号３に示されるトウモ
ロコシユビキチン遺伝子のイントロン配列も好ましく用
いることができる。
上記の各イントロン由来DNA断片は、その塩基配列及
びその由来が公知であるので、常法であるPCR法により
容易に調製することができる。また、長さが200bp程度
以下のものならば化学合成することも可能である。ま
た、上記の修飾イントロン由来DNA断片も常法である部
位特異的変異法又は化学合成法により容易に調製するこ
とができる。
本発明の方法では、発現すべき外来遺伝子の上流、す
なわち該外来遺伝子の転写領域、より好ましくはこの転
写領域の5'末端側に上記イントロン由来DNA断片が複数
個挿入される。イントロン由来DNA断片はプロモーター
と外来遺伝子の間に挿入することが好ましい。上記イン
トロン由来DNA断片は、発現すべき外来遺伝子の直上流
に挿入されていてもよいが、イントロン由来DNA断片と
外来遺伝子の間に他の配列が介在していてもよい。この
介在する配列の長さは特に限定されないが、通常０〜10
00bp程度である。また、プロモーターとイントロン由来
DNA断片とは直結していてもよいし、これらの間に他の
配列が介在していてもよい。この介在する配列の長さは
特に限定されないが、通常０〜1000bp程度である。
本発明の方法では、上記イントロン由来DNA断片を複
数個、好ましくは２〜５個、さらに好ましくは２又は３
個挿入する。挿入するイントロン由来DNA断片は同一の
配列であっても異なる配列であってもよい。挿入される
複数のイントロン由来DNA断片は、互いに直結されてい
てもよいし、それらの間に他の配列が介在していてもよ
い。この介在する配列の長さは特に限定されないが、通
常０〜1000bp程度である。
なお、プロモーターとしては、下流の外来遺伝子を発
現させることができるいずれのプロモーターをも用いる
ことができ、好ましい例として、35Sプロモーターを挙
げることができるがこれに限定されるものではない。
本発明は、また、上記本発明の方法を適用した組換え
ベクターをも提供する。すなわち、本発明は、プロモー
ターと、その下流に連結された発現すべき外来遺伝子
と、該外来遺伝子の上流に挿入された、外来遺伝子の発
現を促進する効果を有する、同一又は異なる複数のイン
トロン由来DNA断片とを含む組換えベクターを提供す
る。このような組換えベクターは、適当な発現ベクター
に上記複数個のイントロン由来DNA断片及び外来遺伝子
を挿入することにより得ることができる。この挿入は、
発現ベクターのクローニング部位の塩基配列がわかって
いるので、適当な制限酵素や必要によりリンカーを用い
ることにより容易に行なうことができる。
なお、このような発現ベクターは、種々のものがこの
分野において周知であり、かつ市販されている。これら
の発現ベクターは、宿主細胞内で複数するための複数開
始点、プロモーター、外来遺伝子を挿入するための制限
酵素部位を与えるクローニング部位及び薬剤耐性遺伝子
等の選択マーカーを少なくとも含み、通常、転写を安定
に終了させるターミネーターや、宿主が細菌の場合には
SD配列を含む。本発明の方法においては、これらの公知
の発現ベクターのいずれをも採用することができる。
本願発明者らは、配列表の配列番号３に示される塩基
配列を有する、トウモロコシのユビキチン遺伝子のイン
トロン配列が単独で外来遺伝子の上流に挿入されている
場合であっても該外来遺伝子の発現を促進する効果を有
することを見出した。もっとも、配列番号３で示される
配列であっても複数個挿入する方が効果が大きく、特
に、配列番号１で示されるイネPLDのイントロン配列と
共に挿入する効果が大きい。
実施例 以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明す
る。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるもので
はない。
実施例１ イネPLDの遺伝子には、mRNAの5'末端非翻訳領域に対
応する位置に173bpの第１イントロンが存在する（配列
番号１、WO 95/09234）。そのイントロンについて植物
細胞における遺伝子発現に及ぼす影響を調べた。エキソ
ン部分を10ベースずつ含む20merのプライマー（5'−TCA
CCACCCGGTAAGCCCAG−3',3'−CCCCCGCGTCCATCCCGCTC−
5'）を合成し、イネゲノムクローンを鋳型としてPCRを
行った。PCR反応は、50pmolの各々のプライマーの混合
物、200μＭのdATP,dCTP,dGTPおよびdTTP、1 x PCR緩衝
液（宝酒造社製）および2.5U AmpliTaq DNAポリメラー
ゼ（宝酒造社製）を使用して全容積50μｌで行った。反
応は下記の温度条件に従って30周期を繰り返した;DNAサ
ーモサイクラー（パーキン エルマー シータス社製）
中で:1分間にわたり94℃、１分間にわたり40℃、および
２分30秒間にわたり72℃。
PCR産物をPCR IIベクター（インビトロジェン社製）
にサブクローニングし、そこからEcoR Iで切り出した断
