CN104169424A - 通过abph2改良植物的农学特性 - Google Patents

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R.约翰逊
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Abstract

本发明提供了用于调节植物的农学特性的方法和组合物。本发明提供了用于调节Abph2序列在宿主植物或植物细胞中的表达的方法，所述方法用于调节农学特性诸如改变穗数量和增加产量。

Description

通过ABPH2改良植物的农学特性
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求2012年3月14日提交的美国临时申请No.61/610690的权益，其全部内容以引用方式并入本文。
政府支持
本文所述发明受政府整体或部分支持，美国农业部批准号为2011-67013-30031，由国家食品与农业研究所(National Institute of Food andAgriculture)以农业和食品研究计划竞争性赠款项目(Agriculture and FoodResearch Initiative Competitive Grants Program)资助。美国政府在本发明中享有某些权利。
技术领域
本公开涉及改良作物特性领域。
背景技术
植物形态和多样性在很大程度上依赖于叶序的建立，所述叶序起始于茎尖分生组织(SAM)中的一团干细胞。叶和产生分枝与花的腋生分生组织以规则模式起始于茎尖分生组织(SAM)。茎尖分生组织顶端的细胞用作干细胞，所述干细胞分裂以连续置换子细胞至周围区域，其中它们进入分化的叶或花原基。分生组织从而能够在发育期间通过平衡细胞增殖与细胞进入新的原基中来调节它们的尺寸。SAM提供植物体的所有地上部分。
在交叉对生(对生)模式中，叶片沿茎成对对生排列，连续的每一对(叶片)成90度取向。例如，例子，莎草属(Cyprus)具有交叉对生模式。在二列(互生)模式中，单个叶片交替排列在茎的两侧。例如，玉米具有互生叶序。在旋生叶序中，单个叶片偏置角度约为137.5度。例子包括拟南芥(Arabidopsis)和其他植物。植物中叶序在发育过程中能够改变。在玉米中，如上所述茎上的主叶排列成互生叶序，而穗上的外皮排列为旋生叶序。
生长素是控制叶序模式的重要因素。对玉米叶序突变体的研究表明细胞分裂素，以及它与生长素的串扰，在这个过程中起重要作用。
干细胞调控的中心概念通过CLAVATA/WUSCHEL(CLV/WUS)基因的信号途径是已知的。在拟南芥(Arabidopsis)中CLV1、CLV2或CLV3活性的丧失导致茎端中未分化细胞的积累，表明CLV基因一起促进了干细胞及时过渡至分化途径、或抑制干细胞分裂、或两者都有(Fletcher等人(1999)Science283：1911-1914；Taguchi-Shiobare等人(2001)Genes andDevelopment15：2755-5766；和Trotochaud等人(1999)Plant Cell11：393-405；Merton等人(1954)Am.J.Bot.41：726-32和Szymkowiak等人(1992)Plant Cell4：1089-100；Yamamoto等人(2000)Biochim.Biophys.Acta.1491：333-40)。已经报道了CLV1/2的玉米直系同源物为TD1和FEA2(Taguchi-Shiobara等人(2001)Genes Dev.6515：2755-66)。期望能够控制苗和花分生组织的尺寸和外观，从而提供提高的叶、花、和果实的产量。因此，本发明的目的是为了提供用于调节分生组织发育的新型方法和组合物。
调节叶序和花序发育在改良作物植物的农学特性中起重要作用。
发明内容
在一个实施例中，本公开提供了一种制备转基因植物的方法，所述转基因植物具有调节的Abph2的表达，所述方法包括以下步骤：(a)将包含可操作地连接至启动子的多核苷酸序列的重组构建体导入可再生的植物细胞中，其中所述多核苷酸序列的表达调节Abph2表达；(b)在步骤(a)后从可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)选择(b)的转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组DNA构建体并在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出调节的Abph2的表达。
一种制备转基因植物的方法，所述转基因植物具有调节的Abph2的表达，所述方法包括：(a)将包含可操作地连接至启动子的多核苷酸的重组构建体导入可再生的植物细胞中，其中所述多核苷酸序列的表达调节Abph2的表达或活性；(b)在步骤(a)后从可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)选择(b)的转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组构建体并在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，表现出Abph2的表达的改变。
一种制备转基因植物的方法，所述转基因植物具有调节的Abph2的表达，所述方法包括调节多核苷酸的表达，所述多核苷酸编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1至少70％相同的序列。
一种制备转基因植物的方法，所述转基因植物具有调节的Abph2的表达，所述方法包括调节多核苷酸的表达，所述多核苷酸编码选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：1和6-31、它们的功能结构域、以及与SEQ ID NO：1和6-31至少70％相同的序列。
一种增加玉米植物产量的方法，所述方法包括转基因改变Abph2基因的表达，使得每株玉米植物收获的穗的数量相对于未经此类转基因改变的玉米植物增加。
附图说明和序列表
根据以下的详细描述和附图以及序列表，可以更全面地理解本公开，以下的详细描述和附图以及序列表形成本申请的一部分。此序列表中以一个字母代码表示核苷酸序列字符，以三个字母代码表示氨基酸，如NucleicAcids Research13：3021-3030(1985)和Biochemical Journal219(No.2)：345-373(1984)所描述的IUPAC-IUBMB标准中所规定，2)：345-373(1984)，其以引用方式全文并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循37C.F.R.§1.822所示的规定。
图1显示了Abph2突变型植物在大约第5叶后具有对生和交互对生叶片，并且茎分生组织比野生型植物宽。在一些遗传背景中，Abph2植物发育了多个茎。图1B和1C显示在ABPH2植物中茎分生组织更宽。
图2显示了Abph2的插入区域和基于作图的克隆方法以分离Abph2等位基因。
图3显示了Abph2基因座从它在7号染色体上的原始位置至新的染色体位置的可能易位。在原始位置和易位后的位置之间的近似染色体距离是大约800kb。“GRX”表示谷氧还蛋白基因。“BRF”表示分支超家族基因。
图4A显示了靶向EMS敲除筛选被用于开发两种独立的Abph2表型回复突变体，其在谷氧还蛋白基因中有突变。图4B和图4C分别显示了两种独立突变体V65M和C75T。
图5A显示了pAbph2：：ABPH2-YFP转基因拟表型Abph2A，并由荧光成像确认(图5B)。
图6A显示了与野生型植物相比Abph2在叶原基中的表达模式。图6B中显示了Abph2在花药中的表达模式。
图7A显示了ABPH2(GRX)和FEA4(bZIP)在核内如何相互作用的模型。图7B通过双分子荧光互补显示了FEA4和ABPH2的相互作用(nYFP-ABPH2+cYFP-FEA4)。图7C是负对照(nYFP-AS1+cYFP-FEA4)。
