DE60310690T2

DE60310690T2 - An der synthese von brassinosteroid beteiligtes gen

Info

Publication number: DE60310690T2
Application number: DE60310690T
Authority: DE
Inventors: Hirokazu Koumuin Syukusha Okazaki-shi Tsukaya; Gyung-Tae Kim
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2002-03-12
Filing date: 2003-03-07
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2023-03-08
Also published as: JP4064184B2; JP2003334089A; CN1643150A; DE60310690D1; EP1484403A1; CN100339479C; EP1484403A4; WO2003076626A1; EP1484403B1; US20050246797A1

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Gen, das an der Synthese von Brassinosteroid beteiligt ist, insbesondere ein neues Gen (CYP90D1, SEQ ID NO: 1), welches den letzten Schritt der Synthese von Brassinosteroid in Kombination mit dem ROT3-Gen (= CYP90C1, Nr. 51 bis Nr. 1625 von SEQ ID NO: 3) kontrolliert.
Stand der Technik
Brassinosteroide sind eine Art von Pflanzenhormonen, die ubiquitär im ganzen Pflanzenreich verbreitet sind und bei extrem niedrigen Konzentrationen in der Zellverlängerung und Zellteilung wirksam sind, wobei es sich um den generischen Namen für mehr als 40 Arten von Analoga handelt.
Aufgrund ihrer starken Wirkung auf Pflanzen konnte man davon ausgehen, dass die Verwendung von Brassinosteroiden für die landwirtschaftliche Industrie eine wichtige Rotte spielen könnte, und es wurden viele mit ihnen zusammenhängende Patente offenbart (z.B. Japanische ungeprüfte Patentveröffentlichungen 5-222090, 6-98648, 6-340689, 8-59408, 8-81310, 8-113503, 9-97).
Forschungsarbeiten über die Brassinosteroid-Biosynthese wurden mit großem Einsatz durchgeführt, wobei die zunehmende Aufklärung der Biosynthesewege (z.B. Fujioka et al., „Brassinosteroid biosynthesis and signal transduction", in: Signal Transduction of Plant Hormones, S. 180-189, Cell Technology Supplement, Plant Cell Technology Series 10, Shujunsha Co. Ltd. (1998)) vermuten lässt, dass Proteine vom Typ Cytochrom P450 die Brassinosteroid-Biosynthese in Pflanzen regulieren.
Die Erfinder haben bereits das Gen ROTUNDIFOLIA3 (ROT3), das zu einer Familie von Cytochromen P450 gehört, in Arabidopsis identifiziert (Gene & Development 12: 2381-2391 (1998)) und gezeigt, dass eine Modulation der Expression des ROT3-Gens zu morphologischen Veränderungen von Blättern und Blüten führte (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 9433-9437 (1999)).
Probleme die durch die Erfindung gelöst werden mussten
Wie vorstehend beschrieben wurden Nucleinsäuremoleküle identifiziert, die Proteine vom Typ Cytochrom P450 codieren, welche an der Brassinosteroid-Biosynthese Biosynthese beteiligt sind (veröffentlichte Japanische Übersetzung der PCT Internationalen Veröffentlichung für Patentanmeldung (WO 97135986) Nr. 2000-508524). Jedoch sind Nucleinsäuremoleküle, die früher für den Biosyntheseweg bekannt waren, an der Regulation der Schritte in einem vergleichsweise frühen Stadium der Brassinosteroid-Biosynthese beteiligt. Deshalb war es schwierig, die Wirkung der vorstehend beschriebenen Nucleinsäuremoleküle auf die Organ-spezifische Kontrolle oder auf die quantitative Regulation zu beziehen. Weiterhin waren weder die Enzymproteine noch Nucleinsäuren, welche die Proteine codieren, die den letzten Schritt der Brassinosteroid-Biosynthese regulieren, bekannt. Mit dem letzten Schritt, wie hier verwendet, ist der Schritt gemeint, mit dem Brassinolid (der nachstehend angegebenen Formel) aus Castasteron synthetisiert wird (der gesamte Syntheseweg von Brassinosteroid ist in 1 dargestellt).
