JP2024512050A - 誘導可能なモザイク現象 - Google Patents

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Abstract

植物の種子中における複数の固有の編集を生成するためのシステム及び方法。一例では、方法は、ＤＮＡ修飾酵素をコードする核酸、任意に、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸及び誘導可能なシステムの配列を植物細胞又は植物組織中に導入することを含み、誘導可能なシステムの配列は、植物の所望の成長段階で誘導され、且つ花芽始原細胞及び花芽生殖器官の少なくとも１つにおけるＤＮＡ修飾酵素の発現を媒介するか、又はＤＮＡ修飾酵素を核に転座させ、及び（ｉｉ）花芽始原及び花芽生殖器官の少なくとも１つにおける複数の編集を媒介する。本方法は、植物細胞又は植物組織を、複数の固有の編集を含む複数の種子を有する植物へと再生することも含み得る。

Description

本発明の分野は、植物バイオテクノロジー、具体的には植物における遺伝子編集に関する。本発明の分野は、誘導可能な遺伝子編集システムであって、植物の生活環の所望の段階でシステムを誘導することにより、子孫における複数の編集を得ることを目的とする誘導可能な遺伝子編集システムにさらに関する。
配列表
本出願には、２０２２年３月１４日に作成されたＩＮＤＹＭＯＳ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称の配列表が添付され、これは、約１３７キロバイトのサイズである。この配列表は、その全体が参照により本明細書に援用される。この配列表は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して本明細書とともに提出され、米国特許施行規則（３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．）第１．８２４条（ａ）（２）～（６）及び（ｂ）に準拠している。
作物の量及び質を改善するための科学的方法の開発は、重大な取り組みである。例えば、標的化された突然変異誘発、挿入事象、対立遺伝子置換などによる遺伝子編集は、様々な作物の量及び質の両方を改善するのに広く使用されている非常に重要な技術である。クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ関連配列（Ｃａｓ）酵素、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ及びジンクフィンガーを含む、特定の遺伝子標的を編集するための多くの方法が現在存在する。しかしながら、遺伝子編集は、必ずしも容易な作業ではない。
遺伝子の機能をオフにする編集（一般的に「ノックアウト」と呼ばれる）は、ゲノム編集によって比較的容易に達成され得る。部位特異的ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９又はＣａｓ１２ａ及び関連するＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の使用により、標的遺伝子のコード配列中に小さい挿入又は欠失（「インデル」）を容易に生成することができ、これは、タンパク質を切断するか又は異常な配列を生成するフレームシフトをもたらすことが多い。遺伝子をノックアウトするためのこれらの周知の方法とは対照的に、それは、他のタイプの編集、例えば部分的機能喪失型若しくは機能獲得型対立遺伝子を誘導する編集又は遺伝子の発現レベル若しくはタンパク質産物の機能を変化させる編集を達成するために非常に労力を必要とし得る。これらの編集の多くは、対立遺伝子置換を必要し、これは、かなり非効率的である。同様に、全エクソン又は遺伝子又は染色体領域を除去する編集（大きい欠失）は、２つ以上のｇＲＮＡ標的部位の同時の切断を必要とし得るため、実行するのが困難であり得る。同様に、ＳＮＰを導入するための編集 － シトシンヌクレオチドからチミンヌクレオチドへの変化は、例えば、塩基編集技術を用い得るが、標的部位に関して特定のウインドウ内のみである。これらは、使用されるＤＮＡ修飾酵素系の完全な特異性又は効率の欠如のため、所望の編集結果を得ることが困難になる場合のごく一部の例である。
対立遺伝子置換（「対立遺伝子スワッピング」と呼ばれることもある）に関して、これは、植物細胞内の内因性配列を、提供され得る新たな配列で置換するために、相同的組み換え又は相同組み換え修復を用いる編集の方法である。これは、酵母及び多くの動物系で行うのがかなり容易である一方、非相同末端結合経路がＤＮＡ修復に非常に有利に作用するため、植物で行うのが非常に困難である。さらに、このプロセスは、相同的組み換えによってＤＮＡ修復のための鋳型としての役割を果たすために、切断部位への多くの供与体ＤＮＡの送達を必要とする。この送達は、特に植物の場合に行うのが容易でない。この理由のため、植物における対立遺伝子置換は、典型的には、非常に高コストであり、達成するのに多大な労力を必要とする。例えば、植物を形質転換し、対立遺伝子置換を実行することを望む場合、１つの対立遺伝子スワップが事象の１つのみ又は２つにおいて生成されることを確実にするために、１０００の安定に形質転換された事象を生成する必要があり得る。効率は、一般に、１％未満、ある場合には０～０．３％である。最良の作物、系列及び構築物設計でも、効率は、依然として非常に低い。
本出願人は、対立遺伝子置換、大きい欠失、特定の塩基編集及び様々な他の編集結果を生成するコスト及び労働強度が植物育種の主要なボトルネックになっていると考えている。プロセスの極めて低い効率を緩和する役割を果たした方法は、ほとんどない。したがって、本開示は、これらの又はさらなる課題の少なくとも１つに向けられている。
対立遺伝子置換の他、ゲノム編集の別の主要な課題は、配列の広い多様性（遺伝子座の対立遺伝子多様性）を生じさせるのに必要とされる時間及び労力に関するものである。例えば、遺伝子のコード配列のための多様な対立遺伝子を生成するか、又は遺伝子の調節領域（プロモーター）を修飾することによって発現多様性を生じさせることは、かなり時間及びコストがかかり得る。本開示は、多くの実施形態において、対立遺伝子系列を生成するためのコスト効率の高い方法にも関する。これらの及び他の利益は、以下の詳細な説明に基づいて明らかになるであろう。
本発明の目的は、植物における遺伝性の編集を効率的に得ることに関する課題に対処することである。その課題を達成するために、一実施形態は、植物の子孫における複数の固有の編集を生成するための方法であって、（ａ）発現カセットを植物細胞又は植物組織中に導入する工程であって、発現カセットは、（ｉ．）ＤＮＡ修飾酵素をコードする核酸、（ｉｉ．）少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする任意の核酸、及び（ｉｉｉ．）ＤＮＡ修飾酵素をコードする核酸に作動可能に連結された誘導因子を含む、工程と、（ｂ．）所望の植物発達段階で誘導因子を誘導する工程と、（ｃ．）植物細胞又は植物組織を、子孫を有する植物へと生成する工程であって、子孫は、複数の固有の編集を集合的に含む、工程とを含む方法を提供する。
一実施形態では、誘導因子は、転写エフェクター又は転座エフェクターであり、誘導因子は、化学物質によって誘導され、化学物質は、抗生物質、金属、ステロイド、殺虫剤、ホルモン、アルコール及びアルデヒドから選択され、抗生物質は、テトラサイクリン又はその化学的模倣体であり、金属は、銅又は銅含有化合物であり、ステロイドは、デキサメタゾン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロン及びそれらの任意の化学的模倣体からなる群から選択されるグルココルチコイドであり、グルココルチコイドは、デキサメタゾンであり、殺虫剤は、テブフェノジド、メトキシフェノジド及びそれらの任意の化学的模倣体からなる群から選択され、ホルモンは、エストロゲン（ｅｓｔｒｏｇｅｎ）、エストロゲン（ｏｅｓｔｒｏｇｅｎ）、１７－β－エストラジオール及びそれらの任意の化学的模倣体からなる群から選択され、アルコールは、エタノール及びその任意の化学的模倣体からなる群から選択され、アルデヒドは、アセトアルデヒド及びその任意の化学的模倣体からなる群から選択される。
別の実施形態では、転写エフェクターは、アルコール依存性エフェクター、ラクトース依存性エフェクター、ガラクトース依存性エフェクター及びｌｅｘＡ依存性エフェクターからなる群から選択され、アルコール依存性エフェクターは、ａｌｃエフェクターである。一態様では、ａｌｃエフェクターは、ａｌｃＡプロモーターを含むアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｌｃエフェクターである。
別の実施形態では、本方法は、ａｌｃＲ転写因子活性化遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む追加的な発現カセットをさらに含み、それによりａｌｃＡ／ａｌｃＲ誘導性システムを形成する。一態様では、本方法は、所望の植物発達段階でアルコールを適用することを含む。
別の実施形態では、ラクトース依存性エフェクターは、ｐＯｐエフェクターである。一態様では、本方法は、ＬｈＧ４転写因子活性化遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む追加的な発現カセットをさらに含み、それによりＬｈＧ４／ｐＯｐ誘導性システムを形成する。
別の実施形態では、ガラクトース依存性レギュロンは、Ｇａｌ４ ＵＡＳエフェクターである。一態様では、本方法は、Ｇａｌ４転写因子活性化遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む追加的な発現カセットをさらに含み、それによりＧＶＧ誘導性システム又はＶＧＥ誘導性システムを形成する。
別の実施形態では、ｌｅｘＡ依存性エフェクターは、少なくとも１つのＬｅｘＡオペロンである。一態様では、本方法は、ＬｅｘＡ：ＶＰ１６：ＥＲ活性化因子をコードするヌクレオチド配列を含む追加的な発現カセットをさらに含み、それによりＸＶＥ誘導性システムを形成する。
一実施形態では、ＤＮＡ修飾酵素は、メガヌクレアーゼ（ＭＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、キメラＦＥＮ１－ＦｏｋＩ、Ｍｅｇａ－ＴＡＬ及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼからなる群から選択される。一態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、ｄＣａｓ９－ＦｏｋＩ、ｄＣｐｆ１－ＦｏｋＩ、キメラＣａｓ９－シチジンデアミナーゼ、キメラＣａｓ９－アデニンデアミナーゼ、ニッカーゼＣａｓ９（ｎＣａｓ９）、キメラｄＣａｓ９非ＦｏｋＩヌクレアーゼ及びｄＣｐｆ１非ＦｏｋＩヌクレアーゼ、デアミナーゼドメインに融合されたＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｊヌクレアーゼ、ＣａｓＸヌクレアーゼ、ＣａｓＹヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１４ヌクレアーゼである。
別の実施形態では、転座因子は、グルココルチコイド受容体である。一態様では、グルココルチコイド受容体は、配列番号６を含む。別の態様では、グルココルチコイド受容体は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに作動可能に連結される。別の実施形態では、グルココルチコイド受容体連結ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、グルココルチコイド受容体結合ドメインを含むように修飾された修飾Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ（「ＧＲ－Ｃａｓ１２ａ」）である。一態様では、ＧＲ－Ｃａｓ１２ａは、配列番号７を含む。別の実施形態では、本方法は、デキサメタゾンの適用時、ＧＲ－Ｃａｓ１２ａが植物細胞又は植物組織の細胞質から核に転座することをさらに含む。
本方法の別の実施形態では、固有の編集は、インデル突然変異、ヌクレオチド置換、対立遺伝子置換、染色体転座又は供与核酸の挿入である。
本方法の別の実施形態では、植物細胞又は植物組織は、双子葉植物である。一態様では、双子葉植物の植物細胞又は植物組織は、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ヒマワリ、ダイズ、トマト、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種、ヤマナラシ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）（ポプラ）、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）、タバコ、アサ属（Ｃａｎｎａｂｉｓ）、ジャガイモ、ワタ、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、サトウキビ、グリシン・トメンテラ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｔｏｍｅｎｔｅｌｌａ）及び他の野生ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ）種からなる群から選択される。
本方法の別の実施形態では、植物細胞又は植物組織は、単子葉植物である。一態様では、単子葉植物の植物細胞又は植物組織は、トウモロコシ、コムギ、イネ、ブタモロコシ、ソルガム、オオムギからなる群から選択される。別の態様では、単子葉植物の植物細胞又は植物組織は、トウモロコシである。
一実施形態では、植物細胞又は植物組織は、トウモロコシであり、所望の発達段階は、ＶＥ、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ（ｎ）、ＶＴ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６段階からなる群から選択され、ここで、（ｎ）は、存在する葉の襟の数を表す整数である。
別の実施形態では、植物細胞又は植物組織は、ダイズであり、所望の発達段階は、ＶＥ、ＶＣ、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ（ｎ）、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８段階からなる群から選択され、ここで、（ｎ）は、存在する三小葉の数を表す整数である。
別の実施形態では、本方法は、（ｄ．）複数の固有の編集を集合的に含む子孫を苗、小植物体、未熟植物、成熟植物又は老化植物へと成長させる工程と、（ｅ．）工程ａ．の苗、小植物体、未熟植物、成熟植物又は老化植物における少なくとも１つの表現型を測定する工程と、（ｆ．）任意に、少なくとも１つの表現型の測定に基づいて、苗、小植物体、未熟植物、成熟植物又は老化植物を選択する工程とをさらに含む。
さらに別の実施形態では、本方法は、（ｄ．）複数の固有の編集を集合的に含む子孫を苗、小植物体、未熟植物、成熟植物又は老化植物へと成長させる工程と、（ｅ．）工程ａ．の苗、小植物体、未熟植物、成熟植物又は老化植物をジェノタイピングする工程と、（ｆ．）任意に、工程ｂ．の遺伝子型に基づいて、苗、小植物体、未熟植物、成熟植物又は老化植物を選択する工程とをさらに含む。
本発明の別の実施形態は、上に記載される方法によって生成される編集された植物である。
