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Technisches
Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Isolierung und Identifizierung
eines Gens, das an der Semi-Verzwergung von Pflanzen beteiligt ist,
sowie die Semi-Verzwergung von Pflanzen unter Verwendung dieses Gens.
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Technischer
Hintergrund
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In
1956 in Taiwan erbrachte eine neue Reis-Varietät „Taichung Native 1" einen hohen Ertrag,
der bei den konventionellen indica-Varietäten nicht beobachtet worden
war. „Taichung
Native 1" wurde
mittels einer Kreuzung zwischen einer lokalen halbverzwergten Varietät, „Dee-geo-woo-gen", und einer krankheitsresistenten
Gartenvarietät, „Tsai-yuangchung", gezüchtet. In
den späten
1960ern wurde eine Halbzwerg-Varietät, „IR8", in ähnlicher Weise mittels einer
Kreuzung zwischen der Halbzwerg-Varietät „Dee-geo-woo-gen" und einer indonesischen
Hochqualitäts-Langkornreis-Varietät, „Peta", am internationalen
Reisforschungsinstitut (IRRI), Philippinen, gezüchtet. Diese Varietät wurde
als „Wunderreis" („miracle
rice") bezeichnet,
da sie den Ertrag pro Flächeneinheit
dramatisch verbesserte. Die Verbreitung des „miracle rice" half der Lebensmittelkrise
in Asien ab und führte
zur Entstehung der „grünen Revolution". Das Gen, das zu
den hohen Erträgen
sowohl von Taichung Native 1 als auch von IR8 beitrug, ist das Halbzwerg-Gen
sd1, das aus Dee-geo-woo-gen
stammte. Jedoch ist bis zum heutigen Zeitpunkt nur der ungefähre chromosomale
Locus des sd1-Gens bestimmt worden (Maeda et al., Breeding Science
47: 317–320,
1997).
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Im
allgemeinen müssen
Pflanzen, insbesondere landwirtschaftliche Nutzpflanzen, wie etwa
Reis, unter gut gedüngten
Bedingungen (d.h. stickstoffreichen Bedingungen) kultiviert werden,
wenn ihre Ausbeute gesteigert werden soll. Unter solchen Bedingungen
werden die Pflanzen jedoch so groß, dass sie dazu neigen, von
Taifunen umgeweht zu werden, wodurch somit eine Verringerung der
Erträge
erfolgt. Ein Verfahren für
die Lösung
solcher Probleme besteht darin, Pflanzen zu verzwergen und sie dann
unter gut gedüngten
Bedingungen zu kultivieren. Das sd1-Gen verzwergt Pflanzen nur geringfügig und
tut dies, ohne die Anzahl der Wurzelsprosse oder die Korngröße oder
die Anzahl der Samen zu verringern. Es hält die Pflanzen außerdem davon
ab, unter Bedingungen guter Düngung
umzufallen und verbessert die Form der Pflanze. Auf diese Weise resultiert
das Gen sd1 in Phänotypen,
die sich von denjenigen unterscheiden, die durch die bereits bekannten Zwergengene
d1 und d61 (Ashikari M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:
10284–10289,
1999; Yamamuro C. et al., Plant Cell, 12: 1591–1605, 2000) induziert werden.
Diese Verbesserung bei der Widerstandsfähigkeit gegen Umfallen erlaubt
eine Pflanzen-Kultivierung unter gedüngten Bedingungen; ebenso verstärkt die
Verbesserung der Pflanzenform die Fähigkeit zur Substanzerzeugung
und die Verteilungsrate der Assimilationsprodukte in Körnern und
Samen. Bis zum heutigen Zeitpunkt sind unter Verwendung dieser Eigenschaften
viele Reisvarietäten,
einschließlich
IR64 mit der größten, mit
Reis bepflanzten Fläche
in der Welt, mit durch das sd1-Gen induzierten Phänotypen
versehen worden, indem man zur Zucht neuer Reisvarietäten Rückkreuzungen
durchführte.
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Auf
der anderen Seite müssen
die Kornerträgnisse
bei dem derzeitigen explosionsartigen Bevölkerungswachstum um 50% weiter
gesteigert werden, sodass eine dringende Notwendigkeit besteht,
Varietäten verschiedener
Nutzpflanzen mit hohen Erträgen
zu züchten.
Daher, zur Steigerung der Erträge
verschiedener Pflanzen, landwirtschaftlicher Nutzpflanzen, einschließlich Reis
im Besonderen, ist es vorteilhaft, das sd1-Gen zu nutzen, das unter
gedüngten
Bedingungen stabile Zunahmen des Ertrags induziert. Jedoch ist die
Isolierung und Identifizierung des Gens sd1 von Pflanzen, einschließlich Reis,
noch nicht beschrieben worden.
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Offenbarung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung wurde in Anbetracht dieser Umstände durchgeführt. Es
ist eine Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen,
um unter Verwendung des Gens sd1 Pflanzen als Halbzwergformen zu
erzeugen. Gibberellin (GA), ein Pflanzenhormon, ist an einer Reihe
von Wachstumsprozessen, wie etwa Keimung, Stängel/Blatt-Verlängerung
und Bildung der Blütenknospen,
beteiligt. Der Syntheseweg von GA ist im Detail studiert worden,
und es sind einige Gene, die für
Enzyme codieren, die die GA-Synthese katalysieren, aus Arabidopsis,
Reis, Mais, Kürbis
und dergleichen isoliert worden (Hedden und Kamiya, Annu. Rev. Plant
Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 431–460, 1997). Wenn Gene, die
an der GA-Synthese oder -Signaltransduktion beteiligt sind, fehlerhaft
werden, so wird eine Pflanze unfähig,
GA für
ihr Wachstum zu verwerten und wird somit verzwergt. Tatsächlich haben
viele Berichte beschrieben, dass Defizienzen in Genen, die an der
GA-Synthese oder -Signaltransduktion beteiligt sind, Zwergenmutanten
verursachen (Hedden und Kamiya, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant
Mol. Biol. 48: 431–460,
1997). Somit haben die vorliegenden Erfinder postuliert, dass GA
an der Semi-Verzwergung von Reis beteiligt war und verabreichten
GA an eine sd1-Mutante, Dee-geo-woo-gen, um die Reaktivität gegenüber GA zu
prüfen.
