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TECHNISCHES
GEBIET
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Expression eines
Fremdgens und ein Vektor dafür.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere ein Verfahren
zur Expression eines Fremdgens in genetischen Manipulationsverfahren,
wodurch die Expression des Fremdgens stärker als mit üblichen
Verfahren gefördert
wird, und ein Vektor dafür.
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HINTERGRUND
DES STANDES DER TECHNIK
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Die
Expressionspromotion von Fremdgenen stellt eine der notwendigsten
Techniken im Rahmen der genetischen Manipulationsverfahren dar,
insbesondere wenn die genetischen Manipulationsverfahren an Pflanzen
angewendet werden.
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Von
einem derartigen Verfahren ist bekannt, dass mit ihm ein von Intron
herrührendes
DNA-Fragment in eine Stelle stromaufwärts vom Fremdgen insertiert
werden kann. Die offengelegte Japanische Patentanmeldung (Kokai)
Nr. 3-103182 offenbart zum Beispiel, dass die Expression eines Fremdgens
durch Insertion eines von Intron herrührenden DNA-Fragments eines
Katalasegens (CAT-1) aus einer Kastorölpflanze in eine Stelle stromaufwärts vom
Fremdgen und Expression des Fremdgens, gefördert wird. Ähnliche
Phänomene
wurden für
verschiedene von Intron herrührende
DNA-Fragmente berichtet.
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Obwohl
Introne zum Zweck der Promotion der Expression von Fremdgenen genutzt
wurden, ist die Verwendung einer Vielzahl von Intronen nicht sehr
weit verbreitet, und eine vorteilhafte Wirkung davon wurde nicht
erkannt. Obwohl zum Beispiel das erste Intron und das sechste Intron
des Gens der Mais-Alkoholdehydrogenase individuell die Genexpression
fördern,
ist die Wirkung, wenn diese Introne ligiert sind, geringer als in
dem Fall, wenn das sechste Intron allein verwendet wird (Mascarenhas
et al. Plant Mol. Biol., 15, 913-920 (1990)). In Fällen, in
denen zwei dritte Introne vom Mais-Aktin ligiert werden, ist die
Wirkung ebenso geringer als in dem Fall, in dem nur ein Intron verwendet
wird (Luehrsen et al., Mol. Gen. Genet., 225, 81-93 (1991)).
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Im
Stand der Technik sind verschiedene Verfahren zur Expression eines
Fremdgens bekannt. Mascarenhas et al. (Plant Molecular Biology,
Vol. 15, (1990), S. 913-920, „Intron-Mediated
Enhancement of Heterologous Gene Expression in Maize") offenbaren Konstrukte,
in welche die Introne 2 und 6 des Adh1-Gens aus Mais am 5'-Ende stromaufwärts von
der CAT-Kodierungsregion insertiert wurden.
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Luehrsen
et al. (Mol. Gen. Genet., Vol. 225, (1991), S. 81-93, „Intron
Enhancement of Gene Expression and the Splicing Efficiency of Introns
in Maize Cells")
offenbaren Verfahren zur Expression von humanem Serumalbumin (HSA)
unter Verwendung von Vektoren, die aus einem β-Lactoglobulin-Promotor (BLG-Promotor)
besteht, der die HSA-Expression antreibt und spezifische Subsets
von Intronen umfasst, wobei die Verwendung bestimmter spezifischer
Subsets zu einer höheren
Expression von HSA fuhrt.
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Hurwitz
et al. (Transgenic Research, Vol. 3, Nr. 6, 1. November 1994, S.
376-375) offenbaren auch eine Reihe von Expressionsvektoren, wobei
jeder aus einem BLG-Promotor besteht, der eines von vielen verschiedenen
HSA-Minigenen oder das gesamte Gen antreibt.
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Christensen
et al. (Plant Molecular Biology, Vol. 18, (1992), S. 675-689, „Maize
Polyubiquitin Genes: Structure, Thermal Perturbation of Expression
and Transcript Splicing and Promoter Activity Following Transfer Protoplasts
by Electroporation")
offenbaren die verstärkte
Expression von humaner Lactoferrin-cDNA unter Verwendung heterologer
Introne.
