DE68925258T2 - Transgene pflanze mit veränderter physiologie, morphologie und hormonstoffwechsel gewebekulturen dieser pflanze sowie verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents
Transgene pflanze mit veränderter physiologie, morphologie und hormonstoffwechsel gewebekulturen dieser pflanze sowie verfahren zu ihrer herstellungInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft transgene Pflanzen oder transgene Organe von Pflanzen mit veränderter Physiologie, Morphologie und verändertem Hormonmetabolismus, ein Verfahren zur Herstellung dieser Pflanzen und Organe und Gewebekulturen, die Zellen oder Organe dieser Pflanzen oder Zellen der Pflanzenorgane enthalten. Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung der transgenen Pflanze oder des Organs oder der Gewebekulturen davon zur Herstellung sekundärer Pflanzenprodukte.
- Bei der Entstehung von Pflanzenkrankheiten, die durch Bakterien verursacht sind, spielt in der Wechselwirkung zwischen der Pflanze und den Bakterien häufig die Hormonbiosynthese eine wichtige Rolle. Ein Beispiel ist Agrobacterium tumefaciens, das auslösende Agens der Wurzelhalsgallen-Krankheit. Diese Pflanzenkrankheit wird durch eine veränderte Hormonbiosynthese in den infizierten Pflanzenzellen verursacht. Die Pflanzenzellen werden während des Infektionsvorganges transformiert. Dies wird durch die Insertion eines DNA-Fragmentes, der "T-DNA", in das Genom der Pflanzenzelle und die anschließende Expression der in der T-DNA enthaltenen genetischen Information ausgelöst. Auf diese Weise wird der Hormonmetabolismus der Pflanzenzelle verändert und ein unkontrol liertes Tumorwachstum hervorgerufen.
- Auch bei der Pathogenese der hr("hairy-root")-Krankheit ist das erste Ereignis eine Transformation einzelner Zellen der Pflanze. Die hr-Krankheit wird durch DNA-Pragmente der Ri- Plasmde von Agrobacterium rhizogenes verursacht, die in das Genom der befallenen Pflanzenzelle eingebaut sind. Die durch Agrobacterium tumefaciens verursachten Wurzelhalsgallen sind chimäre Gewebe, denn die Biosynthese der durch die T-DNA-Genprodukte hergestellten Auxine (IAA) und Cytokinine (IPT) fördert sowohl das Wachstum der transformierten als auch das der benachbarten nicht-transformierten Zellen. Im Gegensatz dazu bestehen die durch Agrobacterium rhizogenes an der Stelle der Infektion hervorgerufenen Wurzeln nur aus transformierten Zellen. Demgemäß wurde vermutet, daß die Produkte der rol-Gene, die in der DNA des Ri-Plasmids enthalten und in das Planzengenom eingebaut sind, hauptsächlich, wenn nicht ausschließlich, in den transformierten Zellen wirken. Somit wurde angenommen, daß diese Gene nicht direkt an der Synthese transportabler Wachstumsfaktoren beteiligt sind.
- Vier rol-Gene sind bekannt, d.h. das rolA-, rolB-, rolC- und rold-Gen. Die rolA-, rolB- und rolC-Loci oder -Gene entsprechen den offenen Leserastern 10, 11 und 12 der TL-DNA des Ri-Plasmids. Eine ausführlichere Beschreibung der Loci findet sich in Spena et al., EMBO J. 6 (1987), 3891. Die Sequenz der TL-DNA von Agrobacterium rhizogenes wurde von Slightom et al., J. Biol. Chem. 261 (1986), 108, veröffentlicht. Der binäre Vektor pPCV002 wurde von Koncz und Schell in Mol. Gen. Genet. 204 (1986), 383, beschrieben.
- Das hr-Syndrom tritt in Pflanzen auf, die von Ri-transformierten Wurzeln regeneriert wurden. Charakteristische Merkmale dieses Syndroms sind eine zusätzliche Wurzelbildung, eine hohe Wachstumsgeschwindigkeit von in hormonfreien Kulturmedien ausgepflanzten Wurzelstücken, eine verminderte apikale Dominanz sqwohl in den Stielen als auch in den Wurzeln, eine veränderte Blatt- und Blütenmorphologie, ein plagiotropes Wurzelwachstum (d.h. mit verändertem Geotropismus) und eine verminderte Fertilität. Die Entstehung des vollständig entwickelten hr-Syndroms steht mit der Expression der rolA-, rolB- und rolC-Loci oder -Gene in Zusammenhang, wobei deren Genprodukte synergtstisch auf die Induktion der Wurzelbildung wirken, Spena et al., a.a.O..
- Spena et al. beschreiben jedoch lediglich die Wirkung, die alle drei Loci, die einzelnen Loci oder weitere Kombinationeri der Loci untereinander auf die Induktion der Wurzelbildung an der Infektionsstelle von infizierten Kalanchoe- oder Tabakpflanzen ausüben. Spena et al. haben dagegen nicht spezielle biologische Effekte des rolA-, rolB- oder rolC-Locus oder spezifischer Kombinationen dieser Loci auf ganze transgene Pflanzen beschrieben, in denen jede Zelle und nicht nur die an der Stelle der Infektion vorliegende Zelle diese Loci oder Kombinationen dieser Loci enthält. Auch wurde bisher noch nicht in ganzen transgenen Pflanzen untersucht, welche Wirkung die Modifikation von Promotoren bei Verwendung einzelner rol- Gene oder einer Kombination von mehr als einem rol-Gen ausübt.
- Oono et al., Jpn. J. Genet. 62 (1987), 501, beschreiben transgene Tabakpflanzen, die ein rolC-Gen unter der Kontrolle seines natürlichen Promotors enthalten und die deshalb im Vergleich zu den Wildtyp-Pflanzen eine geringere Höhe zeigen.
- Im Bereich der Zierpflanzen besteht eine große Nachfrage nach Pflanzen mit deutlichem Zwergwuchs, nach Pflanzen, deren Blütezeit gesteuert werden kann, und nach Pflanzen, die sich lange üalten, auch wenn sie in Blumenvasen stecken, d.h. bei denen es länger dauert, bis der Alterungsprozess eintritt. Außerdem besteht ein Bedarf an Pflanzen mit einem verbesserten Wurzelsystem, die auch unter schwierigen Standortbedingungen gut wachsen. Solche physiologischen und morphologischen Eigenschaften wurden bisher nur erreicht, indem man die Pflanzen mit Chemikalien behandelte.
- Pflanzen mit einem deutlichen Zwergwuchs sind für die Kultivierung in Gewächshäusern von besonderem Interesse. Bisher bestand das Verfahren, das verwendet wurde, um solche Pflanzenmorphologien zu erhalten, abgesehen vom Einsatz chemischer Wirkstoffe im wesentlichen darin, das Pflanzenwachstum physikalisch zu beeinträchtigen.
- Pflanzen, die als Zuchtpflanzen geeignet sind und die erwähnten gewünschten Eigenschaften aufweisen, standen bisher nur in oegrenztem Ausmaß zur Verfügung.
- Bei der Selektion neu gezüchteter Pflanzen kann ein spezielles Problem daraus entstehen, daß beide an der Kreuzung beteiffligten Pflanzen fertil sind.
- Ferner werden Pflanzengewebekulturen für die Herstellung sekundärer Pflanzenprodukte verwendet. Die dabei erzielten Erträge sind jedoch nicht befriedigend.
- Folglich besteht das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Problem darin, Pflanzen und Pflanzenorgane bereitzustellen, die veränderte physiologische und morphologische Eigenschaften aufweisen, und diese für die Züchtung neuer Pflanzen urd die Herstellung bevorzugter Gewebekulturen zu verwenden. Außerdem besteht das der Erfindung zugrundeliegende technische Problem in der Bereitstellung von Verfahren für die Herstellung solcher Pflanzen und Organe.
- Das vorstehend erwähnte Problem wird durch die Ausführungsformen gelöst, die in den Patentansprüchen gekennzeichnet sind.