片を平滑末端処理した後、東洋紡社製のプラスミドpBI2
21（35Sプロモーター（以下、「35S pro」）の下流にβ
−グルクロニダーゼ遺伝子（以下、「GUS」）を挿入し
たベクタープラスミド）のSma Iサイトに組み込んだベ
クターpBI221P（35S pro,PLD intron,GUS）を調製し
た。さらに、そのプラスミドをBamH Iで消化し、平滑末
端処理を行ったのち、上記の断片を組み込み、ベクター
pBI221PP（35S pro,PLD intron x 2,GUS）を作製した。
また、特開平03−103182号公報に記載されたpIG221
（35S proの下流にヒマカタラーゼイントロン（配列表
の配列番号２）及びGUSをこの順序で有する）をXba Iで
消化し、平滑末端処理の後、上記PLDイントロンの配列
を有するDNA断片を挿入して、ベクターpIG221P（35S pr
o,PLD intron,Catalase intron,GUS）を作製した。
日本稲品種のニホンバレの未熟胚よりイネ培養細胞を
調製し（Hiei et al.The Plant Journal,6,271−282（1
994））、既報（Shimamoto et al.Nature,338,274−276
（1989））にしたがって上記遺伝子を導入後、β−gluc
uronidase（GUS）活性を測定した。結果を表１に示す。
表１に示したとおり、２つの同種あるいは異種のイン
トロンの導入により、単独使用の場合と比べてGUS活性
の顕著な増大が認められた。同時に、PLDイントロンの
塩基配列を有するDNA断片は、イントロンの塩基配列を
有するDNA断片の複数使用において遺伝子発現促進効果
を得られるDNA断片であることが明らかになった。
実施例２ トウモロコシのユビキチン遺伝子（Ubi−1:Christens
en A.H.et al.Plant Mol.Biol.,18,675−689（1982））
のイントロンについても外来遺伝子発現の促進効果を調
べた。用いたベクターは２種類である。
先ず、単独使用での効果を調べるためのベクターを以
下の方法で作製した。ユビキチン遺伝子のプロモーター
とイントロンの部分をPat Iで切り出し（配列番号
３）、pUC18ベクターのPst Iサイトに挿入した。イント
ロン部分をBgl IIとBamH Iで切り出し、pBI221ベクター
のBamH Iサイトに挿入し、ベクターpBI221U（35S pro,U
biquitin intron,GUS）とした。
次に、複数使用での効果を調べるためのベクターを以
下の方法で作製した、イントロン部分をBgl IIとBamH I
で切り出し、平滑末端処理の後、pBI221ベクターのSma
Iサイトに挿入した。さらに、そのベクターのBamH Iサ
イトに平滑末端処理を行ない、記述のPLDイントロンを
挿入することにより、ベクターpBI221PU（35S pro,PLD
intron,Ubiquitin intron,GUS）とした。これらのベク
ターを上述の方法でプロトプラストに導入し、GUS活性
を測定した。
表２に示した通り、ユビキチンイントロンと単独使用
によってGUS発現の促進効果が認められた。さらに、PLD
イントロンとユビキチンイントロンの併用によって、各
々のイントロンを単独で使用した場合と比べ、より強い
促進効果が認められた。
配列表 配列番号:1 配列の長さ:173 配列の型：核酸 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名:Oryza sativa トポロジー：直鎖状 鎖の数：二本鎖 配列 配列番号:2 配列の長さ:217 配列の型：核酸 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：ヒマ トポロジー：直鎖状 鎖の数：二本鎖 配列 配列番号:3 配列の長さ:1010 配列の型：核酸 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：トウモロコシ トポロジー：直鎖状 鎖の数：二本鎖 配列
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 倉屋 芳樹 静岡県磐田郡豊田町東原700 日本たば こ産業株式会社 遺伝育種研究所内 (56)参考文献 特開 平３−103182（ＪＰ，Ａ) Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．, 1990年，15，913−920 Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，1991 年，225，81−93 Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．, 1992年，18，675−689 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤ Ｓ（ＳＴＮ)