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Kim
et al. (Journal of Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 1, Nr.
28, 31. Januar 1995, S. 57-61) offenbaren,
dass die Expression eines rekombinanten humanen Lactoferrins in
murinen Brustepithelzellen HC11 durch Platzieren seiner cDNA unter
die Kontrolle des bovinen β-Casein-Gens
erreicht wurde. Zur Verbesserung des humanen Lactoferrin-Expressionsgrades
in einem Zellkultursystem, wurden zur Konstruktion von Expressionsvektoren
auch zwei artifizielle Introne eingeführt. Ein Intron stellte ein
Hybrid-Spleißsignal
dar, bestehend aus bovinem β-Casein-Intron
I und β-Globin-Intron
II vom Kaninchen. Das andere Intron stellte ein Intron VIII-„spanning" DNA-Fragment des
bovinen β-Casein-Gens, dar.
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EP 0 342 926 (Lubrizol Genetics,
Inc.) beschreibt eine Mais-Ubiquitin-Promotor-Region, die Hitzeschock-Konsensuselemente
umfasst und die Transkription von Genen, die unter ihre Kontrolle
platziert sind, initiiert und reguliert.
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Obwohl
die bekannten Verfahren, bei denen ein von einem Intron herrührendes
DNA-Fragment insertiert wird, wirksam sind, sind die Expressions-fördernden
Wirkungen häufig
unzureichend. Folglich ist ein Verfahren erwünscht, durch das die Genexpression
stärker
gefördert
wird.
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OFFENBARUNG
DER ERFINDUNG
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist demgemäß die Bereitstellung eines
Verfahrens zur Expression von Fremdgenen, wobei die Fremdgene stärker exprimiert
werden als durch die bekannten Verfahren, und die Bereitstellung
rekombinanter Vektoren dafür.
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Es
wurden erfindungsgemäß eingehende
Untersuchungen zur Entdeckung angestellt, dass die Expression von
Fremdgenen durch die Insertion in eine oder mehr Stelle(n) stromaufwärts vom
Fremdgen einer Vielzahl von Intron-herrührenden DNA-Fragmenten, die
gleich oder verschieden sind und zur Promotion der Expression von
Fremdgenen fähig
sind, wenn sie in eine Stelle stromaufwärts vom Fremdgen insertiert
werden, viel mehr gefördert
wird als mit den bekannten Verfahren, bei denen ein einzelnes von
einem Intron herrührendes
DNA-Fragment insertiert wird, wodurch die vorliegende Erfindung
abgeschlossen ist.
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Das
heißt,
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines
Verfahrens zur Expression eines Fremdgens, umfassend die Insertion
des Fremdgens in eine Stelle stromabwärts von einem Promotor und
Expression des Fremdgens in einer Zelle, dadurch gekennzeichnet,
dass eine Vielzahl von Intron-herrührenden DNA-Fragmenten, die
gleich oder verschieden sind und zur Promotion der Expression von Fremdgenen
fähig sind,
in eine oder mehr Stelle(n) stromaufwärts vom Fremdgen insertiert
werden und das Fremdgen exprimiert wird, worin mindestens eines
von der Vielzahl von Intron-herrührenden
DNA-Fragmenten, welche die in SEQ ID NO:1 im SEQUENZPROTOKOLL gezeigte
Sequenz oder eine funktionelle Variante davon umfasst.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist auch die Bereitstellung eines rekombinanten
Vektors, umfassend einen Promotor, ein Fremdgen, das in eine Stelle
stromabwärts
vom Promotor insertiert wird, und eine Vielzahl von Intron-herrührenden
DNA-Fragmenten, die gleich oder verschieden sind und zur Promotion
der Expression von Fremdgenen fähig
sind, die in eine oder mehr Stelle(n) stromaufwärts vom Fremdgen insertiert sind,
worin mindestens eines von der Vielzahl von Intron-herrührenden
DNA-Fragmente die
in SEQ ID NO:1 in SEQUENZPROTOKOLL gezeigte Sequenz oder eine funktionelle
Variante davon umfasst.