Als Ergebnis wurde durch die GA-Verabreichung eine Stängel/Blatt-Verlängerung
von Dee-geo-woo-gen verursacht. Weiterhin katalysiert die C20-Oxidase, ein GA-Biosynthese-Enzym,
die folgenden Schritte: GA53-GA44-GA19-GA20 und GA12-GA15-GA24-GA9
im GA-Biosyntheseweg. Bis zum heutigen Tag ist C20-Oxidase aus Kürbis, Arabidopsis
und Reis isoliert worden (Lange et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
91: 8552–8556,
1994; Phillips et al., Plant Physiol. 108: 1049–1057, 1995; Xu et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 92: 6640–6644,
1995; Toymasu et al., Physiol. Plant. 99: 111–118, 1997) und es ist für wenigstens
drei C20-Oxidasegene gezeigt worden, dass sie im Arabidopsis-Genom
vorkommen (Phillips et al., Plant Physiol. 108: 1049–1057, 1995).
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Ausgehend
von der vorstehend genannten Erkenntnis haben die vorliegenden Erfinder
angenommen, dass das sd1-Gen ein Gen ist, das an der GA-Biosynthese
beteiligt ist, und insbesondere, dass es ein C20-Oxidasegen ist,
das in Pflanzengenomen wiederholt vorkommt. Wenn dem so ist, erklärt dies,
warum das sd1-Gen aus Reis keine dramatische Verzwergung der Pflanzenform
induziert. Daher war es zunächst
Absicht der Erfinder, das Reisgegenstück der Arabidopsis-C20-Oxidase
zu isolieren und zu identifizieren.
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Im
Ergebnis waren die vorliegenden Erfinder erfolgreich darin, ein
neues Reis-GA C20-Oxidasegen
zu isolieren und zu identifizieren. Weiterhin überprüften die Erfinder, ob der chromosomale
Locus dieses Gens nahe dem Reis-sd1-Locus liegt, und außerdem,
ob das neue Reis-GA C20-Oxidasegen bei Halbzwerg-Varietäten von
Reis mutiert ist. Im Folgenden wurde entdeckt, dass der chromosomale
Locus des Gens extrem nah zu demjenigen von Reis-sd1 liegt. Zusätzlich,
wenn die Nukleotidsequenzen des GA C20-Oxidasegens in mehreren sd1-Mutanten,
einschließlich
Dee-geo-woo-gen und entsprechenden Wildtypen, bestimmt und verglichen
wurden, so waren diese GA C20-Oxidasegene bei allen untersuchten
sd1-Mutanten mutiert. Es wurde daher zum ersten Mal gezeigt, dass
das sd1-Gen aus
Reis identisch mit einem Gen ist, das für eine neue C20-Oxidase codiert,
was anzeigt, dass eine Mutation des Pflanzen sd1-Gens (C20-Oxidase-Gen)
eine Semi-Verzwergung
von Pflanzen induzieren wird.
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Das
Pflanzen-sd1-Gen kann über
Markerselektion in einer effizienten Zucht eingesetzt werden. Wenn eine
Varietät,
in die das sd1-Gen eingeführt
wurde, unter Verwendung konventioneller Kreuzungszüchtung hergestellt
wird, wenn z.B. Koshihikari, die am verbreitetsten kultivierte Reisvarietät in Japan,
mit dem sd1-Gen versehen wird, ist es notwendig, F1-Pflanzen herzustellen,
indem man Koshihikari mit IR64 oder einer solchen Form mit dem sd1-Gen
kreuzt, gefolgt vom wiederholten Rückkreuzen der F1-Pflanzen mit
Koshihikari, bis alle Chromosomen mit Ausnahme des sd1-Genlocus
durch die von Koshihikari ersetzt worden sind. Die Isolierung des
sd1-Gens erlaubt ein großes
Maß an
Zeit- und Arbeitsersparnis bei der Zucht, da es einem die Verwendung
des sd1-Gens als molekularen Marker erlaubt, einzelne Pflanzen,
bei denen die Koshihikari-Chromosomen nur im Bezug auf das sd1-Gen
ersetzt wurden, effizient zu selektieren. Weiterhin erlaubt die
Verwendung des Pflanzen-sd1-Gens die Produktion von Pflanzentransformanten
unter Verwendung molekularbiologischer Techniken, wie etwa von Antisense-
und RNAi-Verfahren.
Es wird auch erwartet, die Erträge
landwirtschaftlicher Nutzpflanzen, einschließlich Getreiden, wie etwa Weizen,
Gerste und Mais, Gemüse
und Fruchtpflanzen zu steigern, und des weiteren, Zierpflanzen,
wie etwa Laubpflanzen, durch Verzwergung ästhetischen Wert zu verleihen,
was in der Erzeugung neuer Varietäten resultiert.
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Spezifisch
bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Isolierung und Identifizierung
eines Gens, das an der Semi-Verzwergung von Pflanzen beteiligt ist,
sowie auf die Semi-Verzwergung
von Pflanzen unter Verwendung des sd1-Gens.
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Gemäß der Erfindung
wird somit eine Reispflanze bereitgestellt, die semi-verzwergt worden
ist durch Einführen
einer DNA gemäß einem
von (a) bis (c):
- (a) einer DNA, codierend für eine Antisense-RNA,
die komplementär
ist zu einem Transkriptionsprodukt einer DNA, die eine Nukleotidsequenz
der SEQ ID NO: 3 umfasst;
- (b) einer DNA, die für
eine RNA mit einer Ribozymaktivität codiert, um spezifisch ein
Transkriptionsprodukt einer DNA zu spalten, die eine Nukleotidsequenz
der SEQ ID NO: 3 umfasst; oder
- (c) einer DNA, die für
eine RNA codiert, welche durch Co-Suppressionseffekte die Expression
einer DNA hemmt, die eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 3 umfasst.
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Die
Erfindung stellt außerdem
folgendes zur Verfügung:
- – Eine
Reispflanze, welche ein Nachkomme oder Klon der Reispflanze der
Erfindung ist;
- – Einen
Samen, eine Ähre,
einen Tubus, Kallus oder Protoplasten der Reispflanze der Erfindung;
- – Ein
Verfahren zur Herstellung der Reispflanze der Erfindung, wobei dieses
Verfahren folgende Schritte umfasst:
- (i) Einführen
einer DNA, welche eine aus (a) bis (c) ist, in eine Reispflanzenzelle;
- (a) einer DNA, codierend für
eine Antisense-RNA, die komplementär ist zu einem Transkriptionsprodukt
einer DNA, die eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 3 umfasst;
- (b) einer DNA, die für
eine RNA mit einer Ribozymaktivität codiert, um spezifisch ein
Transkriptionsprodukt einer DNA zu spalten, die eine Nukleotidsequenz
der SEQ ID NO: 3 umfasst; oder
- (c) einer DNA, die für
eine RNA codiert, welche durch Co-Suppressionseffekte die Expression
einer DNA hemmt, die eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 3 umfasst.