- Transgene Pflanzen und Pflanzenorgane mit veränderter Physiologie, Morphologie und verändertem Hormonmetabolismus können in ihrem Genom folgendes enthalten:
- a) den codierenden Bereich des rolA-Gens, rolB-Gens, rolC- Gens, rolA- und rolC-Gens, rolB- und rolC-Gens oder rolA-und rolB-Gens der TL-DNA des Ri-Plasmids von Agrobacterium rhizogenes und/oder den codierenden Bereich des IPT (Isopentenyladenosin-Transferase)-Gens der T-DNA des Ti- Plasmids von Agrobacterium tumefaciens, wobei der (die) codierende(n) Bereich(e) unter der Kontrolle seines/ihrer natürlichen oder eines heterologen Promotors (Promotoren) steht (stehen), mit Ausnahme des codierenden Bereiches des rolC-Gens, der, sofern er nicht in Kombination mit einem anderen codierenden Bereich im Genom enthalten ist, unter der Kontrolle eines heterologen Promotors steht; und
- b) gegebenenfalls außerdem ein Gen eines selektierbaren Markers;
- wobei die codierenden Bereiche und das Markergen exprimiert werden.
- Die Erfindung geht im wesentlichen auf die Entdeckung neuer Wirkungen der rolA-, rolB- und rolC-Gene in transgenen Pflanzen und Organen zurück. Diese Wirkungen umfassen die folgenden Punkte:
- a) die voneinander unabhängige Expression der rol-Gene in t:ransgenen Pflanzen und Organen führt zu spezifischen und unterscheidbaren morphologischen Veränderungen, die nahelegen, daß diese Gene verschiedene biologische oder bio- chemische Ziele haben;
- b) die Experession chimärer Gene, in denen die Expression des codierenden Bereiches des rolB- oder rolC-Gens durch den CaMV ("Cauliflower Mosaic Virus")-35S-Promotor kontrolliert wird, führt in den transgenen Pflanzen und Organen zu neuen morphologischen Veränderungen;
- c) durch rol-Gen hervorgerufene Wurzeln sind immer transformiert; und
- d) bestes Wurzelwachstum in in vitro-Kulturen wird erreicht, indem man das rolC-Gen mit dem rolB-Gen oder mit dem rolA-Gen kombiniert, oder durch eine gesteigerte Expression des rolC-Gens.
- Die Ergebnisse der vorliegenden Erfindung zeigen, daß die rol-Genprodukte entweder verschiedene biochemische Ziele haben oder einen unterschiedlichen Einfluß auf das gleiche Ziel ausüben, das bei der Kontrolle der Pflanzen- und Organentwicklung eine Rolle spielt. Außerdem zeigen die Ergebnisse, daß die Kontrolle der Expression dieser Gene bei der Entstehung der morphologischen Veränderungen in den transgenen Pflanzen und Organen eine entscheidende Rolle spielt. Jedes dieser drei rol-Gene ist selbst befähigt, die Wurzelbildung z.B. beim Tabak hervorzurufen. Eine größere Zahl von Wurzeln und ein gesteigertes Wurzelwachstum wird jedoch durch die Aktivität von mehr als einem einzigen rol-Gen erreicht.
- Die erfindungsgemäßen Pflanzen zeigen nicht das vollständige hr-Syndrom, das durch eine kombinierte Expression der codierenden Bereiche des rolA-, rolB- und rolC-Gens verursacht wird. Sie weisen nur ausgewählte, erwünschte Merkmale auf und zeigen durch Modifikation der Genregulation neue und/oder verbesserte phänotypische Merkmale.
- Die transgenen Pflanzen der Erfindung weisen einen deutlichen Zwergwuchs, eine veränderte Blütezeit, verzögerte Alterung und ein verändertes Wurzelsystem mit z.B. plagiotropem Wurzelwachstum (wachsen nahe unter der Oberfläche) auf. Sie zeigen Veränderungen in der Fertilität, der Zahl der Blüten und/oder der Größe der Blüten. Um diese Eigenschaften der transgenen Pflanzen zu erhalten, wird der vorstehend erwähnte codieiende Bereich des rolC-Gens eingesetzt.
- Die Organe solcher Pflanzen, die entweder aus den Pflanzen erhalten werden können oder die getrennt hergestellt werden, weisen die entsprechenden Eigenschaften der Pflanzen auf.
- Die erfindungsgemäßen Pflanzen mit gesteigertem und/oder verändertem Wurzelwachstum haben unter schwierigen Wachstumsbedingungen, die in der Natur auftreten, einen Selektionsvorteil gegenüber den vielen in der Natur vorkommenden Pflanzen.
- In einer bevorzugten Ausführungsform ist der heterologe Promotor der HSP ("Heat Shock Promotor")-70-Promotor von Drosophila melanogaster. Der HSP-70-Promotor von Drosophila melanogaster wird in Spena et al., EMBO J. 4 (1985), 2739, beschrieben.
- In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der heterologe Promotor ein starker konstitutiver Promotor.
- In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der starke konstitutive Promotor der CaMV35S-Promotor.
- In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die transgene Pflanze oder das Organ in ihrem (seinem) Genom den codierenden Bereich des rolC-Gens der TL-DNA des Ri-Plasmids von Agrobacterium rhizogenes, der unter der Kontrolle eines starken konstitutiven Promotors steht, vorzugsweise unter der Kontrolle des CaMV35S-Promotors. Wenn der CaMV35S-Promotor für die Kontrolle des rolC-Gens eingesetzt wird, sind die entsprechenden transgenen Pflanzen dominant männlich-steril, weiblich-fertil und zeigen eine verlängerte Lebensdauer oder verzögerte Alterung.
- Mit Hilfe eines dominanten Gens, das den Pflanzen männliche Sterilität verleiht, können Hybridsamen wirtschaftlicher hergestellt werden. Auch wenn die weibliche Fertilität leicht vermindert sein sollte, ist der Pflanzenzüchter trotzdem in der Lage, Hybridsamen in ausreichend großer Menge herzustellen, um die Eigenschaften der Hybridpopulation festzustellen. Der wesentliche Vorteil von dominant männlich-sterilen Pflanzen besteht darin, daß Kreuzungen zwischen verschiedenen Varietäten keine Emaskulation des Empfängers mehr erforderlich machen. Ferner ist es möglich, sofern die transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung ein Herbizid-resistentes Gen enthalten, eine reine Population von männlich-sterilen Elterpflanzen zu züchten, da die männliche Sterilität und die Herbizid-Resistenz kombiniert weitervererbt werden, somit kann der männlich-fertile Nachwuchs aus der Nachkommenschaft der Kreuzungen zwischen männlich-sterilen und männlich-fertilen Pflanzen durch eine Behandlung mit Herbiziden eliminiert werden.
- Ein Beispiel einer dominant männlich-sterilen transgenen Pflanze gemäß der Erfindung ist eine Tabakpflanze, die das chimäre CaMV35S-rolC-Gen enthält.
- Diese erfindungsgemäße Pflanze zeigt einen deutlichen Zwergwuchs und eine verminderte apikale Dominanz. Außerdem weist sie eine verlängerte Lebensdauer und eine verlängerte Blüte- und Knospezeit oder eine verzögerte Alterung auf. Ihre Blüten sind kleiner als die der Wildtyp-Pflanze. Vorteilhafterweise werden diese Merkmale auf die nächste Pflanzengeneration übertragen. Die Bestäubung der erfindungsgemäßen transgenen Tabakpflanze CaMV-C1-I mit den vorstehend erwähnten Eigenschaften durch eine Wildtyp-Pflanze (SR1) führte zu 23 Pflanzen mit dem transgenen Phänotyp und 62 Pflanzen mit dem Wildtyp-Phänotyp. In einem anderen Experiment betrug der prozentuale Anteil der Pflanzen mit einem transgenen Phänotyp 50 %.
- Um in der Nachkommenschaft der vorstehend erwähnten Pflanzen, die das erfindungsgemäße CaMV-C-Gen enthalten und exprimieren, männliche Sterilität oder verminderte weibliche Fertilität auszuschalten, können diese transgenen CaMV-C- Pflanzen mit männlich-fertilen Pflanzen gekreuzt werden, die hinsichtlich eines der folgenden Gene homozygot sind:
- a) ein Gen, das unter der Expressionskontrolle des CaMV35S- Promotors oder anderer Promotoren den Antisense-RNA- Strang des rolC-Transkriptes exprimiert. Wegen der Bildung von RNA/RNA-Hybriden wird der charakteristische Phänotyp transgener CaMV-C-Pflanzen nicht in der Nachkommenschaft (F1-Hybride) gefunden; vgl. A. van der Krol, J. N. M. Mol und A. R. Stuitje, Gene 72 (1988), 45-50;
- b) ein Gen, das unter der Expressionskontrolle des CaMV35S- Promotors oder anderer Promotoren ein Ribozym exprimiert, das die mRNA des rolC-Gens in der Nachkommenschaft kata- lytisch spaltet und auf diese Weise inaktiviert; vgl. J. Maseloff und W. L. Gerlach, Nature 334 (1988), 585-591.