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Durch
den erfindungsgemäßen Gegenstand
wurden Verfahren zur Expression von Fremdgenen, durch welche die
Expression der Fremdgene viel stärker
als mit den bekannten Verfahren gefördert wird, ebenso wie rekombinante
Vektoren dafür,
bereitgestellt. Da erfindungsgemäß die Expression
von Fremdgenen, die durch genetische Manipulationsverfahren eingeführt werden,
gefördert
wird, wird erwartet, dass die vorliegende Erfindung sehr weitgehend
zum Gebiet der genetischen Manipulation beitragen wird.
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BESTE AUSFÜHRUNGSFORM
DER ERFINDUNG
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
ist gekennzeichnet durch die Insertion von zwei oder mehr von Intron-herrührenden
DNA-Fragmenten, die zur Promotion der Expression von Fremdgenen
in eine oder mehr Stelle(n) stromaufwärts von einem zu exprimierenden
Fremdgen fähig
ist, um auf diese Weise die Expression des Fremdgens zu fördern.
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Hierin
versteht man unter dem Begriff „von Intron herrührendes
DNA-Fragment mit einer Wirkung zur Promotion der Expression von
Fremdgenen" ein
DNA-Fragment, das von einem Intron herrührt, das im Vergleich zu dem
Fall, worin das Fremdgen ohne die Insertion des von Intron herrührenden
DNA-Fragments exprimiert wird, zur Promotion der Expression von
Fremdgenen bis zu einem nachweisbaren Grad fähig ist. Verschiedene solcher
von Intron herrührenden
DNA-Fragmente sind als solches bekannt. Beispiele solcher von Intron
herrührenden
DNA-Fragmente schließen
das erste Intron des Katalase-Gens (CAT-I) aus der Kastoröl-Pflanze
(Japanische offengelegte Patentanmeldung (Kokai) Nr. 3-103182; Tanaka et
al. Nucleic Acids Res. 18, 6767-6770 (1990)); das Intron von der
Mais-UDP-Glucose:Flavonol-glycosyltransferase
(Callis et al., Genes & Develop.
1, 1183-1200 (1987)); das erste Intron von Mais-Alkoholdehydrogenase-1
(Callis et al., Genes & Develop.
1, 1183-1200 (1987)); das zweite und sechste Intron der Mais-Alkoholdehydrogenase-1
(Mascarenhas et al., Plant Mol. Biol. 15, 913-920 (1990)); das erste Intron aus Mais
Shrunken-1 (Vasil et al., Plant Physiol. 91, 1575-1579 (1989));
das erste Intron des Translationselongationsfaktors EF-1-α von Arabidopsis thaliana);
und das erste Intron von Reis-Aktin (McElroy et al. Plant Cell 2,
163-171 (1990)) ein. Man sollte jedoch zur Kenntnis nehmen, dass
die von Intron herrührenden
DNA-Fragmente, die erfindungsgemäß eingesetzt
werden können,
nicht darauf beschränkt
sind, und jedwede von Intron herrührenden DNA-Fragmente, welche
die Expression von Fremdgenen stromabwärts davon fördern können, eingesetzt werden können.
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Diese
Erfinder, die zuvor Introne vom Reis-PLD-Gen durch den Vergleich
der Nukleotidsequenzen der cDNA und der genomischen DNA von Reis-Phospholipase
D-Gen (PLD-Gen) entdeckt hatten, entdeckten auch, dass eines dieser
Introne die Expression von Genen stromabwärts davon ausgeprägt förderte und
meldeten ein sich darauf beziehendes Patent an (PCT/JP96/00812).