Mittel und Wege zum Lösen der Probleme und genaue Beschreibung der Erfindung
Die Erfinder suchten homologe Nucleotidsequenzen zu ROT3, welches die Erfinder vorher entdeckt hatten, und fanden eine Nucleotidsequenz, die eine Identität von 51 % zu dem ROT3-Gen zeigt. Beim Untersuchen der Sequenz entdeckten die Erfinder, dass die Sequenz ein neues Gen ist (CYP90D1, SEQ ID NO: 1), welches einen Faktor codiert, der den letzten Schritt der Brassinosteroid-Biosynthese reguliert und der beim Regulieren der Größe der Pflanze physiologisch wirksam ist. Weiterhin haben die Erfinder entdeckt, dass das Gen CYP90D1 den letzten Schritt der Brassinosteroid-Biosynthese in Kombination mit dem Gen ROT3 (= CYP90C1) reguliert, wodurch sodann die vorliegende Erfindung zustande gebracht wurde.
Die vorliegende Erfindung macht es möglich, den Biosyntheseweg von physiologisch aktivem Brassinosteroid unter Verwendung von ROT3 (= CYP90C1) und CYP90D1 zu regulieren, und diese Möglichkeit der Regulation ist die einzigartige Tatsache, welcher die Erfindung von früheren Entdeckungen unterscheidet.
Mit anderen Worten ist die Expression von ROT3 (= CYP90C1) alleine in einer ganzen Pflanze nur an Blättern und Blütenorganen wirksam, insbesondere ist sie auf die Längsrichtung wirksam. Blütenorgane stammen von deformierten Blättern ab, wobei es bei ihnen in der morphologischen Regulation durch Gene gemeinsame Wege gibt. Andererseits ist die Kombination von ROT3 (= CYP90C1) und CYP90D1 an einer ganzen Pflanze wirksam. Durch Manipulieren von Nucleinsäuremolekülen von ROT3 (= CYP90C1) und CYP90D1 und Proteinen, die durch diese Gene codiert sind, kann die Form von Blättern und Blüten nach Belieben und gleichzeitig verändert werden, und außerdem kann lediglich die Form von Blüten verändert werden, ohne dass der Großteil der Höhe von Pflanzen und der Form von Blättern verändert wird.
Das heißt, dass die vorliegende Erfindung ein Polynucleotid darstellt, das die Nucleotidsequenz von (1) oder (2) oder die von (3) oder (4) aufweist:

(1) Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1;
(2) Nucleotidsequenzen, die eines der folgenden Proteine codieren,
(a) ein Protein, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist;
(b) ein Protein, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist, in der eine Aminosäure deletiert, substituiert oder angefügt ist, und dessen Expression die Brassinosteroid-Biosynthese stimuliert;
(3) Nucleotidsequenz von Nr. 51 bis Nr. 1625 von SEQ ID NO: 3;
(4) Nucleotidsequenz, die eines der folgenden Proteine codiert,
(c) ein Protein, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 aufweist;
(d) ein Protein, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 aufweist, in der eine oder einige Aminosäuren deletiert, substituiert oder angefügt sind, und dessen Expression die Brassinosteroid-Biosynthese stimuliert.

Außerdem stellt die vorliegende Erfindung ein Polynucleotid dar, umfassend einen Promotor und das Polynucleotid, in dem die beiden vorstehend beschriebenen Nucleotidsequenzen an den Promotor in Vorwärtsrichtung gebunden sind; oder ein Polynucleotid, umfassend einen Promotor und das Polynucleotid, in dem mindestens eine Nucleotidsequenz der vorstehend beschriebenen Nucleotide an den vorstehend beschriebenen Promotor in umgekehrter Richtung gebunden ist.
Der hier verwendete Promotor wird später genau beschrieben und schließt den Blumenkohlmosiakvirus-35S-Promotor, Hitzeschockpromotor, chemisch-induzierbare Promotoren und andere ein. Das Koppeln kann unter geeigneter Verwendung herkömmlicher Verfahren der Gentechnik durchgeführt werden.