- (ii) Neubildung eines Reispflanzenkörpers aus der Reispflanzenzelle.
- – Ein
Verfahren zum Semi-Verzwergen einer Reispflanze, wobei dieses Verfahren
den Schritt der Suppression der Expression einer endogenen DNA,
die eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 3 umfasst, in Zellen einer
Reispflanze umfasst; und
- – Verfahren
gemäß obiger
Darstellung, wobei die Suppression der Expression erreicht wird
durch Einführen einer
DNA, welche eine aus (a) bis (c) ist, in eine Reispflanze:
- (a) einer DNA, codierend für
eine Antisense-RNA, die komplementär ist zu einem Transkriptionsprodukt
einer DNA, die eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 3 umfasst;
- (b) einer DNA, die für
eine RNA mit einer Ribozymaktivität codiert, um spezifisch ein
Transkriptionsprodukt einer DNA zu spalten, die eine Nukleotidsequenz
der SEQ ID NO: 3 umfasst; oder
- (c) einer DNA, die für
eine RNA codiert, welche durch Co-Suppressionseffekte die Expression
einer DNA hemmt, die eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 3 umfasst.
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Die
vorliegende Erfindung zeigt, dass die Mutation des pflanzlichen
sd1-Gens eine Semi-Verzwergung der Pflanze induziert. Es ist daher
möglich,
eine Semi-Zwergvarietät herzustellen,
die unter gedüngten
Bedingungen stabile hohe Erträge
erbringt, indem man die Expression des pflanzlichen sd1-Gens supprimiert.
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Im
Kontext der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „Semi-Verzwergung
(Halbverzwergung) einer Pflanze" auf
eine leichte Verzwergung der Pflanzenhöhe, ohne dabei die Anzahl der
Wurzelsprosse, die Größe der Körner oder
die Anzahl der Samen zu verringern. Durch diese Halbverzwergung
wird der Pflanze eine Widerstandsfähigkeit gegen das Umfallen
unter gedüngten
Bedingungen verliehen und ihre Form verbessert. Als Ergebnis kann
ein stabiler hoher Ertrag erreicht werden.
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Im
Kontext der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „Pflanzen-sd1-Gen" auf ein Gen, das für die C20-Oxidase
aus Reis codiert (DNA, codierend für die SEQ ID NOs: 3 und 4).
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Die
Identifizierung eines unbekannten „Pflanzen-sd1-Gens" kann mittels Techniken
der Hybridisierung (Southern et al., Journal of Molecular Biology
98: 503, 1975) und der Polymerasekettenreaktion (PCR) (Saiki et
al., Science 230: 1350–1354,
1985; Saiki et al., Science 239: 487–491, 1988) erfolgen. Das bedeutet,
ein Fachmann kann DNAs isolieren, die hochgradig homolog zu dem
sd1-Gen aus anderen gewünschten
Pflanzen sind und deren Sequenzen bestimmen, z.B. unter Verwendung
einer Sonde mit der Nukleotidsequenz des Reis-sd1-Gens (DNA, codierend
für die
SEQ ID NOs: 3 und 4) oder eines Teils hiervon, oder durch die Verwendung
als Primer-Oligonukleotide, die spezifisch an die Nukleotidsequenz
des sd1-Gens hybridisieren.
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Die
Hybridisierungsreaktionen werden für gewöhnlich unter stringenten Bedingungen
durchgeführt, um
solche DNAs zu isolieren. Stringente Hybridisierungsbedingungen
beinhalten Bedingungen wie die folgenden: 6 M Harnstoff, 0,4% SDS
und 0,5 × SSC;
und solche mit einer ähnlichen
Stringenz wie diese Bedingungen. Die Isolierung von DNAs mit höherer Homologie
kann erreicht werden, indem man die Hybridisierung unter Bedingungen
höherer
Stringenz durchführt,
z.B. 6 M Harnstoff, 0,4% SDS und 0,1 × SSC. Die isolierten DNAs
können
mittels bekannter Verfahren sequenziert werden.
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Ob
die isolierte DNA eine DNA ist, die für ein sd1-Protein codiert,
wird für
gewöhnlich
anhand des Ausmaßes
der Homologie zwischen den Sequenzen bewertet.
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Die
Sequenzhomologie kann bestimmt werden unter Verwendung von Programmen,
wie etwa BLASTN (Nukleinsäuresequenzebene)
und BLASTX (Aminosäuresequenzebene) (Altschul
et al., J. Mol. Biol. 215: 403–410,
1990). Diese Programme basieren auf dem Algorithmus „BLAST", der von Karlin
und Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264–2268, 1990;
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873–5877, 1993) beschrieben wurde.
Wenn Nukleotidsequenzen gemäß BLASTN
analysiert werden, werden die Parameter z.B. auf „Treffer" (score) = 100 und
Wortlänge
(word length) = 12 eingestellt. Auf der anderen Seite werden die
Parameter zur Analyse von Aminosäuresequenzen
durch BLASTX z.B. auf „Treffer" (score) = 50 und
Wortlänge (word
length) = 3 eingestellt. Weiterhin, wenn Aminosäuresequenzen unter Verwendung
von BLAST-Programmen mit Lückeneinfügung („gapped
BLAST") analysiert
werden, so kann die Analyse erfolgen, wie von Altschul et al. beschrieben
(Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402,
1997). Wenn BLAST-Programme und BLAST-Programme mit Lückeneinfügung verwendet
werden, so lassen sich die Default-Parameter jedes Programms verwenden.
Spezifische Techniken für
solche Analysen sind in der Technik bekannt (siehe: http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
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Bei
dieser Erfindung werden Reispflanzen mit einer Semi-Zwergeneigenschaft
versehen, indem man die Expression des Gens sd1 supprimiert.
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Eine
Reispflanzen-Transformante, die gemäß der vorliegenden Erfindung
semi-verzwergt ist,
wird hergestellt, indem man eine DNA, die die Expression des sd1-Gens
supprimiert, in einen geeigneten Vektor inseriert, diesen Vektor
in eine Reispflanzenzelle einführt
und die resultierende transformierte Pflanzenzelle dann regeneriert.
Der Begriff „Suppression
der sd1-Gen-Expression" bezieht
sich auf die Suppression der Transkription des sd1-Gens und ebenso
auf die Suppression der Translation zum Protein. Dies umfasst nicht
nur eine vollständige
Abstellung der DNA-Expression, sondern auch eine Verringerung einer
derartigen Expression.