Die Nukleotidsequenz dieses Introns wird in SEQ ID NO:1 im SEQUENZPROTOKOLL
gezeigt. Es wird erfindungsgemäß gezeigt,
dass dieses von Intron herrührende
DNA-Fragment in SEQ ID NO:1 eingesetzt werden kann. Die Intron-Sequenz
des Katalase-Gens aus der Kastorölpflanze,
die in SEQ ID NO:2 im SEQUENZPROTOKOLL gezeigt ist und die Intron-Sequenz, die
im Ubiquitin-Gen aus Mais gezeigt ist, das eine in SEQ ID NO:3 gezeigte
Nukleotidsequenz aufweist, kann weiter auch bevorzugt eingesetzt
werden.
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Es
ist im Stand der Technik überall
bekannt, dass es Fälle
gibt, bei denen die physiologische Aktivität einer physiologisch aktiven
DNA-Sequenz beibehalten wird, selbst wenn ein oder mehr Nukleotid(e)
zugefügt, insertiert,
deletiert oder substituiert wird/werden. DNA-Fragmente, die sich
erfindungsgemäß aus einer
solchen Modifikation der vorstehend beschriebenen bekannten, von
Intron herrührenden
DNA-Fragmente oder der in der in SEQ ID NO:1 gezeigten Sequenz,
die die Expression des Gens stromabwärts davon fördern, ergeben, sind im Begriff „von Intron
herrührende
DNA-Fragmente",
wie hierin verwendet, eingeschlossen. Das heißt, dass DNA-Fragmente, die
die gleichen Nukleotidsequenzen wie die vorstehend erwähnten bekannten,
von Intron herrührenden
DNA-Fragmente oder das von Intron herrührende DNA-Fragment mit der
in SEQ ID NO:1 gezeigten Nukleotidsequenz aufweisen, außer dass
ein oder mehr Nukleotid(e) zugefügt,
deletiert oder substituiert wird/werden, die die Expression eines
Genes stromabwärts
davon fördern,
auch in die erfindungsgemäßen „von Intron
herrührenden
DNA-Fragmente" eingeschlossen
werden. Hier weist ein derartig modifiziertes, von Intron herrührendes
DNA-Fragment bevorzugt eine Homologie von nicht weniger als 70 %,
bevorzugter nicht weniger als 90 %, zu dem ursprünglichen, von Intron herrührenden
DNA-Fragment auf. Auf ähnliche Weise
versteht man unter dem Begriff „funktionelle Variante", die in den Ansprüchen angegeben
wird, das DNA-Fragment, das die gleiche Nukleotidsequenz wie die
Originalsequenz aufweist, außer
dass ein oder mehr Nukleotid(e) zugefügt, deletiert oder substituiert
wird/werden, was die Expression eines Gens stromabwärts davon
fördert
und die bevorzugt eine Homologie von nicht weniger als 70 %, bevorzugter
nicht weniger als 90 % zu der der Originalsequenz aufweist. So versteht
man zum Beispiel unter dem Begriff „funktionelle Variante der
in SEQ ID NO:1 gezeigten Sequenz" das
DNA-Fragment mit der gleichen wie in SEQ ID NO:1 gezeigten Nukleotidsequenz,
außer
dass ein oder mehr Nukleotid(e) zugefügt, deletiert oder substituiert
wird/werden, was die Expression eines Gens stromabwärts davon
fördert,
und die bevorzugt eine Homologie von nicht weniger als 70 %, bevorzugter
nicht weniger als 90 % der Originalsequenz aufweist.
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Jedes
der vorstehend beschriebenen DNA-Fragmente kann durch das übliche PCR-Verfahren
leicht hergestellt werden, da die Nukleotidsequenz und die Originalquelle
davon bekannt sind. Diejenigen, die Größen von nicht länger als
ca. 200 bp aufweisen, können
ferner chemisch synthetisiert werden. Die vorstehend erwähnten modifizierten,
von Intron herrührenden
DNA-Fragmente können
durch das ortsspezifische Mutageneseverfahren oder durch die chemische
Synthese leicht hergestellt werden.