Ferner stellt die vorliegende Erfindung ein Plasmid dar, das die vorstehend beschriebenen Polynucleotide enthält, und sie stellt außerdem eine Pflanze dar, die mit den vorstehend beschriebenen Polynucleotiden transformiert ist.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung ein Plasmid dar, welches das vorstehend beschriebene Polynucleotid enthält. Die hier verwendeten Plasmide schließen solche binären Vektoren, wie pBl-121-Plasmid, Ti-Plasmid und andere, ein.
Außerdem umfassen die Pflanzen, die für die vorliegende Erfindung eingesetzt werden können, einen ganzen Spermatophyten.
Zum Transformieren solcher Pflanzen wurde das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung in das vorstehend beschriebene Plasmid eingefügt, mit welchem die vorstehend beschriebenen Pflanzen unter Verwendung herkömmlicher Verfahren der Gentechnik transformiert werden können.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Verändern der Morphologie einer Pflanze dar, umfassend die Schritte des Transformierens einer Pflanze durch das Polynucleotid und des Verstärkens oder Unterdrückens der Expression des vorstehend beschriebenen Polynucleotids. Ferner stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Verändern der Morphologie einer Pflanze dar, die durch ein beliebiges der vorstehend beschriebenen Polynucleotide transformiert ist, umfassend den Schritt des Stimulierens des verantwortlichen Promotors in der transformierten Pflanze. Und außerdem stellt die vorliegende Erfindung die Pflanze mit einer Morphologie dar, die durch ein beliebiges der vorstehend beschriebenen Verfahren verändert ist.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung ein Gemisch oder einen Komplex aus einem Protein des folgenden (a) oder (b) und einem Protein des folgenden (c) oder (d) dar:

(a) ein Protein, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist;
(b) ein Protein, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist, in der eine Aminosäure deletiert, substituiert oder angefügt ist, und dessen Expression die Brassinosteroid-Biosynthese stimuliert;
(c) ein Protein, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 aufweist;
(d) ein Protein, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 aufweist, in der eine Aminosäure deletiert, substituiert oder angefügt ist, und dessen Expression die Brassinosteroid-Biosynthese stimuliert.

Es ist möglich, Nucleinsäuremoleküle von CYP90D1 und ROT3 (= CYP90C1) und Proteine, die durch diese codiert werden, unter Verwendung der folgenden Verfahren zu manipulieren:

(1) Das Verfahren umfasst die Schritte des Koppelns eines manipulierbaren Promotors mit DNA-Molekülen von CYP90D1 (SEQ ID NO: 1) und ROT3 (= CYP90C1, Nr. 51 bis Nr. 1625 von SEQ ID NO: 3), des Transduzierens dieser in eine Pflanze anhand eines geeigneten herkömmlichen Verfahrens, wie Ti-Plasmid, und des Erteilens einer externen Stimulation an den Promotor, um die Expression der vorstehend beschriebenen Gene zu regulieren. Die Beispiele der Promotoren, die hier verwendet werden können, sind wie folgt: ein 35S-Promotor (ermöglicht eine konstitutive Expression); ein Hitzeschock-Promotor (ermöglicht eine Temperatur-abhängige Expression); ein Dex-induzierbarer Promotor (ermöglicht eine Expression durch Exposition gegenüber Dexamethason); ein CHS-A-Promotor von Petunia (Kronblatt-spezifische Expression in Pflanzen mit gefärbten Kronblättern und Zucker-abhängige Expression, die nicht für Kronblatt, sondern für Blattknospe spezifisch ist, in Arabidopsis. Zusätzlich zu diesen Promotoren können andere herkömmliche Promotoren für Pflanzen verwendet werden.