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Die
Expression eines spezifischen endogenen Gens in Pflanzen kann unter
Verwendung von Verfahren der Antisense-Technik, die in der Technik
verbreitet verwendet werden, supprimiert werden. Ecker et al. waren
die ersten, die den Antisense-Effekt einer Antisense-RNA, die durch
Elektroporation in Pflanzenzellen eingeführt wurde, unter Verwendung
des Verfahrens der transienten Genexpression gezeigt haben (Ecker
und Davis (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5372). Danach gab
es Berichte über
eine Verringerung der Zielgen-Expression in Tabak und Petunien durch
das Exprimieren von Antisense-RNAs (Krol et al. (1988) Nature 333:
866). Die Antisense-Technik ist inzwischen als Mittel zur Suppression
der Zielgen-Expression in Pflanzen etabliert worden. Mehrere Faktoren
bewirken die Suppression der Zielgen-Expression durch eine Antisense-Nukleinsäure. Diese
beinhalten: Eine Inhibition der Transkriptionsinitiation, die aus
einer Dreifachstrang-Bildung resultiert; eine Suppression der Transkription,
resultierend aus Hybriden, die an der Stelle ausgebildet werden,
an der die RNA-Polymerase eine lokale offene Loop-Struktur ausgebildet
hat; eine Inhibition der Transkription, resultierend aus der Hybridbildung
mit der RNA, die synthetisiert wird; eine Suppression des Spleißens, resultierend
aus der Hybridbildung an der Verbindungsstelle eines Introns und
eines Exons; eine Suppression des Spleißens, resultierend aus der
Hybridbildung an der Stelle der Spliceosom-Bildung; eine Suppression
der mRNA-Translokation aus dem Zellkern ins Zytoplasma, resultierend
aus der Hybridbildung mit der mRNA; eine Suppression des Spleißens, resultierend
aus der Hybridbildung an der Cap-Stelle oder an der Anfügungsstelle
von poly-A; eine Suppression der Translationsinitiation, resultierend
aus der Hybridbildung an der Bindungsstelle für die Translationsinitiationsfaktoren;
eine Suppression der Translation, resultierend aus der Hybridbildung
an der Stelle der Ribosomenbindung nahe dem Startcodon; eine Inhibition
der Peptidkettenverlängerung,
resultierend aus der Hybridbildung in der translatierten Region
oder an den Polysomen-Bindungsstellen der mRNA; und eine Suppression
der Genexpression, resultierend aus der Hybridbildung an den Stellen
der Interaktion zwischen Nukleinsäuren und Proteinen. Diese Faktoren
unterdrücken
die Zielgen-Expression, indem sie die Prozesse der Transkription,
des Spleißens
und/oder der Translation inhibieren (Hirashima und Inoue, „Shin Seikagaku
Jikken Koza (New Biochemistry Experimentation Lectures) 2, Kakusan
(Nucleic Acids) IV, Idenshi No Fukusei To Hatsugen (Replication
and Expression of Genes)",
Nihon Seikagakukai (The Japanese Biochemical Society) (Herausgeber),
Tokyo Kagaku Dozin, S. 319–347,
(1993)).
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Folglich
kann eine Antisense-Sequenz der vorliegenden Erfindung die Zielgenexpression
durch jeden der obigen Mechanismen supprimieren. Bei einer Ausführungsform,
wenn eine Antisense-Sequenz so ausgestaltet ist, dass sie komplementär zu der
untranslatierten Region nahe dem 5'-Ende der mRNA des Gens ist, wird hierdurch
eine effiziente Hemmung der Translation eines Gens erreicht. Es
ist auch möglich,
Sequenzen zu verwenden, die zu den codierenden Regionen oder zu
der untranslatierten Region des 3'-Endes komplementär sind. Somit beinhaltet die
verwendete Antisense-DNA bei der vorliegenden Erfindung DNA mit
Antisense-Sequenzen sowohl gegen die untranslatierten als auch gegen
die translatierten Regionen des Gens. Die zu verwendende Antisense-DNA
wird stromabwärts
von einem geeigneten Promotor angefügt, und es ist vorzugsweise
eine Sequenz vorhanden, die das Transkriptionsterminationssignal
am 3'-Ende enthält.
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Die
Antisense-DNA kann beispielsweise auf Basis der Sequenzinformation
der DNA gemäß SEQ ID NO:
3 mittels des Phosphorothioat-Verfahrens (Stein, Nucleic. Acid.
Res. 16: 3209–3221,
1988) hergestellt werden. Die hergestellte DNA kann mittels bekannter
Verfahren in die gewünschte
Pflanze transfiziert werden. Die Sequenz der Antisense-DNA ist bevorzugt
eine Sequenz, die komplementär
zu dem endogenen Gen der zu transformierenden Pflanze oder einem
Teil hiervon ist, jedoch muss sie nicht vollkommen (zu 100%) komplementär sein,
solange sie die Genexpression wirkungsvoll inhibieren kann. Die
transkribierte RNA ist bevorzugt zu 90% oder mehr, und bevorzugter
zu 95% oder mehr komplementär
zu den transkribierten Produkten des Zielgens. Um die Expression
des Zielgens mittels einer Antisense-Sequenz wirkungsvoll zu inhibieren, sollte
die Antisense-DNA
wenigstens 15 Nukleotide oder mehr lang sein, bevorzugt 100 Nukleotide
oder mehr, und noch bevorzugter 500 Nukleotide oder mehr. Die zu
verwendende Antisense-DNA ist für
gewöhnlich
kürzer
als 5 kb, und bevorzugt kürzer
als 2,5 kb.
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DNAs,
die Ribozyme codieren, können
verwendet werden, um die Expression eines endogenen Gens zu unterdrücken. Ein
Ribozym ist ein RNA-Molekül,
das katalytische Aktivitäten
besitzt. Es gibt zahlreiche Ribozyme mit verschiedenen Aktivitäten. Die
Forschung über
Ribozyme als RNA-spaltende „Enzyme" hat die Erstellung
eines Ribozyms ermöglicht,
das RNA positionsspezifisch schneidet. Obwohl Ribozyme, wie etwa
diejenigen des Gruppe I-Introntyps und MIRNA, enthalten in RNase
P, mit 400 Nukleotiden oder mehr groß sein können, so gibt es ebenfalls
kleinere, einschließlich
des Hammerkopftyps und des Haarnadeltyps, die eine Aktivitätsdomäne von etwa
40 Nukleotiden oder mehr besitzen (Koizumi und Ohtsuka (1990) Tanpakushitsu
Kakusan Kohso (Protein, Nucleic Acid and Enzyme), 35: 2191).