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Im
erfindungsgemäßen Verfahren
wird eine Vielzahl der vorstehend erwähnten, von Intron herrührenden
DNA-Fragmente in eine oder mehr Stelle(n) stromaufwärts vom
zu exprimierenden Fremdgen, das heißt, eine oder mehr Stelle(n)
stromaufwärts
von der Transkriptionsregion, bevorzugter in das 5'-Ende der Transkriptionsregion
insertiert werden. Die von Intron herrührenden DNA-Fragmente können bevorzugt
zwischen den Promotor und das Fremdgen insertiert werden. Die von
Intron herrührenden
DNA-Fragmente können
in eine Stelle ummittelbar stromaufwärts vom zu exprimierenden Fremdgen
insertiert werden, oder eine andere Sequenz kann zwischen dem von
Intron herrührenden
DNA-Fragment und dem Fremdgen existieren. Die Länge dieser dazwischenliegenden
Sequenz ist nicht eingeschränkt
und beträgt
gewöhnlich
0 bis 1000 bp. Der Promotor und die von Intron herrührenden DNA-Fragmente
können
direkt verbunden werden oder es kann eine andere Sequenz dort dazwischen
existieren. Die Länge
dieser dazwischenliegenden Sequenz ist nicht eingeschränkt und
beträgt
gewöhnlich
0 bis 1000 bp.
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Im
erfindungsgemäßen Verfahren
wird eine Vielzahl von bevorzugt 2 bis 5, bevorzugter 2 oder 3 der vorstehend
beschriebenen, von Intron herrührenden
DNA-Fragmente insertiert. Die zu insertierenden, von Intron herrührenden
DNA-Fragmente können
die gleiche oder eine verschiedene Nukleotidsequenz aufweisen. Die
Vielzahl der von Intron herrührenden
DNA-Fragmente können
direkt verbunden werden oder es kann eine andere dazwischenliegende
Sequenz existieren. Die Länge
dieser dazwischenliegenden Sequenz ist nicht beschränkt und
beträgt
gewöhnlich
0 bis 1000 bp.
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Als
Promotor kann jedweder Promotor, der das sich stromabwärts davon
befindende Fremdgen exprimieren kann, eingesetzt werden. Ein bevorzugtes
Beispiel des Promotors stellt der 35S-Promotor dar, obwohl der Promotor
nicht darauf beschränkt
ist.
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Es
ist erfindungsgemäß auch ein
rekombinanter Vektor bereitgestellt, auf den das vorstehend beschriebene
erfindungsgemäße Verfahren
angewendet wird. Das heißt,
dass erfindungsgemäß ein rekombinanter
Vektor bereitgestellt ist, umfassend einen Promotor, ein in eine
Stelle stromabwärts
vom Promotor insertiertes Fremdgen und eine Vielzahl von Intron-herrührenden
DNA-Fragmenten, die gleich oder verschieden sind und zur Promotion
der Expression von Fremdgenen, die in eine oder mehr Stelle(n) stromaufwärts vom Fremdgen
insertiert sind, fähig
sind. Ein derartiger Vektor kann durch Insertion der vorstehend
beschriebenen Vielzahl von Intron-herrührenden DNA-Fragmenten und
das Fremdgen in einen geeigneten Expressionsvektor, erhalten werden.
Die Insertion kann unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme
und gegebenenfalls Linkers leicht durchgeführt werden, weil die Nukleotidsequenz
der Klonierungsstelle des Expressionsvektors bekannt ist.
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Verschiedene
solcher Expressionsvektoren sind im Stand der Technik bekannt und
sind gewerblich erhältlich.
Diese Expressionsvektoren umfassen mindestens einen Replikationsstartpunkt
für die
Replikation in der Wirtszelle, einen Promotor, eine Klonierungsstelle,
die Restriktionsstellen zum Insertieren eines Fremdgens, und einen
Selektionsmarker, wie zum Beispiel einen Arzneimittel-Resistenzmarker ergibt.
Sie umfassen gewöhnlich
einen Terminator zur stabilen Terminierungstranskription und eine
SD-Sequenz in Fällen,
in denen die Wirtszelle eine Bakterienzelle darstellt. Im erfindungsgemäßen Verfahren
kann jedweder dieser bekannten Expressionsvektoren eingesetzt werden.