- Die transgene Pflanze kann den codierenden Bereich des IPT-Gens unter der Kontrolle des HSP-70-Promotors von Drosophila melanogaster enthalten.
- Die Expression der codierenden Bereiche unter der Kontrolle eines 457 Bp großen DNA-Fragmentes des HSP-70-Gens von Drosophila melanogaster, das den Promotor und 199 Bp der untranslatierten Leader-Sequenz enthält, kann in Tabakpflanzen mittels Hitze reguliert werden; vgl. Spena et al., EMBO J. 4 (1985), 2739, und Spena und Schell, Mol. Gen. Genet. 206 (1987), 436. Dieser Promotor zeigt bei der normalen Wachstumstemperatur ein sehr niedriges Grundniveau der Transkription, das jedoch bei Aktivierung durch einen Hitzeschock drastisch erhöht werden kann.
- Cytokinine sind Pflanzenhormone, die verschiedene biologische Phänomene kontrollieren, wie z.B. die Alterung, die Blütenmorphologie, die apikale Dominanz und die Bildung zusätzlicher Wurzeln. Das IPT-Gen der T-DNA des Ti-Plasmids von Agrobacterium tumefaciens codiert die Isopentenyl-Transferase. Dieses Enzym katalysiert im Gewebe transgener Pflanzen den geschwirdigkeitsbegrenzenden Schritt in der Synthese von Isopentenyladenosin, einem Cytokinin. Transgene Pflanzen, die in ihrem Genom das IPT-Gen unter der Kontrolle seines eigenen Promotors oder anderer Promotoren enthalten, bilden aufgrund der Hemmwirkung des erhöhten Cytokinin-Spiegels keine Wurzeln.
- Um dieses Problem zu umgehen, wurde der codierende Bereich des IPT-Gens der T-DNA des Oktopus-Ti-Plasmids pTi15955 unter die Kontrolle des HSP-70-Promotors von Drosophila melanogaster gestellt. Das Oktopus-Ti-Plasmid pTi15955 wird in Barker et al., Plant Mol. Biol. 2 (1983), 325, beschrieben. Das verwendete chimäre HSIPT-Gen besteht aus (1) der Promotorregion des HSP-70-Gens von Drosophila (Spena et al., EMBO J. 4 (1985), 2739), (2) einem untranslatierten Signalbereich, des durch die Ligierung von 199 Bp des untranslatierten Signalbereichs des HSP-70-Gens von Drosophila mit 16 Bp, die unmittelbar simromaufwärts des ATG-Start-Codons des codierenden Bereiches des IPT-Gens liegen, erhalten wird, (3) 702 Bp des codierenden Bereiches des IPT-Gens und (4) 373 Bp des 3'-flankierenden Bereiches des IPT-Gens, der sich bis zu einer RsaI- Restriktionsspaltstelle erstreckt.
- Transgene Tabakpflanzen, die dieses chimäre Gen enthalten, bilden Wurzeln und weisen eine veränderte Blütenmorphologie auf. Die Blüten sind größer und haben größere Narben als die Wtldtyp-Pflanzen (SR1). Das chimäre HSIPT-Gen in diesen transcenen Pflanzen kann durch eine Hitzeschock-Behandlung induziert werden.
- Die transgenen Pflanzen oder Organe können in ihrem Genom den codierenden Bereich des rolC-Gens unter der Kontrolle eines Wurzel-spezifischen Promotors enthalten und somit eine gesteigerte Wurzelbildung und ein verändertes oder verbessertes Wurzelwachstum zeigen, wobei andere Merkmale fehlen, die für transgene rolBC-Pflanzen oder -Organe typisch sind.
- Transgene Pflanzen oder Organe mit veränderter Physiologie, Morphologie und verändertem Hormonmetabolismus, die in ihrem Genom den codierenden Bereich des rolC-Gens enthalten, sind auch gemäß der Erfindung bevorzugt. Der codierende Bereich ist unter der Kontrolle eines heterologen Promotors, vorzugsweise eines starken konstitutiven Promotors. Der CaMV35S-Promotor ist besonders bevorzugt.
- Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen oder Organe stammen vorzugsweise von Solanaceae, Apocynaceae, Chenopodiaceae, Polygonaceae, Boraginaceae, Compositae, Rubiaceae, Scrophulariaceae, Caprifoliaceae, Leguminosae, Araceae, Moraceae, Asplenium, Euphorbiaceae, Kohl-Arten, Sonnenblumen, Karotten, Paprika (Capsicum annuum), Lauch, Rettich-Arten, Salat-Arten, Sellerie (Apium graveolens), Zwiebeln, Fenchel (Foeniculum vulgare), Weizen, Roggen, Gerste, Korn (Mais), Zuckerrüben, Sojabohnen, Hafer, Reis-Arten, Dahlien, Ziertabak, Pelargonien, Petunien, Primeln, Veilchen, Astern, Amaranthus-Arten, Anemonen, Löwenmäulchen (Antirrhinum), Akeleien, Zierspargel, Begonien, Calceolaria, Coleus, Chrysanthemen, Cyclamen, Delphinium, Nelken, Gerbera, Impatiens, Lupinen, Levkojen, Portulaceae, Mahnenfußgewächsen (Ranunculus), Salbei, Gloxinia, Tagetes Königskerzen, Zinnien, Rosaceae, Seifenkraut oder Panax ginseng.
- Pflanzen, die von Kartoffeln oder Tabak stammen, sind besonders bevorzugt.
- Der wesentliche Punkt hier ist die Tatsache, daß sowohl Dikotyledonen als auch Monokotyledonen als Ausgangsmaterial für die Herstellung der erfindungsgemäßen Pflanzen geeignet sind.
- Außerdem sind Gewebekulturen, die Zellen oder Organe der vorstehend beschriebenen transgenen Pflanzen oder Zellen der vorstehend beschriebenen transgenen Pflanzenorgane enthalten, auch gemäß der Erfindung bevorzugt.
- In vitro-Wurzelkulturen von transgenen Pflanzen, die den codierenden Bereich des rolC-Gens unter der Kontrolle des CaMV35S-Promotors tragen, wachsen mindestens zehnmal schneller als in vitro-Wurzelkulturen von Wildtyp-Pflanzen.
- Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen können als Zuchtpflanzen mit veränderten biochemischen, physiologischen und entwicklungsphysiologischen und/oder morphologischen Merkmalen verwendet werden.
- Ferner können die transgenen Pflanzen, Organe oder Gewebekulturen, die von diesen Pflanzen und Organen stammen, verwendet werden, um sekundäre Pflanzenprodukte, vorzugsweise Alkaloide, Monoterpene, Sesquiterpene, Diterpene, Triterpensteroide, Tetraterpene, Polyketide, Polyacrylene, Flavonoide, Phenylpropanoide, Amine, Alkaloide, Nicht-Protein-Aminosäuren, Cyanoglykoside oder Glucosinolate herzustellen.
- Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen oder Organe können gemäß dem folgenden Verfahren hergestellt werden.
- Zuerst werden Protoplasten oder Gewebe einer Pflanze zusammen mit Agrobacterium tumefaciens-Bakterien oder Agrobacterium rhizogenes-Bakterien gezüchtet, die ein rekombinantes Plasmid enthalten, das vom Ti- oder Ri-Plasmid stammt und als Insertionen die codierenden Bereiche der TL-DNA des Ri-Plasmids von Agrobacterium rhizogenes und/oder den codierenden Bereich des IPT-Gens der T-DNA des Ti-Plasmids von Agrobacterium tumefaciens und gegebenenfalls ein Gen eines selektierbaren Markers beinhaltet. Der einzige wesentliche Punkt bei der Herstellung der transgenen Pflanze der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von spezifischen rekombinanten Plasmiden.
- Sodann werden transgene Zellen selektiert und aus den transgenen Zellen transgene Pflanzen oder Organe regeneriert.
- In den bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die rekombinanten Plasmide so ausgewählt, daß die vorstehend erwähnten Kombinationen der codierenden Bereiche in das Genom der transgenen Pflanzen eingefügt werder können.
- Gemäß der Erfindung sind diejenigen Ausführungsformen des Verfahrens zur Herstellung der vorstehend erwähnten Pflanzen und Organe der Erfindung bevorzugt, in denen das rekombinante Plasmld codierende Bereiche und Promotoren enthält, die die biolgische Aktivität z.B. der Plasmide pPCV002-C oder pPCV002- CaMV-C aufweisen.
