DE69433424T2

DE69433424T2 - Pflanzen mit modifizierter reaktion auf ethylen

Info

Publication number: DE69433424T2
Application number: DE69433424T
Authority: DE
Inventors: Elliott M. Meyerowitz; Caren Chang; Anthony B. Bleecker
Original assignee: California Institute of Technology CalTech
Current assignee: California Institute of Technology CalTech
Priority date: 1993-07-01
Filing date: 1994-06-30
Publication date: 2004-09-30
Anticipated expiration: 2014-07-01
Also published as: DE69433424D1; AU680029B2; WO1995001439A3; WO1995001439A2; JPH08508412A; CO4370126A1; EP0706570B1; EP0706570A1; NZ269640A; BR9406988A; ATE256741T1; JP3183407B2; KR960703435A; AU7396594A; ES2213747T3; CA2165678A1; CA2165678C; US6294716B1; US5824868A

Description

Dies ist eine teilweise Fortführung der Anmeldung der Anmeldenummer 08/086.555, eingereicht am 1. Juli 1993.
Die US-Regierung besitzt gewisse Rechte an dieser Erfindung gemäß der Vertragsnummer DE-FG03-88ER13873 des Department of Energy.
Technisches Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft im Allgemeinen eine modifizierte ETR-Nucleinsäure und mit einer solchen Nucleinsäure transformierte Pflanzen, die einen Phänotyp aufweist, der durch eine Modifizierung der normalen Reaktion auf Ethylen gekennzeichnet ist.
Hintergrund der Erfindung
Ethylen ist seit der Jahrhundertwende als ein Pflanzenhormon anerkannt, als seine Wirkung auf die Erbsenkeimlingsentwicklung erstmals beschrieben wurde. Neljubow, Pflanzen Beih. Bot. Zentralb. 10, 128–139 (1901). Seit damals sind zahlreiche Berichte erschienen, die zeigen, dass Ethylen ein endogener Regulator von Wachstum und Entwicklung in höheren Pflanzen ist. Beispielsweise ist Ethylen mit Samenruhe, Keimlingswachstum, Blütenanlegung, Blattabwurf, Alterung und Fruchtreifung in Zusammenhang gebracht worden. Ethylen ist ein Pflanzenhormon, dessen Biosynthese durch Umweltbelastung, wie z. B. Sauerstoffmangel, Verwundung, Pathogeninvasion und Überflutung, induziert wird.
Neulich sind Gene kloniert worden, die für einige der an der Ethylen-Biosynthese beteiligten Enzyme kodieren. Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6621–6625 (1989); Nakajima et al., Plant Cell Phys. Physiol. 29, 989–996 (1990); Van Der Straeten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4859–4963 (1990); Hamilton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7434–7437 (1991); und Spanu et al., EMBO J. 10, 2007–2013 (1991). Der Stoffwechselweg der Ethylen-Biosynthese ist in 1 gezeigt. Wie ersichtlich ist, wird die Aminosäure Methionin durch SAM-Synthase zu S-Adenosyl- Methionin (SAM) umgesetzt, das seinerseits durch ACC-Synthase zu 1-Aminocyclopropan-1-carbonsäure (ACC) umgesetzt wird. Adams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 170–174 (1979). Die ACC wird dann durch das Enzym ACC-Oxidase zu Ethylen umgesetzt. Yang et al., Annu. Rev. Plant. Physiol. 35, 155–189 (1984).
Eine Reihe von Versuchen ist im Bestreben unternommen worden, die Ethylen-Biosynthese zu steuern, um dadurch die Fruchtreifung zu steuern. Oeller et al., Science 254, 437–439 (1991), berichten, dass die Expression einer Antisense-RNA gegen ACC-Synthase die Fruchtreifung in Tomatenpflanzen hemmt. Hamilton et al., Nature 346, 284–287 (1990), berichten die Verwendung eines Antisense-TOM13-(ACC-Oxidase-) Gens in transgenen Pflanzen. Picton et al., Plant Journal 3, 469–481 (1993), berichten von einer veränderten Fruchtreifung und Blattalterung in Tomatenpflanzen, die Ethylen-bildendes Antisense-Enzym exprimieren.
In einem zweiten Ansatz wurde die Ethylen-Biosynthese wie berichtet durch Exprimieren einer ACC-Deaminase in Pflanzengewebe moduliert, um den zur Umsetzung zu Ethylen verfügbaren ACC-Spiegel zu vermindern. Siehe PCT-Publikation Nr. WO92/12249, publiziert am 23. Juli 1992, und Klee et al., Plant Cell 3, 1187–1193 (1991).
Während eine beträchtliche Menge an Informationen bezüglich der Biosynthese von Ethylen angesammelt worden ist, ist nur sehr wenig darüber bekannt, wie Ethylen die Pflanzenentwicklung steuert. Obgleich mehrere Berichte darauf hinweisen, dass eine hochaffine Bindungsstelle für Ethylen in Pflanzengeweben vorhanden ist, sind solche Rezeptoren nicht identifiziert worden. Jerie et al., Planta 144, 503 (1979); Sisler, Plant Physiol. 64, 538 (1979); Sisler et al., Plant Growth Reg. 9, 157–164 (1990); und Sisler, "Ethylene-binding Component in Plants", The Plant Hormone Ethylene, A. K. Mattoo und J. C. Suttle (Hrsg.), C. R. C. Press Inc. (Boston), S. 81–90 (1990). In Arabidopsis sind mehrere Kategorien von Mutanten beschrieben worden. In den ersten beiden Kategorien wurden Mutanten beschrieben, die überschüssiges Ethylen oder weniger Ethylen im Vergleich zur Wildform produzieren. Guzman et al., The Plant Cell 2, 513–523 (1990). In einer dritten Kategorie reagierten Mutanten nicht auf Ethylen. Ebenda; Bleecker et al., Science 241, 1086–1089 (1988); Harpham et al., Ann. of Botany 68, 55–61 (1991). Die beobachtete Unempfindlichkeit gegenüber Ethylen wurde als seine entweder dominante oder rezessive Mutation beschrieben. Ebenda.
Auf Basis des Vorhergehenden ist klar, dass die genetische Basis und der molekulare Mechanismus der Ethylen-Wechselwirkung mit Pflanzen nicht eindeutig beschrieben worden ist. Angesichts des breiten durch Ethylen regulierten Funktionsumfangs und der früheren Versuche, die Ethylen-Funktion durch Regulation seiner Synthese zu steuern, wäre es wünschenswert, einen alternativen Ansatz zur Verfügung zu haben, um Wachstum und Entwicklung in verschiedenen Pflanzengeweben, wie z. B. Obst, Gemüse und Blumen, durch Verändern der Wechselwirkung von Ethylen mit Pflanzengewebe zu modulieren.
Demgemäß ist es ein Ziel der Erfindung, isolierte Nucleinsäuren bereitzustellen, die eine Ethylen-Reaktions-(ETR-) Nucleinsäure umfassen.
Weiters ist es ein Ziel, Modifizierungen solcher ETR-Nucleinsäuren bereitzustellen, um ein oder mehrere Nucleotide zu substituieren, insertieren und/oder deletieren, so dass ein oder mehrere Aminosäurereste im von der ETR-Nucleinsäure kodierten Protein substituiert, insertiert und/oder deletiert werden.
Darüber hinaus ist es ein Ziel, Pflanzenzellen bereitzustellen, die mit einer oder mehreren ETR-Nucleinsäuren transformiert sind. Solche transformierten Pflanzenzellen können verwendet werden, um transformierte Pflanzenzellen herzustellen, worin der Phänotyp gegenüber der Reaktion von einem oder mehreren Geweben der Pflanze auf Ethylen moduliert ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß den vorhergehenden Zielen umfasst die Erfindung transformierte Pflanzen, die zumindest eine mit einer modifizierten ETR-Nucleinsäure transformierte Zelle aufweisen. Solche Pflanzen weisen einen Phänotyp auf, der durch eine Verminderung der Reaktion von zumindest einer transformierten Pflanzenzelle auf Ethylen im Vergleich zu einer Pflanze gekennzeichnet ist, welche die transformierte Pflanzenzelle nicht enthält.
Die Erfindung umfasst ferner Vektoren, die zur Transformation einer Pflanzenzelle zur Veränderung der Reaktion auf Ethylen fähig ist. In einer Ausführungsform umfasst der Vektor eine modifizierte ETR-Nucleinsäure, die eine Verminderung der Zellreaktion auf Ethylen bewirkt. Gewebe- und/oder zeitliche Spezifität für die Expression der modifizierten ETR-Nucleinsäure wird durch Wählen geeigneter Expressionsregulationssequenzen gesteuert, um auf Ort und/oder Zeit der Expression der transformierten Nucleinsäure abzuzielen.
Die Erfindung umfasst außerdem Verfahren zum Herstellen von Pflanzen mit einem Phänotyp, der durch eine Verminderung der Reaktion von zumindest einer transformierten Pflanzenzelle auf Ethylen im Vergleich zu einer Pflanze der Wildform gekennzeichnet ist, die eine solche transformierte Zelle nicht enthält. Das Verfahren umfasst das Transformieren von zumindest einer Pflanzenzelle mit einer modifizierten ETR-Nucleinsäure, das Neubilden von Pflanzen aus einer oder mehreren transformierten Pflanzenzellen und das Selektieren von zumindest einer Pflanze mit dem gewünschten Phänotyp.
Kurzbeschreibung der Abbildungen
1 stellt den biosynthetischen Stoffwechselweg für Ethylen dar.
Die 2A, 2B und 2C stellen die genomische Nucleinsäuresequenz (Seq.-ID Nr. 1) für das ETR-Gen aus Arabidopsis thaliana dar.
Die 3A, 3B, 3C und 3D stellen die cDNA-Nucleinsäure (Seq.-ID Nr. 2) und abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 3) für das ETR-Gen aus Arabidopsis thaliana dar.
Die 4A, 4B, 4C und 4D bis 7A, 7B, 7C und 7D stellen die cDNA und abgeleitete Aminosäuresequenz für vier mutierte ETR-Gene aus Arabidopsis thaliana dar, die Ethylen-Unempfindlichkeit verleihen. Jede Sequenz unterscheidet sich von der in 3 dargelegten Sequenz der Wildform durch Substitution eines Aminosäurerests. Die etr1-3-(vormals ein1-1-) Mutation in 4 (Seq.-ID Nr. 8 und 9) umfasst die Substitution von Alanin-31 durch Valin. Die etr1-4-Mutation in 5 (Seq.-ID Nr. 10 und 11) umfasst die Substitution von Isoleucin-62 durch Phenylalanin. Die etr1-1-(vormals etr-) Mutation in 6 (Seq.-ID Nr. 4 und 5) umfasst die Substitution von Cystein-65 durch Tyrosin. Die etr1-2-Mutation in 7 (Seq.-ID Nr. 6 und 7) umfasst die Substitution von Alanin-102 durch Threonin.
8 stellt die Struktur des zur Lokalisation des ETR1-Gens in Arabidopsis thaliana verwendeten Cosmid-Inserts dar. Die Startposition für das Chromosome-Walking ist durch einen schraffierten Balken bezeichnet. Die offenen Balken zeigen den Ort und die Länge der als Sonden zur Detektion von Rekombinationsbruchstellen verwendeten DNA-Segmente. Die maximale Anzahl der von jeder Sonde detektierten Bruchstellen ist gezeigt. Die Ziffern rechts vom ETR1-Gen sind aus 74 F2-Rekombinanten zwischen etr1-1 und ap-1, und jene links des ETR1-Gens sind aus 25 F2-Rekombinanten zwischen etr1-1 und clv2. Überlappende YAC-Klone EG4E4 und EG2G11 sind ebenfalls gezeigt.
Die 9A und 9B stellen die Aminosäuresequenz-Angleichungen des vorhergesagten ETR1-Proteins und der konservierten Domänen mehrere bakterieller Histidin-Kinasen und Reaktionsregulatoren dar. Aminosäuren sind an Positionen fett gedruckt dargestellt, wo zumindest zwei Übereinstimmungen mit ETR1 vorliegen. In 9A die abgeleitete ETR1-Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 12 und 27)(Reste 326 bis 562), angeglichen an die Histidin-Kinase-Domänen von E.-coli-BarA (Seq.-ID Nr. 13 und 28), P.-syringae-LemA (Seq.-ID Nr. 14 und 29) und X.-campestris-RpfC (Seq.-ID Nr. 15 und 30). Die Rahmen umschließen fünf konservierte, für die bakterielle Histidin-Kinase-Domäne charakteristische Motive, wie sie von Parkinson und Kofoid (Parkinson et al., Annu. Rev. Genet. 26, 71 (1992)) zusammengestellt wurden. Der konservierte Histidin-Rest, der die angenommene Stelle der Autophosphorylierung darstellt, ist durch einen Stern bezeichnet. Ziffern und Positionen nicht gezeigter Aminosäuren sind in Klammer angegeben. In 9B sind die abgeleiteten ETR1-Aminosäuresequenzen (Reste 610 bis 729)(Seq.-ID Nr. 15 und 31) an die Reaktionsregulatordomänen von B.-parapertussis-BvgS (Seq.-ID Nr. 17 und 32), P.-syringae-LemA (Seq.-ID Nr. 19 und 34) und E.-coli-RscC (Seq.-ID Nr. 18 und 33) angeglichen. Aminosäuren sind an Positionen fett gedruckt dargestellt, wo zumindest zwei Übereinstimmungen mit ETR1 vorliegen. Die Rahmen umschließen die vier höchst konservierten Reste in bakteriellen Reaktionsregulatoren. Der konservierte Aspartatrest, der die Phosphorylierungsstelle darstellt, ist durch einen Stern bezeichnet. Ziffern und Positionen nicht gezeigter Aminosäuren sind in Klammer angegeben. Zum Zwecke der Angleichung wurde eine Lücke (–) in die ETR1-Sequenz eingeführt.