本発明の別の実施形態は、誘導可能な遺伝子編集システムであって、（ａ．）ＤＮＡ修飾酵素をコードする核酸、（ｂ．）少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする任意の核酸、及び（ｃ．）ＤＮＡ修飾酵素をコードする核酸に作動可能に連結された誘導因子を含む発現カセットを含む誘導可能な遺伝子編集システムである。一実施形態では、システムは、発現カセットを保有する細胞をさらに含む。一態様では、細胞は、真核細胞である。別の態様では、真核細胞は、植物細胞である。
配列表中の配列の簡単な説明
配列番号１は、ベクター２４９０２である。それは、構成的に発現されるＧＶＧタンパク質のヌクレオチド配列を含む。図２も参照されたい。
配列番号２は、ベクター２５６５７である。それは、イネコドン最適化ＧＲ－ＬｂＣａｓ１２のヌクレオチド配列を含み、これは、核局在化シグナル（「ＮＬＳ」）を欠き、長いリンカーによって隔てられたＮ末端におけるグルココルチコイド受容体（「ＧＲ」）結合ドメインを有する。得られるキメラＧＲ－Ｃａｓ１２は、構成的に発現されるが、細胞質に限局される。ＤＥＸの存在下にある間、ＧＲ－Ｃａｓ１２ａは、核に転座する。図３も参照されたい。
配列番号３は、ベクター２５７６５である。それは、ＡｌｃＡ／ＡｌｃＲエタノール依存性誘導性システムのヌクレオチド配列を含む。図４も参照されたい。
配列番号４は、ベクター２５８８１である。それは、エタノール及び／又はアセトアルデヒドの存在下にあるとき、Ｃａｓ１２ａの発現を誘導するために、ＡｌｃＡ／ＡｌｃＲエタノール依存性誘導性システムのヌクレオチド配列を含む。図５も参照されたい。
配列番号５は、ＧＶＧタンパク質のアミノ酸である。
配列番号６は、グルココルチコイド受容体のアミノ酸配列である。
配列番号７は、融合グルココルチコイド受容体を有するＣａｓ１２ａタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号８は、６１４塩基対ｇｌ１フラグメントアンプリコンである。
配列番号９は、ｇｌ１アンプリコンを生成するのに使用されるプライマーＧＬ１＿Ｆである。
配列番号１０は、ｇ１ｌアンプリコンを生成するのに使用されるプライマーＧＬ１＿Ｒである。
配列番号１１は、例のｇｌ１コンセンサス配列である。
配列番号１２は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号１３は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号１４は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号１５は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号１６は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号１７は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号１８は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号１９は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号２０は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号２１は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号２２は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号２３は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号２４は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号２５は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号２６は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号２７は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号２８は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号２９は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号３０は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号３１は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号３２は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号３３は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号３４は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号３５は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号３６は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号３７は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号３８は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号３９は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号４０は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号４１は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号４２は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号４３は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号４４は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号４５は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号４６は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号４７は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号４８は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号４９は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号５０は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号５１は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号５２は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号５３は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号５４は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号５５は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号５６は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号５７は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号５８は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号５９は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号６０は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号６１は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号６２は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号６３は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号６４は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号６５は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号６６は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号６７は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号６８は、ｇｌ１配列の編集である。
配列番号６９は、ベクター２７０５７である。それは、ＬｂＣａｓ１２ａのデキサメタゾン誘導性発現のためのヌクレオチド配列を含む。ｃＧａｌ４ＶＰ１６ＧＲは、構成的に発現され、ＤＥＸの存在下において、それは、核に限局し、ＧＡＬ４ ＵＡＳプロモーターに結合し、ＬｂＣａｓ１２ａの転写を駆動する。ガイドＲＮＡは、表現型スクリーニングのためにＧｌａｂｒｏｕｓ １（ＧＬ１）遺伝子の第２のエクソンを標的とする。構築物は、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）形質転換体の選択のためのカナマイシン耐性カセットを含む。ガイドＲＮＡは、ダイズＳ－アデノシルメチオニンシンテターゼ（ＳＡＭＳ）プロモーターからリボザイムハンマーヘッド設計を用いて発現される。図７も参照されたい。
Ｃａｓ１２ａ発現の関数としてのｇｌ１突然変異誘発のグラフ図である。 ベクター２４９０２のプラスミドマップである。 ベクター２５６５７のプラスミドマップである。 ベクター２５７６５のプラスミドマップである。 ベクター２５８８１のプラスミドマップである。 シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）における野生型及びｇｌ１突然変異体の外観の写真である。 ベクター２７０５７のプラスミドマップである。
定義
以下の用語は、当業者によって十分に理解されると考えられる一方、以下の定義は、本明細書に開示される主題の説明を容易にするために記載される。
本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、以下に特に定義されない限り、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有することが意図される。本明細書で用いられる技術への言及は、当業者に明らかであろう技術における変化形態及び／又は均等な技術の置き換えを含む、当技術分野で一般的に理解される技術を指すことが意図される。以下の用語は、当業者によって十分に理解されると考えられる一方、以下の定義は、本明細書に開示される主題の説明を容易にするために記載される。
本明細書で使用される際、「ＣＲＩＳＰＲ酵素」は、細菌ＣＲＩＳＰＲシステム又はその任意の人工、合成若しくは他に改変されたホモログから単離された任意のＩ、ＩＩ、ＩＶ又はＶ型酵素を意味する。特に、この定義は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１としても知られている）、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｊ、Ｃｍｓ１、ＭＡＤ７、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４など、及びその突然変異体を包含する。全て全体が参照により本明細書に援用される米国特許第１０，２２７，６１１号明細書、米国特許第１０，０００，７７２号明細書、米国特許第９，７９０，４９０号明細書、米国特許第９，８９６，６９６号明細書、米国特許第９，９８２，２７９号明細書、国際公開第２０１４／０９３５９５号、国際公開第２０１７／１８４７６８号、国際公開第２０１８／１９５５４５号を参照されたい。さらに、これらの酵素の修飾は、この定義の範囲内であり、例えばデアミナーゼドメイン又はエキソヌクレアーゼドメイン、トランスポザーゼドメイン、逆転写酵素ドメインなどを含む融合酵素、例えばＣａｓ９－ＢＥ（Ｃａｓ９及び塩基エディタードメイン、例えばＡＰＯＢＥＣの融合）、Ｃａｓ１２ａ－ＢＥ（Ｃａｓ１２ａ及び塩基エディタードメイン、例えばＡＰＯＢＥＣの融合及びさらにウラシルＤＮＡグリコシラーゼを任意に含む）又はＣａｓ９－ＲＴ（逆転写酵素ドメインに融合されたＣａｓ酵素、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０２０／１９１２３３号を参照されたい）である。同様に、これらの酵素のヌクレアーゼ不活性（「ｄＣａｓ」）又はニッカーゼ（「ｎＣａｓ」）形態は、この定義の範囲内である。「ＣＲＩＳＰＲ酵素」及び「ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ」は、全体を通して同義的に使用される。
本明細書で使用される際、「誘導可能なモザイク性（ｍｏｓａｉｃｉｓｍ）」は、子孫植物における編集のモザイク性を得るための誘導性システムの使用を指す。適用可能な誘導性システムとしては、限定されないが、ＡｌｃＡ／ＡｌｃＲ誘導性システム、ＬｈＧ４／ｐＯｐ誘導性システム、ＧＶＧ誘導性システム及びＶＧＥ誘導性システムが挙げられる。誘導性システムは、機能的に、動作可能に又は物理的にＣＲＩＳＰＲ酵素に連結される。誘導性システムの誘導後、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、発現されるか又は代わりに核に転座される。植物におけるモザイク性を得るために、対象とする植物組織の発達と一致して誘導が起こることが重要である。モザイク性が葉の発達時に所望される場合、およそ葉細胞が発達及び／又は分化し始めるときに誘導が起こるであろう。モザイク性が植物の子孫で所望される場合、およそ花芽始原細胞が発達し始めるときに誘導が起こるであろう。
本明細書で使用される際、「化学的模倣体」は、別の化学物質と類似の構造及び／又は効果を有する化学物質を意味する。例えば、デキサメタゾンの化学的模倣体は、デキサメタゾンと類似の構造を共有し得るか、又はそれは、デキサメタゾンの修飾形態であり得る。いずれの場合にも、デキサメタゾンの化学的模倣体は、ＤＥＸ誘導性システムでデキサメタゾンと類似の機能を果たすことが可能であろう。さらに、アセトアルデヒドの化学的模倣体は、アセトアルデヒドと類似の構造を共有し得るか、又はそれは、アセトアルデヒドの修飾形態であり得る。いずれの場合にも、アセトアルデヒドの化学的模倣体は、ＡｌｃＡ／ＡｌｃＲ誘導性システムでアセトアルデヒドと類似の機能を果たすことが可能であろう。同様に、エタノールの化学的模倣体は、ＡｌｃＡ／ＡｌｃＲ誘導性システムで機能するために、エタノールのアセトアルデヒドへの代謝と同様にアセトアルデヒドへと代謝され得る。
本明細書で使用される際、「ジェノタイピング」は、生物又は細胞の遺伝子コードを解析する任意の解析方法を指す。ジェノタイピングの方法としては、特に、Ｓａｎｇｅｒシークエンシング、次世代シークエンシング（「ＮＧＳ」）、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）及びＴａｑＭａｎ解析が挙げられる。ジェノタイピングは、標的領域のＰＣＲ増幅、続いてＳａｎｇｅｒシークエンシング及びＩＣＥ解析（ｉｃｅ．ｓｙｎｔｈｅｇｏ．ｃｏｍを参照されたい）を用いたクロマトグラムのデコンボリューションを含み得る。ジェノタイピング方法は、手動であるか又は自動化され得る。ジェノタイピングは、全ゲノムシークエンシング、ＳＮＰ検出、ハプロタイプ解析、接合性解析及び偶発性存在解析を含む。