- Für die Herstellung der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen und Organe sind nicht nur die spezifisch genannten Plasmide geeignet, sondern auch alle biologisch funktionellen Äquivalente dieser Plasmide. Ein Fachmann auf diesem Fachgebiet, der die Erfindung kennt, ist z.B. befähigt, codierende Bereiche von rol-Genen aus verschiedenen in Agrobacterium rhizogenes vorkommenden Ri-Plasmiden zu isolieren und sie für die Konstruktion rekombinanter Plasmide einzusetzen, durch welche die ccdierenden Bereiche in das Genom der gewünschten Pflanzen eingetügt werden können, wodurch transgene Pflanzen und Organe hergestellt werden. Plasmidsysteme, die für diese Zwecke geeignet sind, werden z.B. in EP-A1 116 718 beschrieben. Gemäß der Efindung ist es genauso möglich, nicht nur Promotoren zu verwenden, die eine identische DNA-Sequenz aufweisen, wie z.B. nur einen spezifischen CaMV35S-Promotor, sondern auch Promotoren die eine gleichwertige biologische Funktion zeigen, wie z.B. 35S-Promotoren, die aus verschiedenen Stämmen von Cauliflower.-Mosaic-Viren isoliert werden können.
- Die Figuren zeigen das Folgende.
- Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung der verwendeten rekombinanten Plasmide.
- Fig. 2 zeigt einen Vergleich einer Wildtyp-(SR1)-Tabakpflanze auf der rechten Seite, einer transgenen rolABC-Pflanze auf der linken Seite und einer transgenen rolAB-Pflanze in der Mitte. Die transgene rolABC-Pflanze zeigt alle phänotypischen Merkmalen des hr-Syndroms, während die transgene rolAB-Pflanze sich sowohl von der Wildtyp-(SR1)-Pflanze als auch von der rolABC-Pflanze unterscheidet.
- Fig. 3 zeigt einen Vergleich einer Wildtyp-Tabakpflanze (SR1) auf der linken Seite und einer transgenen CaMV-C-Pflanze. Die CaMV-C-Pflanze weist eine verminderte apikale Dominanz auf, die einen Zwergwuchs verursacht. Sie zeigt eine größere Zahl von Seitentrieben und hellgrünen lanzenförmigen Blättern. Die Blütenstände haben kleinere Blüten, die männlichsteril sind.
- Fig. 4 zeigt transgene CaMV-C-Pflanzen.
- Fig. 5 zeigt in vitro-Wurzelkulturen.
- Die Figur zeigt einen Vergleich des Wurzelwachstums einer Wildtyp-(SR1)-Tabakpflanze auf der rechten Seite und desjenigen einer transgenen CaMV-C-Pflanze, die drei Wochen im Dunkeln in einem hormonfreien Flüssigmedium (MS) gezüchtet wurde.
- Fig. 6 zeigt eine transgene rolA Pflanze.
- Die dargestellte transgene rolA-Pflanze wurde mit dem rekombinanten Plasmid pPCV002-A hergestellt. Sie weist gekräuselte Blätter und einen verkürzten Blütenstand auf. Diese Morphologie ist der Expression des codierenden Bereiches des rolA-Gens zuzuschreiben.
- Fig. 7 zeigt den Vergleich einer transgenen rolC-Pflanze in der Mitte, einer Wildtyp-(SR1)-Pflanze auf der linken Seite und einer CaMV-C-Pflanze auf der rechten Seite.
- Die transgene rolC-Pflanze wurde mit dem rekombinanten Plasmid pPCV002-C konstruiert. Die transgene rolC-Pflanze hat eine leicht verminderte apikale Dominanz und kleinere Blüten mit reduzierter Pollenproduktion. Dieser Phänotyp ist der Expression des codierenden Bereiches des rolC-Gens unter der Kontrolle des eigenen Promotors zuzuschreiben.
- Fig. 8 zeigt eine transgene rolAC-Pflanze.
- Die dargestellte transgene rolAC-Pflanze wurde mit dem rekombinanten Plasmid pPCV002-AC hergestellt. Sie weist gekräuselte Blätter, eine leicht verminderte apikale Dominanz und kleinere Blüten auf. Diese Morphologie ist der kombinierten Expression der codierenden Bereiche des rolA-Gens und des rolC-Gens zuzuschreiben.
- Fig. 9 zeigt die Blütenmorphologie I.
- Die Figur zeigt einen Vergleich der Blüte der Wildtyp-(SR1)-Pflanze und der Blüten transgener Pflanzen. Transgene rolA- und rolB-Pflanzen haben größere Blüten, während transgene rolC-Pflanzen kleinere Blüten aufweisen.
- Fig. 10 zeigt die Blütenmorphologie II.
- Die Figur zeigt einen Vergleich der Blüten der Wildtyp-(SR1)-Pflanzen und der Blüten transgener Pflanzen. Die Blüten der transgenen CaMV-C-Pflanzen sind sehr klein und männlich-steril. Die Blüten der transgenen CaMVBT-Pflanzen, in denen der gleiche Promotor die Expression des codierenden Bereiches des rolB-Gens kontrollliert, weisen hervorstehende Narben und reduzierte Staubgefäße auf.
- Fig. 11 zeigt die Größe der Samenkapsel.
- Die Figur zeigt einen Vergleich von Samenkapseln der Wildtyp-(SR1)-Pflanzen und Samenkapseln transgener Pflanzen. Während die Größe der Samenkapseln der transgenen rolA- und rolB-Pflanzen unverändert ist, sind die Samenkapseln der transgenen rolC-Pflanzen deutlich kleiner. Die Samenkapseln der transgenen CaMV-C-Pflanzen sind noch kleiner. Alle dargestellten Samenkapseln wurden durch Kreuzungs-Bestäubung weiblicher Empfänger mit SR1-Pollen erhalten.
- Fig. 12 zeigt eine transgene rolBC-Pflanze.
- Die dargestellte transgene rolBC-Pflanze wurde mit Hilfe des rekombinanten Plasmids pPCV002-BC erhalten. Sie weist eine verminderte apikale Dominanz und kleinere Blüten auf. Diese Morphologie ist der Expression des rolC-Gens zuzuschreiben. Diese transgene Pflanze hat wegen der kombinierten Expression der codierenden Bereiche des rolB- und rolC-Gens ein größeres Wurzelsystem.
- Fig. 13 zeigt eine Northern-Blot-Analyse von PolyA-RNA von transgenen rolABC-Pflanzen und Polya-RNA von transgenen CaMV-C-Pflanzen.
- Der codierende Bereich des rolC-Gens wird in transgenen rolABC-Pflanzen in organspezifischer Art und Weise exprimiert. Im Gegensatz dazu wird der codierende Bereich des rolC-Gens in transgenen CaMV-C- Pflanzen in konstitutiver Art und Weise exprimiert. Bahn 1 bis 4 zeigt PolyA-RNA von Wurzeln (r), Stielen (s) und Blättern (1) einer transgenen rolABC- Pflanze.
- Bahn 5 bis 7 zeigt PolyA-RNA von Wurzeln (r), Stielen (s) und Blättern (1) einer transgenen CaMV-C- Pflanze.
- Der Northern-Blot wurde mit dem radioaktiv markierten EcoRI-Fragment 15 der TL-DNA von Agrobacterium rhizogenes hybridisiert, das die rolA-, rolB- und rolC-Gene enthält.
- Fig. 14 zeigt eine Northern-Blot-Analyse von PolyA-RNA von verschiedenen transgenen Pflanzengeweben. Der dargestellte Northern-Blot zeigt die Expression der verschiedenen rol-Gene. Polya-RNA der folgenden transgenen Pflanzengeweben wurde verwendet:
- Bahn 1: Clon rolABC 1-27
- Bahn 2: Clon rolA-2
- Bahn 3: Clon rolA-4
- Bahn 4: Clon rolB1100-1
- Bahn 5: Clon rolB1100-2
- Bahn 6: Clon rolCaMVBT-5
- Bahn 7: Clon rolCaMVBT-6
- Bahn 8: Clon rolCaMV-C-2
- Bahn 9: Clon rolCaMV-C-4
- Bahn 10: Clon rolAB-1
- Bahn 11: Clon rolAB-5
- Bahn 12: Clon rolAC-1,5
- Bahn 13: Clon rolAC-2,4
- Bahn 14: Clon rolBC-10
- Bahn 15: Clon rolBC-14
- Bahn 16: Clon rolCaMVBT+C1
- Bahn 17: Clon rolCaMVBT+C3.
- Fig. :L5 zeigt Blattnekrosen einer transgenen CaMVBT-Pflanze, die durch die höhere Expression des rolB-Gens in Blättern aufgrund seiner spezifischen Expression unter der Kontrolle des CaMV35S-Promotors verursacht werden.