图8经由酵母双杂交相互作用显示了ABPH2(GRX)和FEA4(bZIP相互作用因子)的相互作用。SD/-LW无亮氨酸和色氨酸的合成缺陷性培养基；SD/-AHLW无腺嘌呤、组氨酸、亮氨酸和色氨酸的合成缺陷性培养基。
图9显示了调控分生组织尺寸的途径的示意图，并且显示了ABPH2和FEA4的功能相互作用。
序列描述(表1)以及所附序列表遵循如37C.F.R.§1.821-1.825所列出的关于专利申请中核苷酸和/或氨基酸序列公开的规定。此序列表中以一个字母代码表示核苷酸序列字符，以三字母代码表示氨基酸，如NucleicAcidsRes.13：3021-3030(1985)和BiochemicalJ.219(2)：345-373(1984)中，它们引入本文以供参考。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37C.F.R.§1.822所示的规定。
表1
*多核苷酸(PN)；多肽(PP)
序列描述以及所附序列表遵循如37C.F.R.§1.821-1.825所列出的关于专利申请中核苷酸和/或氨基酸序列公开的规定。
此序列表中以一个字母代码表示核苷酸序列字符，以三字母代码表示氨基酸，如Nucleic Acids Res.13：3021-3030(1985)和Biochemical J.219(No.2)：345-373(1984)所描述的IUPAC-IUBMB标准中所规定，它们引入本文以供参考。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37C.F.R.§1.822所示的规定。
具体实施方式
本文中所列出的每篇参考文献的公开内容均全文以引用方式并入本文。
除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”以及“所述”包括复数涵义。因此，例如，“一株植物(a plant)”的涵义包括多株此类植物，“一个细胞(acell)”的涵义包括一个或多个细胞以及它们为本领域技术人员所知的等同物，诸如此类。
如本文所用：
术语“单子叶植物”和“单子叶的植物”在本文中互换使用。本公开的单子叶植物包括禾本科(Gramineae)。
术语“双子叶植物”和“双子叶的植物”在本文中互换使用。本公开的双子叶植物包括下列科：十字花科(Brassicaceae)、豆科(Leguminosae)和茄科(Solanaceae)。
术语“全长互补序列”和“全长的互补序列”在本文中互换使用，是指给定核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且是100％互补的。
“转基因”指其基因组因异源核酸(诸如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植株部分或植株，包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性繁殖而产生的那些。如本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变。
“基因组”在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还包括存在于细胞的亚细胞组分(例如线粒体、质粒)中的细胞器DNA。
术语“Abph2”和“Abhyl2”在本文中互换使用。
“调节的Abph2的表达”或“调节Abph2的表达”或“经改变的/改变Abph2的表达”大体是指改变一个或多个表达参数，诸如强度(大小)、特异性(例如，组织特异性)和时间(时机-即，在胚胎形成期间)。此外，通过改变Abph2的氨基酸序列使得其活性受到影响也能实现此类调节或改变。此外，通过影响内源性Abph2基因的调控因子，人们能够调节Abph2的表达和/或活性。
“植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及同一植株的子代。植物细胞无包括但不限于来自种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子的细胞。
“子代”包括植物的任何后续世代。
“转基因植物”包括在其基因组内包含异源性多核苷酸的植物。举例来说，异源性多核苷酸被稳定地整合到基因组内，以使得该多核苷酸传给连续几代。异源性多核苷酸可以单独地或作为重组DNA构建体的一部分整合到基因组中。
“性状”指植物或特定植物材料或细胞的生理学、形态学、生物化学、或物理学特性。在某些情况下，这种特征是人眼可见的，诸如种子或植物大小，或者能够通过生物化学技术测量，诸如检测种子或叶片的蛋白质、淀粉、或油含量，或者通过观察代谢或生理过程，例如通过测量缺水耐受性或特定盐或糖浓度的耐受性，或者通过观察一个或多个基因的表达水平，或者通过农学观察诸如渗透胁迫耐受性或产量。
“农学特性”是可测量的参数，包括但不限于穗分生组织尺寸、雄穗尺寸、绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植株高度、穗高、穗长、耐盐性、早期幼苗活力和在低温胁迫下的出苗。
针对序列而言的“异源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改性的序列。
“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用，并且指为单链或双链的RNA或DNA聚合物，任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸(通常以它们的5′-单磷酸形式存在)通过它们的单字母命名指代如下：“A”是指腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别用于RNA或DNA)，“C”是指胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”是指鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”是指尿苷酸，“T”是指脱氧胸苷酸，“R”是指嘌呤(A或G)，“Y”是指嘧啶(C或T)，“K”是指G或T，“H”是指或C或T，“I”是指肌苷，“N”是指任何核苷酸。
“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。
“信使RNA(mRNA)”指无内含子并且由细胞翻译成蛋白质的RNA。
“cDNA”指与mRNA模板互补并且利用逆转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是单链的或者可以用DNA聚合成酶I的Klenow片段转化成双链形式。
“编码区”是指当转录、加工、和/或翻译时导致多肽序列产生的多核苷酸序列。
“表达序列标签”(“EST”)是来源自cDNA文库的DNA序列，并且因此是已经被转录的序列。EST通常通过cDNA插入序列单程测序获取。将完整的cDNA插入序列称为“全长插入序列”(“FIS”)。“重叠群”序列是由选自，但不限于EST、FIS和PCR序列的两个或更多个序列组合成的序列。将编码完整或功能性蛋白的序列称为“完全基因序列”(“CGS”)，该序列能得自FIS或重叠群。
“成熟的”蛋白是指经翻译后加工的多肽；即，一种已经去除了在初级翻译产物中存在的任一种前肽或原肽的多肽。
“前体”蛋白是指mRNA的初级翻译产物；即仍然存在前肽和原肽。前肽和原肽可以是并且不限于细胞内定位信号。
“分离的”指物质，诸如核酸和/或蛋白质，该物质基本上不含在天然存在的环境中通常伴随该物质或与其反应的组分，或者说是该物质被从所述组分移出。分离的多核苷酸可从它们天然存在于其中的宿主细胞纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。