(2) Ein Verfahren zum Unterdrücken der Funktion von ROT3 oder CYP90D1: Es ist möglich, Funktionen eines spezifischen Gens durch ein Antisense-RNA-Verfahren (ein Verfahren zum Transduzieren eines veränderten Gens, wobei es in umgekehrter Richtung transkribiert werden soll) oder durch ein RNAi-Verfahren (ein Verfahren zum Transduzieren eines veränderten Gens, wobei ein Teil eines Gens in Tandemanordnung vorwärts und rückwärts ligiert und ganz transkribiert werden soll) zu unterdrücken. Das vorstehend beschriebene Verfahren kann angewendet werden, um die genetischen Expression zu unterdrücken. Da die Zielgene CYP90D1 (SEQ ID NO: 1) und ROT3 (= CYP90C1, Nr. 51 bis Nr. 1625 von SEQ ID NO: 3) sind, die aufgeklärt sind, ist eine gezielte Unterdrückung ihrer Expression möglich.
(3) Ein Kombinationsverfahren: Die Voraussetzung ist, dass einzeln veränderte Stämme von CYP90D1 und ROT3 (= CYP90C1, Nr. 51 bis Nr. 1625 von SEQ ID NO: 3) unabhängig voneinander hergestellt werden, und anschließend sind zwei Verfahren möglich: entweder das Kreuzen untereinander durch klassische Genetik oder eine direkte Transduktion von beiden veränderten Genen, wodurch doppelt veränderte Stämme entstehen sollten.
(4) Ein Verfahren der Vorläufer-Fermentation: Es gibt erfolgreiche Beispiele für mindestens einen Teil von für die Brassinosteroid-Biosynthese verantwortlichen Genen, die eine enzymatische Aktivität zeigen, wenn diese Gene in Hefezellen exprimiert werden. Unter Verwendung der Verfahren dieser Beispiele und unter Bereitstellung geeigneter Vorläufer ist es möglich, Castasteron oder Brassinolid (das End- und aktive Produkt) in Hefezellen oder in eukaryotischen Zellen künstlich zu synthetisieren, wobei eine Kombination von ROT3 und CYP90D1 oder eines der vorstehend beschriebenen Gene exprimiert wird.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt den gesamten Weg der Brassinosteroid-Biosynthese.
2 zeigt die Morphologie von Blättern von Wildtyp (Ws-2) (Nr. 1), eines Stamms von Bezugsbeispiel 1 (Unterdrückung der Funktion von ROT3) (Nr. 2), eines Stamms von Bezugsbeispiel 2 (Unterdrückung der Funktion von sowohl ROT3 als auch CYP90D1) (Nr. 3 und 4) von Arabidopsis, die unter den gleichen Bedingungen gezüch tet wurden. Nr. 3 und Nr. 4 zeigen einen teilweise effektiven bzw. einen sehr effektiven Stamm.
3 zeigt die Morphologie von Blättern von Stämmen ohne Funktion von ROT3 und CYP90D1 nach der Behandlung mit Zwischenprodukten der Brassinosteroid-Synthese und Brassinolid. Kontrolle: keine Behandlung; 6-D-CT: behandelt mit (nachstehend das gleiche) 6-Deoxocathasteron; 6-D-TE: 6-Deoxoteasteron; 6-D-3DT: 3-Dehydro-6-deoxoteasteron; 6-D-TY: 6-Deoxotyphasterol; 6-D-CS: 6-Deoxocastasteron; CT: Cathasteron; TE: Teasteron; 3DT: 3-Dehydroteasteron; TY: Typhasterol; CS: Castasteron; BL: Brassinolid.
Effekte der Erfindung:
In der Praxis zeigen frühere Erfindungen über die Regulation von Schritten im Biosyntheseweg von Steroidverbindungen, die eine bestimmte physiologische Aktivität in Pflanzen besitzen, verschiedene Mängel.