- Das vollständig entwickelte hr-Syndrom wird in transgenen Pflanzen gefunden, die das rolA-, rolB- und rolC-Gen exprimieren; vgl. Spena et al., a.a.O.. Die erfindungsgemäße Analyse transgener Pflanzen, die in ihrem Genom verschiedene Kombinationen der codierenden Bereiche dieser drei rol-Gene enthalten, zeigte unterscheidbare und spezifische Wachstumsanomalien, die mit der Expression der erwähnten codierenden Bereiche in Zusammenhang stehen; vgl. die Figuren 2, 6 bis 9, 11, 12. Transgene Pflanzen, die nur den codierenden Bereich eines einzelnen rol-Gens in ihrem Genom enthalten, zeigen nicht alle phänotypischen Merkmale des hr-Syndroms. Somit wird das hr- Syndrom durch eine kombinierte Wirkung von Genen ausgelöst, von denen jedes in den transgenen Pflanzen eine bestimmte biologische Wirkung aufweist.
- Es ist bereits bekannt, daß die rolB- und rolC-Gene in Ri-transgenen Tabakpflanzen und in Ri-transgenen Kartoffelpflanzen, die jedoch alle mindestens drei Gene, d.h. das rolA-, rolB- und rolC-Gen, in ihrem Genom enthalten, in organspezifischer Art und Weise exprimiert werden. Darüberhinaus ist eine organspezifische Expression von transgenen Tabakpflanzen bekannt, die alle drei Gene enthalten; vgl. Spena et al., a.a.O.. In diesen Experimenten wurde durch eine Northern- Blot-Analyse gezeigt, daß die Expressionsrate des rolB- und rolC-Gens in den Stielen hoch, in den Wurzeln etwas niedriger und in den Blättern viel niedriger ist. Diese Ergebnisse wurden durch die Untersuchung der Expressionsrate eines Reportergens unter der Kontrolle des rolB- und rolC-Promotors bestätigt. Außerdem war es möglich, die Organspezifität und Zellspezifität der Expression genauer zu bestimmen.
- Modifikationen der Expressionsrate führen auch zu Veränderungen in der Entwicklung. Die gesteigerte Zahl von Seitentrieben steht z.B. mit einer höheren Expressionsrate des rolC- Gens in Zusammenhang (Figur 13). Die Spezifität der Expressionsrate spielt bei der Entstehung von morphologischen Veränderungen der transgenen hr-Pflanzen eine wichtige Rolle. Transgene Pflanzen, die chimäre Gene enthalten, in denen der codierende Bereich des rolB- oder rolC-Gens unter der Kontrolle eines CaMV35S-Promotors steht, zeigen neue morphologische Wachstumsanomalien. Mit Hilfe der Northern-Blot-Analyse und histochemischer Färbungen wurde gezeigt, daß die Blattnekrose mit einer gesteigerten Expression des rolB-Gens in den Blättern in Zusammenhang steht (Figur 15). Die gesteigerte Expression dieses Gens kann durch Expression unter der Kontrolle eines CaMV35S-Promotors erreicht werden.
- Die unterscheidbaren Wachstumsmuster von transgenen Tabakpflanzen, die in ihrem Genom chimäre CaMVBT- und CaMV-C- Gene enthalten, in denen die codierenden Bereiche durch den gleichen Promotor kontrolliert werden, legen nahe, daß die biologische Wirkung, die diese Genprodukte auf die ganze Pflanze ausüben, unterschiedlich ist. Somit haben die rolB- und rolC-Genprodukte entweder verschiedene biochemische Ziele oder sie üben eine unterschiedliche Wirkung auf das gleiche Ziel aus. Die durch die Expression der rol-Gene verursachten Veränderungen deuten auf Veränderungen von hormonkontrollierten Vorgängen hin. Aus diesem Grund wurden Modelle vorgeschlagen, in denen das hr-Syndrom durch erhöhte Auxin-Sensitivität erklärt wird, die durch eine durch rol-induzierte Modifikation des Hormon-Signal-Empfangs-Transduktions-Systems verursacht wird. Andererseits wurde angenommen, daß eine Funktion des rol-Gens zu Modifikationen in der Cytokinin-Biosynthese führt oder eine Cytokinin-ähnliche Wirkung aufweist. In den entsprechenden Experimenten wurde die Virulenz von Ti-Plasmiden, die im Bereich des IPT-Gens mutiert waren, durch Einbau eines Bereiches der TL-DNA des Ri-Plasmids wiederhergestellt. Die biologischen Wirkungen der Produkte der rolA- und rolB-Gene erinnern tatsächlich an Effekte, die durch Auxin verursacht werden, die durch das rolC-Gen hervorgerufenen biologischen Wirkungen legen eine Cytokinin-Aktivität nahe. Trotzdem lassen sich die Effekte der rol-Gene nicht einfach durch Modelle erklären, die die Synthese von transportierten Phytohormonen erforderlich machen, wie z.B. Indolessigsäure (IAA) und Isopentenyladenosin (IPT). Die Wirkung dieser Gene ist auf die transformierten Zellen beschränkt, zumindest bei der Wurzelbildung. Die durch rolB und/oder rolA hervorgerufenen Auxinähnlichen Wirkungen könnten einerseits erhalten werden, indem eine Veränderung im Empfangs-Transduktions-System für das Auxin-Signal ausgelöst wird, andererseits jedoch auch, indem die Wirkung von Auxin-Antagonisten, wie z.B. Cytokininen, gehemmt wird oder indem eine Substanz mit Auxin-ähnlicher Wirkung synthetisiert wird, wie z.B. Phenylessigsäure, die in den Pflanzengeweben nicht transportiert wird. In beiden Fällen wäre das Ergebnis eine gesteigerte biologische Auxin-Wirkung ohne Anderung der IAA-Konzentration. Andererseits sind die in transgenenen CaMV-C-Pflanzen gefundenen Merkmale und die Effekte die in hr-Pflanzen und transgenen CaMV-BT+C-Pflanzen durch eine erhöhte Expressionsrate des rolC-Gens erzeugt werden, typisch für eine gesteigerte Cytokinin-Aktivität. Demgemäß könnte die gesteigerte Cytokinin-Aktivität auch der Hemmung oder teilweisen Inaktivierung von Indolessigsäure oder der Synthese einer zellautonomen Substanz mit Cytokinin-Aktivität zuzuschreiben sein.
- Die Untersuchung des Wachstumsverhaltens transgener Tabakwurzelkulturen zeigte, daß das Wurzelwachstum in in vitro- Wurzelkulturen insbesondere durch die Kombination des rolB- und rolC-Gens wesentlich verbessert werden kann und etwas weniger wirksam durch die Kombination des rolA- und des rolC- Gens. Hier ist das rolB-Gen bei der Induktion der Wurzelbildung das wirksamste Gen aus der aus rolA-, rolB- und rolC-Gen bestehenden Gruppe. Ein schnelles Wachstum von verzweigten Wurzeln wird jedoch besser durch das rolC-Gen erreicht. Das Produkt des rolC-Gens besitzt eine ziemlich begrenzte Fähigkeit jur Induktion der Wurzelbildung. Transgene rolC- und insbesondere CaMV-C-Wurzeln sind stark verzweigt und zeigen ein schnelles und plagiotropes Wachstum; vgl. Figur 5.
- Es ist bekannt, daß Auxine die Bildung von zusätzlichen Wurzeln induzieren (Rhizogenese). Jedoch haben auch andere Phytoilormone, wie z.B. Cytokinine, einen Einfluß auf die Rhizogenese. Außerdem gibt es Anzeichen, die darauf hinweisen, daß für die Induktion des Wurzelwachstums ein hohes Verhältnis von Auxin zu Cytokinin optimal ist, während für die Fortsetzung des Wurzelwachstums ein niedriges Verhältnis von Auxin zu Cytokinin erforderlich ist. Folglich ist die kombinierte Wirkung der rolB- und rolC-Genprodukte für eine wirksame Wurzelbildung und ein wirksames Wurzelwachstum vorteilhaft; das rolB-Genprodukt (Auxin-ähnliche Wirkung) ruft wirksam die Wurzelbildung hervor, und das rolC-Genprodukt (Cytokinin-ähnliche Wirkung) erlaubt ein schnelles und verzweigtes Wurzelwachstum, indem es der biologischen Aktivität des rolB-Genproduktes entgegenwirkt.