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Die
Selbstspaltungsdomäne
eines Hammerkopftyp-Ribozyms spaltet an der 3'-Stelle von C15 der Sequenz G13U14C15.
Die Ausbildung eines Nukleotidpaars zwischen U14 und A an der neunten
Position wird als wichtig für
die Ribozymaktivität
betrachtet. Es ist weiterhin gezeigt worden, dass die Spaltung auch
erfolgt, wenn das Nukleotid an der 15. Position A oder U anstatt
C ist (Koizumi et al., (1988) FEBS Lett. 228: 225). Wenn die Substratbindungsstelle
des Ribozyms so ausgestaltet ist, dass sie komplementär zu den
RNA-Sequenzen ist, die an die Zielstelle angrenzen, so kann man
ein Restriktionsenzym-artiges
RNA-spaltendes Ribozym herstellen, das die Sequenz UC, UU oder UA
innerhalb der Ziel-DNA erkennt (Koizumi et al. (1988) FEBS Lett.
239: 285; Koizumi und Ohtsuka (1990) Tanpakushitsu Kakusan Kohso
(Protein, Nucleic Acid and Enzyme), 35: 2191; Koizumi et al. (1989),
Nucleic Acids Res. 17: 7059).
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Das
Haarnadeltyp-Ribozym ist ebenfalls bei der vorliegenden Erfindung
nützlich.
Ein Haarnadeltyp-Ribozym findet sich z.B. im Minusstrang der Satelliten-RNA
des Tabak- Ringfleckenvirus
(tabacco ringspot virus) (Buzayan (1986) Nature 323: 349). Für dieses
Ribozym ist außerdem
gezeigt worden, dass es in zielspezifischer Weise RNA schneidet
(Kikuchi und Sasaki (1992) Nucleic Acids Res. 19: 6751; Kikuchi
(1992) Kagaku To Seibutsu (Chemistry and Biology) 30: 112).
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Ein
Ribozym, das so gestaltet ist, dass es das Ziel schneidet, wird
mit einem Promotor fusioniert, wie etwa mit dem Cauliflower Mosaic
Virus 35S-Promotor, sowie mit einer Transkriptionsterminationssequenz,
so dass es in Pflanzenzellen transkribiert wird. Wenn jedoch zusätzliche
Sequenzen an das 5'-Ende
oder an das 3'-Ende
der transkribierten RNA angefügt
worden sind, so kann die Ribozymaktivität verloren gehen. In diesem Fall
kann man ein zusätzliches
Ribozym zum Zurechtschneiden („trimming
ribozyme") hinzufügen, das
in cis funktioniert, um das Zurechtschneiden der 5'- oder der 3'-Stelle des Ribozymanteils
durchzuführen,
um den Ribozymanteil aus der transkribierten RNA, die das Ribozym
enthält,
präzise
herauszuschneiden (Taira et al. (1990) Protein Eng. 3: 733; Dzaianott
und Bujarski (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA 86: 4823; Grosshands und
Cech (1991) Nucleic Acids. Res. 19: 3875; Taira et al. (1991) Nucleic
Acid. Res. 19: 5125). Es können mehrere
Stellen innerhalb eines Zielgens geschnitten werden, indem man diese
Struktureinheiten im Tandem anordnet, um größere Wirkungen zu erzielen
(Yuyama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186: 1271 (1992)).
Unter Verwendung solcher Ribozyme ist es möglich, die Transkriptionsprodukte
eines Zielgens der vorliegenden Erfindung spezifisch zu schneiden
und dadurch die Expression des Gens zu unterdrücken.
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Die
endogene Genexpression kann außerdem
durch Co-Suppression unterdrückt
werden, durch die Transformation mit einer DNA, die eine Sequenz
besitzt, die der Zielgensequenz gleich oder ähnlich hierzu ist. „Co-Suppression" bezieht sich auf
ein Phänomen,
bei dem es bei der über
Transformation erfolgenden Einführung
eines Gens mit einer Sequenz, die identisch oder ähnlich zu
einer endogenen Zielgensequenz ist, in Pflanzen, dazu kommt, dass
sowohl die Expression des eingeführten
exogenen Gens als auch die Expression des endogenen Zielgens unterdrückt werden.
Obwohl der detaillierte Mechanismus der Co-Suppression nicht voll
verstanden ist, wird sie oft in Pflanzen beobachtet (Curr. Biol.
7: R793, 1997; Curr. Biol. 6: 810, 1996). Wenn man z.B. beabsichtigt,
einen Reispflanzenkörper
zu erhalten, bei dem das sd1-Gen co-supprimiert wird, so kann eine
Reispflanze mit einer Vektor-DNA transformiert werden, die so gestaltet
ist, dass sie das sd1-Gen oder eine DNA mit einer ähnlichen
Sequenz exprimiert, um eine Reispflanze zu selektieren, die eine
Eigenschaft der sd1-Mutante besitzt, d.h. eine semi-verzwergte Reispflanze
unter den resultierenden Pflanzen. Das Gen, das für die Co-Suppression
verwendet werden soll, muss nicht völlig identisch mit dem Zielgen
sein, aber es sollte wenigstens 70% oder mehr, bevorzugt 80% oder
mehr, und bevorzugter 90% oder mehr (z.B. 95% oder mehr) an Sequenzidentität hierzu
besitzen.
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Zusätzlich kann
die endogene Genexpression bei der vorliegenden Erfindung auch supprimiert
werden, indem man eine Reispflanze mit einem Gen transformiert,
das den dominant negativen Phänotyp
des Zielgens hat. Ein Gen mit dem dominant negativen Phänotyp bezieht
sich auf ein Gen, das, wenn es exprimiert wird, die Aktivität des wildtypischen
endogenen Gens, das der Pflanze eigen ist, eliminieren oder reduzieren kann.
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Vektoren,
die zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind,
umfassen DNAs, die befähigt
sind, die Expression eines oben beschriebenen endogenen Gens zu
unterdrücken;
weiterhin einbezogen sind transformierte Pflanzenzellen, die solche
DNAs in einem exprimierbaren Zustand enthalten, Pflanzentransformanten,
die die transformierten Pflanzenzellen enthalten, Pflanzentransformanten,
die Nachkommen oder Klone der obigen Pflanzentransformanten sind,
sowie Zuchtmaterial von den Pflanzentransformanten.