本明細書で使用される際、「転座エフェクター」は、細胞内の移動が依存する分子（タンパク性又はその他）を指す。例えば、限定されないが、グルココルチコイド受容体は、異種タンパク質に融合されるとき、転座エフェクターとして動作する。
長年の特許法の慣習に従い、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」という用語は、特許請求の範囲を含む本出願で使用される場合、「１つ以上」を指す。例えば、「細胞」という語句は、１つ以上の細胞を指し、ある実施形態では組織及び／又は器官を指し得る。同様に、「少なくとも１つ」という語句は、本明細書で実体を指すのに用いられる場合、例えば、限定されないが、１～１００の全ての整数値並びに１００を超える整数値を含む、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００又はそれを超える該当する実体を指す。
本明細書で使用される際、「及び／又は」という用語は、関連する列挙された項目の１つ以上のあらゆる可能な組合せ及び代替的な「又は」で解釈される場合には組合せの欠如を指し、それを包含し、実体が単独で又は組み合わせて存在することを指す。したがって、例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ及び／又はＤ」という語句は、個々にＡ、Ｂ、Ｃ及びＤを含むだけでなく、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤのあらゆる組合せ及び部分組合せ（例えば、ＡＢ、ＡＣ、ＡＤ、ＢＣ、ＢＤ、ＣＤ、ＡＢＣ、ＡＢＤ及びＢＣＤ）も含む。ある実施形態では、「及び／又は」が指す要素の１つ以上は、組合せ及び／又は部分組合せにおける単一又は複数の出現で個々にも存在し得る。
特に示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される成分、反応条件などの量を表す全ての数値は、いずれの場合にも「約」という用語によって修飾されるものと理解されるべきである。本明細書で使用される際の「約」という用語は、質量、重量、時間、体積、濃度又はパーセンテージの量などの測定可能な値を指す場合、特定の量の、ある実施形態では±２０％、ある実施形態では±１０％、ある実施形態では±５％、ある実施形態では±１％、ある実施形態では±０．５％及びある実施形態では±０．１％の変動を包含することを意味し、このような変動は、開示される方法を実施し、且つ／又は開示される組成物、核酸、ポリペプチドなどを用いるのに適切である。したがって、矛盾する記載がない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本明細書に開示される主題によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。「約」という用語が本開示に関して（例えば、温度又は分子量値と組み合わせて）使用される場合、正確な値（すなわち「約」を伴わない）が好ましいことがある。
本明細書で使用される際、「対立遺伝子」という用語は、遺伝子座における変異体又は選択的配列形態を指す。２倍体では、単一の対立遺伝子が各遺伝子座で各親から別々に子孫個体に継承される。２倍体生物中に存在する所与の遺伝子座の２つの対立遺伝子が相同染色体の対における対応する位置を占めるが、当業者は、任意の特定の個体における対立遺伝子が種に存在する対立遺伝子の全てを必ずしも表さないことを理解する。
単位、接頭語及び記号は、ＳＩ承認形態で表され得る。特に示されない限り、核酸は、左から右に５’から３’の配向で描かれ、アミノ酸配列は、それぞれ左から右にＮ末端からＣ末端の配向で描かれる。アミノ酸は、本明細書では、それらの一般的に知られている３文字記号又はＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会（ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨される１文字記号のいずれかによって示され得る。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般的に認められた１文字コードによって示され得る。
本明細書で使用される際、「～に関連した」という語句は、２つの実体間の認識可能な及び／又は評価可能な関係を指す。例えば、「ＨＩに関連した」という語句は、その存在又は非存在が、植物若しくはその子孫がＨＩ若しくは半数体誘導を示す程度及び／又は度合いに影響を与え得る、特質、遺伝子座、遺伝子、対立遺伝子、マーカー、表現型など、又はそれらの発現を指す。したがって、マーカーは、それが特質に関連する場合及びマーカーの存在が、所望の特質若しくは特質形態が、マーカーを含む植物／生殖質において生じるかどうか及び／又はどの程度生じるかの指標である場合、特質「に関連」している。同様に、マーカーは、それが対立遺伝子に関連する場合及びマーカーの存在が、対立遺伝子が、マーカーを含む植物／生殖質中に存在するかどうかの指標である場合、対立遺伝子「に関連」している。例えば、「ＨＩに関連したマーカー」は、マーカーの存在又は非存在が、植物が半数体誘導を示すかどうか及び／又はどの程度示すかを予測するのに使用され得るマーカーを指す。
「～に関連した／作動可能に連結された」は、物理的又は機能的に関連する２つの核酸も指し得る。例えば、プロモーター又は調節ＤＮＡ配列は、２つの配列が作動可能に連結されている場合又は調節ＤＮＡ配列がコード配列又は構造ＤＮＡ配列の発現レベルに影響を与えるように位置している場合、ＲＮＡ又はタンパク質をコードするＤＮＡ配列「に関連」しているといわれる。
「コード配列」は、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、センスＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡなどのＲＮＡに転写され、次に生物中で好ましくは翻訳されて、タンパク質を産生する核酸配列である。
本明細書で使用される際、「コドン最適化」配列は、コドンが、宿主細胞又は生物が有し得る特定のコドンバイアスを反映するように選択されるヌクレオチド配列を意味する。これは、典型的には、最適化されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を保存するような方法で行われる。特定の実施形態では、組み換えＤＮＡ構築物のＤＮＡ配列は、構築物が発現される細胞（例えば、動物、植物又は真菌細胞）についてコドン最適化された配列を含む。例えば、植物細胞内で発現される構築物は、植物内で発現についてコドン最適化されたその配列（例えば、第１の遺伝子抑制要素又は遺伝子発現要素）の全て又は一部を有し得る。例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第６，１２１，０１４号明細書を参照されたい。実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、植物細胞（例えば、双子葉植物細胞若しくは単子葉植物細胞）又は細菌細胞内で発現についてコドン最適化される。
「包含する」、「含有する」及び「～によって特徴付けられる」と同義である「含む」という用語は、包含的又はオープンエンドであり、さらなる列挙されていない要素及び／又は方法工程を除外しない。「含む」は、指定された要素及び／又は工程が存在するが、他の要素及び／又は工程が追加され得、関連する主題の範囲内に依然として含まれることを意味する専門用語である。
本明細書で使用される際、「～からなる」という語句は、具体的に列挙されていないいずれの要素、工程又は成分も除外する。「～からなる」という語句が、前文の直後ではなく、請求項の本文の節に出現する場合、それは、その項に記載される要素のみを限定し、他の要素は、特許請求の範囲全体から除外されない。
本明細書で使用される際、「～から本質的になる」という語句（及び文法的な変化形）は、関連する本開示の範囲又は特許請求の範囲を、特定の材料及び／又は工程並びに開示及び／又は権利請求される主題の基本的な及び新規な特徴に実質的に影響を与えないものに限定する。「含む」、「含んでいる、「包含する」、「包含している」、「有する」という用語及びそれらの活用形は、「限定されないが」含むことを意味する。これらの用語は、記載される特徴、整数、工程、操作、要素又は構成要素の存在を規定するが、１つ以上の他の特徴、整数、工程、操作、要素、構成要素又はそれらの群の存在又は追加を除外しない。「～からなるという用語は、「～を含み、それに限定される」を意味する。
「含む」、「～から本質的になる」及び「～からなる」という用語に関して、これらの３つの用語の１つが本明細書で使用される場合、本明細書に開示され、権利請求される主題は、ある実施形態では、他の２つの用語のいずれかの使用を含み得る。例えば、主題が、ある実施形態では、配列番号と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸に関連する場合である。開示される主題は、ここで、ある実施形態では、その配列番号と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドをコードする核酸並びにある実施形態ではその配列番号と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸も包含することが理解される。同様に、ある実施形態では、開示される主題のための方法は、本明細書に開示される工程を含み、ある実施形態では、本明細書に開示される主題のための方法は、開示される工程から本質的になり、ある実施形態では、本明細書に開示される主題のための方法は、本明細書に開示される工程からなることも理解される。
本開示に関して、「～に対応している」又は「～に対応する」は、参照配列のアミノ酸配列が、参照配列と異なる第２のアミノ酸配列（例えば変異体又は相同配列）と一致する場合、第２のアミノ酸配列中の特定の列挙される位置「に対応する」アミノ酸が参照アミノ酸配列中のこれらの位置と一致するが、本開示の特定の参照アミノ酸配列に関して必ずしも正確な数値の位置にあるわけではないものであることを意味する。
本明細書で使用される際、「事象」という用語は、遺伝子組み換え生物又は細胞、例えば自然界に通常見られないであろう非天然ＤＮＡを有するようにされた遺伝子組み換え植物又は種子を指す。事象は、導入遺伝子が生物のＤＮＡ中に挿入されたトランスジェニック事象を含み得る。事象は、染色体における特定の位置への特定の導入遺伝子の挿入も含み得る。事象は、インデル及び点突然変異の任意の組合せも含み得る。
本明細書で使用される際、「遺伝子」という用語は、染色体における特定の位置を占め、生物における特定の特徴又は特質のための遺伝的指令を含むＤＮＡの配列を含む遺伝性単位を指す。
「遺伝子地図」は、線図又は表形式で一般に示される、所与の種中の１つ以上の染色体における遺伝子座間の遺伝的連鎖関係の記述である。
本明細書で使用される際、「遺伝子調節ネットワーク」（又は「ＧＲＮ」）は、互いに及び細胞内の他の物質と相互作用して、ｍＲＮＡ及びタンパク質の遺伝子発現レベルを調節する分子調節因子の一群である。調節因子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質及びこれらの複合体であり得る。ＧＲＮは、本明細書で使用される際の「遺伝子ファミリー」も含み得る。「遺伝子ファミリー」は、ほぼ同様の生化学的機能を有する一連のいくつかの同様の遺伝子を指す。
「ドメイン」という用語は、進化的に関連するタンパク質の配列のアラインメントに沿って特定の位置で保存された一連のアミノ酸を指す。他の位置におけるアミノ酸は、ホモログ間で変化し得るが、特定の位置で高度に保存されたアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性又は機能に不可欠である可能性が高いアミノ酸を示す。タンパク質ホモログのファミリーのアラインされた配列におけるそれらの高度な保存によって同定されて、それらは、該当する任意のポリペプチドが、予め同定されたポリペプチド群に属するかどうかを決定するための識別子として使用され得る。
本明細書で使用される際の「発現カセット」は、適切な宿主細胞内の特定のヌクレオチド配列の発現を指令することが可能な核酸配列を意味し、対象とするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み、これは、終結シグナルに作動可能に連結されている。発現カセットは、典型的には、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列も含む。対象とするヌクレオチド配列を含む発現カセットは、他の構成要素の少なくとも１つに対して異種であるその構成要素の少なくとも１つを有し得る。発現カセットは、天然に存在するが、異種発現に有用な組み換え形態で得られたものでもあり得る。しかしながら、典型的には、発現カセットは、宿主に対して異種であり、すなわち、発現カセットの特定の核酸配列は、宿主細胞内に天然に存在せず、形質転換事象によって宿主細胞又は宿主細胞の祖先に導入されていなければならない。発現カセット中のヌクレオチド配列の発現は、宿主細胞がある特定の外部刺激に曝されたときにのみ転写を開始する構成的プロモーター又は誘導性プロモーターの制御下にあり得る。植物などの多細胞生物の場合、プロモーターは、特定の組織若しくは器官又は発達段階に特異的でもあり得る。
対象とするヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであり得、これは、その構成要素の少なくとも１つが他の構成要素の少なくとも１つに対して異種であることを意味する。発現カセットは、その天然遺伝子を駆動する天然プロモーターを含むものでもあり得るが、それは、異種発現に有用な組み換え形態で得られた。発現カセットのこのような使用は、それが導入された細胞内でそれが天然に存在しないようにする。
発現カセットは、植物において機能的である転写及び／又は翻訳終結領域（すなわち終結領域）も任意に含み得る。様々な転写ターミネーターは、発現カセットにおける使用に利用可能であり、対象とする異種ヌクレオチド配列を越える転写の終結に関与し、ｍＲＮＡポリアデニル化を修正する。終結領域は、転写開始領域にとって天然であり得るか、作動可能に連結された対象とするヌクレオチド配列にとって天然であり得るか、植物宿主にとって天然であり得るか、又は別の源由来（すなわちプロモーター、対象とするヌクレオチド配列、植物宿主又はそれらの任意の組合せにとって外来又は異種）であり得る。適切な転写ターミネーターとしては、限定されないが、ＣＡＭＶ ３５Ｓターミネーター、ｔｍｌターミネーター、ノパリンシンターゼターミネーター及び／又はエンドウマメｒｂｃｓ Ｅ９ターミネーターが挙げられる。これらは、単子葉植物及び双子葉植物の両方に使用され得る。さらに、コード配列の天然の転写ターミネーターが使用され得る。植物において機能することが知られている任意の利用可能なターミネーターが本開示に関して使用され得る。