So ist der früher aufgeklärte regulatorische Faktor der Brassinosteroid-Biosynthese an den frühen Schritten des Biosynthesewegs beteiligt, und eine gesteigerte Expression des Faktors in transgenen Pflanzen führt zu einem spindeldürren Wachstum der ganzen Pflanze und vergrößert die Pflanze. Deshalb hat der vorstehend beschriebene regulatorische Faktor keinen praktischen Nutzen, außer einer gelegentlichen Anwendung. Wenn man andererseits einen Biosyntheseweg in einer transgenen Pflanze stoppte, führte das zu einer Verkleinerung der ganzen Pflanze, und dies hat wieder keinen praktischen Nutzen, außer einer gelegentlichen Anwendung. Mit anderen Worten verändern herkömmliche Verfahren die gesamte Form einer Pflanze, wobei dies praktisch keinen Wert hat. Praktisch einsetzbare und nützliche transgene Pflanzen werden durch die folgenden Beispiele gezeigt: Im Gartenbau soll nur die Größe der Blütenorgane groß oder nur die Größe der Blätter klein sein, oder zur Verbesserung von Gemüsepflanzen soll nur die Größe von Blättern groß sein. Deshalb hat man bei herkömmlichen Verfahren Schwierigkeiten, wenn man sie für das Biodesign von Pflanzen verwenden will und sie nicht mit einem speziellen Expressions-Regulationssystem kombiniert. Im Gegensatz hierzu wird es gemäß der Erfindung möglich gemacht, unter Verwendung der Kombination von ROT3 (= CYP90C1) mit CYP90D1 die Größe eines spezifischen Organs in einer spezifischen Richtung (insbesondere in Längsrichtung) und die ganze Größe einer Pflanze zu kontrollieren.
Weiterhin wurde durch die vorliegende Erfindung aufgeklärt, dass ROT3 (= CYP90C1) und CYP90D1 gemeinsam den letzten Schritt der Brassinosteroid-Biosynthese kontrollieren. Deshalb könnte die Erfindung für verschiedene industrielle Anwendungen eingesetzt werden, die zur chemischen Synthese von Brassinosteroid dienen.
Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung, sie sollen jedoch in keiner Weise den Umfang der Erfindung einschränken.
Herstellungsbeispiel 1
Die Erfinder verwendeten die rot3-1-Null-Mutante von Arabidopsis (Tsuge et al., Development 122: 1589-1600 (1996)), eine funktionelle Defektmutante von ROT3, als den Stamm, bei dem die Funktion von ROT3 ausgeschaltet war. Die mutierte Zelllinie wurde unter sterilen Bedingungen ausgesät und bei 23°C unter dauernder Belichtung gezüchtet.
Herstellungsbeispiel 2
Um den Stamm zu bekommen, bei dem die Funktion sowohl von ROT3 als auch von CYP90D1 ausgeschaltet war, haben die Erfinder zuerst cDNA von CYP90D1 aus Arabidopsis unter Verwendung eines Primersatzes,
ROT3h-cDNA-for: 5'-GTTAAAACACTAATGGACAC-3'(SEQ ID NO: 5);
ROT3h-cDNA-rev: 6'-TGATTTATATTCTTTTGATCC-3'(SEQ ID NO: 6),
isoliert, durch den spezifisch das ROT3-Homologon (CYP90D1) amplifiziert werden konnte. Danach wurde der vorstehend beschriebene CYP90D1-Clon (SEQ ID NO: 1) in den Vielzweck-Vektor pBl121 so eingefügt, dass er in umgekehrter Richtung vom 35S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus aus transkribiert wurde, wobei das Hygromycin-Resistenz-Gen als Selektionsmarker eingefügt und eine GUS-Protein-codierende Region entfernt wurde. Das Konstrukt wurde in Agrobacterium (C58C1 Rif-resistent) transduziert und in Arabidopsis rot3-1 durch ein in-planta-Verfahren eingeführt, wobei ein herkömmlicher Weg mit Suspensionskulturmedium von Agrobacterium verwendet wurde. Nachdem die Transformanten durch Hygromycin selektiert worden waren, wurden Transformanten mit homozygoten eingefügten Genen durch Selbstbestäubung isoliert. Danach wurde der Stamm unter sterilen Bedingungen ausgesät und bei 23°C unter dauernder Belichtung gezüchtet.