- Die in den folgenden Beispielen verwendeten rekombinanten Plasmide werden mit Ausnahme von Plasmid pPCV002-BC in Spena et al., a.a.O., beschrieben.
- Die transgenen Pflanzen und Organe der vorliegenden Erfindung können z.B. hergestellt werden, indem man Protoplasten mit Hilfe der rekombinanten Plasmide transformiert, anschließend transgene Zellen selektiert und aus den selektierten transgenen Zellen ganze Pflanzen regeneriert.
- Die Bakterienstämme und -kulturen werden in Spena et al., a.a.O., beschrieben. Alle rekombinanten Plasmide wurden zuerst in E. coli, Stamm SM10, übertragen und anschließend in Agrobacterium tumefaciens, Stamm Gv3101, mobilisiert; Koncz und Schell, Mol. Gen. Genet. 204 (1986), 383.
- Die verwendeten rekombinanten Plasmide wurden gemäß herkömmlicher Verfahren konstruiert; Maniatis et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Laboratory, 1982. Die in Figur 1 dargestellten Plasmide wurden bereits von Spena et al., a.a.O., beschrieben, mit Ausnahme des rekombinanten Plasmids pPCV002-BC.
- Die Wurzelinduktion auf Blättern von Kalanchoe diagremontiana und auf Blattscheiben von sterilen Triebkulturen von Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1 (Nagy und Maliga, Z. Pflanzenphys. 78 (1976), 453) wurden durchgeführt, wie von Spena et al., a.a.O., beschrieben.
- Um zu untersuchen, ob die durch rol-Gen hervorgerufene Wurzeln in allen Fällen transformiert waren, wurden Blattscheiben mit verschiedenen Konstrukten inkubiert und auf MS- Medium ohne Kanamycin gezüchtet; Murashige und Skoog, Physiol. Plant. 15 (1962), 473. Nach vier Wochen wurden die Wurzeln geschniüten und in zwei Hälften aufgeteilt. Eine Hälfte wurde während der Kallusbildung einer Kanamycin-Selektion (50 mg/l) auf MS-Medium ausgesetzt. Das MS-Medium war mit 0,6 mg/l Naphthylessigsäure (NAA) und 0,2 mg/l Kinetin angereichert. Transgene Pflanzen wurden in herkömmlicher Art und Weise aus transgenen Kalli auf einem MS-Medium regeneriert, das mit 0,5 mg/l Benzylaminopurin (BAP) und 0,1 mg/l NAA angereichert war. Die Regeneration von transgenen Pflanzen aus Kalli bereitet jedoch Schwierigkeiten, sofern die codierenden Bereiche, die von den rekombinanten Plasmiden pPCV002-CaMVBT oder pPCV002-CaMVBT+C stammen, in das zelluläre Genom eingebaut werden. Aus diesem Grund wurden die Triebe 10 bis 12 Wochen auf MS-Medium gezüchtet, das mit 7,5 mg/l Isopentenyladenosin und 0,1 mg/l Chlorphenoxyessigsäure angereichert war; Firoozabady, Plant Science 46 (1986), 127. Sodann ließ man die Triebe auf hormonfreiem MS-Medium Wurzeln schlagen und selektierte sie auf Kanamycin- Resistenz. Die Wurzelkulturen wurden entweder auffestem oder auffjüssigem Medium gehalten.
- DNA und RNA wurden aus den Geweben der transgenen Pflanzen gemäß Taylor und Powell erhalten; BRL Focus 4 (1983), 4. Die PolyA-RNA wurde durch Chromatographie auf Oligo-dT-Cellulose gemäß den Anweisungen des Herstellers (Boehringer Mannheim) gereinigt und anschließend auf einem 1,5 % Agarose-Formaldehyd-Gel aufgetrennt. Sodann wurden sie auf Nylonmembranen übertragen und mit radioaktiven Sonden hybridisiert. Als Sonden wuren gereinigte DNA-Fragmente verwendet, die durch Nick- Translation mit einem Nick-Translations-Kit von BRL gemäß den Anweisungen des Lieferanten markiert wurden. Die Hybridisierung äes Northern-Blot wurde in 10 % Dextransulfat, 1 M Natriumchlcrid, 1 % Natriumlaurylsulfat, 100 ug/ml heterologer DNA bei 65ºC durchgeführt. Gewaschen wurde zuerst mit 2xSSPE, 1 % SDS, bei Raumtemperatur und anschließend mit 0,2xSSPE und 1 % SDS bei 65ºC. Sodann wurden die DNA-Blots in herkömmlicher Art und Weise weiterbehandelt; Maniatis et al., a.a.O..
- Die Neomycin-Phosphotransferase-II-Aktivität wurde durch in-situ-Tests nachgewiesen, wie von Spena et al., EMBO J. 4 (1985), 739, beschrieben.
- Die Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung.
- Das rekombinante Plasmid pPCV002-BC wurde durch Subclonierung des 3581 Bp großen SmaI/EcoRI-DNA-Fragmentes in den binären Vektor pPCV002 erhalten. Eine genaue Beschreibung des Fragmentes findet sich in Spena et al., a.a.O.. Ein SmaI/EcoRI-Fragment, das die codierenden Bereiche des rolB- und des rolC-Gens enthielt, wurde aus dem Plasmid pPCV002-ABC isoliert und in die SmaI/EcoRI-Restriktionsspaltstelle von Plasmid puclg subcloniert. Dieses Fragment überspannt den Bereich von Basenpaar 9863 bis 13 445, gemäß der Numerierung der TL-DNA Sequenz durch Slightom et al., (1986), a.a.O.. Aus dem auf diese Weise erhaltenen Plasmid pUC19-BC wurde ein EcoRI/XbaI- DNA-Fragment ausgeschnitten und in die EcoRI/XbaI-Restriktionsspaltstellen des Vektors pPCV002 subcloniert. Auf diese Weise wurde das Plasmid pPCV002-BC erhalten.
- Das Plasmid pPCV002-HSIPT wurde gemäß herkömmlicher Verfahren konstruiert; vgl. Maniatis et al., (1982), a.a.O.. Ein RsaI/RsaI-DNA-Fragment der T-DNA des Oktopus-Ti-Plasmids pTi15955 wurde in die SmaI-Restriktionsspaltstelle des Plasmids pUC9 subcloniert. Dieses DNA-Fragment überspannt den Bereich von Basenpaar 8488 bis 9836 gemäß der Numerierung von Barker et al., Plant Mol. Biol. 2 (1983), 335-350. Das erhaltene Plasmid pUC9-IPT wurde durch das Restriktionsenzym EcoRI an einer Restriktionsspaltstelle stromaufwärts des codierenden Bereiches des IPT-Gens gespalten und der Promotor sodann durch Spaltung mit der Exonuclease Ba131 entfernt. Die Zahl der Basenpaare, die stromaufwärts der Translations-Startstelle verblieben, wurde durch DNA-Sequenzierung gemäß dem Kettenabbruch-Verfahren überprüft. Anschließend wurde der codierende Bereich des IPT-Gens durch Restriktionsspaltung durch die Enzyme EcoRI und HindIII aus dem Plasmid pUC9-IPT entfernt und in die BamHI/HindIII-Restriktionsspaltstellen des Plasmids pUCB-PSP-70 subcloniert, wobei die EcoRI- und die BamHI-Restriktionsspaltstellen durch die Behandlung mit Klenow-Polymerase vor der Ligierung in glatte Enden überführt worden waren. Das resultierende Plasmid pUC8-HSIPT enthält somit den codierenden Bereich des IPT-Gens stromabwärts des durch Hitze induzierbaren HSP-70-Promotors von Drosophila melanogaster. Dieses chimäie Gen wurde durch die Restriktionsenzyme EcoRI und Hindlil herausgeschnitten und in die EcoRI- und HindIII-Restriktionsspaltstelle des binären Pflanzenvektors pPCV002 subcloniert. Folglich weist das erhaltene Plasmid pPCV002-HSIPT die folgenden strukturellen Merkmale auf:
- - 258 Bp des HSP-70-Promotors von Drosophila melanogaster;
- - 399 Bp untranslatierte Sequenz von Drosophila melanogaster;
- - 16 Bp untranslatierte Sequenz des IPT-Gens mit der Nucleotidsequenz GGATCTAATTC an der Fusionsstelle;
- - 712 Bp codierender Bereich des IPT-Gens; und
- - 373 Bp 3'-untranslatierte Sequenz der Terminationsregion des IPT-Gens.