「異種」という用語は、遺伝子又はポリヌクレオチド又はポリペプチドに関して使用されるとき、その自然な環境において存在しない（すなわちヒトの手により変更された）又はその部分を含む遺伝子又はポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。例えば、異種遺伝子は、別の種に導入されたある種からのポリヌクレオチドを含み得る。異種遺伝子は、何らかの方法（例えば、突然変異、複数のコピーで付加、非天然のプロモーター又はエンハンサーポリヌクレオチドに連結されるなど）で改変された、生物にとって天然のポリヌクレオチドも含み得る。異種遺伝子は、ｃＤＮＡ形態の植物遺伝子を含む植物遺伝子ポリヌクレオチドをさらに含み得、ｃＤＮＡは、センス（ｍＲＮＡを産生するために）又はアンチセンス配向（ｍＲＮＡ転写産物に相補的なアンチセンスＲＮＡ転写産物を産生するために）のいずれかで発現され得る。本開示の一態様では、異種遺伝子は、異種遺伝子ポリヌクレオチドが、異種遺伝子によってコードされるタンパク質の遺伝子若しくは染色体中の植物遺伝子ポリヌクレオチドと天然に結合していないか、又は天然では見られない染色体の一部（例えば、遺伝子が通常発現されない遺伝子座で発現される遺伝子）と結合しているプロモーターなど、調節要素を含むポリヌクレオチドに典型的に結合される点で内因性植物遺伝子と区別される。さらに、「異種」ポリヌクレオチドは、それが導入される宿主細胞と天然では結合しないポリヌクレオチドを指し、天然に存在するポリヌクレオチドの天然に存在しない複数のコピーを含む。異種核酸配列又は核酸分子は、キメラ発現カセットなどのキメラ配列を含み得、プロモーター及びコード領域は、複数の供給源生物に由来する。プロモーター配列は、構成的プロモーター配列、組織特異的プロモーター配列、化学的誘導性プロモーター配列、創傷誘導性プロモーター配列、ストレス誘導性プロモーター配列又は発達段階特異的なプロモーター配列であり得る。
「相同」核酸配列は、それが導入される宿主細胞に天然に関連する核酸配列である。
「発現」という用語は、遺伝子、ＯＲＦ又はその部分又は植物中の導入遺伝子などのポリヌクレオチドに関して使用されるとき、遺伝子にコードされた遺伝情報を遺伝子の「転写」によって（すなわちＲＮＡポリメラーゼの酵素作用によって）ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ又はｓｎＲＮＡ）へと、且つ該当する場合（例えば、遺伝子がタンパク質をコードする場合）にはｍＲＮＡの「翻訳」によってタンパク質へと変換するプロセスを指す。遺伝子発現は、プロセスにおける多くの段階で調節され得る。例えば、アンチセンス又はｄｓＲＮＡ構築物のそれぞれの場合、発現は、アンチセンスＲＮＡのみ又はｄｓＲＮＡのみの転写を指し得る。実施形態では、「発現」は、センス（ｍＲＮＡ）又は機能的ＲＮＡの転写及び安定した蓄積を指す。「発現」は、タンパク質の産生も指し得る。
本明細書で使用される際、「半数体」と呼ばれる植物は、半数体植物における減少した数の染色体（ｎ）を有し、その染色体組は、配偶子のものに等しい。半数体生物では、染色体の正常な数の半分のみが存在する。したがって、２倍体生物（例えば、トウモロコシ）の半数体は、一倍体性を示し、４倍体生物（例えば、ライグラス）の半数体は、２倍体性を示し、６倍体生物（例えば、コムギ）の半数体は、３倍体性を示すなどである。本明細書で使用される際、「倍加半数体」と呼ばれる植物は、染色体の半数体組を倍加することによって発生される。任意の世代数まで自殖された倍加半数体植物から得られた植物又は種子は、依然として倍加半数体植物として同定され得る。倍加半数体植物は、ホモ接合体植物と見なされる。植物は、それが稔性である場合、植物の成長部分全体が、染色体の二本組を有する細胞からなっていない場合でも倍加半数体であると見なされ、すなわち、植物は、それが生存可能な配偶子を含む場合、それが成長組織中でキメラである場合でも倍加半数体と見なされるであろう。
本明細書で使用される際、「ヒト誘導性突然変異」という用語は、直接又は間接的な人間の行為の結果として起こる任意の突然変異を指す。この用語は、限定されないが、標的化突然変異誘発の任意の方法によって得られる突然変異を含む。
本明細書で使用される際、「導入される」は、核酸若しくはタンパク質又はそれらの組合せのいずれかにかかわらず、所望の対象物からある対象物への送達、発現、適用、輸送、移送、浸透又は送達を示す他の類似の用語を意味する。例えば、部位特異的ヌクレアーゼをコードする核酸及び任意に少なくとも１つのガイドＲＮＡが植物細胞中に導入され得る。
本明細書で使用される際、「マーカープローブ」及び「プローブ」という用語は、核酸ハイブリダイゼーションにより、より大きい配列内の配列の存在又は非存在を検出するのに使用され得るヌクレオチド配列又は核酸分子、例えばマーカー又はマーカー遺伝子座の全て又は一部に相補的な核酸プローブを指す。約８、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００又はそれを超える連続ヌクレオチドを含むマーカープローブが核酸ハイブリダイゼーションに使用され得る。
本明細書で使用される際、「分子マーカー」という用語は、ＨＩ関連遺伝子座の存在／非存在を同定するとき、基準点として使用される、上に定義される遺伝子マーカー又はそのコードされた産物（例えば、タンパク質）を指すのに使用され得る。分子マーカーは、ゲノムヌクレオチド配列又は発現されたヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）に由来し得る。この用語は、マーカー配列を増幅させることが可能なプローブ及び／又はプライマーとして使用されるヌクレオチド配列などのマーカー配列に相補的な又はそれに隣接するヌクレオチド配列も指す。ヌクレオチド配列は、（例えば、ワトソン・クリック型塩基対規則に従って）それらが溶液中で特異的にハイブリダイズする場合、「相補的」である。この用語は、マーカー配列を増幅させることが可能なプローブ及び／又はプライマーとして使用されるヌクレオチド配列などのマーカー配列に相補的な又はそれに隣接するヌクレオチド配列の非存在によって特質を示す遺伝子マーカーも指す。
本明細書で使用される際、「ヌクレオチド配列」、「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「核酸分子」及び「核酸フラグメント」という用語は、一本鎖又は二本鎖である、任意に合成、非天然及び／又は改変ヌクレオチド塩基を含有するＲＮＡ又はＤＮＡのポリマーを指す。「ヌクレオチド」は、ＤＮＡ又はＲＮＡポリマーが構築されるモノマー単位であり、プリン又はピリミジン塩基、ペントース及びリン酸基からなる。ヌクレオチド（通常、それらの５’－一リン酸塩形態で見られる）は、以下のようにそれらの１文字表記によって示される：「Ａ」は、アデニレート又はデオキシアデニレート（それぞれＲＮＡ又はＤＮＡの場合）を表し、「Ｃ」は、シチジレート又はデオキシシチジレートを表し、「Ｇ」は、グアニレート又はデオキシグアニレートを表し、「Ｕ」は、ウリジレートを表し、「Ｔ」は、デオキシチミジレートを表し、「Ｒ」は、プリン（Ａ又はＧ）を表し、「Ｙ」は、ピリミジン（Ｃ又はＴ）を表し、「Ｋ」は、Ｇ又はＴを表し、「Ｈ」は、Ａ又はＣ又はＴを表し、「Ｉ」は、イノシンを表し、及び「Ｎ」は、任意のヌクレオチドを表す。
本明細書で使用される際、「ヌクレオチド配列同一性」という用語は、２つのポリヌクレオチドの対応する位置における同一のヌクレオチドの存在を指す。ポリヌクレオチドは、２つのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの配列が（例えば、比較ウインドウにおいて）最大一致するようにアラインされるときに同じである場合、「同一の」配列を有する。２つ以上のポリヌクレオチド間の配列比較は、一般に、配列類似性の局所領域を同定及び比較するために、比較ウインドウ上で２つの配列の部分を比較することによって行われる。比較ウインドウは、一般に、約２０～２００の連続ヌクレオチドである。約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９又は１００パーセント配列同一性など、ポリヌクレオチドの「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウインドウ上で２つの最適にアラインされた配列を比較することによって決定され得、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのために参照配列と比較した際に付加又は欠失（すなわちギャップ）を含み得る。ある実施形態では、パーセンテージは、（ａ）同一の核酸塩基が両方の配列中に存在する位置の数を決定し、（ｂ）一致した位置の数を比較のウインドウにおける位置の総数で除算し、（ｃ）結果に１００を乗算することによって計算される。
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０に記載されている。ある実施形態では、配列同一性のパーセンテージは、比較される配列番号１の最大ＯＲＦにおけるｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ又は予測されるタンパク質配列の１つの完全長にわたる配列同一性を指す。ある実施形態では、核酸配列同一性のパーセンテージを決定するための計算は、計算中、比較される核酸のいずれかが「Ｎ」を含む（すなわち任意のヌクレオチドがその位置に存在し得る場合の）任意のヌクレオチド位置を含まない。
「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）という用語は、ポリペプチドをコードする核酸配列を指す。ある実施形態では、ＯＲＦは、翻訳開始コドン（すなわち開始コドン）、翻訳終結（すなわち終止コドン）及びポリペプチド中に存在するアミノ酸をコードするそれらの間の核酸配列を含む。「開始コドン」及び「終結コドン」という用語は、タンパク質合成（ｍＲＮＡ翻訳）の、開始及び連鎖終止のそれぞれを規定するコード配列における３つの隣接するヌクレオチドの単位（すなわちコドン）を指す。
本明細書で使用される際、「表現型」、「表現型特質」又は「特質」という用語は、植物又は植物細胞の１つ以上の特質を指す。表現型は、肉眼で又は当技術分野で公知の任意の他の評価手段、例えば顕微鏡法、生化学分析若しくは電気機械アッセイによって観察可能であり得る。ある場合には、表現型は、単一の遺伝子又は遺伝子座によって直接制御される（すなわち「単一の遺伝子特質」に対応する）。他の場合、表現型は、いくつかの遺伝子間の相互作用の結果であり、これは、ある実施形態では、植物及び／又は植物細胞とその環境との相互作用からも得られる。
本明細書で使用される際、「植物」という用語は、植物全体、その任意の部分又は植物に由来する細胞若しくは組織培養物を指し得る。本開示の方法で使用され得る植物の種類は、一般に、限定されないが、以下の属：カボチャ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）、バラ属（Ｒｏｓａ）、ブドウ属（Ｖｉｔｉｓ）、クルミ属（Ｊｕｇｌａｎｓ）、オランダイチゴ属（Ｆｒａｇａｒｉａ）、ミヤコグサ属（Ｌｏｔｕｓ）、ウマゴヤシ属（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、（イガマメ属（Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ）、シャジクソウ属（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ）、フェヌグリーク属（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ）、ササゲ属（Ｖｉｇｎａ）、ミカン属（Ｃｉｔｒｕｓ）、アマ属（Ｌｉｎｕｍ）、フウロソウ属（Ｇｅｒａｎｉｕｍ）、イモノキ属（Ｍａｎｉｈｏｔ）、ニンジン属（Ｄａｕｃｕｓ）、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ダイコン属（Ｒａｐｈａｎｕｓ）、シロガラシ属（Ｓｉｎａｐｉｓ）、ベラドンナ属（Ａｔｒｏｐａ）、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、チョウセンアサガオ属（Ｄａｔｕｒａ）、ヒヨス属（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）、トマト属（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）、ジキタリス属（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ）、トウモロコシ属（Ｍａｉｚｅ）、ハナハッカ属（Ｍａｊｏｒａｎａ）、キクニガナ属（Ｃｉａｈｏｒｉｕｍ）、ヒマワリ属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）、アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）、スズメノチャヒキ属（Ｂｒｏｍｕｓ）、クサスギカズラ属（Ａｓｐａｒａｇｕｓ）、キンギョソウ属（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ）、ワスレグサ属（Ｈｅｔｅｒｏｃａｌｌｉｓ）、ネメシス属（Ｎｅｍｅｓｉｓ）、テンジクアオイ属（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ）、キビ属（Ｐａｎｉｅｕｍ）、チカラシバ属（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）、キンポウゲ属（Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ）、キオン属（Ｓｅｎｅｃｉｏ）、サルピグロッシス属（Ｓａｌｐｉｇｌｏｓｓｉｓ）、キュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）、ブロワリア属（Ｂｒｏｗａａｌｉａ）、ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、エンドウ属（Ｐｉｓｕｍ）、インゲンマメ属（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）、イネ属（Ｏｒｙｚａ）、カラスムギ属（Ａｖｅｎａ）、オオムギ属（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、ライムギ属（Ｓｅｃａｌｅ）、ネギ属（Ａｌｌｉｕｍ）及びコムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）の種を含む単子葉植物及び双子葉植物の両方を含む、形質転換技術に適している高等植物の種類と同程度に広い。
植物細胞は、植物から採取されるか、又は植物から採取された細胞からの培養物によって得られる植物の細胞である。したがって、「植物細胞」という用語は、限定されないが、種子、懸濁培養、胚、分裂組織部位、カルス組織、葉、芽、配偶体、胞子体、花粉及び小胞子中の細胞を含む。「植物部位」という語句は、植物が再生され得る、植物、細胞塊及び組織培養物中でインタクトな植物細胞などの単一細胞及び細胞組織を含む植物の部位を指す。植物部位の例としては、限定されないが、花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、葯、花、果実、茎、芽及び種子並びに若枝、根茎、プロトプラスト、カルスなどに由来する単一細胞及び組織が挙げられる。
本明細書で使用される際、「プライマー」という用語は、核酸標的にアニールして（ある実施形態では核酸標的に特異的にアリールして）、ＤＮＡポリメラーゼ及び／又は逆転写酵素をそれに結合させ、それにより（例えば、ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼなどの重合用の薬剤の存在下において且つ好適な温度及びｐＨで）プライマー伸長産物の合成が誘導される条件下に置かれた場合、ＤＮＡ合成の開始点としての役割を果たすことが可能なオリゴヌクレオチドを指す。ある実施形態では、１つ以上の複数のプライマーが（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲを用いて）植物核酸を増幅させるのに用いられる。