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Es
wurde erfindungsgemäß entdeckt,
dass selbst, wenn eine einzelne Intronsequenz aus einem Mais-Ubiquitin-Gen,
die eine in SEQ ID NO:3 im SEQUENZPROTOKOLL gezeigte Nukleotidsequenz
aufweist, in ein Fremdgen insertiert wird, die Expression des Fremdgens
gefördert
wird. Selbst in Fällen,
in denen die in SEQ ID NO:3 gezeigte Sequenz eingesetzt wird, ist
die Wirkung jedoch höher,
wenn eine Vielzahl der Sequenzen eingesetzt wird, und die Wirkung
ist besonders hoch, wenn die in SEQ ID NO:3 gezeigte Sequenz zusammen
mit der Intronsequenz vom in SEQ ID NO:1 gezeigten Reis-PLD-Gen
insertiert wird.
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BEISPIELE
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Die
Erfindung wird nun konkreter unter Bezugnahme auf Beispiele davon
beschrieben. Es sollte jedoch zur Kenntnis genommen werden, dass
die vorliegende Erfindung nicht auf die folgenden Beispiele beschränkt ist.
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BEISPIEL 1
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Im
PLD-Gen aus Reis existiert ein erstes Intron mit einer Größe von 173
bp an der Region, die der nicht kodierenden Region der mRNA (SEQ
ID NO:1, WO 95/09234) am 5'-Ende
entspricht. Das Intron wurde auf seinen Einfluss auf die Gen-Expression
in Pflanzenzellen geprüft.
Primer von 20mer (5'-TCACCACCCGGTAAGCCCAG-3', 3'-CCCCCGCGTCCATCCCGCTC-5'), von denen jeder
eine Region von aus einem Exon herrührenden 10 Nukleotiden enthält, wurden
synthetisiert, und die PCR wurde unter Verwendung eines Reis-Genomklons
als eine Matrize durchgeführt.
Die PCR wurde unter Verwendung eines Gemischs aus 50 pmol von jeweils
jedem der Primer, 200 μM
dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 1 × PCR-Puffer
(gewerblich erhältlich von
TAKARA SHUZO) und 2,5 E AmpliTaq-DNA-Polymerase (TAKARA SHUZO) durchgeführt, wobei
das Gesamtvolumen des Reaktionsgemischs 50 μl betrug. Die Reaktion wurde
gemäß den folgenden
thermischen Bedingungen durchgeführt
und der Zyklus wurde 30-mal, das heißt in einem DNA-THERMOCYCLER
(gewerblich erhältlich
von PERKIN ELMER CETUS), 1 Minute bei 94 °C, 1 Minute bei 40 °C und 2 Minuten
und 30 Sekunden bei 72 °C,
wiederholt.
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Das
PCR-Produkt wurde in einen PCR-II-Vektor (gewerblich erhältlich von
INVITROGEN) subkloniert, und es wurde ein Fragment mit EcoRI ausgeschnitten.
Das Fragment wurde stumpf gemacht („blunted") und in die SmaI-Stelle von pBI221
(ein Vektor-Plasmid) insertiert, in dem ein β-Glucuronidase-Gen (hierin nachstehend
als „GUS" bezeichnet) in eine
Stelle stromabwärts
von einem 35S-Promotor insertiert wird (hierin nachstehend als „35S-Pro" bezeichnet)), gewerblich
erhältlich
von TOYOBO CO., LTD., um einen Vektor pBI221P (35S-Pro, PLD-Intron,
GUS) zu erhalten. Dieses Plasmid wurde mit BamHI aufgeschlossen
und die sich ergebenden Fragmente wurden stumpf gemacht, gefolgt
von der Inkorporation des vorstehend beschriebenen Fragments zur
Konstruktion eines Vektors pBI221PP (35S-Pro, PLD-Intron × 2, GUS).