Die 10A und 10B stellen spezifische DNA-Sequenzen für ETR-Nucleinsäuren aus der Tomatenpflanze und Arabidopsis thaliana dar. 10 vergleicht die für Aminosäurereste 1 bis 123 (Seq.-ID Nr. 20 und 21) kodierende DNA-Sequenz. 10B vergleicht die für Aminosäuren 306 bis 403 (Seq.-ID Nr. 22 und 23) kodierende ETR-Nucleinsäuresequenz. Die vertikalen Linien in jeder Figur kennzeichnen homologe Nucleotide.
Die 11A und 11B vergleichen partielle Aminosäuresequenzen (unter Verwendung des Einbuchstabenkodes) für ein ETR-Protein aus der Tomatenpflanze und Arabidopsis thaliana. 11A vergleicht die Aminosäuresequenz für das ETR-Protein für Aminosäuren 1 bis 123 (Seq.-ID Nr. 24 und 25). 11B vergleicht die Aminosäuresequenz für das ETR-Protein für Reste 306 bis 403 (Seq.-ID Nr. 26 und 27). Die vertikalen Linien kennzeichnen exakte Sequenzhomologie. Zwei vertikale Punkte zeigen an, dass die Aminsäurereste funktionell konserviert sind. Ein Punkt zeigt schwache funktionelle Konservierung zwischen Aminosäureresten an.
Die 12A, 12B, 12C und 12D stellen die genomische Nucleinsäuresequenz (Seq.-ID Nr. 45) und abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 46) für das QITR-ETR-Gen aus Arabidopsis thaliana dar.
13 stellt die cDNA-Nucleinsäuresequenz und abgeleitete Proteinsequenz für das QITR-ETR-Gen aus Arabidopsis thaliana dar.
14 stellt die genomische Nucleinsäuresequenz (Seq.-ID Nr. 41) und abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 42) für das Q8-ETR-Gen aus Arabidopsis thaliana dar.
15 stellt die cDNA-Nucleinsäuresequenz (Seq.-ID Nr. 43) und abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 44) für das Q8-ETR-Gen aus Arabidopsis thaliana dar.
16 stellt die Nucleinsäuresequenz (Seq.-ID Nr. 35) und abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 36) für die TETR-Nucleinsäure aus der Tomatenpflanze dar.
17 ist ein Vergleich von zwei aminoterminalen Abschnitten der TETR- und ETR1-Proteine aus der Tomatenpflanze bzw. Arabidopsis. Die obere Zeile ist die TETR-Sequenz und erstreckt sich bis zum Aminosäurerest 315. Die untere Zeile repräsentiert die ETR1-Proteinsequenz und erstreckt sich bis zum Aminosäurerest 316. Die vertikalen Linien und vertikalen Einzel- und Doppelpunkte haben dieselbe Bedeutung, wie sie in der Beschreibung der 11A und 11B dargelegt ist. Die prozentuelle Identität unter diesen Sequenzabschnitten beträgt 73,33%. Die prozentuelle Ähnlichkeit beträgt 84,76%.
18 stellt die Nucleinsäure- (Seq.-ID Nr. 37) und abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 38) für die TGETR1-ETR-Nucleinsäure aus der Tomatenpflanze dar.
19 stellt die Nucleinsäure- (Seq.-ID Nr. 39) und abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 40) für eine Teilsequenz der TGETR2-ETR-Nucleinsäure aus der Tomatenpflanze dar.
20 ist ein Vergleich der aminoterminalen Anschnitte für die TGETR1- und ETR1-Proteine aus der Tomatenpflanze bzw. Arabidopsis. Die obere Zeile ist die TGETR1-Sequenz bis zum Aminosäurerest 316. Die untere Zeile stellt die ETR1-Proteinsequenz bis zum Aminosäurerest 316 dar. Die Identität zwischen diesen beiden Sequenzen beträgt 91,75%. Die prozentuelle Ähnlichkeit beträgt 95,87%. Die vertikalen Linien und Einzel- und Doppelpunkte haben dieselbe Bedeutung wie für die 11A und 11B.
21 ist ein Vergleich eines aminoterminalen Anschnitts des TGETR2-Proteins mit der entsprechenden ETR1-Sequenz. Die obere Zeile ist die TGETR2-Sequenz von Aminosäurerest 11 bis Aminosäurerest 245. Die untere Zeile ist die ETR1-Sequenz von Aminosäurerest 1 bis Aminosäurerest 235. Die Sequenzidentität zwischen diesen beiden Sequenzen beträgt 85,11%. Die Sequenzähnlichkeit beträgt 92,34%. Die vertikalen Linien und Einzel- und Doppelpunkte haben dieselbe Bedeutung wie für die 11A und 11B.
22 stellt die Nucleinsäure- (Seq.-ID Nr. 50) und abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 51) für die Nr-(Never-ripe-) ETR-Nucleinsäure aus der Never-ripe-Tomatenpflanze dar. Die Aminosäuresequenz in 22 unterscheidet sich von der TETR-Sequenz in 16 dahingehend, dass der Aminosäurerest Prolin am Rest 36 durch Leucin ersetzt ist.
Ausführliche Beschreibung
Die Erfindung stellt zum Teil Pflanzen bereit, die mit einem eine ETR-Nucleinsäure oder eine modifizierte ETR-Nucleinsäure umfassenden Vektor transformierte Zellen aufweisen. Solche transformierte Pflanzenzellen weisen eine modulierte Reaktion auf Ethylen auf. In einer bevorzugten Ausführungsform verleiht die Expression einer modifizierten ETR-Nucleinsäure der Pflanze einen Phänotyp, der durch eine Verminderung der Reaktion auf Ethylen für zumindest jene Zellen gekennzeichnet ist, welche die modifizierte ETR-Nucleinsäure im Vergleich zu einer entsprechenden nicht transformierten Pflanze exprimieren. Folglich wird, wenn beispielsweise die modifizierte ETR-Nucleinsäure in einer Frucht, wie z. B. in der Tomate, exprimiert wird, der Fruchtreifungsprozess verzögert, wodurch der Verderb vermindert und die Haltbarkeit und/oder die Erntesaison für die Frucht verlängert wird. Die Erfindung ist gleichermaßen zweckdienlich, um den Verderb von vegetativem Gewebe zu verhindern und um die Langlebigkeit von Schnittblumen zu erhöhen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich eine „Pflanzen-ETR-Nucleinsäure" auf eine Nucleinsäure, die für ein ganzes oder für einen Teil eines „Pflanzen-ETR-Proteins" kodiert. ETR-Nucleinsäuren können zunächst durch Homologie zu den hierin offenbarten ETR-Nucleinsäuresequenzen identifiziert werden, können aber auch durch Homologie zu einer beliebigen identifizierten ETR-Nucleinsäure oder Aminosäuresequenz identifiziert werden. Beispiele von ETR-Nucleinsäuren umfassen ETR1, QITR und Q8 aus Arabidopsis und TETR, TGETR1 und TGETR2 aus der Tomatenpflanze. ETR-Nucleinsäuren sind jedoch auch funktionell durch ihre Fähigkeit, eine modulierte Ethylen-Reaktion bei Transformation in Pflanzengewebe zu verleihen, definiert. Beispielsweise ist ein Antisense-Konstrukt einer ETR-Nucleinsäure oder modifizierten ETR-Nucleinsäure zur Verminderung der Ethylen-Reaktion in Pflanzengeweben fähig, welche die Antisense- oder modifizierte ETR-Nucleinsäure exprimieren. Außerdem kann die Transformation mit einer ETR-Nucleinsäure oder modifizierten ETR-Nucleinsäure in einer Co-Suppression endogener ETR-Allele resultieren, die ihrerseits die Ethylen-Reaktion modifiziert. Ferner können ETR-Nucleinsäuren wie hierin beschrieben modifiziert werden, um modifizierte ETR-Nucleinsäuren herzustellen, die, wenn sie zur Transformation von Pflanzengewebe verwendet werden, variierende Grade an Ethylen-Unempfindlichkeit in Gewebe bewirken, das derartige modifizierte ETR-Nucleinsäuren exprimiert. Bei der Beurteilung einer mutmaßlichen ETR-Nucleinsäure hinsichtlich ihrer Fähigkeit einer modifizierten Form, Ethylen-Unempfindlichkeit zu verleihen, wird bevorzugt, dass ein Codon oder eine Kombination von Codons, das/die für diejenigen Aminosäurereste kodiert, die Ala-31, Ile-62, Cys-65 oder Tyr-102 im ETR1-Protein von Arabidopsis thaliana oder Pro-36 im TETR-Protein in der Tomatenpflanze entsprechen, so modifiziert wird, dass die angegebenen Reste durch einen anderen Aminosäurerest, wie z. B. jenen, die hierin offenbart sind, substituiert werden.
Pflanzen-ETR-Nucleinsäuren umfassen genomische DNA, cDNA und Oligonucleotide, einschließlich Sense- und Antisense-Nucleinsäuren sowie RNA-Transkripte davon. Die genomische DNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 1) für das ETR1-Gen aus Arabidopsis thaliana ist in 2 gezeigt. Die entsprechende cDNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 2) und abgeleitete ETR-Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 3) sind in 3 gezeigt. Eine aminoterminale Domäne (d. h. Reste 1 bis ungefähr 316) der vorhergesagten ETR-Proteinsequenz weist keine Homologie zu bekannten Proteinsequenzen auf. Ungefähr in der Mitte des ETR-Proteins (d. h. Reste 295 bis 313) befindet sich eine mutmaßliche Transmembrandomäne, gefolgt von einer mutmaßlichen intrazellulären Domäne (d. h. Reste 314 bis 738). Ein wesentlicher Teil dieser mutmaßlichen intrazellulären Domäne weist unerwarteterweise eine Sequenzhomologie zu den in Bakterien bekannten Zweikomponenten-Umweltsensor-Regulatoren auf. Diese beiden Familien in Bakterien bilden ein konserviertes Sensor-Regulator-System, das es den Bakterien ermöglicht, auf ein breites Spektrum von Umweltfluktuationen zu reagieren. Es wird angenommen, dass der aminoterminale Abschnitt des ETR-Proteins entweder direkt mit Ethylen oder indirekt (z. B. mit einem Ethylen-bindenden Protein oder einem anderen Protein) wechselwirkt und dass bei einer solchen Wechselwirkung eine Signaltransduktion durch die intrazelluläre Domäne erfolgt.
Eine ETR-Nucleinsäure oder ein ETR-Protein kann durch eine nennenswerte Nucleinsäure- und/oder Aminosäuresequenz-Homologie zu einer bekannten ETR-Sequenz identifiziert werden. Eine solche Homologie kann auf der gesamten Nucleinsäureoder Aminosäuresequenz beruhen, wobei in diesem Fall die Gesamthomologie der Proteinsequenz vorzugsweise mehr als ungefähr 50%, vorzugsweise mehr als 60%, noch bevorzugter mehr als 75% und insbesondere bevorzugt mehr als 90% beträgt. Ungeachtet der Gesamt-Sequenzhomologie wird bevorzugt, dass der einzigartige, für diesen Abschnitt des Moleküls kodierende aminoterminale Abschnitt einer ETR-Proteinsequenz oder -Nucleinsäuresequenz (d. h. der 5'-terminale Abschnitt) dazu verwendet wird, um ein ETR-Protein oder eine ETR-Nucleinsäure zu identifizieren. Bei Verwendung dieses aminoterminalen Sequenzabschnitts wird bevorzugt, dass die Aminosäuresequenz-Homologie mit der bekannten ETR-Sequenz größer als ungefähr 55%, bevorzugter größer als ungefähr 60%, noch bevorzugter größer als ungefähr 70%, bevorzugter größer als ungefähr 85% und insbesondere bevorzugt größer als 95% ist. Die Homologie auf Basis der Nucleinsäuresequenz entspricht der Aminosäurehomologie, berücksichtigt jedoch die Degeneration des genetischen Codes und der Codon-Ausrichtung in verschiedenen Pflanzen. Demgemäß kann die Nucleinsäuresequenz-Homologie wesentlich niedriger als jene auf Basis der Proteinsequenz sein. Folglich ist ein ETR-Protein jedes Protein, das einen aminoterminalen Abschnitt aufweist, der im Wesentlichen homolog zur aminoterminalen Domäne eines bekannten ETR-Proteins ist. Ein solches bekanntes ETR-Protein ist das ETR1-Protein (siehe 3) aus Arabidopsis thaliana. In analoger Weise kodiert eine ETR-Nucleinsäure auch zumindest für die aminoterminale Domäne eines ETR-Proteins.
Eine ETR-Nucleinsäure aus einer Pflanzenspezies, die nicht Arabidopsis thaliana ist, kann mittels Standardverfahren unter Einsatz einer bekannten ETR-Nucleinsäure leicht identifiziert werden. Beispielsweise können markierte Sonden, die einer bekannten ETR-Nucleinsäure entsprechen oder für die einzigartige aminoterminale Domäne kodieren, für In-situ-Hybridisierung verwendet werden, um die Gegenwart eines ETR-Gens in einer bestimmten Pflanzenspezies zu detektieren. Außerdem können solche Sonden verwendet werden, um genomische oder cDNA-Bibliotheken einer anderen Pflanzenspezies zu screenen oder um eine oder mehrere Banden, die das gesamte oder einen Teil eines ETR-Gens enthalten, durch Hybridisierung an ein elektrophoretisch getrenntes Präparat einer mit einer oder mehreren Restriktionsenzymen verdauten DNA zu identifizieren.