Beispiel 1
2 zeigt die Morphologie von Blättern von Wildtyp-Arten (Ws-2) (Nr. 1), von einem Stamm von Bezugsbeispiel 1 (Unterdrückung der Funktion von ROT3) (Nr. 2) und von einem Stamm von Bezugsbeispiel 2 (Unterdrückung der Funktion von sowohl ROT3 als auch CYP90D1) (Nr. 3 und 4) von Arabidopsis, die unter den gleichen Bedingungen gezüchtet wurden. Während die Blätter des Stamms mit der unterdrückten Funktion von ROT3 (2–2) im Vergleich zu denen des Wildtyps (2–1) in Längsrichtung kürzer sind, sind die Blätter des Stamms mit der unterdrückten Funktion von sowohl ROT3 als auch CYP90D1 (2–3 und 4) noch kürzer als diejenigen der vor stehenden Stämme. Kurz gesagt sind ROT3 und CYP90D1 Gene, die gemeinsam an dem Biosyntheseweg von Brassinosteroid beteiligt sind.
Beispiel 2
Der in Bezugsbeispiel 2 hergestellte Stamm mit unterdrückter Funktion von sowohl ROT3 als auch CYP90D1 wurde aus Samen unter sterilen Bedingungen gezüchtet. Die Samen des vorstehend beschriebenen Stamms wurden auf dem MS-Medium (verfestigt durch 0,2 % Gelrite), angereichert mit 2 % (Gew./Vol.) Saccharose, ausgesät und herkömmlich bei 23°C unter dauernder Belichtung nach dem Aussäen unter sterilen Bedingungen gezüchtet.
Andererseits wurden wässrige Lösungen (0,1 μM) von Zwischenprodukten der Brassinosteroid-Biosynthese zubereitet (z.B. 6-D-CT: 6-Deoxocathasteron; 6-D-TE: 6-Deoxoteasteron; 6-D-3DT: 3-Dehydro-6-deoxoteasteron; 6-D-TY: 6-Deoxotyphasterol; 6-D-CS: 6-Deoxocastasteron; CT: Cathasteron; TE: Teasteron; 3DT: 3-Dehydroteasteron; TY: Typhasterol; CS: Castasteron) und Brassinolid (BL) (BL wurde von WAKO Pharmaceutical Co. bezogen (hergestellt durch FujiKagaku Industry, Co.), und andere Brassinosteroide waren Geschenke von Dr. Shouzou Jujioka, RIKEN und Dr. Tohide Takatsu, Jouetsu University of Education).
Die vorstehend beschriebenen Pflanzen (Stämme mit unterdrückter Funktion von sowohl ROT3 als auch CYP90D1) wurden in der vorstehend beschriebenen wässrigen Lösung, als Submerskultur in der Lösung, unter vorsichtigem Schütteln gezüchtet. Im Fall der Behandlung von Blättern mit den vorstehend beschriebenen Zwischenprodukten oder Brassinolid wurden Blattstiele mit einem chirurgischen Messer ausgeschnitten, nachdem die Pflanzen unter sterilen Bedingungen entnommen worden waren, und in gleicher Weise behandelt. 3 zeigt die Fotos dieser Blätter.
Wie in 3 dargestellt ist, war jedes Brassinosteroid-Zwischenprodukt bei Pflanzen ohne die Funktion von ROT3 und CYP90D1 nicht wirksam, jedoch induzierte Brassinolid (BL), das Endprodukt, eine große Größe von Blättern und zeigte deutliche Effekte. Das heißt, dass ROT3 und CYP90D1 gemeinsam an der Synthese von Brassinolid, dem Endprodukt des Biosynthesewegs von Brassinosteroiden, beteiligt sind.
Beispiel 3
Die Konzentrationen von Brassinosteroiden wurden in Wildstämmen (Ws-2), in dem Stamm von Bezugsbeispiel 1 (rot3-1 und rot3-5, unterdrückte Funktion von ROT3) und in dem Stamm von Bezugsbeispiel 3 (rot3/CYP90D1, unterdrückte Funktion von ROT3 und CYP90D1) von Arabidopsis bestimmt. Die Konzentration wurde bestimmt, indem jeweils der am Boden befindliche Teil („ground part") der Pflanzen zum Zeitpunkt der Rosettenbildung durch Abschneiden geerntet wurde, dieser sodann eingefroren und getrocknet wurde und ein Nachweis unter Verwendung von HPLC und GC-MS durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1
Anmerkung: (-) in der Tabelle gibt an, dass der Wert unter der Nachweisgrenze liegt (0,001 ng/g).