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Weiterhin
betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer zuvor
genannten Reispflanzentransformante, umfassend folgende Schritte:
Einführen
einer DNA, die befähigt
ist, die Expression eines endogenen Gens zu unterdrücken, in
eine Reispflanzenzelle und Regenerieren einer Reispflanze aus der
Pflanzenzelle.
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Die
hier beschriebenen DNAs können
durch Verfahren in Reispflanzenzellen eingeführt werden, die dem Fachmann
bekannt sind, so etwa durch das Verfahren des Agrobacterium-vermittelten Transfers,
das Verfahren der Elektroporation und das Verfahren des Partikelbeschusses.
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Als
oben genanntes Agrobacterium-Verfahren kann z.B. das Verfahren von
Nagel et al. (Microbiol. Lett. 67: 325, 1990) verwendet werden.
Gemäß diesem
Verfahren wird ein rekombinanter Vektor in Bakterienzellen von Agrobacterium
transformiert und das transformierte Agrobacterium wird dann über bekannte
Verfahren, wie etwa durch das Blattscheiben-Verfahren, in die Pflanzenzellen
eingeschleust. Der oben beschriebene Vektor beinhaltet z.B. einen
Promotor, der es ermöglicht,
dass die DNA dieser Erfindung nach ihrer Einführung in eine Pflanze exprimiert
wird. Im allgemeinen befindet sich die DNA dieser Erfindung stromabwärts eines
solchen Promotors, und weiterhin liegt ein Terminator stromabwärts der
DNA. Rekombinante Vektoren, die für eine solche Transformation
verwendet werden, werden in geeigneter Weise von einem Fachmann
ausgewählt,
und zwar in Abhängigkeit
vom Transformationsverfahren oder dem Typ der Pflanze. Die vorstehend genannten
Promotoren beinhalten z.B. den CaMV35S-Promotor, der aus Cauliflower
Mosaic Virus stammt, und den Ubiquitin-Promotor aus Mais (ungeprüfte veröffentlichte
japanische Patentanmeldung Nr. (JP-A) Hei2-79983).
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Weiterhin
beinhalten die oben beschriebenen Terminatoren einen, der vom Cauliflower
Mosaic Virus abgeleitet ist, und einen, der vom Nopalin-Synthasegen
abgeleitet ist. Jedoch ist die Erfindung darauf nicht beschränkt; es
können
alle Promotoren oder Terminatoren, die in einer Reispflanze funktionieren
können,
verwendet werden.
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Zusätzlich kann
die Reispflanze, in die eine DNA eingeführt wird, ein herausgenommenes
Transplantatgewebe sein. Alternativ können Kulturzellen aus Reispflanzen
hergestellt werden, und es kann DNA in die kultivierten Zellen eingeführt werden.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung beinhaltet der Begriff „Pflanzenzellen" z.B. Zellen von
Blättern,
Wurzeln, Stängeln,
Blüten,
Samen, dem Skutellum, Kalli und Kulturzellsuspensionen.
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Weiterhin,
für eine
effiziente Selektion der Reispflanzenzellen, die durch Einführen einer
DNA transformiert wurden, enthalten die oben beschriebenen rekombinanten
Vektoren vorzugsweise ein geeignetes Selektionsmarkergen oder werden
vorzugsweise zusammen mit einem Plasmidvektor, der ein solches Selektionsmarkergen
enthält,
in Pflanzenzellen eingeführt.
Die hier verwendeten Selektionsmarkergene beinhalten beispielsweise
das Hygromycin-Phosphotransferasegen für Resistenz gegenüber dem
Antibiotikum Hygromycin, das Neomycin-Phosphotransferasegen für Resistenz
gegenüber
Kanamycin oder Gentamycin und das Acetyltransferasegen für Resistenz
gegenüber
einem Herbizid, Phosphinotricin.
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Reispflanzenzellen,
in die rekombinante Vektoren eingeführt wurden, werden auf bekannten
Selektionsmedien mit einem geeigneten Selektionswirkstoff plattiert
und kultiviert, wobei der Selektionswirkstoff gemäß dem Typ
des eingeführten
Selektionsmarkergens variiert. Im Ergebnis können transformierte Kulturzellen aus
Reispflanzen erhalten werden.
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Es
können
dann aus den Reispflanzenzellen, die mit der DNA gemäß der vorliegenden
Erfindung transformiert wurden, Reispflanzen regeneriert werden.
Die Regeneration der Pflanze kann in Abhängigkeit vom Typ der Pflanzenzelle
mittels bekannter Verfahren durchgeführt werden (Toki et al., (1995)
Plant Physiol. 100: 1503–1507).
Beispielsweise beinhalten Transformations- und Regenerationsverfahren
für Reispflanzen: (1)
Einführen
von Genen in Protoplasten unter Verwendung von Polyethylenglykol
und Regenerieren des Pflanzenkörpers
(geeignet für
indica-Reisvarietäten)
(Datta et al., (1995) in „Gene
Transfer to Plants",
Potrykus I und Spangenberg, Herausgeber, S. 66–74); (2) Einführung von
Genen in Protoplasten unter Verwendung elektrischer Pulse und Regenerieren
des Pflanzenkörpers
(geeignet für
japonica-Reisvarietäten)
(Toki et al. (1992) Plant Physiol. 100: 1503–1507); (3) Einführung von
Genen direkt in die Zellen über
Teilchenbeschuss und Regenerieren des Pflanzenkörpers (Christou et al. (1991)
Bio/Technology, 9: 957–962);
und (4) Einführen von
Genen unter Verwendung von Agrobacterium und Regenerieren des Pflanzenkörpers (Hiei
et al. (1994) Plant J. 6: 271–282).
Diese Verfahren sind bereits etabliert und werden in der Technik
breit angewendet. Dem entsprechend können solche Verfahren in geeigneter
Weise bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
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Es
wird dann ein Reispflanzenkörper,
der aus transformierten Zellen regeneriert wird, in einem konditionierten
Medium kultiviert. Wenn der akklimatisierte, regenerierte Reispflanzenkörper nachfolgend
unter den üblichen
Kulturbedingungen kultiviert wird, so wird ein Halbzwerg-Reispflanzenkörper erhalten,
der dann ausreift und fruchtet, um Samen zu produzieren.
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Hierbei
kann die Gegenwart der eingeführten
Fremd-DNA in der Pflanzentransformante, die gemäß obiger Beschreibung regeneriert
und kultiviert wurde, durch die bekannten PCR-Verfahren oder Southern
Hybridisierungs-Verfahren oder durch die Nukleotidsequenzanalyse
der DNA in dem Pflanzenkörper
bestätigt werden.