Die Hybridisierungsbedingungen variieren üblicherweise in Abhängigkeit von der verwendeten Sonde. Bei Verwendung einer einzigartigen Nucleotidsequenz einer ETR-Nucleinsäure, z. B. eines Oligonucleotids, das für die gesamte oder einen Teil der aminoterminalen Domäne kodiert, werden relativ hohe Stringenzen, z. B. ungefähr 0,1 × SSPE bei 65°C, angewendet. Wenn die Hybridisierungssonde eine Region umfasst, die eine eventuell niedrigere Sequenzhomologie zu bekannten ETR-Nucleinsäuren aufweist, z. B. eine Region, die einen Abschnitt der einzigartigen aminoterminalen Domäne umfasst und einen Abschnitt, der eine Transmembrandomäne umfasst, wird die Hybridisierung vorzugsweise unter mäßigen Stringenzbedingungen, z. B. ungefähr 5 × SSPE bei 50°C, durchgeführt.
Zum Beispiel wurde unter Anwendung der obigen Kriterien eine cDNA-Bibliothek reifender Tomatenpflanzen (Stratagene, LaJolla, Kalifornien, Katalog-Nr. 936004) mit einer markierten Sonde gescreent, die eine Nucleinsäuresequenz umfasste, die für einen aminoterminalen Abschnitt der hierin in den 3A, B, C und D offenbarten Arabidopsis-ETR-Proteinsequenz kodierte. Mehrere Klone wurden identifiziert und mittels Standardtechniken sequenziert. Die DNA-Sequenzen für diese ETR-Nucleinsäure aus der Tomatenpflanze (TETR) und Arabidopsis thaliana (ETR1), die für Aminosäurereste 1 bis 123 (Seq.-ID Nr. 20 und 21) bzw. Aminosäuren 306 bis 403 (Seq.-ID Nr. 22 und 23) kodieren, sind in 10A bzw. 10B dargelegt.
Die Aminosäuresequenzen für das ETR1-Protein aus Arabidopsis thaliana und der Tomatenpflanze (TETR) für Reste 1 bis 123 (Seq.-ID Nr. 25 und 24) bzw. 306 bis 403 (Seq.-ID Nr. 27 und 26) sind in 11A bzw. 11B dargelegt.
Die vollständige ETR-Nucleinsäure- (Seq.-ID Nr. 35) und -Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 36) für TETR ist in 16 gezeigt. Ein direkter Vergleich der Aminosäu resequenz zwischen den TETR- und ETR1-Proteinen für die aminoterminalen 316 Aminosäurereste ist ein 17 gezeigt.
Wie ersichtlich ist, besteht eine wesentliche Homologie zwischen diesen speziellen Arabidopsis- und Tomatenpflanzen-ETR-Sequenzen auf der Ebene der DNA-Sequenz sowie der Aminosäuresequenz. Im Speziellen ist die Homologie auf der DNA-Ebene für die Sequenz, die für Aminosäuren 1 bis 45 kodiert, etwas höher als 72%. Die Homologie auf der Aminosäure-Ebene für die Aminosäurereste 1 bis 123 beträgt ungefähr 79%. Für den aminoterminalen Abschnitt (Reste 1 bis 316) beträgt die Gesamthomologie ungefähr 73%. Im Falle der Aminosäuresequenz-Homologie steigt die Aminosäuresequenz-Ähnlichkeit, wenn die Unterschiede zwischen den Aminosäuren an äquivalenten Resten verglichen werden und solche Unterschiede die Substitution eines konservierten Restes umfassen, d. h. Aminosäurereste, die funktionell äquivalent sind, auf ungefähr 90% für die ersten 123 Reste. Der Sequenz-Antikörper für die aminoterminalen 316 Aminosäuren steigt auf ungefähr 85%. Eine solche Sequenzähnlichkeit wurde unter Anwendung eines Best-Fit-Sequenzprogramms ermittelt, wie von Devereux et al., Nucl. Acids Res. 12, 387–395 (1984), beschrieben wurde. Funktionell äquivalente (d. h. konservierte) Reste werden durch Doppel- und Einzeldaten in vergleichenden Sequenzen identifiziert. In ähnlicher Weise beträgt die Nucleinsäuresequenz-Homologie zwischen Arabidopsis und der Tomatenpflanze für die Sequenz, die für Aminosäurereste 306 bis 403 kodiert, ungefähr 75%. Die Sequenzhomologie auf der Aminosäure-Ebene für identische Aminosäuren beträgt nahezu 86%, während die Ähnlichkeit nahezu 96% beträgt.
Zusätzlich zu ETR1 aus Arabidopsis und TETR (manchmal als TXTR bezeichnet) aus der Tomatenpflanze sind eine Reihe anderer ETR-Nucleinsäuren in Arabidopsis und Tomatenpflanze identifiziert worden. In Arabidopsis sind die QITR- und Q8-ETR-Nucleinsäuren und -Proteine identifiziert worden. Siehe die 12, 13, 14 und 15 und Seq.-ID Nr. 41 bis 48. Für QITR beträgt die Gesamt-Nucleinsäurehomologie zu ETR1 ungefähr 69%. Bezüglich des aminoterminalen Abschnitts beträgt die Homologie unter den Resten 1 bis 316 ungefähr 71% Identität für die Aminosäuresequenz und ungefähr 72% Identität bezüglich der Nucleinsäuresequenz. Bezüglich Q8 beträgt die Gesamt-Sequenzhomologie zu ETR1 aus Arabidopsis ungefähr 69% für die Gesamt-Nucleinsäuresequenz im Vergleich zu 81% Homologie für denjenigen Abschnitt von Q8, der für die 316 aminoterminalen Aminosäuren kodiert. Die Homologie zwischen Q8 und ETR1 auf der Aminosäureebene beträgt für den aminoterminalen Abschnitt ungefähr 72%.
Die anderen in der Tomatenpflanze identifizierten ETR-Nucleinsäuren umfassen TGETR1 (Seq.-ID Nr. 37) und TGETR2 (Seq.-ID Nr. 39). Die abgeleitete Proteinsequenz für TGETR1 (Seq.-ID Nr. 38) und TGETR2 (Seq.-ID Nr. 40) sind in 18 bzw. 19 dargelegt. Die Sequenz von TGETR2 ist unvollständig. Ein Vergleich der Sequenzhomologie für die ersten 316 Aminosäuren des TGETR1-Proteins und des ETR1-Proteins ist in 20 gezeigt. Die Sequenzidentität beträgt knapp unter 92%. Die Sequenzähnlichkeit zwischen diesem Abschnitt dieser beiden Proteine steigt auf nahezu 96%. Bezüglich TGETR2 legt 21 einen Vergleich des aminoterminalen Abschnitts dieses Moleküls (bis zum Aminosäurerest 245) mit dem entsprechenden Abschnitt des ETR1-Proteins dar. Die Identität der Sequenzen zwischen diesen beiden Sequenzabschnitten beträgt ungefähr 85%. Die Sequenzähnlichkeit steigt auf knapp über 92%.
Die Klonierung und Sequenzierung der ETR-Nucleinsäuren aus Arabidopsis wird in den Beispielen hierin beschrieben. Jedoch kann ein Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung angesichts der umfassenden Offenbarung der Sequenzen für diese ETR-Nucleinsäuren leicht Oligonucleotidsonden konstruieren, PCR-Amplifikation durchführen oder andere, den Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Standardprotokolle verwenden, um die offenbarten Gene sowie andere dazu homologe ETR-Nucleinsäuren aus anderen Spezies zu isolieren. Beim Screening derselben Pflanzenspezies können relativ mäßige bis hohe Stringenzbedingungen zur Hybridisierung verwendet werden, die üblicherweise zwischen 55°C bis 65°C in 5 × SSPE variieren. Wenn es wünschenswert ist, auf niedrigere Homologie oder in einer anderen Pflanzenspezies zu sondieren, können niedrigere Stringenzen, wie z. B. 50°C in 5 × SSPE, verwendet werden. Waschbedingungen erforderten jedoch 0,2 × SSPE.
Die Isolierung der TETR1-ETR-Nucleinsäure aus der Tomatenpflanze wird in den Beispielen beschrieben. Die Isolierung dieser Sequenz setzte den aminoterminalen Abschnitt des ETR1-Gens aus Arabidopsis ein. Die anderen hierin offenbarten Tomatenpflanzen-ETR-Nucleinsäuren (TGETR1 und TGETR2) wurden durch Sondieren einer Tomatenpflanzen-Genombibliothek mit einer ETR1-Sonde identifiziert. Die Genombibliothek wurde aus EMBL3 hergestellt, an das ein partiell Sau3A-verdauter genomischer DNA-Extrakt der Tomatenpflanze ligiert wurde. Die Bedingungen waren 65°C 5 × SSC mit Waschschritten bei 2 × SCC.
Bei der Durchsicht der Gesamtstruktur der verschiedenen bis heute identifizierten ETR-Nucleinsäuren und -Proteine wird ersichtlich, dass zumindest eine Klasse von ETR-Proteinen einen einzigartigen aminoterminalen Abschnitt, gefolgt von einer Histidin-Kinase-Domäne, gefolgt von einer Reaktionsregulatorregion enthält. Das ist das ETR1-Protein in Arabidopsis. Eine zweite Klasse von ETR-Protein enthält die Reaktionsregulatorregion nicht. Beispiele solcher ETR-Proteine umfassen QITR in Arabidopsis und TETR in der Tomatenpflanze. Die Signifikanz davon wird derzeit nicht verstanden. Jedoch können, wie hiernach beschrieben wird, Mutationen in den ETR-Nucleinsäuren, die für Mitglieder aus beiden Klassen kodieren, transgenen Pflanzen, die solche Nucleinsäuren enthalten, eine dominante Ethylen-Unempfindlichkeit verleihen.
Wie hiernach beschrieben, resultiert die Substitution der Aminosäurereste Ala-31, Ile-62, Cys-65 und Tyr-102 durch eine andere Aminosäure in modifizierten Arabidopsis-ETR-Nucleinsäuren, die fähig sind, in einer transformierten Pflanze Ethylen-Unempfindlichkeit zu verleihen. Alle diese Reste sind zwischen ETR-Protein der Tomatenpflanzen (TETR) und Arabidopsis thaliana (ETR1) identisch.
Wenn die ETR-Nucleinsäure einmal identifiziert ist, kann sie kloniert und ihre konstitutiven Teile, falls erforderlich, rekombiniert werden, um die gesamte ETR-Nucleinsäure zu bilden. Wenn sie einmal aus ihrer natürliche Quelle isoliert ist, z. B. in einem Plasmid oder in einem anderen Vektor enthalten oder daraus als ein lineares Nucleinsäuresegment herausgeschnitten ist, kann die ETR-Nucleinsäure als eine Sonde weiterverwendet werden, um andere ETR-Nucleinsäuren zu identifizieren und zu isolieren. Sie kann weiters als eine „Vorläufer"-Nucleinsäure verwendet werden, um modifizierte ETR-Nucleinsäuren und -Proteine herzustellen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „modifizierte ETR-Nucleinsäure" auf eine ETR-Nucleinsäure, welche die Substitution, Insertion oder Deletion einer oder mehrerer Nucleotide einer Vorläufer-ETR-Nucleinsäure enthält. Die Vorläufer-ETR-Nucleinsäuren umfassen natürlich auftretende ETR-Nucleinsäuren sowie andere modifizierte ETR-Nucleinsäuren. Die natürlich auftretende ETR-Nucleinsäure aus Arabidopsis thaliana kann als eine Vorläufer-ETR-Nucleinsäure verwendet werden, die mittels Standardtechniken, wie z. B. ortsgerichtete Mutagenese, Kassettenmutagenese und dergleichen, modifiziert werden kann, um ein oder mehrere Nucleotide an einem Codon, wie z. B. jenem, das für Alanin am Rest 31 in der Arabidopsis-ETR-Nucleinsäure kodiert, zu substituieren. Eine solche In-vitro-Codonmodifizierung kann in der Erzeugung eines Codons an Position 31 resultieren, das für einen beliebigen der anderen natürlich auftretenden Aminosäurereste kodiert. Eine solche Modifizierung liefert eine modifizierte ETR-Nucleinsäure.
Beispielsweise wird die für den in der Never-ripe-Mutante beobachteten Phänotyp verantwortliche Mutation in den Beispielen offenbart. Wie beschrieben tauscht eine einzige Punktmutation das am Rest 36 im TETR-Protein normalerweise vorhandene Prolin gegen Leucin aus. Diese Einzelmutation reicht aus, um der Pflanze der Wildform einen dominanten Ethylen-Unempfindlichkeitsphänotyp zu verleihen. Es wird erwartet, dass die Transformation der Tomatenpflanze und anderer Pflanzen mit dieser modifizierten ETR-Nucleinsäure solchen transformierten Pflanzenzellen den dominanten Ethylen-Unempfindlichkeitsphänotyp verleiht.
Alternativ dazu kann die Vorläufer-Nucleinsäure eine sein, worin eines oder mehrere der Nucleotide einer ETR-Nucleinsäure der Wildform bereits modifiziert worden sind. Folglich kann beispielsweise die ETR-Nucleinsäure von Arabidopsis thaliana am Codon 31 modifiziert werden, um eine modifizierte Nucleinsäure zu bilden, welche die Substitution dieses Codons mit einem Codon enthält, das für eine Aminosäure kodiert, die nicht Alanin ist, z. B. Valin. Diese modifizierte ETR-Nucleinsäure kann ebenfalls als eine Vorläufer-Nucleinsäure fungieren, um eine zweite Modifizierung einzuführen. Beispielsweise kann das für Ala-102 kodierende Codon modifiziert werden, um für die Substitution von Threonin zu kodieren, wobei in diesem Fall die auf diese Weise gebildete modifizierte Nucleinsäure für die Substitution zweier verschiedener Aminosäuren an Resten 31 und 102 kodiert.