Wie in der Tabelle gezeigt wird, nahm in dem Stamm (rot3-1 und rot3-5) mit dem unterdrückten ROT3 die Produktion von Brassinolid deutlich ab, und als Folge hiervon stieg die Produktion von Brassinosteroiden im vorangehenden Stadium (insbesondere Castasteron) an. Jedoch blockierte die Unterdrückung von ROT3 die Produktion von Brassinolid nicht vollständig. Mit anderen Worten reguliert ROT3 selbst nicht vollständig die Biosynthese von Brassinolid.
Andererseits nahm in dem Stamm (rot3/CYP90D1) mit unterdrückter Funktion von sowohl ROT3 als auch CYP90D1 die Menge von Brassinolid unter den Zwischenprodukten der Brassinosteroid-Biosynthese extrem ab, dies zeigt, dass der Syntheseweg von Brassinolid aus Castasteron durch die gleichzeitige Unterdrückung von sowohl ROT3 als auch CYP90D1 vollständig blockiert wird. Mit anderen Worten wird die Produktion von Brassinolid durch die kombinierte Wirkung von ROT3 und CYP90D1 vollständig reguliert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polynucleotid, das die Nucleotidsequenz von (1) oder (2) und diejenige von (3) oder (4) aufweist: (1) Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1. (2) Nucleotidsequenzen, die eines der folgenden Proteine codieren, (a) ein Protein, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist; (b) ein Protein, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist, in der eine Aminosäure deletiert, substituiert oder angefügt ist, und dessen Expression die Brassinosteroid-Biosynthese stimuliert. (3) Nucleotidsequenz von Nr. 51 bis Nr. 1625 von SEQ ID NO: 3. (4) Nucleotidsequenz, die eines der folgenden Proteine codiert, (c) ein Protein, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 aufweist; (d) ein Protein, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 aufweist, in der eine Aminosäure deletiert, substituiert oder angefügt ist, und dessen Expression die Brassinosteroid-Biosynthese stimuliert.
Polynucleotid, umfassend einen Promotor und das Polynucleotid nach Anspruch 1, in dem die beiden Nucleotidsequenzen an den Promotor in Vorwärtsrichtung gebunden sind.
Polynucleotid, umfassend einen Promotor und das Polynucleotid nach Anspruch 1, in dem mindestens eine der Nucleotidsequenzen an den Promotor in umgekehrter Richtung gebunden ist.
Plasmid, umfassend das Polynucleotid nach einem der vorangehenden Ansprüche.
Pflanze, die durch das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 transformiert ist.
Verfahren zum Verändern der Morphologie einer Pflanze, umfassend die Schritte des Transformierens einer Pflanze durch das Polynucleotid nach Anspruch 1 und des Förderns oder Unterdrückens der Expression des Polynucleotids.
Verfahren zum Verändern der Morphologie einer Pflanze, bei dem die Pflanze durch das Polynucleotid nach Anspruch 2 oder 3 transformiert wird, wobei das Verfahren das Stimulieren des Promotors des Polynucleotids umfasst.
Pflanze mit einer durch das Verfahren nach Anspruch 6 oder 7 veränderten Morphologie.
Gemisch oder Komplex aus einem Protein des folgenden (a) oder (b) und einem Protein des folgenden (c) oder (d): (a) ein Protein, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist; (b) ein Protein, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist, in der eine Aminosäure deletiert, substituiert oder angefügt ist, und dessen Expression die Brassinosteroid-Biosynthese stimuliert; (c) ein Protein, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 aufweist; (d) ein Protein, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 aufweist, in der eine Aminosäure deletiert, substituiert oder angefügt ist, und dessen Expression die Biosynthese von Brassinosteroid stimuliert.