本明細書で使用される際、「プローブ」という用語は、標的核酸配列中で相補配列と水素結合二本鎖を形成し得る、核酸（例えば、一本鎖核酸又は二本鎖若しくはより高次の核酸の鎖又はそれらの部分配列）を指す。典型的には、プローブは、その補体と安定した及び配列特異的な二本鎖分子を形成するのに十分な長さを有し、したがってある実施形態では複数の核酸中に存在する対象とする配列を検出するのに用いられ得る。
本明細書で使用される際、「子孫」及び「子孫植物」という用語は、１つ以上の親植物から栄養生殖又は有性生殖から生成される植物を指す。子孫植物は、単一の親植物をクローニング若しくは自殖するか、又は２つ以上の親植物を交配することによって得られる。例えば、子孫植物は、親植物のクローニング若しくは自殖により又は２つの親植物を交配することにより得られ、自殖並びにＦ１若しくはＦ２又はさらに他の世代を含む。Ｆ１は、少なくとも１つが特質の供与体として初めて使用される親から産生された第１世代子孫である一方、第２世代（Ｆ２）以降の世代の子孫（Ｆ３、Ｆ４など）は、自殖、異系交配、戻し交配及び／又はＦ１、Ｆ２などの他の交配から産生される試料である。したがって、Ｆ１は、２つの純粋育種親間の交配から得られるハイブリッドであり得る（及びある実施形態ではそのようなハイブリッドである）（すなわち純粋育種である親は、それぞれ対象とする特質又はその対立遺伝子についてホモ接合性である）一方、Ｆ２は、Ｆ１ハイブリッドの自家受粉から得られる子孫であり得る（及びある実施形態ではそのような子孫である）。
本開示のポリペプチドの「部分」又は「フラグメント」は、本開示の参照アミノ酸配列又は核酸配列と比べて減少した長さのアミノ酸配列又は核酸配列を意味することが理解されるであろう。本開示に係るこのような部分又はフラグメントは、必要に応じて、それが成分であるより大きいポリペプチド又は核酸（例えば、タグ化又は融合タンパク質又は発現カセット）に含まれ得る。実施形態では、「部分」又は「フラグメント」は、完全長タンパク質又は核酸の活性、例えば殺虫活性を実質的に保持し（例えば、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又はさらに１００％の活性）又は完全長タンパク質）よりさらにより高い活性、例えば殺虫活性を有する。
「タンパク質」、「ペプチド」及び「ポリペプチド」という用語は、本明細書において同義的に使用される。
本明細書で使用される際の「プロモーター」という用語は、通常、コード配列の翻訳開始部位の上流（５’）のポリヌクレオチドを指し、これは、ＲＮＡポリメラーゼのための認識及び適切な転写に必要とされる他の要因を提供することにより、コード配列の発現を制御する。例えば、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼによって認識される基底プロモーター要素を含有する領域、コード配列の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び任意にイントロンを含有する領域を含有し得る。
本明細書で使用される際、「組み換え」という語句は、同様の又は同一のヌクレオチド配列の領域にわたる、２つのＤＮＡ分子又は対合染色体の染色分体間のＤＮＡフラグメントの交換（「乗換え」）を指す。「組み換え事象」は、本明細書において、ある実施形態では減数分裂乗換えを指すことが理解される。
本明細書で使用される際、「組み換え」という用語は、自然界に通常見られない、したがって人の介入によって生成された核酸（例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ）又はタンパク質若しくは生物の形態を指す。本明細書で使用される際、「組み換え核酸分子」は、天然で一緒に存在せず、人の介入の結果である、ポリヌクレオチドの組合せを含む核酸分子、例えば互いに異種である少なくとも２つのポリヌクレオチドの組合せを含む核酸分子又は人工的に合成された核酸分子であり、例えば、ポリヌクレオチドは、組み立てられたヌクレオチド配列を用いて合成し、自然界に通常存在するポリヌクレオチドから逸脱したポリヌクレオチド又は宿主細胞のゲノムＤＮＡ及び宿主細胞のゲノムの関連した隣接ＤＮＡに人工的に組み込まれた導入遺伝子を含む核酸分子を含む。組み換え核酸分子の別の例は、植物のゲノムＤＮＡ中への導入遺伝子の挿入から得られるＤＮＡ分子であり、これは、その生物における組み換えＲＮＡ又はタンパク分子の発現を最終的にもたらし得る。本明細書で使用される際、「組み換え植物」は、自然界に通常存在しない植物であり、人の介入の結果であり、そのゲノムに組み込まれ得る導入遺伝子又は異種核酸分子を含有する。このようなゲノム変化の結果として、組み換え植物は、関連する野生型植物と明確に異なる。「組み換え」細菌は、異種核酸分子を含む、自然界に見られない細菌である。このような細菌は、細菌を核酸分子で形質転換するか、又はある細菌株から別の細菌株へのプラスミドのコンジュゲーションのような移行によって生成され得、それにより、プラスミドは、核酸分子を含む。
本明細書で使用される際、「参照配列」という用語は、ヌクレオチド配列比較の根拠として使用される規定のヌクレオチド配列を指す。
本明細書で使用される際、「再生する」という用語及びその文法的変化形は、組織培養物からの植物の産生を指す。
「調節要素」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部又は下流（３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を指し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング又は安定性若しくは翻訳に影響を与える。調節配列は、エンハンサー、プロモーター、翻訳エンハンサー配列、イントロン、ターミネーター及びポリアデニル化シグナル配列を含む。それらは、天然及び合成配列並びに合成及び天然配列の組合せであり得る配列を含む。調節配列は、発現レベル、発現の空間的及び時間的パターン並びにプロモーターのサブセットの場合には誘導条件（光、温度、化学物質及びホルモンなどの外部要因による調節）下での発現を決定し得る。
本明細書で使用される際、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、ポリヌクレオチドが典型的には核酸の複合混合物中でその標的部分配列にハイブリダイズするが、実質的に他の配列にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況下で異なり得る。
より長い配列は、典型的には、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの広範囲な指針は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１に見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度ｐＨで特定の配列についての熱融解点（Ｔｍ）より約５～１０℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（標的配列が過剰に存在する際、Ｔｍでプローブの５０％が平衡状態で占められる）温度（規定のイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度下で）である。例示的なストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的にはｐＨ７．０～８．３で約０．０１～１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（又は他の塩）であり、温度が短いプローブ（例えば、１０～５０ヌクレオチド）について少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、５０超のヌクレオチド）について少なくとも約６０℃であるものである。
ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成され得る。さらなる例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ及び４２℃でインキュベートする１％のＳＤＳ又はＳＳＣ、６５℃でインキュベートする１％のＳＤＳを、６５℃で０．２×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳ中での１回以上の洗浄とともに含む。ＰＣＲについて、約３６℃の温度が低ストリンジェンシー増幅に典型的であるが、アニーリング温度は、プライマー長さに応じて、約３２℃～４８℃（以上）で変化し得る。ハイブリダイゼーションパラメータを決定するためのさらなる指針は、多くの参考文献（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９を参照されたい）において提供される。
本明細書で使用される際、「特質」という用語は、対象とする表現型、対象とする表現型に寄与する遺伝子並びに対象とする表現型に寄与する遺伝子に関連する核酸配列を指す。例えば、「ＨＩ特質」は、半数体誘導表現型並びに半数体誘導表現型の存在又は非存在に関連する半数体誘導及び核酸配列（例えば、ＨＩ関連遺伝子産物）に寄与する遺伝子（例えば、トウモロコシにおけるｍａｔｌ又はイネにおけるＯｓ０３ｇ２７６１０）を指す。
本明細書で使用される際、「導入遺伝子」という用語は、ある形態の人工移入技術によって生物又はその祖先の１つ以上に導入される核酸分子を指す。したがって、人工移入技術は、「トランスジェニック生物」又は「トランスジェニック細胞」を生成する。人工移入技術が祖先生物において行われ得るが（又はその中の細胞及び／又は祖先生物に発達し得る）、人工的に移入された核酸分子又はそのフラグメントを有する任意の子孫個体は、１つ以上の天然及び／又は補助された育種が、子孫個体中に存在する人工的に移入された核酸分子をもたらす場合でも依然としてトランスジェニックと見なされることが理解される。
本明細書で使用される際、「標的化突然変異誘発」又は「突然変異誘発手法」という用語は、選択された遺伝子の意図的な突然変異誘発をもたらす突然変異誘発の任意の方法を指す。標的化突然変異誘発は、方法ＣＲＩＳＰＲ、ＴＩＬＬＩＮＧ、ＴＡＬＥＮ及び依然として開示されていないが、同じ結果を達成するのに使用され得る他の方法を含む。
「形質転換」は、異種核酸を宿主細胞又は生物中に導入するためのプロセスである。特定の実施形態では、「形質転換」は、対象とする生物のゲノム（核又は色素体）へのＤＮＡ分子の安定した統合を意味する。ある特定の実施形態では、植物、植物部位及び／又は植物細胞中への導入は、細菌媒介性形質転換、粒子衝撃形質転換、リン酸カルシウム媒介性形質転換、シクロデキストリン媒介性形質転換、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性形質転換、ナノ粒子媒介性形質転換、ポリマー媒介性形質転換、ウイルス媒介性核酸送達、ウィスカー媒介性核酸送達、マイクロインジェクション、超音波処理、浸潤、ポリエチレングリコール媒介性形質転換、プロトプラスト形質転換又は植物、植物部位及び／若しくはその細胞中への核酸の導入をもたらす任意の他の電気的、化学的、物理的及び／若しくは生物学的機構又はそれらの組合せを介する。植物を形質転換するための手順は、当技術分野で周知且つ日常的であり、文献を通して記載される。
植物の形質転換のための方法の非限定的な例としては、細菌媒介性核酸送達（例えば、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からの細菌を介する）、ウイルス媒介性核酸送達、炭化ケイ素又は核酸ウィスカー媒介性核酸送達、リポソーム媒介性核酸送達、マイクロインジェクション、微小粒子衝撃、リン酸カルシウム媒介性形質転換、シクロデキストリン媒介性形質転換、エレクトロポレーション、ナノ粒子媒介性形質転換、超音波処理、浸潤、ＰＥＧ媒介性核酸取り込み並びに植物細胞中への核酸の導入をもたらす任意の他の電気的、化学的、物理的（機械的）及び／又は若しくは生物学的機構（それらの任意の組合せを含む）を介する形質転換が挙げられる。当技術分野で公知の様々な植物形質転換方法の一般的な指針としては、Ｍｉｋｉ ｅｔ ａｌ．（“Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ ｉｎｔｏ Ｐｌａｎｔｓ”ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｌｉｃｋ，Ｂ．Ｒ．ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｅｄｓ．（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３），ｐａｇｅｓ ６７－８８）及びＲａｋｏｗｏｃｚｙ－Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋａ（２００２，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ ７：８４９－８５８（２００２））が挙げられる。
「形質転換された」及び「トランスジェニック」は、異種核酸分子が導入された細菌又は植物などの宿主生物を指す。核酸分子は、宿主のゲノム中に安定的に統合され得るか、又は核酸分子は、染色体外分子としても存在し得る。このような染色体外分子は、自己複製し得る。形質転換された細胞、組織又は植物は、形質転換プロセスの最終産物だけでなく、そのトランスジェニック子孫も包含することが理解される。「非形質転換」、「非トランスジェニック」又は「非組み換え」宿主は、異種核酸分子を含まない野生型生物、例えば細菌又は植物を指す。
プロモーターの突然変異を誘発して、植物中の導入遺伝子の発現のための要素の有用性を潜在的に改善し得ることが特に考えられる。これらの要素の突然変異誘発は、無作為に行われ、突然変異誘発されたプロモーター配列は、試行錯誤した手順で活性についてスクリーニングされ得る。代わりに、プロモーターに望ましい発現特徴を提供するか、又はプロモーターに発現強化活性を提供する特定の配列が同定され、これらの又は同様の配列は、突然変異によってプロモーター中に導入され得る。特定の種における導入遺伝子のそれらの発現を強化するために、これらの配列の突然変異を誘発し得ることがさらに考えられる。本発明のプロモーター配列をコードするＤＮＡセグメントの突然変異を誘発するための手段は、当業者に周知である。示されるように、プロモーター又は他の調節要素に対する修飾は、無作為の又は部位特異的な突然変異手順によって行われ得る。プロモーター及び他の調節要素は、対応する非修飾配列をコードする配列からの１つ以上のヌクレオチドの付加又は欠失により、それらの構造を改変することによって修飾され得る。
突然変異誘発は、限定されないが、特定の調節配列の配列内の１つ以上の突然変異を有するオリゴヌクレオチドを合成することなど、当技術分野で公知の技術のいずれかに従って行われ得る。特に、部位特異的突然変異は、基本的なＤＮＡの特異的な突然変異誘発による、プロモーター突然変異体の調製に有用な技術である。ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ（「ＲＧＥＮ」、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）も使用され得る。この技術は、例えば、１つ以上のヌクレオチド配列変化をＤＮＡに導入することにより、上記の考慮事項の１つ以上を組み込んで、配列変異体を容易に調製及び試験する能力をさらに提供する。部位特異的突然変異は、所望の突然変異のＤＮＡ配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列並びに十分な数の隣接ヌクレオチドの使用によって突然変異体の産生を可能にして、十分なサイズ及び配列複雑性のプライマー配列を提供して、横断される欠失結合部の両側に安定した二本鎖を形成する。典型的には、約１７～約７５ヌクレオチド又はそれを超える長さのプライマーが好ましく、改変される配列の結合部の両側に約１０～約２５又はそれを超える残基を有する。