Deletionen innerhalb der ETR-Nucleinsäure sind ebenfalls vorgesehen. Beispielsweise kann eine ETR-Nucleinsäure modifiziert werden, um denjenigen Abschnitt zu deletieren, der für die mutmaßlichen Transmembran- oder intrazellulären Domänen kodiert. Die dadurch gebildete modifizierte ETR-Nucleinsäure produziert, wenn sie in der Pflanzenzelle exprimiert wird, nur einen aminoterminalen Teil des ETR-Proteins, der potentiell fähig ist, Ethylen entweder direkt oder indirekt zu binden, um den tatsächlichen Spiegel von Ethylen in Pflanzengewebe zu modulieren.
Außerdem kann die modifizierte ETR-Nucleinsäure aus einer mutierten Pflanze identifiziert und isoliert werden, die einen dominanten und rezessiven Phänotyp aufweist, der durch eine veränderte Reaktion auf Ethylen gekennzeichnet ist. Solche mutierten Pflanzen können spontan entstehen oder können induziert werden, und zwar durch wohl bekannte chemische oder Bestrahlungs-Mutationstechniken, gefolgt von der Ermittlung der Ethylen-Reaktion in der Nachkommenschaft solcher Pflanzen. Beispiele solcher mutierten Pflanzen, die spontan auftreten, umfassen die Never-ripe-Mutante der Tomatenpflanze und die Ethylen-unempfindliche Mutante der Nelke. Folglich können modifizierte ETR-Nucleinsäuren durch rekombinante Modifizierung von ETR- Nucleinsäuren der Wildform oder durch Identifizierung und Isolierung modifizierter ETR-Allele aus mutierten Pflanzenspezies erhalten werden.
Es wird bevorzugt, dass die modifizierte ETR-Nucleinsäuren für die Substitution, Insertion und/oder Deletion eines oder mehrerer Aminosäurereste im Vorläufer-ETR-Protein kodieren. Bei Expression der modifizierten Nucleinsäure in Wirtspflanzenzellen ist das folglich produzierte ETR-Protein fähig, zumindest die Reaktion der Wirtszelle auf Ethylen zu modulieren. In Verbindung mit der Erzeugung eines solchen Phänotyps sind eine Anzahl von Codons in der ETR-Nucleinsäure aus Arabidopsis thaliana identifiziert worden, die bei Modifizierung und Wiedereinführung in eine Pflanze der Wildform eine Verminderung der Ethylen-Reaktion durch die transformierte Pflanze bewirken. Diese Codons kodieren für Aminosäurereste Ala-31, Ile-62, Cys-65 und Tyr-102 im ETR-Protein von Arabidopsis thaliana. Das ETR-Gen und alle dieser speziellen, modifizierten Aminosäurereste wurden durch Klonieren des ETR-Gens der Wildform aus Arabidopsis thaliana und chemisch modifizierter Allele aus vier verschiedenen Sorten (etr1-1, etr1-2, etr1-3 und etr1-4) von Arabidopsis thaliana (jede davon zeigte einen dominanten Phänotyp, der Unempfindlichkeit gegen Ethylen umfasste) und Vergleichen der Nucleotid- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen identifiziert. Die Erfindung ist jedoch, wie in den Beispielen beschrieben, nicht auf modifizierte ETR-Nucleinsäuren aus Arabidopsis thaliana beschränkt. Vielmehr umfasst die Erfindung andere leicht identifizierbare, modifizierte ETR-Nucleinsäuren, welche die Ethylen-Unempfindlichkeit modulieren.
Die obigen vier Sorten, die eine dominante Ethylen-Unempfindlichkeit zeigen, wurden durch chemische Modifizierung von Keimlingen von Arabidopsis thaliana erzeugt und durch Beobachten der Pflanzenentwicklung aus solchen modifizierten Keimlingen mit zugesetztem exogenem Ethylen identifiziert. Unter Anwendung eines ähnlichen Ansatzes, entweder mit oder ohne Zugabe von exogenem Ethylen, kann der Fachkundige leicht andere Varianten beliebig gewählter Pflanzenspezies erzeugen, die ebenfalls eine modulierte Reaktion auf Ethylen aufweisen. Anschließend können unter Verwendung von ETR-Sonden, die auf hierin offenbarten Wildform- oder modi fizierten ETR-Nucleinsäuren beruhen, andere modifizierte ETR-Nucleinsäuren durch Sondieren geeigneter genomischer oder cDNA-Bibliotheken der modifizierten, gewählten Pflanzenspezies isoliert werden. Die Nucleotid- und/oder kodierte Aminosäuresequenz von solchen neu erzeugten modifizierten ETR-Nucleinsäuren wird dann vorzugsweise mit der ETR-Nucleinsäure der Wildform aus der gewählten Pflanzenspezies verglichen, um zu ermitteln, welche Modifizierungen, wenn überhaupt, in der ETR-Nucleinsäure für den beobachteten Phänotyp verantwortlich sind. Wenn die Wildform-Sequenz der gewählten Pflanzenspezies nicht verfügbar ist, können die hierin für Arabidopsis thaliana offenbarten Wildform- oder modifizierten ETR-Sequenzen oder andere ETR-Sequenzen, die identifiziert worden sind, für den Vergleich verwendete werden. Auf diese Weise können andere Modifizierungen an ETR-Proteinen identifiziert werden, die den Ethylen-Unempfindlichkeits-Phänotyp verleihen können. Solche Modifizierungen umfassen die Identifizierung von anderen als die hierin offenbarten Aminosäuren, die an Resten substituiert werden können, die Ala-31, Ile-62, Cys-65 und Ala-102 im ETR-Protein von Arabidopsis thaliana entsprechen, und die Identifizierung anderer Aminosäurereste, die durch Substitution, Insertion und/oder Deletion eines oder mehrerer Aminosäurereste modifiziert werden können, um den gewünschten Phänotyp hervorzubringen.
Alternativ dazu kann eine klonierte Vorläufer-ETR-Nucleinsäure systematisch modifiziert werden, so dass sie für die Substitution, Insertion und/oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren kodiert, und kann getestet werden, um die Wirkung einer solchen Modifizierung auf die Ethylen-Reaktion der Pflanze zu ermitteln. Solche Modifizierungen werden vorzugsweise innerhalb jenes Abschnitts der ETR-Nucleinsäure vorgenommen, der für den aminoterminalen Abschnitt des ETR-Proteins kodiert. Jedoch sind Modifizierungen der carboxyterminalen oder mutmaßlichen Transmembrandomänen zur Modulation der Signaltransduktion ebenso vorgesehen (z. B. Modifizierungen des konservierten Histidins der Histidin-Kinase-Domäne, welches die angenommene Stelle der Autophosphorylierung ist, oder des konservierten Aspartats der Reaktionsregulatordomäne, welches die angenommene Phosphorylierungstelle ist). Ein Verfahren, das zur Identifizierung spezieller, an der direkten oder indirekten Wechselwirkung mit Ethylen beteiligter Aminosäurereste angewendet werden kann, ist die sequentielle Substitution der Codons einer ETR-Nucleinsäure durch Codons, die für eine Scanning-Aminosäure, wie z. B. Glycin oder Alanin, kodieren (siehe z. B. PCT-Anmeldung WO 90/04788, publiziert am 3. Mai 1990), gefolgt von der Transformation aller dadurch gebildeter, modifizierter Nucleinsäuren in eine Pflanze, um die Wirkung einer solchen sequentiellen Substitution auf die Ethylen-Reaktion zu ermitteln. Andere Ansätze umfassen statistische Modifizierungen oder vorherbestimmte abgezielte Modifizierungen der klonierten ETR-Nucleinsäure (siehe z. B. PCT-Anmeldung WO 92/07090, publiziert am 30 April 1992), gefolgt von Transformation von Pflanzenzellen und der Identifizierung der Nachkommenschaft, die eine veränderte Ethylen-Reaktion aufweist. Die ETR-Nucleinsäure aus diesen Pflanzen mit dem gewünschten Phänotyp wird isoliert und sequenziert, um die für den beobachteten Phänotyp verantwortliche Modifizierung zu bestätigen oder zu identifizieren.
Aminosäurereste, die mit jenen äquivalent sind, die speziell in einem ETR-Protein identifiziert worden sind und modifiziert werden können, um die Ethylen-Reaktion zu verändern, können auch in ETR-Proteinen aus anderen Pflanzenspezies leicht identifiziert werden. Beispielsweise können Aminosäuren, die mit jenen im ETR-Protein aus Arabidopsis thaliana äquivalent sind, leicht in anderen ETR-Proteinen identifiziert werden. Ein Aminosäurerest in einem Vorläufer-ETR-Protein ist äquivalent mit einem bestimmten Rest im ETR-Protein von Arabidopsis thaliana, wenn er bezüglich der Position in der Primär- oder der Tertiärstruktur zum spezifizierten Rest des Arabidopsis-ETR-Proteins homolog ist.
Um Homologie durch die Primärstruktur festzulegen, wird die primäre Aminosäuresequenz eines Vorläufer-ETR-Proteins mittels Angleichung direkt mit der Primärsequenz des ETR-Proteins aus Arabidopsis thaliana verglichen. Eine solche Angleichung wird vorzugsweise mit der aminoterminalen Domäne vorgenommen und berücksichtigt üblicherweise die eventuelle Insertion oder Deletion eines oder mehrerer Aminosäurereste der beiden Sequenzen, so dass die Aminosäuresequenz-Homologie maximiert wird. Ein Vergleich der Multiplizität der ETR-Proteinsequenzen mit der von Arabidopsis thaliana sorgt für die Identifizierung konservierter Reste unter solchen Sequenzen, wobei diese Konservierung vorzugsweise für den weiteren Vergleich der primären Aminosäuresequenz beibehalten wird. Auf Basis der Angleichung solcher Sequenzen kann der Fachkundige leicht Aminosäurereste in anderen ETR-Proteinen identifizieren, die mit Ala-31, Ile-62, Cys-65, Ala-102 und anderen Resten im Arabidopsis-thaliana-ETR-Protein äquivalent sind. Solche äquivalenten Reste werden für Modifizierungen ausgewählt, die analog zu jenen anderer modifizierter ETR-Proteine sind, welche den gewünschten Ethylen-reaktiven Phänotyp verleihen. Solche modifizierten ETR-Proteine werden vorzugsweise durch Modifizieren einer Vorläufer-ETR-Nucleinsäure hergestellt, um für die entsprechende Substitution, Insertion und/oder Deletion am äquivalenten Aminosäurerest zu kodieren.
Zusätzlich zur Homologie auf der Ebene der Primärsequenz können äquivalente Reste auf Basis der Homologie auf der Ebene der Tertiärstruktur identifiziert werden. Die Bestimmung der Äquivalenz auf dieser Ebene erfordert üblicherweise dreidimensionale Kristallstrukturen für ein ETR-Protein oder modifiziertes ETR-Protein aus Arabidopsis (oder die Kristallstruktur für ein anderes ETR-Protein mit den definierten äquivalenten Resten) und die Kristallstruktur eines gewählten ETR-Proteins. Äquivalente Reste auf der Ebene der Tertiärstruktur sind als jene Reste definiert, für welche die Atomkoordinaten von zwei oder mehreren der Hauptkettenatome eines bestimmten Aminosäurerests des gewählten ETR-Proteins im Vergleich mit dem ETR-Protein aus Arabidopsis sich nach der Angleichung innerhalb von 0,13 nm und vorzugsweise 0,10 nm befinden. Die Angleichung ist erzielt, nachdem das beste Modell ausgerichtet und positioniert worden ist, um die maximale Überlappung der Atomkoordinaten von Nicht-Wasserstoff-Proteinatomen der fraglichen ETR-Proteine zu ergeben.
ETR-Nucleinsäuren können von beliebigen höheren Pflanzen, die gegen Ethylen reaktiv sind, hergeleitet werden. Besonders geeignete Pflanzen umfassen Tomate, Banane, Kiwi-Frucht, Avocado, Melone, Mango, Papaya, Apfel, Pfirsich und andere kritische Fruchtpflanzen. Nicht-kritische Spezies, aus denen ETR-Nucleinsäuren isoliert werden können, umfassen Erdbeere, Himbeere, Brombeere, Heidelbeere, Kopfsalat, Kohl, Karfiol, Zwiebel, Brokkoli, Rosenkohl, Baumwolle, Raps (Canola), Weintraube, Sojabohne und Ölsamen-Raps. Außerdem können ETR-Nucleinsäuren aus Blütenpflanzen innerhalb der Abteilung Magnoliophyta isoliert werden, welche die Angiospermen umfassen, welche die zweikeimblättrigen (Klasse Magnoliopsida und Dicotyledoneae) und einkeimblättrigen (Klasse Liliopsida) Pflanzen umfassen. Insbesondere bevorzugte Ordnungen von Angiospermen gemäß der „Taxonomy of Flowering Plants" von A. M. Johnson, The Century Co., NY (1931), umfassen Rosales, Cucurbitales, Rubiales, Campanulatae, Contortae, Tubiflorae, Plantaginales, Ericales, Primulales, Ebenales, Diapensiales, Primulales, Plumbaginales, Opuntiales, Parietales, Myritiflorae, Umbelliflorae, Geraniales, Sapindales, Rhamnales, Malvales, Pandales, Rhoendales, Sarraceniales, Ramales, Centrospermae, Santalales, Euphorbiales, Capparales, Aristolochiales, Julianiales, Juglandales, Fagales, Urticales, Myricales, Polygonales, Batidales, Balanopsidales, Proteales, Salicales, Leitneriales, Garrycales, Verticillatae und Piperales. Insbesondere bevorzugte Pflanzen umfassen Lilie, Nelke, Chrysantheme, Petunie, Rose, Geranie, Veilchen, Gladiole, Orchidee, Flieder, Holzapfel, Amberbaum, Ahorn, Weihnachtsstern, Johannisbrot, Esche und Linde.