“重组体”是指例如通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段来实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。“重组体”也包括指已经通过引入异源核酸而进行了修饰的细胞或载体，或源于经这样修饰的细胞的细胞，但不涵盖由天然发生的事件(如自发突变、自然转化/转导/转座)对细胞或载体的改变，诸如没有蓄意人为干扰而发生的那些。
“重组DNA构建体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA构建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。
术语“入门克隆”和“入门载体”在本文中可互换使用。
“调控序列”或“调控因子”可互换使用，并且指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。术语“调控序列”和“调控因子”在本文中可互换使用。
“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。
“在植物中有功能的启动子”指能够控制植物细胞中的转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。
“组织特异性启动子”和“组织优选的启动子”可以互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，但是也可以在一种特定细胞中表达的启动子。
“发育调控的启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。
术语“可操作地连接”指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调控核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段进行了可操作地连接。
“表达”指功能产物的产生。因此，核酸片段的表达可以指核酸片段的转录(例如生成mRNA或功能RNA的转录)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。
“过表达”是指基因产物在转基因生物中超过在来自相同实验的沉默分离(或非转基因)生物中的水平的生产。
“表型”是指细胞或生物体的可检测的特征。
有关将核酸片段(例如重组DNA构建体)插入细胞中的“导入”意指“转染”或“转化”或“转导”″，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可整合进细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转变成自主的复制子或瞬时表达(例如转染的mRNA)。
“转化细胞”是将核酸片段(例如重组DNA构建体)导入其中的任何细胞。
在此所用的“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。
“稳定转化”指将核酸片段导入宿主生物体的基因组中，导致基因稳定遗传。一旦稳定转化，核酸片段稳定地整合进宿主生物体和任何连续世代的基因组中。
“瞬时转化”指将核酸片段导入宿主生物体的核中或包含DNA的细胞器中，引起基因表达而无基因稳定遗传。
术语“杂交的”或“杂交”指经由授粉产生子代的配子融合(例如细胞、种子或植物)。该术语包括有性杂交(一株植物被另一株植物授粉)和自交(自花授粉，例如当花粉和胚珠来自相同植物时)。术语“杂交”指经由授粉产生子代的配子融合行为。
“有利等位基因”为位于特定基因座、赋予或有助于所期望的表型的等位基因，所述表型例如提高的细胞壁消化性，或作为另外一种选择，为允许具有降低的细胞壁消化性的植物的鉴定的等位基因，其中所述植物可从育种计划或种植中被筛除(“反选择”)。标记的有利等位基因是与有利表型分离的标记等位基因，或者作为另外一种选择，与不利植物表型分离，从而提供鉴定植物的有益效果。
术语“导入”指将核酸(例如表达构建体)或蛋白质提供至细胞中的手段。导入包括指将核酸整合到真核或原核细胞中，在该细胞中核酸可整合到细胞的基因组中，并且包括指将核酸或蛋白质暂时提供给细胞。导入包括指稳定的或瞬时的转化方法以及有性杂交。因此，将核酸片段(例如重组DNA构建体/表达构建体)插入细胞中的情况下的“导入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可以整合进细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中、转变成自主的复制子或瞬时表达(例如转染的mRNA)。
“抑制DNA构建体”是在转化或稳定整合进植物基因组时，导致该植物中的靶基因“沉默”的重组DNA构建体。对该植物来说，该靶基因可以是内源性的或是转基因的。如本文针对靶基因所使用的，“沉默”通常指在由靶基因表达的mRNA或蛋白质/酶的水平上的抑制，和/或在酶活性或蛋白质功能性的水平上的抑制。本文中可交换使用的术语“抑制”、“抑制性”以及“沉默”包括降低、减少、减退、减小、抑制、消除或防止。“沉默”或“基因沉默”不确定机理并且包括但不限于反义、共抑制、病毒-抑制、发夹抑制、茎-环抑制、基于RNAi的方法以及基于小RNAi的方法。
抑制DNA构建体可以包含源自所关注的靶基因的区域并且可以包含所关注的靶基因的有义链(链)的核酸序列的全部或部分。取决于所要利用的方法，该区域可与所关注基因的有义链(链)的全部或部分100％相同或者少于100％相同(例如至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同)。
抑制DNA构建体是本领域所熟知的，一旦选定所关注的靶基因就很容易构建，并且包括但不限于共抑制构建体、反义构建体、病毒-抑制构建体、发夹抑制构建体、茎-环抑制构建体、产生双链RNA的构建体，以及更通常的是，RNAi(RNA干扰)构建体和小RNA构建体，诸如siRNA(短干扰性RNA)构建体和miRNA(微RNA)构建体。
“反义抑制”指产生能够抑制靶基因或基因产物表达的反义RNA转录物。“反义RNA”指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补，并阻断分离的靶核酸片段表达的RNA转录物(美国专利号：5，107,065)。反义RNA可与特定基因转录物的任何部分，即5′非编码序列、3′非编码序列、内含子或编码序列互补。
“共抑制”指产生能够抑制靶基因或基因产物表达的有义RNA转录物。“有义”RNA指包括mRNA并且可在细胞内或体外翻译成蛋白质的RNA转录物。此前，已通过着眼于以有义方向过表达与原生mRNA具有同源性的核酸序列(其导致与过表达的序列具有同源性的所有RNA减少)设计出了植物中的共抑制构建体(参见Vaucheret等人，Plant J.16：651-659(1998)；和Gura，Nature404：804-808(2000))。
另一种变型描述了将植物病毒序列用于指导对近端mRNA编码序列的抑制(于1998年8月20日公开的PCT专利公开WO 98/36083)。
RNA干扰是指由短干扰性RNA(siRNA)介导的动物中序列特异性转录后基因沉默的过程(Fire等人，Nature391：806(1998))。在植物中的对应过程通常称为转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默，并且在真菌中也称为阻抑作用(quelling)。转录后基因沉默过程被认为是用于防止外来基因表达的进化保守的细胞防御机制，并且通常由不同植物区系和门所共享(Fire等人，Trends Genet.15：358(1999))。
小RNA在控制基因表达中起重要作用。很多发育过程(包括开花)的调控是由小RNA控制的。现在有可能通过使用在植物中产生小RNA的转基因构建体来以工程手段改变植物基因的基因表达。