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In
diesem Fall kann die DNA-Extraktion aus der Pflanzentransformante
gemäß dem bekannten
Verfahren von J. Sambrook et al. (Molecular Cloning, 2. Auflage,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) durchgeführt werden.
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Wenn
ein Fremdgen mit einer DNA gemäß der vorliegenden
Beschreibung in dem regenerierten Pflanzenkörper mittels PCR-Verfahren
analysiert wird, so wird die Amplifikationsreaktion durchgeführt, indem
man als Matrize die DNA verwendet, die gemäß obiger Beschreibung aus dem
regenerierten Pflanzenkörper
extrahiert wurde. Weiterhin können
synthetische Oligonukleotide mit Nukleotidsequenzen, die gemäß der Sequenz des
Fremdgens in geeigneter Weise ausgewählt wurden, als Primer verwendet
werden, um eine Amplifikationsreaktion in einer Reaktionslösung durchzuführen, die
das Gemisch dieser Oligonukleotide enthält. Bei der Amplifikationsreaktion
lassen sich Amplifikationsprodukte von DNA-Fragmenten mit einer
DNA-Sequenz des Fremdgens erhalten, indem man das Denaturieren,
das Annealing und die Verlängerungsreaktionen
der DNA mehrere zehn Male wiederholt. Wenn eine Reaktionslösung mit
den Amplifikationsprodukten z.B. auf einem Agarosegel einer Elektrophorese
unterzogen wird, so werden die verschiedenen amplifizierten DNA-Fragmente
aufgetrennt, um zu bestätigen,
inwieweit das DNA-Fragment dem Fremdgen entspricht.
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Sobald
eine transformierte Reispflanze, bei der eine DNA in das Chromosom
eingeführt
wurde, erhalten wurde, ist es möglich,
Abkömmlinge
von dieser Pflanze durch sexuelle oder vegetative Vermehrung zu
erhalten. Alternativ können
Pflanzen aus Zuchtmaterialien (z.B. Samen, Früchten, Ähren, Knollen, Knöllchen, Tubus,
Kallus und Protoplasten), die aus der ursprünglichen transformierten Pflanze
oder ihren Nachkommen oder Klonen erhalten werden, in Massen produziert
werden. Reispflanzenzellen, die mit einer DNA transformiert wurden,
Pflanzenkörper,
die diese Zellen beinhalten, Nachkommen und Klone der Pflanze, ebenso
wie Zuchtmaterialien, die von der Pflanze, ihren Nachkommen oder
Klonen erhalten werden, sind alle von der vorliegenden Erfindung
umfasst.
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Bei
der vorliegenden Erfindung kann die Semi-Verzwergung einer Reispflanze
induziert werden, indem man die Expression des sd1-Gens gemäß obiger
Beschreibung supprimiert. Von semi-verzwergten Reispflanzen, die
mittels des Verfahrens dieser Erfindung produziert werden, ist zu
erwarten, dass sie z.B. nützlich als
landwirtschaftliche Nutzpflanzen sind, die stabil hohe Erträge liefern
können.
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Eine
DNA, die für
das Reis-sd1-Protein codiert, ist hier beschrieben. Die sd1-DNA
kann für
die Förderung
des Pflanzenwachstums verwendet werden, insbesondere zur Verstärkung der
Stängel/Blatt-Verlängerung.
Die Herstellung einer Pflanzentransformante unter Verwendung einer
DNA, die für
das Reis-sd1-Protein codiert, kann mittels des oben beschriebenen
Verfahrens durchgeführt
werden. Genauer gesagt, kann eine solche Herstellung erfolgen, indem
man die DNA in den vorstehend genannten Vektor inseriert, den resultierenden
rekombinanten Vektor in Pflanzenzellen einführt und einen Pflanzenkörper aus
den transformierten Pflanzenzellen regeneriert. Des weiteren ist
es, basierend auf der DNA-Sequenz, die für das Reis-sd1-Protein codiert,
möglich,
DNA herzustellen, die Antisense-RNA codiert, DNA, die für RNA mit
der Ribozymaktivität
codiert, und weiterhin DNA, die für RNA mit co-supprimierenden
Wirkungen codiert, und so weiter, die alle verwendet werden, um
die Expression des pflanzlichen sd1-Gens zu supprimieren. Derartig
hergestellte DNAs können
verwendet werden, um eine Semi-Verzwergung der Reispflanze zu induzieren.
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Das
hier beschriebene „Reis-sd1-Protein" umfasst nicht nur
ein Protein der SEQ ID NO: 4, sondern auch aus Reis stammende Proteine,
die funktionell äquivalent
zu diesem Protein sind. Diese Proteine beinhalten sowohl solche,
die künstlich
hergestellt werden, als auch solche, die endogen im Reis vorkommen.
Hier zeigt der Begriff „funktionell äquivalent" an, dass das Protein
von Interesse die GA-Syntheseaktivität und die Aktivität der Stängel/Blatt-Verlängerung
bei Einführung
in Pflanzen besitzt. Diese Proteine beinhalten Mutanten, Homologe
und Varianten des Proteins gemäß der SEQ
ID NO: 4.
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Proteine,
die dem Reis-sd1-Protein funktionell äquivalent sind, können z.B.
unter Verwendung eines Mutagenese-Verfahrens hergestellt werden,
das dem Fachmann bekannt ist, um Mutation(en) in die Aminosäuresequenz
eines Proteins einzuführen
(z.B. positionsspezifische Mutageneseverfahren (Ausubel et al., Current
Protocols in Molecular Biology, herausgegeben/veröffentlicht
von John Wiley & Sons,
Abschnitt 8: 1-8.5, 1987). Weiterhin können endogene Proteine im Reis,
die durch Aminosäuremutation(en)
in der Natur entstanden sind, mittels einer DNA der SEQ ID NO: 3
unter Verwendung von Hybridisierungstechniken, Genamplifikationstechniken
(PCR) und dergleichen isoliert werden.