Zusätzlich zur Bereitstellung einer Quelle für ETR-Nucleinsäuren, die gemäß der Lehren hierin modifiziert oder isoliert werden können, können die vorhergehenden Pflanzen als Rezipienten der modifizierten Nucleinsäure verwendet werden, um chimäre oder transgene Pflanzen herzustellen, die einen Ethylen-Resistenz-Phänotyp in einem oder mehreren Gewebetypen der transformierten Pflanze zeigen.
Wenn einmal eine modifizierte ETR-Nucleinsäure kloniert worden ist, wird sie verwendet, um Vektoren zum Transformieren von Pflanzenzellen zu konstruieren. Die Konstruktion solcher Vektoren wird durch die Verwendung eines Shuttle-Vektors erleichtert, der sowohl in einer Pflanze als auch in einem zweckdienlichen Klonierungswirt, wie z. B. einem Prokaryoten, manipuliert und selektiert werden kann. Solche Shuttle-Vektoren können folglich ein antibiotisches Resistenzgen zur Selektion in Pflanzenzellen (z. B. Kanamycin-Resistenz) und ein antibiotisches Resistenzgen zur Selektion in einem bakteriellen Wirt (z. B. Actinomycin-Resistenz) umfassen. Solche Shuttle-Vektoren enthalten auch einen für den verwendeten prokaryotischen Wirt geeigneten Replikationsstartpunkt und vorzugsweise zumindest eine einzigartige Restriktionsstelle oder einen einzigartige Restriktionsstellen enthaltenden Polylinker, um die Vektorkonstruktion zu erleichtern. Beispiele solcher Shuttle-Vektoren umfassen pMON530 (Rogers et al., Methods in Enzymology 153, 253–277 (1988)) und pCGN1547 (McBride et al., Plant Molecular Biology 14, 269–276 (1990)).
In bevorzugten Ausführungsformen, welche die beste Form der praktischen Durchführung der Erfindung umfassen, wird ein Promotor verwendet, um die Expression einer ETR- oder modifizierten ETR-Nucleinsäure in zumindest einem Teil der Gewebe einer transformierten Pflanze anzutreiben. Die Expression einer ETR-Nucleinsäure erfolgt vorzugsweise in der Antisense-Richtung, um die Ethylen-Reaktion durch Verminderung der Translation des endogenen ETR-RNA-Transkripts zu modulieren. Die Expression einer modifizierten ETR-Nucleinsäure resultiert in der Produktion eines modifizierten ETR-Proteins, das zur Verleihung von Ethylen-Unempfindlichkeit fähig ist. Solche Promotoren können aus Pflanzen, pflanzenpathogenen Bakterien oder Pflanzenviren erhalten werden. Konstitutive Promotoren umfassen die 35S- und 19S-Promotoren des Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV35S und CaMV19S), den Volllängen-Transkript-Promotor aus dem Feigwurz-Mosaikvirus (FMV35S)(siehe PCT-Anmeldung Nr. WO 92/12249, publiziert am 23. Juli 1992) und Promotoren, die mit Agrobacterium-Genen, wie z. B. Nopalin-Synthase (NOS), Mannopin-Synthase (MOS) oder Octopin-Synthase (OCS) assoziiert sind. Andere konstitutive Promotoren umfassen die α-1- und β-1-Tubulin-Promotoren (Silflow et al., Devel. Genet. 8, 435–460 (1987)), die Histon-Promotoren (Chaubet, Devl. Genet. 8, 461–473 (1987)) und die Promotoren, welche die Transkription von ETR-Nucleinsäuren regulieren.
In einigen Ausführungsformen können gewebe- und/oder zeitspezifische Promotoren verwendet werden, um die Expression von ETR- und modifizierten ETR-Nucleinsäuren zu kontrollieren. Beispiele fruchtspezifischer Promotoren umfassen die E8-, E4-, E17- und J49-Promotoren aus der Tomatenpflanze (Lincoln et al., Mol. Gen. Genet. 212, 71–75 (1988)) und die 2A11-, Z130- und Z70-Promotoren aus der Tomatenpflanze, wie beschrieben in US-Patenten Nr. 4.943.674, 5.175.095 und 5.177.307. Außerdem kann die bevorzugte Expression in sich schnell teilendem Gewebe erhalten werden, indem der in US-Patent Nr. 5.177.011 beschriebene EF-1α-Promotor eingesetzt wird. Beispiele blumenspezifischer Promotoren umfassen den Laub-Promotor und Promotoren aus den Apetala-, Pistillata- und Agamous-Genen. Ein Promotorsystem zum Abzielen der Expression in Blättern einer transformierten Pflanze ist ein chimärer Promotor, der den CaMV35S-Promotor umfasst, der an einen Abschnitt des ssRUBISCO-Gens ligiert ist, das die Expression von ssRUBISCO in Abwesenheit von Licht unterdrückt. Außerdem können Pollen-spezifische Promotoren ebenfalls verwendet werden. Solche Promotoren sind dem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung wohl bekannt und leicht erhältlich. Ein Beispiel eines solchen Promotors ist Zn13 (Hamilton et al., Plant Mol. Biol. 18, 211–218 (1992)). Dieser Promotor wurde aus Mais (Monocot) kloniert, fungiert jedoch bei Verwendung in der Tabakpflanze (Dicot) als starker und Pollen-spezifischer Promotor.
Beispiele induzierbarer Promotoren, die zur bedingten Expression von ETR-Nucleinsäuren verwendet werden können, umfassen jene aus Hitzeschockprotein-Genen, wie z. B. das Hitzeschockprotein-Gen PHS1 (Takahashi et al., Mol. Gen. Genet. 219, 365–372 (1989)) und Licht-induzierbare Promotoren, einschließlich der drei Chlorophyll-a/b-Lichternte-Proteinpromotoren (Leutwiler et al., Nucl. Acids. Res. 14, 4051– 4064 (1986)) und des Prä-Ferredoxin-Promotors (Vorst et al., Plant Mol. Biol. 14, 491–499 (1990)).
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird der zur Transformation von Pflanzenzellen verwendete Vektor konstruiert, um die Insertion der ETR-Nucleinsäure in einen endogenen Promotor innerhalb der Pflanzenzelle zu zielen. Einer der Arten von Vektoren, die verwendet werden können, um die Integration einer modifizierten ETR-Nucleinsäure in einen endogenen Promotor zu zielen, umfasst einen Positiv-Negativ-Selektionsvektor analog zu jenem, der von Monsour et al., Nature 336, 348–352 (1988), dargelegt wird, der das Abzielen exogener DNA auf einen vorherbe stimmten endogenen Locus in Säugetier-ES-Zellen beschreibt. Ähnliche Konstrukte, welche positive und negative Selektionsmarker einsetzen, die in Pflanzenzellen funktionell sind, können auf Basis der Identifizierung des endogenen Pflanzenpromotors und der ihn umgebenen Sequenz leicht konstruiert werden. Bei Anwendung eines solchen Ansatzes wird bevorzugt, einen Vektor vom Austausch-Typ zu verwenden, um die Wahrscheinlichkeit der Reversion zum Genotyp der Wildform zu minimieren.
Die Vektoren der Erfindung werden so konstruiert, dass die im Vektor enthaltene Promotorsequenz oder die im Pflanzenzellgenom abgezielte Promotorsequenz operativ an die für die ETR- oder modifizierte ETR-Nucleinsäure kodierende Nucleinsäure gebunden ist. Wenn der positive Strang der ETR-Nucleinsäure verwendet wird, bedeutet der Ausdruck „operativ gebunden", dass die Promotorsequenz relativ zur kodierenden Sequenz der ETR-Nucleinsäure so positioniert ist, dass RNA-Polymerase in der Lage ist, die Transkription der ETR-Nucleinsäure aus der Promotorsequenz zu initiieren. In solchen Ausführungsformen wird ferner bevorzugt, geeignete Ribosombindungsstellen, Transkriptionsinitiations- und -terminationssequenzen, Translationsinitiations- und -terminationssequenzen und Polyadenylierungssequenzen bereitzustellen, um ein funktionelles RNA-Transkript herzustellen, das in ETR-Protein translatiert werden kann. Bei Verwendung einer Antisense-Ausrichtung der ETR-Nucleinsäure ist lediglich erforderlich, dass der Promotor operativ gebunden ist, um den ETR-Antisense-Strang zu transkribieren. Folglich werden in solchen Ausführungsformen nur Transkriptionsstart- und -terminationssequenzen benötigt, um ein RNA-Transkript bereitzustellen, das zur Hybridisierung mit der mRNA oder einem anderen RNA-Transkript aus einem endogenen ETR-Gen oder einer modifizierten ETR-Nucleinsäure, die in einer transformierten Pflanzenzelle enthalten ist, fähig ist. Zusätzlich zu Promotoren können andere Expressionsregulationssequenzen, wie z. B. Enhancer, dem Vektor zugefügt werden, um die Expression der ETR-Nucleinsäure in vivo zu erleichtern.
Wenn der Vektor einmal konstruiert ist, kann die Transformation in Pflanzen gemäß der Erfindung im Wesentlichen durch beliebige der verschiedenen Transformations verfahren durchgeführt werden, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Pflanzenmolekularbiologie bekannt sind. Solche Verfahren werden in Methods of Enzymology, Bd. 153 („Recombinant DNA Part D"), Wu und Grossman (Hrsg.), Academic Press (1987), allgemein beschrieben. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Transformation" die Veränderung des Genotyps einer Pflanzenzelle durch die Einführung exogener Nucleinsäure. Spezielle Verfahren zur Transformation von Pflanzenzellen umfassen die direkte Mikroinjektion der Nucleinsäure in eine Pflanzenzelle durch Verwendung von Mikropipetten. Alternativ dazu kann die Nucleinsäure mittels Polyethylenglykol in eine Pflanzenzelle transferiert werden (Paszkowski et al., EMBO J. 3, 2717–2722 (1984)). Andere Transformationsverfahren umfassen Elektroporation von Protoplasten (Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985)), Infektion mit einem pflanzenspezifischen Virus, z. B. Blumenkohl-Mosaikvirus (Hohn et al., „Molecular Biology of Plant Tumors", Academic Press, New York, S. 549–560 (1982)) oder die Verwendung von Transformationssequenzen aus pflanzenspezifischen Bakterien, wie z. B. Agrobacterium tumefaciens, z. B. eines Ti-Plasmids, das bei Infektion durch Agrobacterium tumefaciens auf eine Pflanzenzelle übertragen wird (Horsch et al., Science 233, 496–498 (1984); Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4803 (1983)). Alternativ dazu können Pflanzenzellen durch Einführung von Nucleinsäure transformiert werden, die innerhalb der Matrix oder an der Oberfläche kleiner Perlen oder Teilchen enthalten ist, und zwar durch ballistische Hochgeschwindigkeitspenetration der Pflanzenzelle (Klein et al., Nature 327, 70–73 (1987)).
Nachdem der Vektor in eine Pflanzenzelle eingeführt worden ist, wird die Selektion auf erfolgreiche Transformation typischerweise vor der Neubildung einer Pflanze durchgeführt. Eine solche Selektion auf Transformation ist nicht notwendig, erleichtert jedoch die Selektion regenerierter Pflanzen mit dem gewünschten Phänotyp durch Verminderung des Wildform-Hintergrunds. Eine solche Selektion basiert zweckdienlicherweise auf Antibiotikaresistenz- und/oder Herbizidresistenz-Genen, die in den Transformationsvektor eingebaut werden können.
Praktisch alle Pflanzen können aus kultivierten Zellen oder Geweben regeneriert werden. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Regenerierung" auf das Züchten einer vollständigen Pflanze aus einer Pflanzenzelle, einer Gruppe von Pflanzenzellen oder einem Pflanzenteil. Die Verfahren zur Pflanzenregenerierung sind dem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung wohl bekannt. Beispielsweise wird die Regenerierung aus kultivierten Protoplasten von Evans et al., „Protoplasts Isolation and Culture", Handbook of Plant Cell Culture 1, MacMillan Publishing Co. New York, S. 124–176 (1983); M. R. Davey, „Recent Developments in the Culture and Regeneration of Plant Protoplasts", Protoplasts, Lecture Proceedings, Birkhauser, Basil, S. 12–29 (1983); und N. Binding, „Regeneration of Plants", Plant Protoplasts, CRC Press, Bocaraton, S. 21–73 (1985), beschrieben. Wenn ein Organteil transformiert wird, kann die Regeneration aus dem Pflanzenkallus, Explantaten, Organen oder Teilen erfolgen. Solche Verfahren zur Regeneration sind dem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung ebenfalls bekannt. Siehe z. B. Methods in Enzymology, s. o.; Methods in Enzymology, Bd. 118; und Klee et al., Annual Review of Plant Physiology 38, 467–486.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Transformieren und Regenerieren der Petunie mit den Vektoren der Erfindung wird von R. B. Horsch et al., Science 227, 1229–1231 (1985), beschrieben. Ein bevorzugtes Verfahren zum Transformieren von Baumwolle mit den Vektoren der Erfindung und das Regenerieren von Pflanzen daraus wird von Trolinder et al., Plant Cell Reports 6, 231–234 (1987), beschrieben.
Tomatenpflanzenzellen werden vorzugsweise unter Einsatz von Agrobacterium-Stämmen durch das von McCormick et al., Plant Cell Reports 5, 81–84 (1986), beschriebene Verfahren transformiert. Insbesondere werden Keimblätter aus 7–8 Tage alten Keimlingen erhalten. Die Samen werden für 20 Minuten in 30% Clorox-Bleichmittel oberflächensterilisiert und in Plantcons-Boxen auf Davis-Keimungsmedium zur Keimung gebracht. Davis-Keimungsmedium besteht aus 4,3 g/l MS-Salzen, 20 g/l Saccharose und 10 ml/l Nitsch-Vitaminen, pH 5,8. Die Nitsch-Vitaminlösung besteht aus 100 mg/l Myoinositol, 5 mg/ml Nicotinsäure, 0,5 mg/l Pyridoxin-HCl, 0,5 mg/ml Thiamin-HCl, 0,05 mg/l Folsäure, 0,05 mg/l Biotin, 2 mg/ml Glycin. Die Samen werden für 7–8 Tage in der Wachstumskammer bei 25°C, 40% Feuchte unter kaltem weißem Licht mit einer Intensität von 80 E. m². s^–1 auskeimen gelassen. Die Photoperiode beträgt 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit.