小RNA似乎是通过与互补RNA或DNA靶序列碱基配对来行使功能的。当与RNA结合时，小RNA引发靶序列的RNA裂解或翻译抑制。当与DNA靶序列结合时，小RNA被认为可介导靶序列的DNA甲基化。无论具体机制是什么，这些事件的后果是基因表达受到抑制。
微RNA(miRNA)是长度为约19至约24个核苷酸(nt)的已经在动物和植物二者中鉴定出的非编码RNA(Lagos-Quintana等人，Science294：853-858(2001)，Lagos-Quintana等人，Curr.Biol.12：735-739(2002)；Lau等人，Science294：858-862(2001)；Lee和Ambros，Science294：862-864(2001)；Llave等人，Plant Cell14：1605-1619(2002)；Mourelatos等人，Genes.Dev.16：720-728(2002)；Park等人，Curr.Biol.12：1484-1495(2002)；Reinhart等人，Genes.Dev.16：1616-1626(2002))。它们是由大小为大约70至200nt的较长的前体转录物加工生成的，并且这些前体转录物能够形成稳定的发夹结构。
微RNA(miRNA)似乎通过与位于由这些基因产生的转录物中的互补序列结合来调控靶基因。很有可能微RNA(miRNA)能够进入至少两种靶基因调控途径：(1)翻译抑制；和(2)RNA裂解。进入RNA裂解途径的微RNA与在动物中RNA干扰(RNAi)期间以及在植物中转录后基因沉默(PTGS)期间产生的21-25nt短干扰性RNA(siRNA)类似，并且可能整合进与在RNAi情况中观察到的复合物类似或相同的RNA-诱导的沉默复合物(RISC)中。
术语“基因座”一般是指携带一个基因或可能两个或更多个基因的基因限定的染色体区域，所述两个或更多个基因的连接如此紧密，以至于它们遗传上表现为引起某种表型的单个基因座。当相对于本文使用的Abph2时，所述“Abph2基因座”是指携带Abph2基因的限定的染色体区域，包括与其相关的调控序列，加上围绕Abph2基因的与B73非共线性的区域，或其保留Abph2基因和相关的调控序列的任一更小的部分。
“基因”应是指基因座内的特定基因编码区，包括它的相关的调控序列。本领域的普通技术人员应当理解，相关的调控序列将在距Abph2编码序列约4kb的距离内具有定位在上游的启动子。
“种质”指个体(例如一个植物)、一组个体(例如一个植物品系、品种或家族)、或来源于一个品系、品种、物种、或培养物的克隆的遗传物质或从其中得到的遗传物质。种质可为生物或细胞的部分，或者可从生物或细胞中分离得到。种质通常提供遗传物质与特异性分子构成，该分子构成提供生物或细胞培养物的一些或全部遗传性状的物理基础。如本文所用，种质包括可从中生长出新植株的细胞、种子或组织，或者植株部分诸如叶、茎、花粉、或细胞，它们能够被培养成整个植株。
在使用Clustal W程序进行序列比对后，通过查看同一程序上的“序列距离”表可以获得“百分比同一性”和“趋异度”值；除非另行指出，本文所提供的并且受权利要求书保护的百分比同一性和趋异度是以这种方式计算的。
本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual；冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press)：Cold Spring Harbor，1989(hereinafter“Sambrook”)。
本领域内的技术人员应当很好地理解，不同的启动子可在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件而指导基因的表达。
本公开能够使用的启动子包括但不限于茎尖分生组织特异性启动子。玉米knotted l启动子和来自已知在玉米SAM中表达的基因的启动子可用于表达本公开所公开的多核苷酸。此类基因的例子包括但不限于Zmphabulosa、terminal earl、roughsheath2、rolledleafl、zybl4、narrowsheath(Ohtsu，K.等人，(2007)Plant Journal 52，391-404)。来自其它物种的这些基因的直系同源物的启动子也可用于本公开。
来自具有SAM优选表达的基因的拟南芥启动子的例子包括但不限于clv3、aintegumenta样(ail5、ail6、和ail7)和terminal ear样l、clavatal、wus、shootmeristemless、terminal flowerl(Yadav等人(2009)Proc NatlAcadSci USA.March24)。
PCT公开WO 2004/071467和美国专利7，129,089描述通过以独特组合将单个启动子、基因和转录终止子连接在一起来合成多个启动子/基因/终止子盒组合。一般来讲，侧接了合适启动子的NotI位点用于克隆所期望的基因。可使用PCR扩增，用经设计用于在基因的5’和3’末端处引入NotI位点的寡核苷酸将NotI位点添加到受关注的基因上。然后用NotI消化所得PCR产物，并将其克隆到合适的启动子/NotI/终止子盒中。虽然将基因克隆进表达盒常利用NotI限制性酶完成，本领域技术人员可认识到能够利用多种限制性酶获得期望的盒。另外，本领域技术人员将会知道可利用其它克隆技术，包括但不限于基于PCR的或基于重组的技术生成合适的表达盒。
此外，WO 2004/071467和美国专利7,129,089描述了为了获得所需表型表达，还将单个启动子/基因/转录终止子盒与合适的选择性标记盒以独特组合和取向连接在一起。虽然这主要使用不同的限制性酶位点来完成，但本领域的技术人员可认识到可利用多种技术来获得所需的启动子/基因/转录终止子组合或取向。这样做可获得茎尖分生组织特异性的启动子/基因/转录终止子盒的任何组合和取向。本领域的技术人员还可认识到这些盒可位于单个DNA片段上或在多个片段上，该处基因共表达是多个DNA片段共转化的结果。
具有Abph2突变的植物，其中所述突变导致Abph2功能增益或调节Abph2表达，也被称为“Abph2植物”或“Abph2空植物”。
具有弱Abph2突变的植物，其中所述突变导致不同程度的Abph2功能或调节Abph2表达，也被称为“具有弱Abph2表型的Abph2植物”。本文所指的“弱Abph2等位基因”是Abph2变体或SEQ ID NO：1或6-31的变体，其赋予植物弱Abph2表型。
如本文所用，术语“显性负突变”是指具有改变的基因产物的突变，该基因产物的作用拮抗野生型等位基因。这些突变通常导致改变的分子功能(常常是失活的)并且特征在于“显性负”表型。赋予“显性负表型”的基因变体、突变基因或等位基因将赋予宿主细胞“无效”或“突变”表型，甚至在野生型等位基因的存在下依然如此。
如本文所用，具有“Abph2活性”的多肽(或多核苷酸)是指当在“Abph2突变系”中表达时，表现出“Abph2突变体表型”的多肽(或多核苷酸)，其能够部分或完全拯救Abph2突变体表型。
术语“基因改组”和“定向进化”在本文中互换使用。“基因改组”方法包括反复进行DNA改组，然后通过适当的筛选和/或选择以生成具有改变的生物活性的Abph2核酸变体或其部分(Castle等人，(2004)Science304(5674)：1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。
“TILLING”或“定向诱导基因组局部突变技术(Targeting InducedLocal Lesions IN Genomics)”是指一种诱变技术，其用于产生和/或鉴定、并且最终分离具有调节的表达和/或活性的特定核酸的诱变变体(McCallum等人，(2000)，Plant Physiology123：439-442；McCallum等人(2000)Nature Biotechnology18：455-457；和Colbert等人(2001)Plant Physiology126：480-484)。