プロモーターを含むクローンが本発明に従って単離されている場合、クローン内のプロモーター領域を区切ることを望むことがある。突然変異誘発されたプロモーターを調製するためのある効率的な標的化手段は、プロモーター配列内の推定的調節要素の同定に依存する。これは、同様の組織特異的又は発達的に固有のパターンで発現されることが知られているプロモーター配列との比較によって開始され得る。同様の発現パターンを有するプロモーター間で共有される配列は、転写因子の結合のための候補である可能性が高く、したがって発現パターンを与える要素である可能性が高い。これらの推定的調節要素の確認は、各推定的調節配列の欠失解析、続いて各構築物に機能的に結合されるレポーター遺伝子のアッセイによる各欠失構築物の機能解析によって達成され得る。したがって、開始プロモーター配列が提供されると、開始プロモーターのいくつかの異なる欠失突然変異体のいずれかが容易に調製され得る。
本明細書に開示される本発明は、新規なキメラ調節要素を構築するのに使用され得る調節要素フラグメントを含むポリヌクレオチド分子を提供する。これらのポリヌクレオチド分子のフラグメント及び少なくとも１つの他の調節要素又はフラグメントを含む新規な組合せは、植物において構築及び試験され得、本発明の範囲内であると考えられる。したがって、キメラ調節要素の設計、構築及び使用は、本発明の一実施形態である。本発明のプロモーターは、本発明のプロモーター配列との相同性を示す遺伝子調節に影響を与えることが知られているｃｉｓ要素のホモログを含む。
本明細書に記載される核酸を調節する転写の１つの機能的な均等なフラグメントは、転写調節核酸の少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０又は１０００塩基対を含む。次に、ｍＲＮＡの５’－非翻訳領域をコードする領域を除去することによって得られる、転写調節核酸の均等なフラグメントは、（非転写）プロモーター領域のみを提供するであろう。５’－非翻訳領域は、当技術分野で公知の方法（５’－ＲＡＣＥ解析など）によって容易に決定され得る。したがって、本明細書に記載される転写調節核酸のいくつかは、他の配列の均等なフラグメントである。
上に示されるように、本発明のプロモーターの欠失突然変異体は、無作為にも調製され、次にアッセイされ得る。この手法後、プロモーターの様々な部分（サブクローン）をそれぞれ含有する一連の構築物が調製され、次に、これらの構築物は、活性についてスクリーニングされる。活性についてスクリーニングするための好適な手段は、欠失されたセグメントを含有する欠失されたプロモーター又はイントロン構築物を選択可能な又はスクリーニング可能なマーカーに結合すること及びマーカー遺伝子を発現する細胞のみを単離することである。このように、いくつかの異なる欠失されたプロモーター構築物が同定され、これは、所望の又はさらに強化された活性を依然として保持する。活性に必要な最も小さいセグメントは、それにより、選択された構築物の比較を通して同定される。次に、このセグメントは、外来遺伝子の発現のためにベクターの構築に使用され得る。
本明細書に記載される「少なくとも１つの発現カセット」は、特に、誘導可能なシステムの配列を含むＤＮＡ及び細胞によって発現されるＤＮＡ修飾酵素をコードする核酸を指す。一例において、少なくとも１つの発現カセットは、ベクターＤＮＡの構成要素であり、細胞内で形質転換後に発現される。本明細書に記載される少なくとも１つの発現カセットは、複数の発現カセット、例えば調節配列及びｇＲＮＡをコードする核酸を含む発現カセット、ドナーＤＮＡの複製を開始する調節配列を含む発現カセット、調節配列及び選択可能なマーカーを含む発現カセット又はそれらのいくつかの組合せ、例えば誘導可能なシステムの配列の制御下でＣａｓ酵素をコードするＤＮＡ及びｇＲＮＡを含む発現カセットを含むことが多いであろう。本明細書に記載される少なくとも１つの発現カセットは、さらなる調節要素を含み得る。これに関連する用語は、少なくとも１つの発現カセットの構築又は機能に影響を与え得る全ての配列を含む広い意味で理解されるべきである。調節要素は、例えば、原核生物又は真核生物における転写及び／又は翻訳を調節し得る。本明細書に記載される少なくとも１つの発現カセットは、発現される核酸配列の下流（３’方向）にあり得、転写又は翻訳エンハンサーなどのさらなる調節要素を任意に含有し得る。各さらなる調節要素は、発現される核酸配列（又は転写調節ヌクレオチド配列）に作動可能に連結され得る。さらなる調節要素は、さらなるプロモーター、最小プロモーター、プロモーター要素又は発現調節特性を調節若しくは強化し得るトランスポゾン要素を含み得る。少なくとも１つの発現カセットは、１つ以上のイントロン、１つ以上のエクソン及び１つ以上のターミネーターも含有し得る。
さらに、２つ以上のプロモーターからの要素を組み合わせたプロモーターが有用であり得ると考えられる。例えば、米国特許第５，４９１，２８８号明細書には、カリフラワーモザイクウイルスプロモーターをヒストンプロモーターと組み合わせることが開示されている。したがって、本明細書に開示されるプロモーター、例えばＦＭＯＳプロモーターからの要素は、ＦＭＯＳ機能が維持される限り、他のプロモーター、ＦＭＯＳ又はその他からの要素と組み合わされ得る。例えば、特定の実施形態では、ＦＭＯＳプロモーター中のイントロンは、ユビキチンプロモーターからのイントロンなど、他のプロモーターからのイントロンで置き換えられ得る。さらに他のＦＭＯＳプロモーターは、ある実施形態では、例えば、ＦＭＯＳプロモーターをユビキチンプロモーターからのイントロンと融合することなど、例えば他のプロモーターからのイントロンとの融合によって伸長され得る。
「ベクター」という用語は、核酸（又は複数の核酸）を細胞中に移送、送達又は導入するための組成物を指す。ベクターは、移送、送達又は導入されるヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。例のベクターとしては、プラスミド、コスミド、ファージミド、人工染色体、ファージ又はウイルスベクターが挙げられる。
（詳細な説明）
本開示は、特に、遺伝子編集効率を改善するため、例えば植物のＤＮＡにおける編集、例えば新たな突然変異又は事象を生成するのに必要な形質転換の回数を減少させるためのシステム及び方法に関する。
様々な実施形態では、本開示は、植物の種子における複数の固有の編集、例えば複数の固有の対立遺伝子置換、複数の固有の塩基挿入、複数の固有の塩基欠失又は複数の固有の点突然変異を生成するための方法に関する。
一実施形態は、植物の子孫における複数の固有の編集を生成するための方法であって、（ａ）発現カセットを植物細胞又は植物組織中に導入する工程であって、発現カセットは、（ｉ．）ＤＮＡ修飾酵素をコードする核酸、（ｉｉ．）少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする任意の核酸、及び（ｉｉｉ．）ＤＮＡ修飾酵素をコードする核酸に作動可能に連結された誘導因子を含む、工程と、（ｂ．）所望の植物発達段階で誘導因子を誘導する工程と、（ｃ．）植物細胞又は植物組織を、子孫を有する植物へと生成する工程であって、子孫は、複数の固有の編集を集合的に含む、工程とを含む方法を提供する。一実施形態では、誘導因子は、転写エフェクター又は転座エフェクターであり、誘導因子は、化学物質によって誘導され、化学物質は、抗生物質、金属、ステロイド、殺虫剤、ホルモン、アルコール及びアルデヒドから選択され、抗生物質は、テトラサイクリン又はその化学的模倣体であり、金属は、銅又は銅含有化合物であり、ステロイドは、デキサメタゾン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロン及びそれらの任意の化学的模倣体からなる群から選択されるグルココルチコイドであり、グルココルチコイドは、デキサメタゾンであり、殺虫剤は、テブフェノジド、メトキシフェノジド及びそれらの任意の化学的模倣体からなる群から選択され、ホルモンは、エストロゲン、エストロゲン、１７－β－エストラジオール及びそれらの任意の化学的模倣体からなる群から選択され、アルコールは、エタノール及びその任意の化学的模倣体からなる群から選択され、アルデヒドは、アセトアルデヒド及びその任意の化学的模倣体からなる群から選択される。別の実施形態では、転写エフェクターは、アルコール依存性エフェクター、ラクトース依存性エフェクター、ガラクトース依存性エフェクター及びｌｅｘＡ依存性エフェクターからなる群から選択され、アルコール依存性エフェクターは、ａｌｃエフェクターである。一態様では、ａｌｃエフェクターは、ａｌｃＡプロモーターを含むアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｌｃエフェクターである。
別の実施形態では、本方法は、ａｌｃＲ転写因子活性化遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む追加的な発現カセットをさらに含み、それによりａｌｃＡ／ａｌｃＲ誘導性システムを形成する。一態様では、本方法は、所望の植物発達段階でアルコールを適用することを含む。
別の実施形態では、ラクトース依存性エフェクターは、ｐＯｐエフェクターである。一態様では、本方法は、ＬｈＧ４転写因子活性化遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む追加的な発現カセットをさらに含み、それによりＬｈＧ４／ｐＯｐ誘導性システムを形成する。
別の実施形態では、ガラクトース依存性レギュロンは、Ｇａｌ４ ＵＡＳエフェクターである。一態様では、本方法は、Ｇａｌ４転写因子活性化遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む追加的な発現カセットをさらに含み、それによりＧＶＧ誘導性システム又はＶＧＥ誘導性システムを形成する。
別の実施形態では、ｌｅｘＡ依存性エフェクターは、少なくとも１つのＬｅｘＡオペロンである。一態様では、本方法は、ＬｅｘＡ：ＶＰ１６：ＥＲ活性化因子をコードするヌクレオチド配列を含む追加的な発現カセットをさらに含み、それによりＸＶＥ誘導性システムを形成する。
一実施形態では、ＤＮＡ修飾酵素は、メガヌクレアーゼ（ＭＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、キメラＦＥＮ１－ＦｏｋＩ、Ｍｅｇａ－ＴＡＬ及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼからなる群から選択される。一態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、ｄＣａｓ９－ＦｏｋＩ、ｄＣｐｆ１－ＦｏｋＩ、キメラＣａｓ９－シチジンデアミナーゼ、キメラＣａｓ９－アデニンデアミナーゼ、ニッカーゼＣａｓ９（ｎＣａｓ９）、キメラｄＣａｓ９非ＦｏｋＩヌクレアーゼ及びｄＣｐｆ１非ＦｏｋＩヌクレアーゼ、デアミナーゼドメインに融合されたＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｊヌクレアーゼ、ＣａｓＸヌクレアーゼ、ＣａｓＹヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１４ヌクレアーゼである。
別の実施形態では、転座因子は、グルココルチコイド受容体である。一態様では、グルココルチコイド受容体は、配列番号６を含む。別の態様では、グルココルチコイド受容体は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに作動可能に連結される。別の実施形態では、グルココルチコイド受容体連結ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、グルココルチコイド受容体結合ドメインを含むように修飾された修飾Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ（「ＧＲ－Ｃａｓ１２ａ」）である。一態様では、ＧＲ－Ｃａｓ１２ａは、配列番号７を含む。別の実施形態では、本方法は、デキサメタゾンの適用時、ＧＲ－Ｃａｓ１２ａが植物細胞又は植物組織の細胞質から核に転座することをさらに含む。
本方法の別の実施形態では、固有の編集は、インデル突然変異、ヌクレオチド置換、対立遺伝子置換、染色体転座又は供与核酸の挿入である。
本方法の別の実施形態では、植物細胞又は植物組織は、双子葉植物である。一態様では、双子葉植物の植物細胞又は植物組織は、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ヒマワリ、ダイズ、トマト、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種、ヤマナラシ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）（ポプラ）、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）、タバコ、アサ属（Ｃａｎｎａｂｉｓ）、ジャガイモ、ワタ、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、サトウキビ、グリシン・トメンテラ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｔｏｍｅｎｔｅｌｌａ）及び他の野生ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ）種からなる群から選択される。
本方法の別の実施形態では、植物細胞又は植物組織は、単子葉植物である。一態様では、単子葉植物の植物細胞又は植物組織は、トウモロコシ、コムギ、イネ、ブタモロコシ、ソルガム、オオムギからなる群から選択される。別の態様では、単子葉植物の植物細胞又は植物組織は、トウモロコシである。
一実施形態では、植物細胞又は植物組織は、トウモロコシであり、所望の発達段階は、ＶＥ、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ（ｎ）、ＶＴ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６段階からなる群から選択され、ここで、（ｎ）は、存在する葉の襟の数を表す整数である。
別の実施形態では、植物細胞又は植物組織は、ダイズであり、所望の発達段階は、ＶＥ、ＶＣ、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ（ｎ）、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８段階からなる群から選択され、ここで、（ｎ）は、存在する三小葉の数を表す整数である。
別の実施形態では、本方法は、（ｄ．）複数の固有の編集を集合的に含む子孫を苗、小植物体、未熟植物、成熟植物又は老化植物へと成長させる工程と、（ｅ．）工程ａ．の苗、小植物体、未熟植物、成熟植物又は老化植物における少なくとも１つの表現型を測定する工程と、（ｆ．）任意に、少なくとも１つの表現型の測定に基づいて、苗、小植物体、未熟植物、成熟植物又は老化植物を選択する工程とをさらに含む。
さらに別の実施形態では、本方法は、（ｄ．）複数の固有の編集を集合的に含む子孫を苗、小植物体、未熟植物、成熟植物又は老化植物へと成長させる工程と、（ｅ．）工程ａ．の苗、小植物体、未熟植物、成熟植物又は老化植物をジェノタイピングする工程と、（ｆ．）任意に、工程ｂ．の遺伝子型に基づいて、苗、小植物体、未熟植物、成熟植物又は老化植物を選択する工程とをさらに含む。