Sobald die Keimung erfolgt ist, werden die Keimblätter unter Verwendung einer Federklinge Nr. 15 durch Wegschneiden des Apikalmeristems und des Hypokotyls explantiert, um ein rechteckiges Explantat zu erzeugen. Diese Schnitte an den kurzen Enden des keimenden Keimblatts erhöhen die Oberfläche für die Infektion. Die Explantate werden in steriler Davis-Regenerationsflüssigkeit gebadet, um Austrocknung zu verhindern. Davis-Regenerationsflüssigkeit besteht aus 1X MS-Salzen, 3% Saccharose, 1X Nitsch-Vitaminen, 2,0 mg/l Zeatin, pH 5,8. Diese Lösung wurde mit 0,8 % Noble-Agar autoklaviert.
Die Keimblätter werden auf „Feeder-Platten" vorkultiviert, die aus Medium zusammengesetzt sind, das keine Antibiotika enthält. Das Medium besteht aus 4,3 g/l MS-Salzen, 30 g/l Saccharose, 0,1 g/l Myoinositol, 0,2 g/l KH₂PO₄, 1,45 ml/l einer 0,9mg/ml-Lösung von Thiamin-HCl, 0,2 ml einer 0,5-mg/ml-Lösung Kinetin und 0,1 ml einer 0,2-mg/ml-Lösung 2,4-D. Diese Lösung wird mit KOH auf pH 6,0 eingestellt. Diese Platten werden mit 1,5–2,0 ml Tabak-Suspensionszellen (TXD's) und einem in 2COO5K-Medium getränkten Whitman-Filter überschichtet. 2COO5K-Medium besteht aus 4,3 g/l Gibco-MS-Salzgemisch, 1 ml B5-Vitaminen (1000X-Stammlösung), 30 g/l Saccharose, 2 ml/l PCPA aus einer Stammlösung mit 2 mg/ml und 10 μl/l Kinetin aus einer Stammlösung mit 0,5 mg/ml. Die Keimblätter wurden für 1 Tag in einer Wachstumskammer bei 25°C unter kaltem weißem Licht mit einer Lichtintensität von 40–50 E. m². s^–1 mit einer Photoperiode mit kontinuierlichem Licht kultiviert.
Die Keimblätter werden dann mit einer Lösung von Agrobacterium in der log-Phase inokuliert, wobei die Lösung die modifizierte oder Wildform-ETR-Nucleinsäure enthält. Die Konzentration von Agrobacterium beträgt ungefähr 5 × 10⁸ Zellen/ml. Die Keimblätter werden in der Bakterienlösung für sechs Minuten getränkt und werden dann an sterilen Whatman-Filterpapierscheiben geblottet, um überschüssige Lösung zu entfernen, und anschließend wieder auf die ursprüngliche Feeder-Platte gelegt, wo sie für 2 Tage co-kultiviert werden. Nach den zwei Tagen werden die Keimblätter auf Selektionsplatten übertragen, die Davis-Regenerierungsmedium mit 2 mg/l Zeatin-Ribosid, 500 μg/ml Carbenicillin und 100 μg/ml Kanamycin enthalten. Nach 2–3 Wochen werden die Keimblätter mit Kallus- und/oder Sprossbildung auf frische Davis-Regenerierungsplatten übertragen, die Carbenicillin und Kanamycin in denselben Konzentrationen enthalten. Das Experiment wird zu diesem Zeitpunkt auf Transformanten ausgezählt. Das Kallusgewebe wird in regelmäßigen 3-Wochenintervallen subkultiviert und jegliche abnormale Strukturen werden zurückgeschnitten, so dass die sich entwickelnden Knospen weiterhin regenerieren. Schösslinge entwickeln sich innerhalb von 3–4 Monaten.
Sobald sich Schösslinge entwickeln, werden sie aus dem Kallusgewebe sauber herausgeschnitten und auf Wurzelbindungs-Selektionsplatten angepflanzt. Diese Platten enthalten 0,5X MSO, das 50 μg/ml Kanamycin und 500 μg/ml Carbenicillin enthält. Diese Schösslinge bilden auf dem Selektionsmedium innerhalb von 2 Wochen Wurzeln. Wenn nach zwei Wochen keine Wurzeln auftreten, werden die Schösslinge beschnitten und auf dem Selektionsmedium neu angepflanzt. Schösslingskulturen werden in Percivals bei einer Raumtemperatur von 22°C inkubiert. Schösslinge mit Wurzeln werden dann in Töpfe versetzt, wenn die Wurzeln ungefähr 2 cm lang waren. Die Pflanzen werden in einer Wachstumskammer bei 21°C mit einer Photoperiode von 18 Stunden Licht und 6 Stunden Dunkelheit für 2–3 Wochen vor dem Transfer in ein Gewächshaus abgehärtet. Im Gewächshaus werden die Pflanzen bei einer Temperatur von 26°C während des Tages und 21°C während der Nacht gezüchtet. Die Photoperiode beträgt 13 Stunden Licht und 11 Stunden Dunkelheit, und die Pflanzen werden zur Reife gebracht.
Wenn die Pflanzen einmal regeneriert worden sind, werden eine oder mehrere Pflanzen auf Basis einer Veränderung des Ethylen-Reaktionsphänotyps selektiert. Wenn beispielsweise eine modifizierte ETR-Nucleinsäure mit seinem nativen Promotor ver wendet wird, kann die Selektion auf einer Veränderung von irgendeiner der „Dreifach-Reaktionen" von Keimlingen aus solchen Pflanzen basieren. Guzman et al., The Plant Cell 2, 523 (1990). Alternativ dazu oder wenn konstitutive Promotoren verwendet werden, können verschiedene andere Ethylen-Reaktionen getestet und mit der Pflanze der Wildform verglichen werden. Solche anderen Ethylen-Reaktionen umfassen Epinastie (die in erster Linie in der Tomatenpflanze beobachtet wird), Epsision, Abwurf, Blütenblattalterung und Fruchtreifung umfassen. Zusätzlich zum Offenkundigmachen der Veränderungen der Ethylen-Reaktion können die Mengen verschiedener Enzyme bestimmt werden, gefolgt von Exposition mit Ethylen, um die Reaktionszeit für die typische Zunahme oder Abnahme der Menge eines bestimmten Proteins, z. B. eines Enzyms, zu bestimmen. Beispiele verschiedener Ethylen-Reaktionen, die dazu verwendet werden können, um zu ermitteln, ob eine bestimmte Pflanze eine verminderte Reaktion auf Ethylen aufweist, sind in Kapitel 7, The Mechanisms of Ethylene Action, in: „Ethylene in Plant Biology", 2. Aufl., F. B. Abels, P. W. Morgan und M. E. Salveit, Jr. (Hrsg.), San Diego, Academic Press Inc. (1992), dargelegt. Wenn ein gewebe- und/oder zeitspezifischer Promotor oder induzierbarer Promotor verwendet wird, wird die Ermittlung einer Modulation der Ethylen-Reaktion im geeigneten Gewebe zur geeigneten Zeit und wenn nötig unter den geeigneten Bedingungen zur Aktivierung/Inaktivierung eines induzierbaren Promotors bestimmt. In allen Fällen wird die Ethylen-Reaktion vorzugsweise mit derselben Ethylen-Reaktion einer Pflanze der Wildform verglichen.
Es folgen insbesondere bevorzugte Ausführungsformen zum Modulieren der Ethylen-Reaktion in der Frucht. Jedoch können solche Ausführungsformen leicht modifiziert werden, um die Ethylen-Reaktion in vegetativem Gewebe und Blüten zu modulieren.
In einem Ansatz wird eine operativ an einen konstitutiven Promotor mäßiger Stärke gebundene modifizierte ETR-Nucleinsäure verwendet, um die Ethylen-Reaktion zu vermindern. Dies resultiert in einer Verlängerung der Zeit für die Fruchtreifung.
In einer alternativen Ausführungsform wird eine operativ an einen regulierbaren (induzierbaren) Promotor gebundene modifizierte ETR-Nucleinsäure verwendet, so dass die Bedingung, welche die Expression der modifizierten ETR-Nucleinsäure anschaltet, aufrechterhalten werden kann, um die Fruchtreifung zu verhindern. Die Bedingung, welche die Expression der modifizierten ETR-Nucleinsäure ausschaltet, kann daraufhin aufrechterhalten werden, um die Reifung zu erzielen. Beispielsweise kann ein hitzeinduzierbarer Promotor verwendet werden, der bei hohen (Feld-) Temperaturen aktiv ist, nicht jedoch bei niedriger Temperatur, wie z. B. während der Kühlung. Ein weiteres Beispiel setzt einen Auxin- oder Gibberellin-induzierten Promotor ein, so dass die transformierten Pflanzen mit kommerziellen Auxin-Analoga, wie z. B. 2,4-D, oder mit kommerziellen Gibberellin-Analoga, wie z. B. Pro-Gibb, behandelt werden können, um eine frühe Reifung zu verhindern.
Alternativ dazu kann ein starker konstitutiver Promotor operativ an eine modifizierte ETR-Nucleinsäure gebunden werden, um die Fruchtreifung zu verhindern. Um die letztendliche Fruchtreifung zu ermöglichen, wird die Pflanze auch mit einer operativ an einen induzierbaren Promotor gebundenen ETR-Nucleinsäure der Wildform transformiert. Die Expression der ETR-Nucleinsäure der Wildform wird verstärkt, indem die Pflanze der geeigneten Bedingung ausgesetzt wird, auf die der induzierbare Promotor reagiert. Bei Verstärkung der Expression der ETR-Nucleinsäure der Wildform wird die Wirkung der Expression der modifizierten ETR-Nucleinsäure vermindert, so dass die Fruchtreifung stattfindet.
Spezielle Konstrukte, die zur Verwendung bei der Transformation von Pflanzen zur Verleihung von Ethylen-Unempfindlichkeit wünschenswert sind, umfassen den operativ an beliebige anderen mutierte Arabidopsis-ETR-Genom- oder -cDNA-Klone gebundenen CMV35S-Promotor, einschließlich der entsprechenden Modifikation am Rest 36, um Prolin in Leucin umzuwandeln. Von solchen Konstrukten wird erwartet, dass sie Zellen und Pflanzen, die mit solchen Konstrukten transformiert sind und diese exprimieren, einen dominanten Ethylen-Unempfindlichkeits-Phänotyp verleihen.
Außerdem umfasst ein bevorzugtes Konstrukt das operative Binden des FMV-Promotors, um die Expression der Tomaten-TETR-cDNA anzutreiben, die genetisch dahingehend manipuliert worden ist, eine Mutation zu enthalten, die zu irgendeiner derjenigen Mutationen, die in den ETR-Genen aus Arabidopsis identifiziert wurden, sowie zu der sich im Tomaten-ETR-Gen findenden Nr-Mutation analog ist. Von solchen Konstrukten wird erwartet, dass sie Zellen und Pflanzen, die mit solchen Konstrukten transformiert sind und diese exprimieren, einen dominanten Ethylen-Unempfindlichkeits-Phänotyp verleihen.
Andere bevorzugte Konstrukte umfassen die operative Bindung des FMV-Promotors an ETR-Antisense-cDNAs, einschließlich TETR und ETR1. Von solchen Konstrukten wird erwartet, dass sie Zellen und Pflanzen, die mit solchen Konstrukten transformiert sind und diese exprimieren, einen dominanten Ethylen-Unempfindlichkeits-Phänotyp verleihen.