TILLING组合高密度点突变，快速灵敏地检测突变。通常使用甲磺酸乙酯(EMS)诱变植物种子。EMS烷基化鸟嘌呤，这通常导致错配。例如，将种子浸泡在约10-20mM的EMS溶液中约10至20小时；将种子洗涤和然后播种。将这一代植物称为M1。M1植物随后自体繁殖。存在于形成生殖组织的细胞中的突变被下一代继承(M2)。通常筛选M2植物以获得期望基因和/或特定表型的突变。
TILLING也允许选择携带突变体变体的植株。这些突变体变体可表现出在强度或位置或时间上改变的表达(如果突变影响例如启动子)。这些突变体变体甚至可表现出比天然形式的基因表现出的活性更低的ABPH2活性。TILLING组合高密度诱变与高通量筛选方法。TILLING之后的步骤通常是：(a)EMS诱变(Redei G P和Koncz C(1992)在Methods inArabidopsis Research中，Koncz C，Chua N H，Schell J，编辑Singapore，World Scientific Publishing Co，页码16-82；Feldmann等人，(1994)InMeyerowitz E M，Somerville C R编辑Arabidopsis。冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，Cold Spring Harbor，N.Y，页码137-172；Lightner J和Caspar T(1998)In J Martinez-Zapater，J Salinas编辑，Methods on Molecular Biology，第82卷Humana Press，Totowa，N.J.，页码91-104)；(b)DNA制备并且将个体合并成池；(c)PCR扩增所关注的区域；(d)变性和退火以允许异源双链体形成；(e)DHPLC，其中在池中存在的异源双链体被检测为色谱中的额外峰；(f)单个突变体的鉴定；以及(g)突变体PCR产物的测序。TILLING方法是本领域为人们所熟知的(美国专利US8,071,840)。
也可使用其它突变方法以将突变导入Abph2基因。用于将基因突变导入植物基因中并选择具有期望性状的植株的方法是熟知的。例如，种子或其它植物材料可根据标准技术用突变化学物质处理。此类化学物质包括但不限于下列物质：硫酸二乙酯、乙撑亚胺和N-亚硝基-N-乙基脲。作为另外一种选择，可利用电离辐射，其来自源诸如X-射线或γ射线。
可采用用于检测Abph2基因中的突变的其它检测方法，例如毛细管电泳(例如恒定变性毛细管电泳和单链构象多态性)。又如，可利用错配修复酶学检测异源双链体(例如来自芹菜的CELI内切核酸酶)。CELI识别错配并精确地切开错配的3′侧。错配的精确碱基位点可通过用错配修复酶切割，随后进行例如变性凝胶电泳来确定。参见例如Oleykowski等人，(1998)“Mutation detection using a novel plant endonuclease”Nucleic AcidRes。26：4597-4602；和Colbert等人，(2001)“High-Throughput Screeningfor Induced Point Mutations”Plant Physiology126：480-484。
包含突变Abph2基因的植株可与其它植株杂交以将突变导入另一个植株中。这可使用标准育种技术完成。
同源重组允许将选择的核酸在限定的选择位点处导入基因组中。同源重组已经在植物中展示。参见例如，Puchta等人(1994)，Experientia50：277-284；Swoboda等人(1994)，EMBO J.13：484-489；Offringa等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：7346-7350；Kempin等人(1997)Nature389：802-803；和Terada等人，(2002)Nature Biotechnology，20(10)：1030-1034)。
在植物中进行同源重组的方法已有描述，不仅针对模式植物(Offringa等人(1990)EMBO J.October；9(10)：3077-84)也针对作物植物，例如水稻(Terada R，Urawa H，Inagaki Y，Tsugane K，Iida S.Nat Biotechnol.2002；Iida和Terada：Curr Opin Biotechnol.2004April；15(2)：1328)。靶向核酸(其可为如前文所定义的ABPH2核酸或其变体)不需要分别靶向ABPH2基因的基因座，但是可被导入例如高表达区。靶向核酸可为弱Abph2等位基因或显性负等位基因，它们用于置换内源性基因或可另外引入到内源性基因。
转座因子可基于它们的转座模式归类为两大类。这些被命名为Class I和Class II；两者都被用作诱变剂和作为传递载体。I类转座因子通过RNA中间体转座并利用反转录酶，即，它们是逆转录因子。存在至少三种类型的I类转座因子，例如反转录转座子、反座子、SINE样因子。反转录转座子通常含有LTR、和编码病毒外壳蛋白(gag)与逆转录酶的基因、RnaseH、整合酶和聚合酶(pol)基因。已经描述了植物物种中的多个反转录转座子。此类反转录转座子经由RNA中间体在由转座子编码的逆转录酶和RNA酶H催化的反应中移动和易位。例子分成Tyl-copia和Ty3-gypsy组以及分成SINE样和LINE样类别(Kumar和Bennetzen(1999)AnnualReview ofGenetics33：479)。此外，DNA转座因子诸如Ac、Taml和En/Spm也存在于广泛多种植物种类中，并且可在本公开中利用。转座子(和IS因子)是用于将突变导入植物细胞中的常见工具。
实施例：
在一个实施例中，能用于本公开的方法中的Abph2变体是下列ABPH2核酸变体的一个或多个：(i)Abph2核酸序列(SEQ ID NO：2)的一部分；(ii)能够与Abph2核酸序列(SEQ ID NO：2)杂交的核酸序列；(iii)Abph2核酸序列(SEQ ID NO：2)的剪切变体；(iv)Abph2核酸序列(SEQ ID NO：2)的天然存在的等位变体；(v)通过基因改组获得的Abph2核酸序列；(vi)通过定点诱变获得的Abph2核酸序列；(vii)通过TILLING方法获得并鉴定的Abph2变体。
在一个实施例中，内源性Abph2的表达水平可在植物细胞中通过反义构建体、有义构建体、RNA沉默构建体、RNA干涉作用、和基因组缺失而降低。基因组缺失的例子包括但不限于转座子、tilling、同源重组诱导的缺失。
在一个实施例中，在本公开方法中使用的Abph2核酸变体是通过基因改组获取的核酸变体。
在一个实施例中，也可利用TILLING(定向诱导基因组局部突变)技术将基因修饰导入玉米Abph2基因的基因座。
在一个实施例中，可利用定点诱变生成Abph2核酸的变体。可利用多种方法实现定点诱变。一般来讲，可利用修饰或改变宿主内源性基因组DNA的方法。这包括改变宿主原生DNA序列或先前存在的转基因序列(其包括调控因子、编码和非编码序列)。这些方法也可用于将核酸靶向至基因组中先前基因工程的靶标识别序列。例如，本文所述的经基因修饰的细胞或植株是使用“定制的”归巢核酸内切酶制备以修饰植物基因组而生成的(参见例如，WO 2009/114321；Gao等人(2010)Plant Journal1：176-187)。另一个定点工程化是通过使用与限制性酶的限制性特性偶合的锌指结构域识别。参见例如，Urnov，等人，(2010)Nat Rev Genet.11(9)：636-46；Shukla，等人，(2009)Nature459(7245)：437-41。
在一个实施例中，也可利用同源重组失活或减少植物中内源性Abph2基因的表达。
同源重组可通过特定靶向体内的Abph2基因用于诱导定向基因修饰。体外制备在Abph2基因序列(诸如本文提供的那些)的选择部分(包括5′上游、3′下游、和基因间区)中的突变并且利用标准技术将它们导入期望的植株。在导入的突变Abph2基因和目标内源性ABPH2基因之间的同源重组将导致转基因植物中野生型基因的定向替换，导致Abph2表达或活性的改变。