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Das
pIG221 (mit dem Intron (SEQ ID NO:2) des Katalase-Gens aus der Kastorölpflanze
und GUS in der erwähnten
Reihenfolge, an einer in der Japanischen offengelegten Patentanmeldung
(Kokai) Nr. 3-103182 beschriebenen
Region stromabwärts
von 35S-Pro) wurde mit XbaI aufgeschlossen und die sich ergebenden Fragmente
wurden stumpf gemacht, gefolgt von der Insertion der vorstehend
beschriebenen PLD-Intronsequenz zur Konstruktion eines Vektors pIG221P
(35S-Pro, PLD-Intron, Katalase-Intron, GUS).
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Die
kultivierten Reiszellen wurden aus dem immaturen Embryo von Japonica-Reis
der Varietät
Nihonbare (Hiei et al., The Plant Journal, 6, 271-282 (1994)) präpariert,
das vorstehend beschriebene Gen wurde gemäß einem berichteten Verfahren
in die Zellen eingeführt
(Shimamoto et al. Nature, 338, 274-276 (1989)) und die β-Glucuronidase-Aktivitäten (GUS)
wurden gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
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Wie
aus Tabelle 1 ersichtlich ist, wurde durch Einführen von zwei gleichen oder
verschiedenen Intronen die GUS-Aktivität im Vergleich zu den Fällen, in
denen ein einzelnes Intron verwendet wurde, ausgeprägt erhöht. Es wurde
auch nachgewiesen, dass das DNA-Fragment mit der Nukleotidsequenz
des PLD-Introns das DNA-Fragment darstellt, das die Genexpressions-fördernde
Wirkung ergibt, wenn zwei oder mehr der DNA-Fragmente verwendet
werden.
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BEISPIEL 2
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Das
Intron vom Mais-Ubiquitin-Gen (Ubi-1: Christensen A.H. et al. Plant
Mol. Biol., 18, 675-689 (1982)) wurde auch hinsichtlich der Wirkung
auf die Promotion der Expression von Fremdgenen untersucht. Es wurden zwei
Vektorarten verwendet.
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Zuerst
wurde ein Vektor zur Untersuchung der Wirkung des Introns, wenn
ein einzelnes Intron insertiert wird, anhand des folgenden Verfahrens
konstruiert. Das heißt,
die Region des Promotors und des Introns des Ubiquitin-Gens wurde
mit PstI ausgeschnitten und das erhaltene Fragment (SEQ ID NO:3)
wurde in die PstI-Stelle des pUC18-Vektors insertiert. Die Intron-Region
wurde mit BglII und BamHI ausgeschnitten, und das erhaltene Fragment
wurde in die BamHI-Stelle des pB1221-Vektors zum Erhalt eines Vektors
pBI221U (35S-Pro, Ubiquitin-Intron, GUS) insertiert.
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Als
Nächstes
wurde ein Vektor zur Untersuchung der Wirkung des Introns, wenn
eine Vielzahl von Intronen insertiert werden, durch das folgende
Verfahren konstruiert. Das heißt,
die Intron-Region wurde mit BglII und BamHI ausgeschnitten und das
erhaltene Fragment wurde stumpf gemacht, gefolgt von der Insertion
des sich ergebenden Fragments an der SmaI-Stelle des pBI221-Vektors.
Die BamHI-Stelle dieses Vektors wurde stumpf gemacht und das vorstehend
beschriebene PLD-Intron wurde dort hinein insertiert, um einen Vektor pBI221PU
(35S-Pro, PLD-Intron, Ubiquitin-Intron, GUS) zu erhalten. Die Vektoren
wurden durch das vorstehend erwähnte
Verfahren in die Protoplasten eingeführt und die GUS-Aktivitäten wurden
gemessen.
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Wie
in Tabelle 2 ersichtlich ist, wurde die Promotion der GUS-Expression
beobachtet, wenn ein einzelnes Ubiquitin-Intron verwendet wurde.
Eine stärkere
Promotionswirkung wurde durch Einsetzen von sowohl des PLD-Introns
als auch des Ubiquitin-Introns beobachtet, als in Fällen, in
denen die Introne individuell verwendet wurden.
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