Die Erfindung kann in einer breiten Vielfalt von Pflanzen praktisch umgesetzt werden, um zweckdienliche Phänotypen zu erhalten. Beispielsweise kann die Erfindung verwendet werden, um Blütenalterung und Abwurf während der Züchtung oder während Transport und Lagerung zu verzögern oder zu verhindern, wie sie in Blumenbeeten oder Baumwollkulturen (Hall et al., Physiol. Plant 10, 306–317 (1957)) und in Zierblumen auftreten (z. B. Nelken, Rosen), die entweder geschnitten (Halevy et al., Hort. Rev. 3, 59–143 (1981)) oder ungeschnitten sind. Außerdem kann die Erfindung umgesetzt werden, um Alterung und Abwurf von Blättern und Früchten bei Gurken (Jackson et al., Can. J. Bot. 50, 1465–1471 (1972)), Hülsenfrüchten und anderen Feldfrüchten (Heck et al., Texas Agric. Expt. Sta. Misc. Publ. MP 613, 1–13 (1962)) und Zierpflanzen (z. B. Stechpalmenkränzen)(Curtis et al., Proc. Am. Soc. Hort. Sci. 560, 104–108 (1952)) zu verzögern oder zu verhindern. Andere Verwendungen umfassen die Verminderung oder Unterbindung bitter schmeckender phenolischer Verbindungen (Isocumarine), die durch Ethylen induziert werden, zum Beispiel in Süßkartoffeln (Kitinoja, „Manipulation of Ethylene Responses in Horticulture", Reid (Hrsg.), Acta. Hort. Bd. 201, 377–42 (1978)), Karotten (Coxon et al., Phyto. Chem. Istry. 12, 1881–1885 (1973)), Pastinak (Shattuck et al., Hort. Sci. 23, 912 (1988)) und Brassica. Andere Verwendungen umfassen die Verhinderung selektiver Schädigung der reproduktiven Gewebe, wie sie in Hafer und Canola auftritt (Reid et al., in: „Ethylene in Plant Development", Roberts, Tucker (Hrsg.), Butterworths, London, S. 277–286 (1985)), von Geschmacksverlust, Festigkeit und/oder Textur, wie sie in gelagerten Produkten, wie z. B. Äpfeln und Melonen, auftritt (Risse et al., Hort. Sci. 17, 946– 948 (1982)), Rostflecken (eine Störung nach der Ernte), die im Eissalat Ethylen-induziert ist (Hyodo et al., Plant Physiol. 62, 31–35 (1978)), die Förderung der Produktion männlicher Blüten (Jaiswal et al., Proc. Indian Acad. Sci. (Plantg Sci. 95, 453–459) (1985)) und die Erhöhung der Pflanzengröße, z. B. durch Verzögern der Blütenbildung in Zier-Bromelien (Mekers et al., Acta Hortic 137, 217–223 (1983)). Darüber hinaus kann eine Abnahme der Ethylen-Reaktion verwendet werden, um Krankheitsentwicklungen zu verzögern, wie z. B. die Verhinderung von Wunden und Alterung in mit Colletotrichum lagenarium infizierten Gurken, und um Krankheiten in Pflanzen zu vermindern, in denen Ethylen eine Erhöhung der Krankheitsentwicklung verursacht, z. B. in Gerste, Zitrone, Douglas-Fichtenkeimlingen, Grapefruit, Pflaume, Rose, Nelke, Erdbeere, Tabak, Tomate, Weizen, Wassermelone und Zierpflanzen. Außerdem kann die Erfindung angewendet werden, um die Wirkung von Ethylen, das sich in der Umwelt findet, und indirekt die Wirkung verschiedener Umweltbelastungen zu vermindern, welche in der Biosynthese von Ethylen in Pflanzengewebe resultieren. Beispielsweise tritt Ethylen aufgrund von Bränden, Fahrzeugabgasen und Industrie in der Luft lokal in biologisch schädlichen Mengen auf. Siehe z. B. Kapitel 8, Ethylen in der Umwelt, in: „Ethylene in Plant Biology", s. o. Außerdem kann die Erfindung angewendet werden, um die Wirkung von Ethylen zu minimieren, das in Reaktion auf Umweltbelastungen, wie z. B. Überflutung, Trockenheit, Sauerstoffmangel, Verwundung (einschließlich Druck und Blessur), Abkühlung, Pathogeninvasion (durch Viren, Bakterien, Pilze, Insekten, Nematoden und dergleichen), chemische Exposition (z. B. Ozon, Salz und Schwermetallionen) und Strahlung, synthetisiert wird.
Die folgenden Beispiele dienen der Illustration und sind nicht als Einschränkung des Schutzumfangs der Erfindung auszulegen.
Beispiel 1
Klonierung des ETR1-Gens
Etr1-1-Pflanzen wurden mit zwei, die rezessiven sichtbaren Marken ap1 bzw. clv2 tragenden Linien gekreuzt. Der F₁-Nachkommenschaft wurde die Selbstbestäubung ermöglicht. Phänotypen wurden in der F₂-Nachkommenschaft bewertet. Die prozentuelle Rekombination (unter Verwendung der Kosambi-Kartierungsfunktion (D. D. Kosambi, Ann. Eugen. 12, 172 (1944))) wurde in Centi-Morgan-Einheiten bestimmt. Der ETR1-Locus befand sich am unteren Abschnitt des Chromosoms 1 zwischen den sichtbaren genetischen Markern ap1 und clv2 (6,5 +/– 1,0 cM vom AP1 und 2,8 +/– 1,1 cM vom CLV2).
Etr1-1 wurde mit der Testerlinie W100 (Ökotypus Landsberg (Koornneef et al., Arabidopsis Inf. Serv. 23, 46 (1987))) gekreuzt, und den F₁-Pflanzen wurde die Selbstbestäubung ermöglicht. Die Bindung von RFLP-Markern an den ETR1-Locus wurde in 56 F₂-Pflanzen wie von Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 6856 (1988), beschrieben analysiert. Von den RFLP-Markern, die sich in dieser Region des Chromosoms 1 befinden, segregierte einer der Macker, 1bAt315, aus 112 Chromosomen heraus vollkommen mit dem mutierten etr1-1-Phänotyp. Der 1bAt315-Klon wurde daher als Sonde verwendet, um einen Chromosomen-Walk in der ETR-1-Gen-Region zu initiieren. Verschiedene genomische DNA-Cosmid-Bibliotheken wurden eingesetzt. Eine der Bibliotheken enthielt Subklone von zwei künstlichen Hefechromosomen (YACs EG4E4 und EG2G11 (Grill et al., Mol. Gen. Genet. 226, 484 (1991))), die an 1 bAt315 hybridisierten. Um die YACs zu subklonieren, wurde Gesamt-DNA aus EG4E4- oder EG2G11-tragenden Hefezellen teilweise mit Sau3Al verdaut und in die BglII-Stelle des Cosmidvektors pCIT30 kloniert (Ma et al., Gene 117, 161 (1992)). Standardmäßige Klonierungs- und Screeningverfahren wurden verwendet (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboraton Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Eine Bibliothek aus der etr1-1-Mutante wurde auf ähnliche Weise in pCIT30 konstruiert. Die Bibliothek der Wildform wurde bereits früher konstruiert (Yanofsky et al., Nature 346, 35 (1990)). Mittels Restriktionsanalyse und sequentieller Hybridisierung an diese Bibliotheken wurden überlappende Cosmide (ein Contig) erhalten, die eine Strecke von ungefähr 230 kb umfassten. Siehe 8.
Das ETR1-Gen wurde an einer Unterregion von ungefähr 47 kb unter Anwendung von Feinstruktur-RFLP-Kartierung lokalisiert. Um die Feinstrukturkarte zu erzeugen, wurden meiotische Rekombinanten auf Basis des Phänotyps aus der F2-Selbstnachkommenschaft der obigen Kreuzungen zwischen der etr1-1-Mutante (Ökotypus Columbia) und zwei ap1 und clv2 tragenden Linien (beide Ökotypus Landsberg) isoliert. Rekombinanten wurden in der F2-Nachkommenschaft als Pflanzen identifiziert, die entweder an beiden Loci von der Wildform oder an beiden Loci mutiert waren. ETR1 wurde an im Dunkeln gezüchteten Keimlingen bewertet (Bleecker et al., Science 241, 1086 (1988)). Vierundsiebzig (74) Rekombinanten zwischen ETR1 und AP1 wurden erhalten und 25 Rekombinanten zwischen ETR1 und CLV2. Die Rekombinationsbruchstellen wurden unter Verwendung von DNA-Fragmenten aus dem Chromosomen-Walk als RFLP-Sonden kartiert. Angesichts der Anzahl von isolierten Rekombinanten betrug der berechnete mittlere Abstand zwischen Bruchstellen ungefähr 20 kb für jede Kreuzung. Über den 230-kb-Contig erwies sich die tatsächliche Dichte von Bruchstellen konsistent mir der berechneten Dichte an der CLV2-Seite (mit 5 Bruchstellen in ungefähr 120 kb). Die nächstliegenden das ETR1-Gen flankierenden Bruchstellen definierten ein DNA-Segment von ungefähr 47 kb.
Die Suche nach von dieser 47 kb-Region hergeleiteten Transkripten wurden cDNA-Bibliotheken unter Verwendung von DNA-Fragmenten gescreent. Einer der cDNA-Klone wurde λC4 genannt und wurde mit dem in 8 gezeigten 4,25-kb-EcoRI-Fragment 1 detektiert. Das λC4 potentiell das ETR1-Gen darstellte, wurde dieser Klon näher charakterisiert.
Beispiel 2
Charakterisierung des ETR-Gens
Die Nucleotidsequenz der λC4-cDNA und die entsprechende genomische DNA ( 2)(Seq.-ID Nr. 1) wurde unter Verwendung von Sequenzee Version 2,0 (United States Biochemical Co., Cleveland, Ohio) und synthetischen Oligonucleotidprimern mit einer Länge von 17 Nucleotiden bestimmt. Die Primersequenzen wurden aus bestehenden ETR1-Sequenzen gewählt, um die Sequenz zu verlängern, bis die gesamte Sequenz bestimmt war. Die Anfangssequenz wurde unter Verwendung von Primern erhalten, die an den Klonierungsvektor anellierten. Die Template waren doppelsträngige Plasmide. Beide Stränge der genomischen DNA wurden sequenziert, einschließlich 225 bp stromauf der vermuteten Transkriptionsstartstelle und 90 bp stromab der Polyadenylierungsstelle. λC4 wurde an einem einzigen Strang sequenziert.
λC4 war 1812 Basenpaare lang, einschließlich eines polyA-Schwanzes von 18 Basen. Aus den DNA-Sequenzen und RNA-Blots (unten beschrieben) wurde ermittelt, dass λC4 ungefähr 1000 Basenpaare am 5'-Ende fehlten.
Um längere cDNAs zu erhalten, wurde Erststrang-cDNA aus Keimlings-polyA⁺-RNA unter Verwendung von sequenzspezifischen, zu λC4 internen Primern synthetisiert (RiboClone cDNA Synthesis System, Promega, Madison, Wisconsin). Die cDNA wurde dann mittels PCR amplifiziert (R. K. Saiki et al., Science 230, 1350 (1985)), und zwar unter Verwendung verschiedener Primerpaare: 3'-PCR-Primer wurden gewählt, um an verschieden Exons zu anellieren, wie sie von den cDNA- und genomischen DNA-Sequenzen abgeleitet wurden, und 5'-PCR-Primer wurden gewählt, um an verschiedene 5'-Abschnitte genomischer DNA-Sequenzen zu anellieren. Sechs verschiedene Primer am 5'-Ende wurden verwendet. Die am weitesten stromauf liegende Primer, der die cDNA amplifizierte, war Primer Q (5'AGTAAGAACGAAGAAGAA-GTG)(Seq.-ID Nr. 26). Ein überlappender Primer, der zwölf Basen stromab verschoben war, amplifizierte ebenfalls die cDNA. Die cDNA konnte bei Verwendung ei nes 5'-Ende-Primers, der sich 98 Basenpaare weiter stromauf befand, nicht amplifiziert werden. Genomische DNA-Template wurden als PCR-Kontrollen verwendet. Von der längsten cDNA wurde angenommen, dass sie sich bis zum 5'-Ende des Primers Q erstreckt. Die amplifizierten cDNAs wurden direkt mit Sequenaee Version 2,0 wie folgt sequenziert: Nach dem Aufkonzentrieren der PCR-Reaktionen mittels Ethanolpräzipitation wurden die amplifizierten Produkte mittels Elektrophorese in 0,8 LMP-Agarosegelen getrennt. Die DNA-Fragmenten wurden herausgeschnitten, und ein Gemisch von 10 μl herausgeschnittenem Gel (geschmolzen bei 70°C), 1 ml 10 mM Primer und 1,2 ml 5% Nonidet P-40 wurde bei 90°C für zwei Minuten erhitzt, um die DNA zu denaturieren. Das Gemisch wurde dann vor der Fortsetzung mit Sequenzierungsreaktionen auf 37°C abgekühlt.
Die längste cDNA, die 2786 Basen (den polyA-Schwanz nicht beinhaltend) lang war, stimmte mit der geschätzten Größe von 2800 Basen aus RNA-Blots überein, und es wurde angenommen, dass sie nahezu volle Länge aufwies. Eine potentielle TATA-Box (5'ATAATAATAA) liegt 33 bp stromauf des 5'-Endes in der genomischen Sequenz. Auf Basis des Vergleichs der cDNA- und genomischen DNA-Sequenzen weist das Gen sechs Introns auf, wovon eines sich im 5'-untranslatierten Leader befindet. Die Exons enthalten ein einziges offenes Leseraster von 738 Aminosäuren. Siehe 3.
Die Feststellung, dass dieses Gen tatsächlich das ETR1 ist, wurde durch Vergleichen der Nucleotidsequenzen des Allels der Wildform mit den vier mutierten Allelen begründet. Für jedes mutierte Allel wurde eine EcoRI-größenselektierte Bibliothek im Vektor Lambda-ZAPII konstruiert (Stratagene, LaJolla, Kalifornien). Klone des 4,25-kb-EcoRI-Fragments wurden durch Hybridisierung mit dem Fragment der Wildform isoliert. Diese Klone wurden mittels In-vivo-Ausschneiden gemäß dem Lieferanten (Stratagene) in Plasmide umgewandelt (pBluescript-Vektor) und sequenziert. Zwei unabhängige Klone wurden an einem einzigen Strang für jedes mutierte Allel sequenziert. Die 5'-Enden (am 4,25-kb-EcoRI-Fragment nicht vorhandene 535 bp) wurden mittels PCR amplifiziert und wie vorher beschrieben direkt sequenziert. Die Co don-Unterschiede waren die Folgenden: Codon 65 TGT bis TAT in etr1-1 (6A, B, C und D), Codon 102 GCG bis ACG in etr1-2 (7A, B, C, und D), Codon 31 GCG bis GTG in etr1-3 (4A, B, C und D), Codon 62 ATC bis TTC in etr1-4 (5A, B, C und D). Alle vier Mutationen liegen als ein Cluster in der aminoterminalen Region der abgeleiteten Proteinsequenz vor.
Die ETR1-Message wurden in standardmäßigen RNA-Elektrophorese-(Formaldehyd-) Gelblots untersucht. Das 2,8-kb-ETR1-Transkript war in allen untersuchten Pflanzenteilen – Blättern, Wurzeln, Stämmen, Blüten und Keimlingen – vorhanden (Daten nicht gezeigt). Außerdem wurden keine Unterschiede zwischen ETR1-Transkripten der Wildform und den mutierten Allelen beobachtet (Daten nicht gezeigt). Eine Veränderung der Menge an ETR1-mRNA in im Dunkeln gezüchteten Keimlingen der Wildform durch Behandlung mit Ethylen war nicht nachweisbar (Daten nicht gezeigt).