在一个实施例中，催化RNA分子或核糖酶也可用于抑制基因的表达。设计特定地与事实上的任何目标RNA配对并在特定位置裂解磷酸双酯骨架，从而功能上失活目标RNA的核糖酶是可能的。在进行这种裂解时，核糖酶不发生自体改变，并且因此能够循环利用并裂解其它分子。在反义RNA中包括核糖酶序列赋予它们RNA裂解活性，从而提高构建体的活性。已经鉴定了多类核糖酶。例如，一类核糖酶来源于多个小的环形RNA，它们能够自体裂解并在植物中复制。
该RNA能够单独复制(类病毒RNA)或用辅助病毒(卫星RNA)复制。RNA的例子包括来自鳄梨日斑病类病毒的RNA和来自烟草环斑病毒、紫花苜蓿暂时性线条病毒、绒毛烟斑驳病毒、茛菪斑驳病毒和地三叶草斑驳病毒的卫星RNA。已经描述了目标RNA特异性核糖酶的设计和使用。参见例如Haseloff等人，(1988)Nature，334：585-591。
在一个实施例中，Abph2基因也可通过例如基于转座子的基因活化而被活化。
在一个实施例中，失活步骤包括在Abph2基因序列中制造一个或多个突变，其中在Abph2基因序列中的一个或多个突变包括一个或多个转座子插入，从而与相应的对照植物相比改变Abph2基因表达。例如，该突变可包括在Abph2基因中的纯合缺失，或一个或多个突变包括在Abph2基因或其调控因子中的杂合缺失。
将这些可移动的遗传因子例如通过有性杂交递送至细胞，选择转座并且筛选所得插入突变体，例如用于获得所关注的表型。包含干扰的Abph2基因(即，调节了Abph2的表达或其活性)的植株能与野生型植株杂交。取决于将进行杂交的物种，可使用多种标准育种技术中的任何一种。在分离或重组植物的基因组内的TN(转座子)位置可通过已知方法来确定，例如如本文所述的侧接区域测序。例如，植物的PCR反应可用于扩增序列，其随后可进行诊断测序以确认它的起源。任选地，筛选插入突变体以获得期望的表型，诸如抑制Abph2的表达或活性，或者改变农学特性。
实例
本公开将在下面的实例中进一步说明，其中份数和百分比是以重量计并且度数是摄氏度，除非另外说明。应该理解，尽管这些实例说明了本公开的实施例，但仅是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实例，本领域的技术人员能够确定本公开的基本特征，并且在不脱离其实质和范围的情况下，能够对本公开做出各种变化和修改以使其适用于各种用法和条件。此外，除了那些本文所示和描述的那些之外，根据前文所述，本公开的各种修改形式对本领域的技术人员来说将是显而易见的。这些修改形式也旨在涵盖于所附权利要求书的范围内。
用生物信息计算包(Inc.，Madison，WI)的程序进行序列比对和百分比同一性计算。使用Clustal W比对方法(Thompson，J.D，等人(1994)Nucleic Acids Research，22：4673-80)，采用默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝0.2，延迟发散序列(Delay Divergen Seqs)(％)＝30，DNA转换权重(DNA TransitionWeight)＝0.5，蛋白质权重矩阵(Protein Weight Matrix)＝Gonnet系列)进行所述序列的多重比对。
对于成对比对采用的Clustal方法的默认参数是缓慢-准确(SLOW-ACCURATE)，空位罚分＝10，空位长度＝0.10，蛋白质权重矩阵(ProteinWeight Matrix)＝“Gonnet250”。
实例1
克隆玉米Abph2基因
使用基于作图的克隆方法以鉴定和分离Abph2基因。使用基因组范围面板的SSR标记将Abphyl2初始作图至7号染色体的顶端。使用在标记mmc0171和umc1577之间设置突变的～50个单个(SSR标记)精细作图，并且使用～1,000个单个(SSR标记)精细作图将区域收窄至BACb0226D18上预测的基因AC195322.2_FG002和BAC b0316O18上的AC201967.3_FG002之间。(图2)。
这些基因被预测位于相邻的BAC克隆上，然而在这个区域的候选基因在Abph2突变体中没有显示出任何可检测的变化。使用来自这些BAC的另外的探针来探查由Abph2突变体制得的BAC文库。分离跨这个区域的单个BAC并进行测序。在与B73参照基因组进行比较时，这个BAC包含～4.5kb的掺入序列，其包含单个基因，预测的谷氧还蛋白(GRX)。
这个GRX基因存在于B73参照基因组中但位于7号色体上的不同位置，大约距离800kbp。GRX基因拷贝功能的丧失导致雄性不育表型(mscal，ms22，参见例如，美国专利7，915,478)。
实例2
Abph2的表达分析
Abph2以局部化模式在茎尖分生组织中、在叶片起始的域中和叶片维管组织中表达(图5B和6A)。它也在发育的花药中表达(图6B)。
实例3
玉米突变体Abph2表型
ABPHYL2是新的显性基因座，其控制玉米中叶片起始(“叶序”)的模式。在Abph2突变体中，叶片是成对对生的，而不是野生型玉米中每次长出一片(图1A和5A)。所述突变体还在单节生成两个穗而不是一个，因此这种基因型可用于增加田里的产量。通过定位克隆分离出Abph2，并且对来自突变型品系的BAC进行测序，并且通过对EMS诱导的基因回复突变进行测序(图4A和4B)以及通过玉米转化(图5A)证实了对应的基因。
Abph2编码一种预测的谷氧还蛋白。此类蛋白催化氧化还原交换反应以形成或断裂蛋白中的二硫键。基于本文所公开的拟南芥(Arabidopsis)中的工作，似乎Abph2通过催化bZIP转录因子间的二硫键来起作用。
Abph2与先前公开的mscal/ms22(美国专利7,915,478)相同，其中纯合隐性突变导致雄性不育。本文所公开的Abph2等位基因是显性的，使得分生组织变大并且叶序发生变化。本公开提供了Abph2基因在分生组织发育中的新功能。mscal/ms22突变体由于基因冗余不具有分生组织缺陷。Abph2表型似乎是由所述基因从其在7号染色体顶端的原始位置易位至～800kbp近端的新位置而形成的。(图3)。这种变化可将新的调控因子导入内源性基因，从而可导致在胚胎形成期间其表达发生变化。
实例4
与FEA4相互作用
ABPH2被证明与bZIP转录因子FEA4相互作用(美国临时申请61/610730，提交于2012年3月14日，标题为“NUCLEOTIDESEQUENCES ENCODING FASCIATED EAR4(FEA4)AND METHODSOF USE THEREOF”)。图7显示了ABPH2(GRX)和FEA4(bZIP)在核内相互作用。通过双分子荧光互补(BiFC)显示了FEA4和ABPH2的相互作用。图8经由酵母双杂交相互作用显示了ABPH2(GRX)和FEA4(bZIP相互作用因子)的相互作用。SD/-LW无亮氨酸和色氨酸的合成缺陷性培养基。图9中显示了涉及ABPH2和FEA4的分生组织发育模型。
实例5
ABPH2的同系物
使用序列比较算法诸如BLAST(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1993)；也参见美国国家卫生研究院国家医学图书馆的国家生物技术信息中心的万维网网站上对BLAST算法的解释)鉴定ABPH2的同源序列。检索公共和专有数据库以获得ABPH2同系物序列(SEQ ID NO：6-31)。

Claims (33)

1.制备转基因植物的方法，所述转基因植物具有调节的Abph2的表达，所述方法包括：
a.将包含可操作地连接至启动子的多核苷酸的重组构建体导入可再生的植物细胞中，其中多核苷酸序列的表达调节Abph2的表达或活性；
b.在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及
c.选择(b)的所述转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组构建体并在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出Abph2的表达的改变。