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Proteine
mit der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 4, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren substituiert,
deletiert, inseriert und/oder addiert wurden, sind in diese Erfindung
einbezogen, solange sie eine funktionelle Äquivalenz gegenüber der
Funktionsweise des Reis-sd1-Proteins besitzen. Die Anzahl der Mutationen
in dem Protein beträgt
typischerweise 30 Aminosäuren
oder weniger, bevorzugt 10 Aminosäuren oder weniger, bevorzugter
5 Aminosäuren
oder weniger (z.B. 3 Aminosäuren
oder weniger); es gibt jedoch keine Begrenzung hinsichtlich der
Anzahl und der Stelle der Mutationen, solange die Proteinfunktion
erhalten bleibt. Vom Aspekt des Erhalts der Proteinfunktion aus
besitzt eine substituierte Aminosäure bevorzugt eine ähnliche Eigenschaft
wie die Aminosäure,
die als Austausch eingefügt
wird. Da beispielsweise Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe und Trp
alle als nicht polare Aminosäuren
klassifiziert werden, ist es wahrscheinlich, dass sie jeweils ähnliche
Eigenschaften besitzen. Weiterhin beinhalten nicht geladene Aminosäuren Gly,
Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn und Gln. Weiterhin sind die sauren Aminosäuren beispielhaft
durch Asp und Glu vertreten, die basischen Aminosäuren dagegen
durch Lys, Arg und His.
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Bei
dieser Erfindung gibt es keine bestimmte Begrenzung hinsichtlich
des Typs der DNAs, die für
ein Reis-sd1-Protein, das verwendet werden kann, codieren, solange
sie in der Lage sind, das oben beschriebene Protein zu codieren;
es können
genomische DNAs, chemisch synthetisierte DNAs oder cDNA sein. Zusätzlich umfassen
die DNAs dieser Erfindung diejenigen mit einer willkürlichen
Nukleotidsequenz auf Basis der Degeneriertheit des genetischen Codes,
solange sie befähigt
sind, für
ein Reis-sd1-Protein zu codieren. DNAs, die für ein Reis-sd1-Protein codieren,
können
gemäß obiger
Beschreibung mittels Standardverfahren isoliert werden, so etwa
durch Hybridisierungstechniken unter Verwendung der DNA-Sequenz
von SEQ ID NO: 3 oder eines Teils hiervon als Sonden und durch Genamplifikationsverfahren
(PCR) unter Verwendung von Primern, die basierend auf der Information über solche
DNA-Sequenzen erstellt werden. Diese Sonden und Primer können von
einem Fachmann unter Verwendung bekannter Techniken, basierend auf
der DNA, die für
das Reis-sd1-Protein, wie hier beschrieben, codiert, leicht hergestellt
werden.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 ist
ein Diagramm, das Mutationsstellen des sd1-Gens in Dee-geo-woo-gen,
Calrose 76 und Reimei zeigt.
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Beste Weise
zur Durchführung
der Erfindung
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Hier
im Folgenden wird die vorliegende Erfindung spezifischer unter Verwendung
von Beispielen beschrieben. Jedoch ist die vorliegende Erfindung
nicht als hierauf beschränkt
zu verstehen.
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Beispiel 1
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Basierend
auf der Sequenz des Arabidopsis C20-Oxidasegens wurden die Primer
OsC20U (5'-ccgctcgccgagaagcgccg-3'/SEQ ID NO: 1) und
OsC20L (5'-atgaaggtgtcgccgatgtt-3'/SEQ ID NO: 2) entworfen.
Die PCR erfolgte mit der genomischen DNA von „Nipponbare"-Reis als Matrize,
mit dem Ziel, das GA C20-Oxidasegen von Reis zu isolieren. Als Ergebnis
wurde ein Amplifikationsprodukt von 618 bp erhalten und sequenziert,
um zu zeigen, dass es ein neues GA-Oxidasegen von Reis ist. GAC20
gehört
zur Familie der 2-Oxoglutarat-abhängigen Dioxygenasen (2-ODD-Familie)
und konserviert die funktionell essentielle Domäne (NYYPXCXXP) für die Bindung
von 2-Oxoglutarat. Weiterhin konserviert GAC20 außerdem drei
Histidinreste, um das Fe-Ion zu binden, und die Domäne LPWKET,
die an der Bindung von GA beteiligt sein kann. Das GAC20-Gen aus
Reis zeigt eine 50%ige Homologie zu dem aus Arabidopsis.
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Beispiel 2
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Die
Verknüpfungsanalyse
für den
chromosomalen Lokus dieses neuen GAC20-Oxidasegens unter Verwendung von BIL
(1998; TAG 96: 997–1003,
Mapping quantitative trait loci controlling seed dormancy and heading
date in rice, Oryza sativa L., using backcross inbred lines) zeigte,
dass das Gen bei etwa 155 cM auf dem Reischromosom 1 liegt. Dieser
Locus liegt extrem nah zum Locus des sd1-Gens, eine Tatsache, die
stark auf die Möglichkeit
hinweist, dass das Reis-C20-Oxidasegen mit dem sd1-Gen identisch
ist.
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Beispiel 3
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Es
wurde eine genomische Bibliothek aus dem Wildtyp Nipponbare konstruiert,
und Genomklone, die das GAC20-Oxidasegen umfassen, wurden unter
Verwendung von Verfahren der Plaque-Hybridisierung isoliert, um
die vollständige
Nukleotidsequenz des Gens zu bestimmen (SEQ ID NO: 3). Die abgeleitete
Aminosäuresequenz
der GAC20-Oxidase
ist in der SEQ ID NO: 4 dargestellt.
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Beispiel 4
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Die
Nukleotidsequenzen des GAC20-Oxidasegens in der sd1-Mutante Dee-geo-woo-gen und dem korrespondierenden
Wildtyp Woo-gen wurden zum Vergleich bestimmt. Es wurde so herausgefunden,
dass eine Nukleotidsequenz von 386 bp, die sich von Exon 1 nach
Exon 2 erstreckt, in Dee-geo-woo-gen deletiert war. Die Nukleotidsequenzen
des GAC20-Oxidasegens in anderen sd1-Mutanten wurden ebenfalls bestimmt. Als
Ergebnis war bei einer sd1-Mutante, Calrose 76, ein Nukleotid (Cytosin)
in Exon 2 durch Thymin ersetzt, und auf Aminosäureebene war Leucin durch Phenylalanin
ersetzt. In ähnlicher
Weise war bei einer sd1-Mutante, Reimei, ein Nukleotid (Guanin)
in Exon 3 durch Cytosin ausgetauscht, und auf Aminosäureebene
war Asparaginsäure
durch Histidin ausgetauscht (1).
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Industrielle
Anwendbarkeit
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Verwendung eines
Pflanzen-sd1-Gens
zur Semi-Verzwergung von Reispflanzen bereit. Es ist in hohem Maße anzunehmen,
dass die Verwendung von Pflanzen-sd1-Genen eine Steigerung des Ertrags
von Reispflanzen ermöglichen
und weiterhin den Ertrag und die effiziente Zucht von verzwergten
Reispflanzen durch Markerselektion steigern wird.
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