本発明の別の実施形態は、上に記載される方法によって生成される編集された植物である。
本発明の別の実施形態は、誘導可能な遺伝子編集システムであって、（ａ．）ＤＮＡ修飾酵素をコードする核酸、（ｂ．）少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする任意の核酸、及び（ｃ．）ＤＮＡ修飾酵素をコードする核酸に作動可能に連結された誘導因子を含む発現カセットを含む誘導可能な遺伝子編集システムである。一実施形態では、システムは、発現カセットを保有する細胞をさらに含む。一態様では、細胞は、真核細胞である。別の態様では、真核細胞は、植物細胞である。
実施例１．アルコールに誘導されるモザイク性
この実施例において、モザイク性は、植物生命体の所望の発達段階、例えば花芽始原の発生時、ＧＥシステムに作動可能に連結されたＡｌｃＲ／ＡｌｃＡ誘導性システムを含む植物へのエタノールの適用によって誘導され得る。ＡｌｃＲ／ＡｌｃＡシステムにおいて、ＡｌｃＲ転写因子及びＡｌｃＡプロモーターをアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｍ ｎｉｄｕｌａｎｓ）から単離した。このシステムを含む植物がエタノールに曝露されるとき、植物は、エタノールをアセトアルデヒドに代謝し、これは、ＡｌｃＲとともに、ＡｌｃＡプロモーターを活性化し、それにより下流の遺伝子の発現を駆動する。
使用される材料：（１）誘導中２８℃で及び２週間にわたって２つのチャンバ。（２）シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物を、３つのカセットを含むカナマイシン選択マーカーを有する、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）における発現のためのエタノール誘導性遺伝子編集システムを含むベクター２５８８１で形質転換した。第１の発現カセットにおいて、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）からの双子葉植物最適化アルコール受容体遺伝子（ＡｌｃＲ）を構成的プロモーターｐｒＡｔＥＦ１ａＡ１によって駆動する。第２の発現カセットにおいて、ＡｌｃＡプロモーター及び３５Ｓ最小プロモーターの融合からなるキメラプロモーターであるｐｒＡｌｃＡ（Ｃａｄｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ，１９９８．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙに記載される）がＣａｓ１２ａの発現を駆動する。エタノールの存在下において、ＡｌｃＲは、ＡｌｃＡプロモーターに結合し、転写を活性化する。第３の発現カセットは、Ｇｌａｂｒｏｕｓ１（ＧＬ１）遺伝子の第２のエクソンを標的化するｇＲＮＡを含む。
処理：（１）２％のエタノール水溶液による一晩の浸漬。（２）対照植物を、エタノールを与えなかったことを除いて同じ条件下で成長させ、それらを水のみで浸漬した。
編集のサンプリング：植物の様々な部位から８～１６の長角果を収穫し、種子を発芽させ、植物をシークエンシングのために採取し、１つの長角果からの全ての種子を同じポットに入れた。種子を土壌に植え付けた後、４Ｃで２日間にわたって開花結実を促進する。
ボルティング後、最初の長角果が収穫できるようになるまで約１か月かかる。
Ａ．浸漬処理Ｎｏ．１
植物を、２％のエタノールで浸漬した。対照をエタノールなしの別個のチャンバに入れておいた。
Ｂ．ｑＲＴ ＰＣＲ結果
本発明者らは、２％のエタノールで一晩の浸漬（１７時間）の翌日及び６日後（１４４時間）にＣａｓ１２ａ転写産物のレベルを最初に試験し、この実験を「１＿６＿ｄａｙｓ」と命名した。本発明者らは、Ｃａｓ１２ａが２％のエタノールによる浸漬の開始から１７時間後に誘導されたが、それが１４４時間後に水対照レベルに戻ったことを見出した。誘導されたＣａｓ１２ａ転写産物の経時的な発現プロファイルをよりよく推定するために、本発明者らは、「時間経過」と命名された別の実験を行い、浸漬の１７、４６、７０及び９４時間後に採取された、２５８８１シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物の第２のバッチを用いた。第２の実験（「時間経過」）において、対照植物を含むトレーを、２％のエタノールで浸漬されたものの隣に置いた。１７時間後、対照植物は、表面上は、２％のａｌｃトレーから来るエタノール蒸気からのＣａｓ１２ａ転写産物の活性化を示した。この理由のため、「時間経過」実験からの１日目（１７時間）の水対照データ点を解析から除外した。
本発明者らは、ＴａｑＭａｎ ｑＲＴ－ＰＣＲ（表１．）を用いてＣａｓ１２ａ転写産物のレベルを定量した。これらの実験からの結果に基づいて、本発明者らは、誘導されたＣａｓ１２ａを維持するために、４日ごとに２％のエタノールで浸漬することを選択した。
Figure 2024512050000002
Figure 2024512050000003
Figure 2024512050000004
Figure 2024512050000005
Figure 2024512050000006
Figure 2024512050000007
本発明者らは、花及び葉におけるＣａｓ１２ａの発現を比較するための実験も行った。この実験は、上記のＴ１植物のサブセットからのＴ２植物を用いて行った。データは、アルコールがＣａｓ１２ａ発現を全身的に（葉及び花において）誘導することを示す。
Figure 2024512050000008
Figure 2024512050000009
Figure 2024512050000010
Figure 2024512050000011
Ｃ．発現のスケジュール
Ｃａｓ１２ａアルコール誘導及びｇｌ１突然変異誘発
ｇｌ１突然変異誘発の率を最適化するために、本発明者らは、Ｔ１事象を、植え付け後の様々な時点で誘導される４つのバッチに分割した。第１のバッチにおける植物は、土壌への移植の２３日後に誘導された一方、それらの全ては、生長期にあった。第２のバッチにおける植物は、移植の３４日後に誘導され、その時点において２つを除く全てが生長期にあった。第３のバッチにおける植物は、移植の４４日後に誘導され、この時点で全て開花していた。第４のバッチにおける植物は、移植の４７日後に誘導された。活性化されたＣａｓ１２ａを維持するために、全ての植物を、それらの最初の誘導後に４日置きに浸漬した。葉サンプルを全ての植物について誘導前及び誘導の１日後に採取した。さらに、いくつかの植物を採取して、後の時点でＣａｓ１２ａを測定した。
Figure 2024512050000012
Figure 2024512050000013
Figure 2024512050000014
Figure 2024512050000015
Figure 2024512050000016
本発明者らは、Ｔ２世代におけるｇｌ１突然変異誘発率を採点するために、各処理からＴ１植物のサブセットを選択した。老化したＴ１植物からの８～１６の長角果を個別に収集し、全てのその種子を個々の２インチ×２インチポット上に蒔いた。ポットは、４℃で４日間にわたって層状になり、次にそれを１２時間の光とともに２３℃で設定された成長チャンバに入れた。葉を、毛状突起を有さない苗の数を計数し、それらをポット中の苗の総数で除算することにより、無毛表現型について採点した。ごくわずかな苗がモザイク状であり、無毛の１つ又は複数の葉の部位及び毛状突起を有する部位を伴い、本発明者らは、それらの苗を無毛と採点した。平均無毛１率を同じＴ１事象の全てのポットにわたる無毛苗の平均率として計算した。
Figure 2024512050000017
アルコール誘導性Ｃａｓ１２ａによって生成された対立遺伝子を評価するために、本発明者らは、ｇｌ１における標的化配列の周りの領域のＤＮＡ抽出、ＰＣＲ増幅及びＳａｎｇｅｒシークエンシングのために、９６ウェルプレート中に個々のＴ２ ｇｌ１苗を採取した。ｇｌ１における多数の欠失は、ｇｌ１が劣性であるため、それらがヘテロ接合性である場合、無毛の苗をもたらすことが予想されず、さらに、３量体欠失は、部分的な機能消失をもたらす乃至機能消失をもたらさない可能性が高い。ヘテロ接合性又は部分的な機能消失によって「マスクされた」ｇｌ１のさらなる対立遺伝子を捕捉するために、本発明者らは、５つの苗のプールで野生型苗もシークエンシングした。６１４塩基対ｇｌ１フラグメントを、プライマーＧＬ１＿Ｆ（ＣＧＴＧＴＣＡＣＧＡＡＡＡＣＣＣＡＴＣ）及びＧＬ１＿Ｒ（ＴＣＡＡＣＴＴＡＡＣＣＧＧＣＣＡＡＡＴＣ）を有するＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いて増幅し、プライマーＧＬ１＿Ｆを用いてＳａｎｇｅｒシークエンシングした。得られたトレースクロマトグラムを、編集の性質を与えるＳｙｎｔｈｅｇｏ’ｓ ＩＣＥ ＣＲＩＳＰＲ解析ツール（ｗｗｗ．ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１０．１１０１／２５１０８２ｖ３）を用いて解析した。
Figure 2024512050000018
Figure 2024512050000019
Figure 2024512050000020
Figure 2024512050000021
２４の植物（植物０１～２４）が処理群（すなわち２％のエタノール浸漬トレー）にあり、８つの植物（植物３３～４０）が対照群（すなわちエタノールなし）にあった。ｑＲＴ ＰＣＲサンプルを１７時間、４６時間、７０時間及び９４時間の時点で収集した。
種子をシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物花序の様々な部位から収集し、ｇｌａｂｒｏｕｓ１標的遺伝子の遺伝子編集を評価するために植え付けた。
編集は、葉における毛状突起の存在／非存在の観察並びにｇｌ１のＴａｑＭａｎ及びシークエンシングの両方により、表現型的に評価されるであろう。
実施例２．ＤＥＸに誘導されるモザイク性
ＤＥＸ誘導性Ｃａｓ１２ａ活性のための２つのベクターを構築した。第１のベクター２５６５７において、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）を、構成的プロモーター、ｐｒＡｔＥＦ１ａＡ１－０７（配列番号２、図３）によって駆動されるＣａｓ１２ａに融合した。バージョン２、ベクター２７０５７では、ｐｒ３５Ｓによって駆動されるＧａｌ４－ＶＰ１６－ＧＲの融合がある。これらの２つの構築物のさらなる詳細が以下に提供される。
第１の例において、ラットグルココルチコイド受容体（ＧＲ）のホルモン結合ドメインを最適な編集酵素に融合した。ＧＲドメインをＣａｓ１２ａに融合することにより、これは、その核局在化をＤＥＸの適用に依存性にする。シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物を、ＤＥＸ誘導性Ｃａｓ１２ａ（「ＧＲ－Ｃａｓ１２ａ」）の発現を可能にする配列を含むベクター２５６５７で形質転換した。ＧＲ－Ｃａｓ１２ａは、ＮＬＳを欠くが、長いリンカーによって隔てられるＮ末端においてグルココルチコイド受容体（ＧＲ）結合ドメインを含む。ＧＲ－Ｃａｓ１２タンパク質は、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）プロモーターｐｒＡｔＥＦ１ａＡ１によって構成的に発現されるが、細胞質に限局されたままである。グルココルチコイド、例えばデキサメタゾン（「ＤＥＸ」）の存在下において、ＧＲ－Ｃａｓ１２ａは、核に転座する。ベクターは、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）におけるｇｌａｂｒｏｕｓ １（ｇｌ１）遺伝子の第２のエクソンにおける５’－ｃｃａｃａｔｃｔｃｔｔｔａｇｃｃｃｔａｔｃａａ－３’を標的とするガイドＲＮＡもコードする。
形質転換されたシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物を所望の発達段階、例えば花序の発達中に成長させ、その時点でグルココルチコイド、例えばデキサメタゾンを植物に適用する。ＤＥＸ適用は、局所的に、根浸漬又はその他であり得る。植物を正常に発達させ、子孫をモザイク性について解析する。編集を葉における毛状突起の存在／非存在の観察（図６を参照されたい）並びにｇｌ１のＴａｑＭａｎ及びシークエンシンの両方により表現型的に評価した。しかしながら、２５６５７実施形態は、Ｃａｓ１２ａのバージョンが十分に活性でないため又はＧＲ－Ｃａｓ１２ａ融合に関連する他の理由のため、必要とされるほど編集に効率的でないことが分かった。この問題は、Ｃａｓ１２ａの不十分に高い発現にも反映される。
ベクター２７０５７について、システムは、デキサメタゾンのようなステロイドの組み換えタンパク質ＧＶＧとの相互作用特性に基づき、これは、酵母（サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン、単純ヘルペスＶＰ１６活性化ドメイン及びラット（ラツス・ノルベギクス（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））グルココルチコイド受容体（ＧＲ）に由来するホルモン結合ドメインから構成される。グルココルチコイド受容体（「ＧＲ」）のホルモン結合ドメインは、２７７アミノ酸のサイズを有する。ステロイドの非存在下において、ＧＶＧは、熱ショックタンパク質９０（「ＨＳＰ９０」）を含有する細胞質複合体と相互作用し、細胞質に限局されたままであり、それにより転写的に不活性になる。合成ステロイドホルモンデキサメタゾンによる処理後、ＧＶＧ／ＨＳＰ９０相互作用が妨害され、ＧＶＧタンパク質は、細胞核に限局し、ここで、それは、活性化配列の上流のＧＡＬ４（ＧＡＬ４ ＵＡＳ）の複数のコピーから構成される調節配列に結合する。このプロモーター領域に結合されると、ＶＰ１６ドメインは、下流の遺伝子の転写を活性化する。このベクターを上記のシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）に形質転換し、編集を葉における毛状突起の存在／非存在の観察並びにｇｌ１のＴａｑＭａｎ及びシークエンシングの両方により表現型的に評価した。
実施例３．誘導されるモザイク性
他の誘導性システムは、遺伝子編集技術と組み合わされ、所望の発達段階で配備されるとき、誘導されたモザイク性を得るのに使用され得る。有用なシステムは、ガラクトース依存性エフェクター（例えば、ＶＧＥ誘導性システム）及びｌｅｘＡ依存性エフェクター（例えば、ＬｅｘＡ：ＶＰ１６：ＥＲ活性化因子（ＸＶＥ誘導性システム））を含む。
ＶＧＥシステムにおいて、活性化因子は、Ｎ末端からＣ末端方向にＶＰ１６：Ｇａｌ４：ＥＲである。このシステムにおいて、エフェクターは、最小プロモーターの上流の、少なくとも１つであるが、一般に４、５又は６つのＧａｌ４－ＵＡＳ要素を含むプロモーターである。
ｌｅｘＡ依存性エフェクターベースのシステム、例えばＸＶＥ誘導性システム（Ｉ．Ｍｏｏｒｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｅｄ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ，ＰＬＡＮＴ Ｊ．，４５：６５１－６８３（２００６）、図３に記載されるように）において、活性化因子は、例えば、３５Ｓプロモーターによって構成的に発現される、ステロイド受容体にさらに融合されたＬｅｘ：ＶＰ１６融合タンパク質を含む。ステロイド受容体は、グルココルチコイド受容体（「ＧＲ」）又はエストラジオール受容体（「ＥＲ」）であり得る。ＸＶＥシステムにおいて、活性化因子は、Ｎ末端からＣ末端方向に、ＶＰ１６転写活性化ドメイン及びヒトエストロゲン受容体ＥＲに融合されたｌｅｘＡリプレッサードメイン（「Ｌｅｘ：ＶＰ１６：ＥＲ」又は「ＸＶＥ」；これらの用語は、同義的に使用される）を含む。エフェクターは、最小プロモーターの上流の、少なくとも１つであるが、一般に４、５、６、７又は８つのｌｅｘＡオペレーターを含むプロモーターであり、それにより対象とする遺伝子の転写を活性化する。１７－β－エストラジオールのようなエストロゲンの存在下において、ＸＶＥは、ｌｅｘＡドメインの複数のコピーに結合し、したがって下流の標的 － この場合、Ｃａｓ１２ａの転写を活性化する。代わりに、Ｃａｓ１２ａは、構成的に発現され得、ＸＶＥは、ｇＲＮＡ分子の転写を活性化する。