2.制备转基因植物的方法，所述转基因植物具有调节的Abph2的表达，所述方法包括调节所述多核苷酸的表达，所述多核苷酸编码SEQ IDNO：1的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1至少70％相同的序列。
3.制备转基因植物的方法，所述转基因植物具有调节的Abph2的表达，所述方法包括调节所述多核苷酸的表达，所述多核苷酸编码选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：1和6-31、它们的功能结构域、以及与SEQ ID NO：1和6-31至少70％相同的序列。
4.增加玉米植物的产量的方法，所述方法包括转基因改变Abph2基因的表达，使得每株玉米植物收获的穗的数量相对于未经转基因改变的玉米植物是增加的。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述Abph2基因编码具有SEQ IDNO：1的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1至少70％相同的序列的多肽。
6.提高植物的农学特性的方法，所述方法包括：
a.将包含分离的多核苷酸的DNA构建体导入可再生的植物细胞中，所述多核苷酸以有义方向可操作地连接至在植物中有功能的启动子，其中所述多核苷酸包含：
i.SEQ ID NO：2或5的核苷酸序列；
ii编码多肽的核苷酸序列，所述多肽具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列、或基于Clustal V比对方法在与SEQ ID 1进行比较时与SEQID NO：1至少70％相同的序列；
iii.编码选自以下的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO：1和6-31、它们的功能结构域、以及与SEQ ID NO：1和6-31至少70％相同的序列；或
iv.能够在严格条件下与(i)的所述核苷酸序列杂交的核苷酸序列；
b.在步骤(a)之后再生转基因植物细胞，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及
c.选择(b)的转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组DNA构建体并在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变，所述农学特性选自：穗分生组织尺寸、果仁行数、叶片数、花序数、花序内的分枝数、花数、果实数、种子数、生物量和产量。
7.鉴定Abph2的等位基因的方法，所述方法包括以下步骤：
a.对一个突变型玉米植物群体进行基因筛选；
b.鉴定一种或多种表现出不同程度的Abph2表型的突变型玉米植物；
c.从具有不同的Abph2表型的所述突变型玉米植物中鉴定所述Abph2等位基因。
8.鉴定Abph2的更弱等位基因的方法，所述方法包括以下步骤：
a.使用一种或多种核苷酸序列进行基因改组，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO：1和6-31、或与SEQ ID NO：1和6-31约70％相同的蛋白质、或它们的片段；
b.将来自步骤(a)的所述经改组的序列转化进一个可再生的植物细胞群体中；
c.从步骤(b)的所述经转化的可再生的植物细胞群体中再生转化植物群体；
d.对于Abph2表型，筛选来自步骤(c)的转化植物群体；以及
e.从表现出Abph2表型的转化植物中鉴定具有所期望的Abph2表型的植物。
9.植物，其中所述内源性Abph2基因的表达相对于对照植物是减少的。
10.植物，其中所述内源性Abph2基因的表达相对于对照植物是增加的。
11.植物，其中所述内源性Abph2基因的表达被改变使得在胚胎形成期间相对于对照植物所述Abph2基因的表达被改变。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的植物，其中所述Abph2的表达被转基因改变。
13.根据权利要求9-11中任一项所述的植物，其中所述Abph2的表达通过引起诱变而被改变。
14.制备根据权利要求11所述的植物的方法，所述方法包括以下步骤：
a.将突变导入所述内源性Abph2基因中；以及
b.检测所述突变。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述步骤(a)和(b)利用定向诱导基因组局部突变(TILLING)方法完成，并且其中所述突变对于改变所述内源性Abph2基因的表达或其活性是有效的。
16.根据权利要求11所述的方法，其中所述突变是位点特异性突变。
17.制备根据权利要求6所述的植物的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a.使用转座子将插入序列导入可再生的植物细胞的所述内源性Abph2基因中；
b.从步骤(a)的所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述转座子插入序列；
c.从步骤(b)选择转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含步骤(a)的所述插入序列并表现出Abph2的表达的改变。
18.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述植物选自：拟南芥、番茄、玉米、大豆、向日葵、高粱、加拿大双低油菜(canola)、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
19.植物，所述植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含以有义方向可操作地连接至在植物中有功能的启动子的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO：1和6-31、它们的功能结构域、以及与SEQ ID NO：1和6-31至少70％相同的序列，其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变，所述农学特性选自：增大的穗分生组织、果仁行数、种子数、生物量和产量。
20.根据权利要求19所述的植物，其中所述植物选自：拟南芥、番茄、玉米、大豆、向日葵、高粱、加拿大双低油菜、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的植物的种子。
22.在植物中表达异源性多核苷酸的方法，所述方法包括：
a.用包含Abph2多核苷酸的重组DNA构建体转化可再生的植物细胞，所述Abph2多核苷酸可操作地连接至第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸是茎尖分生组织优选的启动子；
b.在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及
c.选择(b)的转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组DNA构建体并且其中所述异源性多核苷酸还在所述转基因植物中表达。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述植物选自：拟南芥、番茄、玉米、大豆、向日葵、高粱、加拿大双低油菜、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
24.植物，所述植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至第二多核苷酸的Abph2多核苷酸，其中所述第二多核苷酸是茎尖分生组织优选的启动子并且其中所述异源性多核苷酸在所述植物中表达。