- Transgene Tabakpflanzen, in denen die rolA-, rolB- und rolC-Gene exprimiert werden, zeigen alle phänotypischen Veränderungen, die für das hr-Syndrom charakteristisch sind. Im Gegensatz dazu zeigen transgene Tabakpflanzen, in denen ein einzelnes rol-Gen oder Zweierkombinationen dieser Gene exprimiert werden, andere phänotypische Veränderungen, die für die jeweiligen einzelnen Gene oder die Kombinationen charakteristisch sind. In Figur 2 wird eine transgene Tabakpflanze, die die codierertden Bereiche des rolA- und des rolB-Gens enthält und exprimiert, mit einer normalen Wildtyp-(SR1)-Tabakpflanze oder einer transgenen Tabakpflanze, die die codierenden Bereiche der rolA-, rolB- und rolC-Gene enthält und exprimiert, verglichen. Es ist leicht zu erkennen, daß die erfindungsgemäße Pflanze, die die codierenden Bereiche des rolA- und des rolB- Gens enthält und exprimiert, sich sowohl von der Wildtyp- Pflanze (SR1) als auch von der hr-Syndrom-Pflanze, die alle drei codierenden Bereiche exprimiert, unterscheidet.
- Transgene Pflanzen, die Kombinationen der codierenden Bereiche des rolB- und des rolC-Gens oder des rolA- und des rolC-Gens in ihren Genomen enthalten, weisen nicht alle Merkmale auf, die für das hr-Syndrom charakteristisch sind, sie unterscheiden sich jedoch von den Wildtyp-Pflanzen; vgl. Figur 12 bzw. Figur 8.
- Die gleichen Folgerungen werden gezogen, wenn man die Nachkommenschaft von Kreuzungsexperimenten untersucht, in denen transgene rolAB-Pflanzen mit transgenen rolC-Pflanzen gekreuzt werden. In diesen Kreuzungsexperimenten, die in herkömmlicher Art und Weise durchgeführt werden, wird eine transgene Tabakpflanze, die in ihrem Genom den codierenden Bereich des rolA- und des rolB-Gens enthält (z.B. AB3-5), mit einer transgenen Tabakpflanze gekreuzt, die in ihrem Genom den codierenden Bereich des rolC-Gens enthält (z.B. C9a). 29 von 100 Pflanzen der Nachkommenschaft zeigten das vollständige hr-Syndrom.
- Transgene Tabakpflanzen, die den codierenden Bereich des rolC-Gens enthalten und exprimieren, zeigen eine veränderte Blattmorphologie, kleinere Blüten und eine verminderte Pollenproduktion (Figur 9), die Samenkapseln sind kleiner (Figur 11) und die Pflanze ist stärker verzweigt (Figur 7).
- Transgene Tabakpflanzen, die den codierenden Bereich des rolB-Gens in ihrem Genom enthalten und exprimieren, zeigen durchweg andere Veränderungen des Wachstums. Dies sind im wesentlichen andere Veränderungen der Blattmorphologie, größere Narben und größere Blüten (Figur 9). Die Pollenproduktion ist nur leicht vermindert und die Samenkapseln sind nicht nachteilig beeinträchtigt (Figur 11). Die Blüten von Tabakpflanzen, die für die rolA-, rolB- und rolC-Gene transgen sind, sind kleiner als diejenigen der Wildtyp-Pflanzen (SR1), während die Blüten von Pflanzen, die für das rolB-Gen transgen sind, größer sind und veränderte Merkmale aufweisen (Figur 9).
- Transgene Pflanzen, die in ihrem Genom eine Kombination des codierenden Bereiches des rolC-Gens und des codierenden Bereiches des rolA-Gens oder des rolB-Gens enthalten, weisen auch kleinere Blüten auf. In diesen Pflanzen steht einer der codierenden Bereiche gegebenenfalls unter der Kontrolle eines starken heterologen Promotors. Solche Pflanzen können z.B. mit Hilfe der Plasmide pPCV002-AC, pPCV002-BC oder pPCV002- CaMVBT+C erhalten werden.
- Transgene Tabakpflanzen, die den codierenden Bereich des rolA-Gens in ihrem Genom enthalten, unterscheiden sich in ihren veränderten Wachstumseigenschaften sowohl von transgenen Pflanzen, die den codierenden Bereich des rolB-Gens in ihrem Genom enthalten, als auch von denjenigen Pflanzen, die den codierenden Bereich des rolC-Gens in ihrem Genom enthalten. Ein besonders typisches Merkmal solcher Pflanzen sind gekräuselte Blätter, verkürzte Blütenstände (Figur 6) und größere Blüten mit veränderter Morphologie (Figur 9).
- Die Nachkommenschaft der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen zeigen morphologische Veränderungen, die denjenigen der Elterpflanze ähnlich sind. Darüberhinaus wurde in den durchgeführten Experimenten gefunden, daß die veränderten Merkmale zusammen mit der Resistenz gegenüber Kanamycinsulfat weitergegeben werden. In einem weiteren Experiment wurden verschiedene erfindungsgemäße Tabakpflanzen getestet, um herauszufinden, ob die phänotypischen Veränderungen mit der Expression von rol-Genen in Zusammenhang stehen.
- Pigur 13 zeigt eine Northern-Blot-Analyse von PolyA-RNA, die aus dem Gewebe verschiedener erfindungsgemäßer transgener Pflanzen extrahiert wurde. In allen getesteten Fällen stand das veränderte Wachstum mit der Expression von rol-Genen in Zusammenhang.
- Transgene Pflanzen, die in ihrem Genom den codierenden Bereich des rolC-Gens enthalten, welcher unter der Kontrolle des CaMV35S-Promotors steht, weisen einen Phänotyp auf, der von dem Phänotyp von Pflanzen verschieden ist, in denen der codierende Bereich der im Genom enthaltenen rolC-Gene unter der Kontrolle des natürlichen Promotors steht; vgl. die Figuren 3, 4 und 7. Die Verwendung des CaMV35S-Promotors führt zu einem buschigen Phänotyp mit einer größeren Zahl an Trieben. Die Blüten sind sehr klein (Figur 10) und die Blätter sind schmal und lanzenförmig (Figur 4). Die transgenen CaMV-C- Pflanzen sind männlich-steril, wobei die Eigenschaft als einzelnes dominantes Gen auf die Nachkommenschaft übertragen wird.
- Tests in einem System mit einer vorübergehenden Expression unter Verwendung von Tabakblattprotoplaten haben gezeigt, daß die Expressionsrate des codierenden Bereiches des rolC- Gens 15-mal höher ist, wenn der CaMV35S-Promotor verwendet wird. Dies entspricht den Ergebnissen der Northern-Blot-Analyse, die mit Polya-RNA aus transgenen Pflanzen durchgeführt wurde Dies wird auch durch die Analyse der Expression in transgenen Pflanzen bestätigt, die ein chimäres Gen enthalten, das aus dem codierenden Bereich der β-Glucuronidase und dem rolC-Promotor besteht. Folglich ist die Modifikation der spezifischen Expression des codierenden Bereiches des rolC-Gens für die Verminderung der apikalen Dominanz verantwortlich.
- Außerdem wurden transgene Pflanzen hergestellt, in denen der codierende Bereich des rolB-Gens unter der Kontrolle des CaMV35S-Promotors steht. Diese Pflanzen wurden unter Verwendung des rekombinanten Plasmids pPCV002-CaMVBT hergestellt. Eines der Merkmale dieser transgenen Pflanzen ist eine frühere Blattalterung (Nekrose); vgl. Figur 15. Die Northern-Blot-Analyse der Polya-RNA aus diesen transgenen Pflanzen zeigte, daß das chimäre Gen in Blättern in einem höheren Niveau exprimiert wird als in transgenen Pflanzen, in denen der codierende Bereich des rolB-Gens unter der Kontrolle des natürlichen Promotors steht. Der neue Phänotyp wird somit durch die gesteigerte Expressionsrate des codierenden Bereiches des rolB-Gens verursacht.
- Ferner wurden transgene Pflanzen gemäß der Erfindung hergestellt, die eine Kombination des codierenden Bereiches des rolB-Gens unter der Kontrolle des CaMV35S-Promotors und des codierenden Bereichs des rolC-Gens enthalten. Für die Herstellung dieser Pflanzen wurde das rekombinante Plasmid pPCV002- CaMVBT+C verwendet. Diese Pflanzen zeigen eine Blattnekrose, die für transgene CaMVBT-Pflanzen typisch ist; vgl. Figur 15. Im Gegensatz dazu ist die Blütenmorphologie mit transgenen Pflanzen vergleichbar, die den codierenden Bereich des rolC- Gens n ihrem Genom enthalten.