Claims (18)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】プロモーターの下流に外来遺伝子を挿入
    し、細胞中で該外来遺伝子を発現させる外来遺伝子の発
    現方法において、該外来遺伝子の上流に、外来遺伝子の
    発現を促進する効果を有する、同一又は異なるイントロ
    ン由来DNA断片を複数挿入して前記外来遺伝子を発現さ
    せる方法であって、前記複数のイントロン由来DNA断片
    の配列が、配列表の配列番号１ないし３で示される配列
    から選択される（ただし、配列番号２で示される配列の
    みを複数含む場合を除く）ことを特徴とする、外来遺伝
    子の発現方法。
  2. 【請求項２】前記複数のイントロン由来DNA断片は、前
    記プロモーターと前記外来遺伝子の間に挿入される請求
    項１記載の方法。
  3. 【請求項３】前記細胞は植物細胞である請求項１又は２
    記載の方法。
  4. 【請求項４】前記複数のイントロン由来のDNA断片のう
    ちの少なくとも１つは配列表の配列番号１で示される配
    列である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方
    法。
  5. 【請求項５】前記複数のイントロン由来DNA断片とし
    て、配列表の配列番号１で示される配列を２個含む、請
    求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】前記複数のイントロン由来DNA断片のうち
    の少なくとも１つは配列表の配列番号２で示される配列
    である請求項１ないし４のいずれか１項記載の方法。
  7. 【請求項７】前記複数のイントロン由来DNA断片は、配
    列表の配列番号１で示される配列と、配列表の配列番号
    ２で示される配列をそれぞれ含む請求項６記載の方法。
  8. 【請求項８】前記複数のイントロン由来DNA断片のうち
    の少なくとも１つは配列表の配列番号３で示される配列
    である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
  9. 【請求項９】前記複数のイントロン由来DNA断片は、配
    列表の配列番号１で示される配列と、配列表の配列番号
    ３で示される配列をそれぞれ含む請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】プロモーターと、その下流に連結された
    発現すべき外来遺伝子と、該外来遺伝子の上流に挿入さ
    れた、外来遺伝子の発現を促進する効果を有する、同一
    又は異なる複数のイントロン由来DNA断片とを含む組換
    えベクターであって、該DNA断片の配列が、配列表の配
    列番号１ないし３で示される配列から選択されることを
    特徴とする組換えベクター（ただし、配列番号２で示さ
    れる配列のみを複数含む場合を除く）。
  11. 【請求項１１】前記複数のイントロン由来DNA断片は、
    前記プロモーターと前記外来遺伝子の間に挿入されてい
    る請求項10記載の組換えベクター。
  12. 【請求項１２】植物細胞内で複製可能なものである請求
    項10又は11記載の組換えベクター。
  13. 【請求項１３】前記複数のイントロン由来DNA断片のう
    ちの少なくとも１つは配列表の配列番号１で示される配
    列を含む請求項10ないし12のいずれか１項に記載の組換
    えベクター。
  14. 【請求項１４】前記複数のイントロン由来DNA断片とし
    て、配列表の配列番号１で示される配列を２個含む、請
    求項13記載の組換えベクター。
  15. 【請求項１５】前記複数のイントロン由来DNA断片のう
    ちの少なくとも１つは配列表の配列番号２で示される配
    列を含む請求項10ないし12のいずれか１項記載の組換え
    ベクター。
  16. 【請求項１６】前記複数のイントロン由来DNA断片は、
    配列表の配列番号１で示される配列と、配列表の配列番
    号２で示される配列をそれぞれ含む請求項15記載の組換
    えベクター。
  17. 【請求項１７】前記複数のイントロン由来DNA断片のう
    ちの少なくとも１つは配列表の配列番号３で示される配
    列を含む請求項10ないし12のいずれか１項記載の組換え
    ベクター。
  18. 【請求項１８】前記複数のイントロン由来DNA断片は、
    配列表の配列番号１で示される配列と、配列表の配列番
    号３で示される配列をそれぞれ含む請求項17記載の組換
    えベクター。
JP50144698A 1996-06-12 1997-06-12 外来遺伝子の発現方法及びそのためのベクター Expired - Fee Related JP3413207B2 (ja)

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