25.根据权利要求24所述的植物，其中所述植物选自：拟南芥、番茄、玉米、大豆、向日葵、高粱、加拿大双低油菜、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
26.鉴定具有至少一种农学特性的改变的第一玉米植物或第一玉米种质的方法，所述方法包括在所述第一玉米植物或所述第一玉米种质中检测与所述表型相关的标记基因座的至少一种多态性，其中所述标记基因座编码包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列选自：SEQ ID NO：1和6-31、或与SEQ ID NO：1和6-31约70％相同的蛋白质，其中在与对照植物进行比较时所述多肽在植物或其植物部分中的表达导致至少一种农学特性的改变，所述农学特性选自：穗分生组织尺寸、果仁行数、花序数、花序内的分枝数、花数、果实数和种子数。
27.玉米植物，所述玉米植物在其基因组中包含谷氧还蛋白基因，其中所述谷氧还蛋白基因位于包含SEQ ID NO：5的基因组区域内。
28.根据权利要求27所述的玉米植物，其中SEQ ID NO：5由7号染色体中的BRF基因界定。
29.渐渗包含遗传变化的玉米植物的方法，其中所述遗传变化导致编码氨基酸序列的多核苷酸的表达的改变，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO：1和6-31、它们的功能结构域、以及与SEQ ID NO：1和6-31至少70％相同的序列，所述方法包括：(a)选择表现出Abph2表型或其变体的玉米植物，以及(b)将所述玉米植物与一种或多种原种玉米种质杂交。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述Abph2表型的选择是标记辅助的。
31.编码氨基酸序列的分离的多核苷酸，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO：6-31、它们的功能结构域、以及与SEQ ID NO：6-31至少70％相同的序列。
32.根据权利要求31所述的多核苷酸是重组的。
33.根据权利要求31所述的多核苷酸在异源宿主中表达。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106119217A (zh) * 2016-07-08 2016-11-16 山西大学 一种重组荞麦谷氧还蛋白及其制备方法和应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11359207B2 (en) * 2017-08-17 2022-06-14 Benson Hill, Inc. Increasing plant growth and yield by using a glutaredoxin

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101802201A (zh) * 2007-08-03 2010-08-11 先锋高级育种国际公司 影响植物雄性生育力的msca1核苷酸序列以及使用其的方法
CN101965405A (zh) * 2008-01-25 2011-02-02 巴斯夫植物科学有限公司 具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5107065A (en) 1986-03-28 1992-04-21 Calgene, Inc. Anti-sense regulation of gene expression in plant cells
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US6395547B1 (en) 1994-02-17 2002-05-28 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
GB9703146D0 (en) 1997-02-14 1997-04-02 Innes John Centre Innov Ltd Methods and means for gene silencing in transgenic plants
US20040172682A1 (en) 2003-02-12 2004-09-02 Kinney Anthony J. Production of very long chain polyunsaturated fatty acids in oilseed plants
US7129089B2 (en) 2003-02-12 2006-10-31 E. I. Du Pont De Nemours And Company Annexin and P34 promoters and use in expression of transgenic genes in plants
EP1931788A2 (en) 2005-09-15 2008-06-18 CropDesign N.V. Plants having increased yield and method for making the same
US7915478B2 (en) * 2007-08-03 2011-03-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Msca1 nucleotide sequences impacting plant male fertility and method of using same
WO2009114321A2 (en) 2008-03-11 2009-09-17 Precision Biosciencs, Inc. Rationally-designed meganucleases for maize genome engineering

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101802201A (zh) * 2007-08-03 2010-08-11 先锋高级育种国际公司 影响植物雄性生育力的msca1核苷酸序列以及使用其的方法
CN101965405A (zh) * 2008-01-25 2011-02-02 巴斯夫植物科学有限公司 具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALEXANDROV NN等: "Insights into corn genes derived from large-scale cDNA sequencing", 《PLANT MOL BIOL.》, vol. 69, no. 12, 21 October 2008 (2008-10-21), pages 179 - 94, XP019648179 *
NICOLAS ROUHIER等: "Genome-wide analysis of plant glutaredoxin systems", 《JOURNAL OF EXPERIMENTAL BOTANY》, vol. 57, no. 8, 23 May 2006 (2006-05-23), pages 1685 - 1696, XP002478546, DOI: doi:10.1093/jxb/erl001 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106119217A (zh) * 2016-07-08 2016-11-16 山西大学 一种重组荞麦谷氧还蛋白及其制备方法和应用
CN106119217B (zh) * 2016-07-08 2019-07-23 山西大学 一种重组荞麦谷氧还蛋白及其制备方法和应用

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