- Die nekrotischen Prozesse beginnen im Elattgewebe zwischen den Venen und dehnen sich dann auf das ganze Blatt aus; vgl. Figur 15. Dies wird üblicherweise in Pflanzen beobachtet, die ihre Reife vor der Blütenbildung erreicht haben. Die als erstes befallenen Blätter sind weder die ältesten noch die jüngsten Blätter, vielmehr liegen sie etwa in der Mitte der Pflanze. Jedoch weisen einige transgene CaMVBT+C-Pflanzen eine höhere Zahl an Trieben und Blättern auf, wobei der nekrotische Prozess in diesen Pflanzen weniger ausgeprägt ist und auf die Zeit nach der Blüte verschoben ist. Die Northern-Blot-Analyse verschiedener transgener CaMVBT+C-Pflanzen legt nahe, daß die Pflanzen mit einer gesteigerten Zahl an Trieben und einer verzögerten Blattnekrose das CaMVBT-Gen weniger exprimieren als das rolC-Gen. Somit haben diese Pflanzen ein erhöhtes Verhältnks von rolC-Transkripten zu rolB-Transkripten.
- An erster Stelle wurde untersucht, ob die durch rol-Gen hervorgerufenen Tabakwurzeln befähigt sind, auf Kanamycin enthaltendem MS-Medium zu wachsen, denn die Wurzeln enthalten aufgrund ihrer Konstruktion durch die Plasmide pPCV002-ABC, pPCV002-B1100, pPCV002-AC, abgesehen von den codierenden Bereichen der rol-Gene, außerdem das Neomycin-Phosphotransferase-II-Gen. 166 durch rol-Gen hervorgerufene Tabakwurzeln wurden getestet. 153 von ihnen waren eindeutig befähigt, auf dem Kanamycinsulfat enthaltenden MS-Medium zu wachsen. Weitere 12 waren nicht eindeutig positiv und wurden deshalb in in-situ- Tests auf die Aktivität des Neomycin-Phosphotransferase-II- Gens untersucht. Außerdem wurden Southern-Blots des Pflanzengenoms hergestellt. Die Ergebnisse zeigen, daß diese Wurzeln tatsächlich transformiert waren.
- Die verschiedenen codierenden Bereiche der rol-Gene oder ihre Kombinationen üben verschiedene Wirkungen auf das Wurzelwachslum aus. Transgene Tabakwurzeln, die die einzelnen rol- Gene enthielten, wuchsen besser als untransformierte Wurzeln. Transgene Wurzeln, die das rolC-Gen enthielten, waren stärker verzweigt als diejenigen, die das rolA-Gen oder das rolB-Gen enthielten. Im Gegensatz dazu wuchsen transgene Wurzeln kräftiger die Kombinationen des rolC-Gens mit dem rolA-Gen und/oder dem rolB-Gen enthielten. Das rolB-Gen zeigte bei Kombination mit dem rolC-Gen eine stärkere Wirkung als die Kombination des rolA-Gens mit dem rolC-Gen. Kombinationen des Gens rolA und rolB führten im Vergleich zu den alleine verwendeten Genen zu keinem wesentlich gesteigerten Wurzelwachstum. Wenn der codierende Bereich des rolC-Gens unter der Kontrolle des CaMV35S-Promotors steht, zeigt sich ein stärkeres Wurzelwachstum (Figur 5). Im Gegensatz dazu wuchsen die Wurzeln weniger stark, wenn die Expression des rolB-Gens unter der Kontrolle des CaMV35S-Promotors stand. Die Wurzeln wachsen jedoch schneiler, wenn der codierende Bereich des rolB-Gens unter der Kontrolle des CaMV35S-Promotors steht und mit dem rolC-Gen kombiniert wird. In diesem Fall sind die Wurzeln stark verzweigt und wachsen plagiotrop. Die rekombinanten Plasmide, die in Spena et al., a.a.O., und in Beispiel 1 beschrieben werden, wurden verwendet, um diese von transgenen Pflanzen stammenden Wurze)n herzustellen.
- Gewebekulturen der Wurzeln sind für die Herstellung sekundärer Pflanzenprodukte besonders geeignet.
Claims (11)
1. Transgene Pflanze mit gewünschten Merkmalen, die in
ihrem Genom den codierenden Bereich des rol C-Gens der
TL-DNA des Ri-Plasmids von Agrobacterium rhizogenes
enthält, wobei die Pflanze aufgrund der Expression des
codierenden Bereichs des Gens veränderte Morphologie,
Physiologie und Hormonmetabolismus aufweist, dadurch
gekennzeichnet, daß das rol C-Gen unter der Kontrolle
eines heterologen Promotors ist und das rol C-Gen das
einzige rol-Gen in der transgenen Pflanze ist.
2. Transgene Pflanze nach Anspruch 1, wobei der heterologe
Promotor der HSP ("Hitzeschockpromotor")-70-Promotor von
Drosophila melanogaster ist.
3. Transgene Pflanze nach Anspruch 1, wobei der heterologe
Promotor ein starker konstitutiver Promotor ist.
4. Transgene Pflanze nach Anspruch 3, wobei der starke
konstitutive Promotor der CaMV ("Cauliflower Mosaic
Virus")-35S-Promotor ist.
5. Transgene Pflanze nach einem der Anspruche 1 bis 4, die
von Solanaceae, Apocynaceae, Chenopodiaceae,
Polygonaceae, Boraginaceae, Compositae, Rubiaceae,
Scrophulariaceae, Caprifoliaceae, Leguminosae, Araceae,
Moraceae, Asplenium, Euphorbiaceae, Kohl-Arten,
Sonnenblumen, Karotten, Paprika (Capsicum annuum), Lauch,
Rettich-Arten, Salat-Arten, Sellerie (Apium graveolens),
Zwiebeln, Fenchel (Foeniculum vulgare), Weizen, Roggen,
Gerste, Korn (Mais), Zuckerrüben, Sojabohnen, Hafer,
Reis-Arten, Dahlien, Ziertabak, Pelargonien, Petunien,
Primeln, Veilchen, Astern, Amaranthus-Arten, Anemonen,
Löwenmäulchen (Antirrhinum), Akeleien, Zierspargel,
Begonien, Calceolaria, Coleus, Chrysanthemen, Cyclamen,
Delphinium, Nelken, Gerbera, Impatiens, Lupinen,
Levkojen, Portulaceae, Hahnenfußgewächsen (Ranunculus),
Salbei, Gloxinia, Tagetes, Königskerzen, Zinnien,
Rosaceae, Seifenkraut oder Panax ginseng stammt.
6. Transgene Pflanze nach Anspruch 5, die von Kartoffeln
oder Tabak stammt.
7. Gewebekultur, enthaltend Zellen oder Organe einer
transgenen Pflanze oder Zellen eines transgenen
Pflanzenorgans nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
8. Verwendung einer transgenen Pflanze nach einem der
Ansprüche 1 bis 6 oder einer Gewebekultur nach Anspruch 7
zur Herstellung sekundärer Pflanzenprodukte.
9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei die sekundären
Pflanzenprodukte Alkaloide, Monoterpene, Sesquiterpene,
Diterpene, Triterpensteroide, Tetraterpene, Polyketide,
Polyacetylene, Flavonoide, Phenylpropanoide, Amine,
Nicht-Protein-Aminosäuren, Cyanglykoside oder
Glucosinolate sind.
10. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze nach
einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei
a) Protoplasten oder Gewebe einer Pflanze zusammen mit
Agrobacterium tumefaciens kultiviert werden oder
Agrobacterium zusammen mit Agrobacterium
tumefaciens- oder Agrobacterium
rhizogenes-Bakterien, die ein von Ti- oder Ri-Plasmiden stammendes
rekombinantes Plasmid enthalten, das den codierenden
Bereich des rol C-Gens der TL-DNA des Ri-Plasmids
aus Agrobacterium rhizogenes unter der Kontrolle
eines heterologen Promotors und gegebenenfalls ein
selektierbares Markergen enthält;
b) transgene Zellen ausgewählt werden; und
c) eine transgene Pflanze oder ein transgenes
Pflanzenorgan von den transgenen Zellen regeneriert werden
durch Verwendung eines mit Isopentenyladenosin und
Chlorphenoxyessigsäure supplementierten Mediums zur
Züchtung von Keimen.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das rekombinante
Plasmid codierende Bereiche und Promotoren enthält, die in
den rekombinanten Plasmiden pPCV002-C oder pPCV002-CaMV-
C, wie in Figur 1 dargestellt, enthalten sind.
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