他のシステムは、誘導可能なモザイク性を得るために適用に組み込まれ得る。以下の表６を参照されたい。
Figure 2024512050000022
参考文献
Ｍｏｏｒｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｅｄ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ，ＰＬＡＮＴ Ｊ．，４５：６５１－６８３（２００６）．
Ｌ．Ｂｏｒｇｈｉ，Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔｓ．Ｉｎ：Ｈｅｎｎｉｇ Ｌ．，Ｋｏｅｈｌｅｒ Ｃ．（ｅｄｓ）Ｐｌａｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），ｖｏｌ ６５５．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／９７８－１－６０７６１－７６５－５＿５．
Ｚｕｏ ａｎｄ Ｎ．－Ｈ．Ｃｈｕａ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅｓ，ＣＵＲＲＥＮＴ ＯＰ．ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．，１１（２）：１４６－１５１（２０００）．

Claims (52)

  1. 植物の子孫における複数の固有の編集を生成するための方法であって、
    ａ．発現カセットを植物細胞又は植物組織中に導入する工程であって、前記発現カセットは、
    ｉ．ＤＮＡ修飾酵素をコードする核酸、
    ｉｉ．少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする任意の核酸、及び
    ｉｉｉ．ＤＮＡ修飾酵素をコードする前記核酸に作動可能に連結された誘導因子
    を含む、工程と、
    ｂ．所望の植物発達段階で前記誘導因子を誘導する工程と、
    ｃ．前記植物細胞又は植物組織を、子孫を有する植物へと生成する工程であって、前記子孫は、複数の固有の編集を集合的に含む、工程と
    を含む方法。
  2. 前記誘導因子は、転写エフェクター又は転座エフェクターである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記誘導因子は、化学物質によって誘導される、請求項１に記載の方法。
  4. 前記化学物質は、抗生物質、金属、ステロイド、殺虫剤、ホルモン、アルコール、及びアルデヒドから選択される、請求項３に記載の方法。
  5. 前記抗生物質は、テトラサイクリン又はその化学的模倣体である、請求項４に記載の方法。
  6. 前記金属は、銅又は銅含有化合物である、請求項４に記載の方法。
  7. 前記ステロイドは、デキサメタゾン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロン、及びそれらの化学的模倣体からなる群から選択されるグルココルチコイドである、請求項４に記載の方法。
  8. 前記グルココルチコイドは、デキサメタゾンである、請求項７に記載の方法。
  9. 前記殺虫剤は、テブフェノジド、メトキシフェノジド、及びそれらの化学的模倣体からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
  10. 前記ホルモンは、エストロゲン、エストロゲン、１７－β－エストラジオール、及びそれらの化学的模倣体からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
  11. 前記アルコールは、エタノール及びその化学的模倣体からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
  12. 前記アルデヒドは、アセトアルデヒド及びその化学的模倣体からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
  13. 前記転写エフェクターは、アルコール依存性エフェクター、ラクトース依存性エフェクター、ガラクトース依存性エフェクター、及びｌｅｘＡ依存性エフェクターからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
  14. 前記アルコール依存性エフェクターは、ａｌｃエフェクターである、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記ａｌｃエフェクターは、ａｌｃＡプロモーターを含むアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｌｃエフェクターである、請求項１４に記載の方法。
  16. ａｌｃＲ転写因子活性化遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む追加的な発現カセットをさらに含み、それによりａｌｃＡ／ａｌｃＲ誘導性システムを形成する、請求項１５に記載の方法。
  17. 工程ｂ．における前記誘導は、前記所望の植物発達段階でアルコールを適用することを含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記ラクトース依存性エフェクターは、ｐＯｐエフェクターである、請求項２に記載の方法。
  19. ＬｈＧ４転写因子活性化遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む追加的な発現カセットをさらに含み、それによりＬｈＧ４／ｐＯｐ誘導性システムを形成する、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記ガラクトース依存性レギュロンは、Ｇａｌ４ ＵＡＳエフェクターである、請求項２に記載の方法。
  21. Ｇａｌ４転写因子活性化遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む追加的な発現カセットをさらに含み、それによりＧＶＧ誘導性システム又はＶＧＥ誘導性システムを形成する、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記ｌｅｘＡ依存性エフェクターは、少なくとも１つのＬｅｘＡオペロンである、請求項２に記載の方法。
  23. ＬｅｘＡ：ＶＰ１６：ＥＲ活性化因子をコードするヌクレオチド配列を含む追加的な発現カセットをさらに含み、それによりＸＶＥ誘導性システムを形成する、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記ＤＮＡ修飾酵素は、メガヌクレアーゼ（ＭＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、キメラＦＥＮ１－ＦｏｋＩ、Ｍｅｇａ－ＴＡＬ、及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  25. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、ｄＣａｓ９－ＦｏｋＩ、ｄＣｐｆ１－ＦｏｋＩ、キメラＣａｓ９－シチジンデアミナーゼ、キメラＣａｓ９－アデニンデアミナーゼ、ニッカーゼＣａｓ９（ｎＣａｓ９）、キメラｄＣａｓ９非ＦｏｋＩヌクレアーゼ、及びｄＣｐｆ１非ＦｏｋＩヌクレアーゼ、デアミナーゼドメインに融合されたＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｊヌクレアーゼ、ＣａｓＸヌクレアーゼ、ＣａｓＹヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１４ヌクレアーゼである、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記転座因子は、グルココルチコイド受容体である、請求項２に記載の方法。
  27. 前記グルココルチコイド受容体は、配列番号６を含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記グルココルチコイド受容体は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに作動可能に連結される、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記グルココルチコイド受容体連結ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、グルココルチコイド受容体結合ドメインを含むように修飾された修飾Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ（「ＧＲ－Ｃａｓ１２ａ」）である、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記ＧＲ－Ｃａｓ１２ａは、配列番号７を含む、請求項２９に記載の方法。
  31. デキサメタゾンの適用時、前記ＧＲ－Ｃａｓ１２ａは、前記植物細胞又は植物組織の細胞質から核に転座する、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記固有の編集は、インデル突然変異、ヌクレオチド置換、対立遺伝子置換、染色体転座、又は供与核酸の挿入である、請求項１に記載の方法。
  33. 前記植物細胞又は植物組織は、双子葉植物である、請求項１に記載の方法。
  34. 前記双子葉植物の植物細胞又は植物組織は、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ヒマワリ、ダイズ、トマト、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種、ヤマナラシ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）（ポプラ）、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）、タバコ、アサ属（Ｃａｎｎａｂｉｓ）、ジャガイモ、ワタ、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、サトウキビ、グリシン・トメンテラ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｔｏｍｅｎｔｅｌｌａ）、及び他の野生ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ）種からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記植物細胞又は植物組織は、単子葉植物である、請求項１に記載の方法。
  36. 前記単子葉植物の植物細胞又は植物組織は、トウモロコシ、コムギ、イネ、ブタモロコシ、ソルガム、オオムギからなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記単子葉植物の植物細胞又は植物組織は、トウモロコシである、請求項３６に記載の方法。
  38. 植物細胞又は植物組織は、トウモロコシであり、前記所望の発達段階は、ＶＥ、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ（ｎ）、ＶＴ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６段階からなる群から選択され、ここで、（ｎ）は、存在する葉の襟の数を表す整数である、請求項１に記載の方法。
  39. 植物細胞又は植物組織は、ダイズであり、前記所望の発達段階は、ＶＥ、ＶＣ、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ（ｎ）、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８段階からなる群から選択され、ここで、（ｎ）は、存在する三小葉の数を表す整数である、請求項１に記載の方法。
  40. 以下をさらに含む、請求項１に記載の方法：
  41. 複数の固有の編集を集合的に含む前記子孫を苗、小植物体、未熟植物、成熟植物、又は老化植物へと成長させる工程、
  42. 工程ａ．の前記苗、小植物体、未熟植物、成熟植物、又は老化植物における少なくとも１つの表現型を測定する工程、及び
  43. 任意に、前記少なくとも１つの表現型の前記測定に基づいて、苗、小植物体、未熟植物、成熟植物、又は老化植物を選択する工程。
  44. 以下をさらに含む、請求項１に記載の方法：
  45. 複数の固有の編集を集合的に含む前記子孫を苗、小植物体、未熟植物、成熟植物、又は老化植物へと成長させる工程、
  46. 工程ａ．の前記苗、小植物体、未熟植物、成熟植物、又は老化植物をジェノタイピングする工程、及び
  47. 任意に、工程ｂ．の遺伝子型に基づいて、苗、小植物体、未熟植物、成熟植物、又は老化植物を選択する工程。
  48. 請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法によって生成される編集された植物。
  49. 誘導可能な遺伝子編集システムであって、
    ａ．ＤＮＡ修飾酵素をコードする核酸、
    ｂ．少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする任意の核酸、及び
    ｃ．ＤＮＡ修飾酵素をコードする前記核酸に作動可能に連結された誘導因子
    を含む発現カセットを含む誘導可能な遺伝子編集システム。
  50. 前記発現カセットを保有する細胞をさらに含む、請求項４３に記載のシステム。
  51. 前記細胞は、真核細胞である、請求項４４に記載のシステム。
  52. 前記真核細胞は、植物細胞である、請求項４５に記載のシステム。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6723896B1 (en) * 1999-11-12 2004-04-20 The Rockefeller University Inducible site-specific recombination for the activation and removal of transgenes in transgenic plants
JP5874949B2 (ja) * 2010-01-15 2016-03-02 トヨタ自動車株式会社 変異体植物、その製造方法及び遺伝的組換え頻度を上昇させる方法
WO2015048707A2 (en) * 2013-09-30 2015-04-02 Regents Of The University Of Minnesota Conferring resistance to geminiviruses in plants using crispr/cas systems
CN111566208A (zh) * 2017-12-22 2020-08-21 生物辐射实验室股份有限公司 利用CRISPR/Cas基因靶向控制生物体表型
US20230060937A1 (en) * 2018-12-21 2023-03-02 Syngenta Participations Ag Simultaneous gene editing and haploid induction

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