Wenn das ETR1-Gen mit genomischen Arabidopsis-DNA-Blots bei normaler Stringenz (d. h. über Nacht in 5 × SSPE (0,9 M NaCl, 50 mM NaH₂PO₄, 40 mM NaOH, 4,5 mM EDTA, pH 7,4 bei 65°C mit dem stringentesten Waschschritt in 0,1 × SSPE bei 65°C für 30 Minuten)) hybridisiert wurde, wurden nur die erwarteten Fragmente des ETR1-Locus beobachtet (Daten nicht gezeigt). Bei verminderter Stringenz (d. h. Hybridisierung in 5 × SSPE bei 50°C und Waschschritten in 5 × SSPE bei 50°C) wurden jedoch zahlreiche Fragmente detektiert, was darauf hinweist, dass eine Familie ähnlicher Gene in Arabidopsis existieren.
Die vorhergesagte aminoterminale Sequenz von ETR1 (Reste 1–316) hat keine Ähnlichkeit mit Sequenzen in der GenBank-Datenbank (Version 77.0). Der carboxyterminale Abschnitt jedoch ist höchst ähnlich mit den konservierten Domänen des Sensors und des Reaktionsregulators des prokaryotischen Zweikomponentensystems der Signaltransduktion. In Bakterien ist die Histidin-Proteinkinase-Domäne des Sensors durch fünf Sequenzmotive gekennzeichnet, die in spezieller Reihenfolge mit lose konservierten Abständen angeordnet sind (Parkinson, Annu. Rev. Genet. 26; 71 (1992)). Die abgeleitete ETR1-Sequenz enthält alle fünf Motive in derselben relativen Reihenfolge und mit denselben Abständen, die sich in bakteriellen Proteinen finden (9A). Die abgeleitete Sequenz ist in höchstem Maße ähnlich zu den Sequenzen von Escherichia coli Bar A (Nagasawa et al., Mol. Microbiol. 6, 3011 (1992)) und Pseudomonas syringae LemA (Harbak et al., J. Bact. 174, 3011 (1992)); über die gesamte Histidin-Kinase-Domäne (die 241 Aminosäuren von Resten 336 bis 566) bestehen 43% und 41% Aminosäureidentitäten mit BarA bzw. LemA und 72% bzw. 71% Ähnlichkeiten. Die Funktion von BarA ist unbekannt, obwohl es auf Basis seiner Fähigkeit, eine Deletion im osmotischen Sensorprotein EnvZ von E. coli zu komplementieren, kloniert worden ist (Nagasawa, s. o.). LemA ist für die Pathogenität von P. syringae an Bohnenpflanzen erforderlich (Hrabak, s. o.). Andere bakterielle Proteine mit zu dieser mutmaßlichen ETR1-Domäne höchst ähnlichen Sequenzen sind: Xanthomonas campestris RpfC (35% Identität), das möglicherweise an der Wirtserkennung für die Pathogenität in Kreuzblütlern beteiligt ist (Tang et al., Mol. Gen. Genet. 226, 409 (1991)), E. coli RcsC (34% Identität), das an der Regulation der Kapselsynthese beteiligt ist (Stout et al., J. Bacteriol. 172, 659 (1990)) und E. coli ArcB (25% Identität), das für die Repression anaerober Enzyme verantwortlich ist (Luchi et al., Mol. Microbiol. 4, 715 (1990)).
Angrenzend an die mutmaßliche Histidin-Kinase-Domäne zeigt die abgeleitete ETR1-Sequenz strukturelle Charakteristika und konservierte Reste bakterieller Reaktionsregulatoren auf. Strukturelle Charakteristika von Reaktionsregulatoren basieren auf der bekannten dreidimensionalen Struktur von CheY (der Reaktionsregulator für Chemotaxie) in Salmonella typhimurium und E. coli, das aus fünf parallelen β-Strängen besteht, die von fünf α-Helices umgeben sind (Stock et al., Nature 337, 745 (1989); Volz et al., J. Biol. Chem. 266, 15511 (1991)). Sequenzen bakterieller Reaktionsregulatoren sind an diese Struktur auf Basis von Resten angeglichen worden, die mit dem hydrophoben Kern des CheY kompatibel sind (Stock et al., Microbiological Rev. 53, 450 (1989)). Die abgeleitete ETR1-Sequenz kann auf ähnliche Weise angeglichen werden (Daten nicht gezeigt). An vier spezifischen Positionen enthalten Reaktionsregulatoren hoch-konservierte Reste – drei Aspartate und ein Lysin (Parkin son et al., Annu. Rev. Genet. 26, 71 (1992); Stock et al., s. o.); die drei Asparate bilden eine saure Tasche, in welche die Seitenkette des konservierten Lysins hineinragt (Stock et al., Nature 337, 745 (1989); Volz et al., J. Biol. Chem. 266, 15511 (1991)), und das dritte Aspartat ist der Empfänger des Phosphats aus Phosphohistidin (Stock et aI. (1989), s. o.). Mit Ausnahme der konservativen Substitution des zweiten Aspartats durch Glutamat finden sich diese konservierten Aminosäuren in denselben Positionen der abgeleiteten ETR1-Sequenz (9B). Die abgeleitete Sequenz in dieser Domäne (ein Abschnitt von 121 Aminosäuren von Resten 609 bis 729 in ETR1) ist den Sequenzen von Bordetella parapertussis BvgS höchst ähnlich (29% Identität, 60% Ähnlichkeit), welche die Virulenz-assoziierten Gene für die Pathogenität im Menschen (Arico et al., Mol. Microbiol. 5, 2481 (1991)), E. coli RcsC (29% Identität, 64% Ähnlichkeit), P. syringae LemA (26% Identität, 57% Ähnlichkeit), X. camprestris RpfC (25% Identität) und E. coli BarA (20% Identität) kontrollieren. Alle der bakteriellen Proteine, die bezüglich ihrer Sequenz ETR1 ähnlich sind, sind ETR1 auch strukturell dahingehend ähnlich, als dass sie die Histidin-Kinase-Domäne sowie die Reaktionsregulatordomäne enthalten. Obgleich sie diese Eigenschaften gemeinsam haben, sind die Sensorfunktionen eindeutig voneinander abweichend.
Eine potentielle Membran-übergreifende Domäne (Reste 295–313) existiert in der abgeleiteten ERT1-Sequenz auf Basis einer Hydropathie-Analyse (Kyte et al., J. Mol. Biol. 157, 105 (1982)), es ist jedoch unklar, ob ETR1 tatsächlich ein Transmembranprotein ist, da keine eindeutige Signalsequenz vorliegt. Es liegen auch keine N-gebundenen Glykosylierungsstellen vor. Während alle bakteriellen Proteine, die der abgeleiteten ETR1-Sequenz ähnlich sind, zwei potentielle Membran-übergreifende Domänen aufweisen, welche die aminoterminale Domäne flankieren, weisen einige wenige bakterielle Sensoren (jene, denen der Reaktionsregulator fehlt) diese nicht auf.
Beispiel 3
Ein mutiertes etr1-Gen verleiht Pflanzen der Wildform Ethylen-Unempfindlichkeit
Dominante Ethylen-Unempfindlichkeit wurde auf Arabidopsis-Pflanzen der Wildform übertragen, wenn das mutierte etr1-Gen unter Anwendung Agrobacterium-vermittelter Transformation stabil eingeführt wurde. Das Gen befand sich auf einem genomischen 7,3-kb-DNA-Fragment (Fragmente 1 und 2 in 8, die ungefähr 2,7 kb stromauf der Transkriptionsinitiationsstelle und ungefähr 1 kg stromab der Polyadenylierungsstelle umfassten). Es wurde in den binären Transformationsvektor pCGN1547 kloniert, der von Calgene Inc., Davis, Kalifornien, erhalten wurde. Der Vektor enthielt ferner einen selektierbaren Marker für Kanamycin-Resistenz in Pflanzen.
Für das etr1-1-Konstrukt wurde der die etr1-1-Mutation enthaltende 4,25-kb-EcoRI-Plasmidklon durch partiellen EcoRI-Verdau linearisiert und mit dem 3,1-kb-EcoRI-Fragment ligiert, das aus dem Cosmid-Klon theta8 (einem Subklon von YAC EG4E4 im Walk) im Agarosegel gereinigt wurde. Das resultierende Plasmid, das die beiden EcoRI-Fragmente in der korrekten Ausrichtung zueinander enthielt, wurde an der Polylinkerstelle Asp718 linearisiert, die Enden wurden mittels Klenow-Enzym aufgefüllt und BamHI-Linker an die stumpfen Enden ligiert. Schließlich wurde das 7,3-kb-Insert aus dem Plasmid an der Polylinkerstelle BamHI entfernt und in die BamHI-Stelle des binären Transformationsvektors pCGN1547 ligiert (K. E. McBride et al., Plant Molecu- lar Biology 14, 269 (1990)). Für das Kontrollkonstrukt wurde das 7,3-kb-Fragment der Wildform vom partiell mit EcoRI verdautem Cosmid theta8 im Agarosegel gereinigt und in die EcoRI-Stelle von pBluescript subkloniert. Das Fragment wurde dann unter Verwendung der BamHI- und KpnI-Stellen des Polylinkers entfernt und in pCGN1547 ligiert, das mit BamHI und KpnI verdaut worden ist. Die mutierten und Wildform-Konstrukte wurden in Agrobacterium-(Holsters et al., Mol. Gen. Genet. 163, 181 (1978)) Stamm ASE (Monsanto)(Rogers et al., Meth. Enzymol. 153, 253 (1988)) transformiert. Arabidopsis Ökotypus Nossen wurde unter Verwendung von in Flüssig- und nicht auf Fest-Medium kultiviertem Wurzelgewebe transformiert (D. Valvekens et al., Natl. Proc. Acad. Sci. USA 85, 5536 (1988)). Triploide Pflanzen mit einer mutierten Kopie des ETR1-Gens wurden als Nachkommen von Kreuzungen zwi schen der ert1-1-Heterozygote (diploid) und einer tetraploiden Wildform in Ökotypus Bensheim erhalten, welche denselben Dreifach-Reaktionsphänotyp wie Ökotypus Columbia aufweist. Triploide Pflanzen der Wildform wurden auf ähnliche Weise durch Kreuzen der diploiden Wildform zur tetraploiden erhalten. Die Ethylen-Unempfindlichkeit wurde in im Dunkeln gezüchteten, entweder mit Ethylen (Bleecker et al., s. o.) oder 0,5 mM ACC behandelten Keimlingen getestet. Für die ACC-Behandlung wurden Pflanzen gekeimt und auf Murashige-und-Skoog-Basalsalzgemisch (MS, Sigma), pH 5,7, 0,5 mM ACC (Sigma), 1% Bacto-Agar (Difco) gezüchtet. Kanamycin-Resistenz wurde durch das Ausmaß der Wurzelverlängerung in einer Woche alten, auf MS pH 5,7 μg/ml Kanamycin, 1% Bacto-Agar gezüchteten Keimlingen gemessen.
Zehn gegen Kanamycin resistente Pflanzen wurden produziert. Acht der zehn zeigten Ethylen-unempfindliche Selbst-Nachkommenschaft, wie mittels der Reaktion von im Dunkeln gezüchteten Keimlingen auf Ethylen beurteilt wurde. In jeder Linie segregierte die Ethylen-Unempfindlichkeit mit der Kanamycin-Resistenz. Als Kontrolle wurden Transformationen unter Verwendung des entsprechenden genomischen 7,3-kb-DNA-Fragments der Wildform durchgeführt, aus denen sechs gegen Kanamycin resistente Pflanzen erhalten wurden. Diese Linien führten ausschließlich zu Ethylenempfindlicher Selbst-Nachkommenschaft, die sich von der Wildform nicht zu unterscheiden schien.
Die etr1-1-Transformanten zeigten verschiedene Grade an Ethylen-Unempfindlichkeit. Folglich ist das Gen der Wildform fähig, den mutierten Phänotyp abzuschwächen, und die etr1-1-Mutation ist in den transformierten Pflanzen nicht vollkommen dominant. Von den zehn Kanamycin-resistenten Linien lieferten sechs vollkommen dominante Ethylen-Unempfindlichkeit, was auf die Gegenwart von Mehrfachkopien des mutierten Gens hinweist. Zwei andere Linien zeigten partielle Dominanz, und zwei Linien schienen von der Wildform zu sein. Verminderte Ethylen-Unempfindlichkeit ist wahrscheinlich auf niedrige Expressionsstärken zurückzuführen, die durch Positionseffekte (z. B. DNA-Methylierung) oder möglicherweise durch Trunkierung der transferierten DNA verursacht werden können.
Beispiel 4
Vektorkonstrukte, die einen heterologen Promotor enthalten
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines Pflanzentransformationsvektors, der einen heterologen Promotor enthält, um die Expression von Wildtyp- und mutierten ETR1-Nucleinsäuren zu steuern.
Der 35S-Proteinpromotor des Blumenkohl-Mosaikvirus (Guilley et al., Cell 30, 763– 773 (1982); Odell et al., Nature 313, 810–812 (1985) und Sanders et al., Nucl. Acids Res. 15, 1543–1558 (1987)) und das 3'-Ende des Nopalin-Synthase-(NOS-) Gens wurden in den pCGN1547-Vektor kloniert, um pCGN18 zu erzeugen. Der 35S-Prornotor an einem HindlII-BamHI-Fragment von ungefähr 1,6 kb wurde in die einzigartige HindlII-BamHI-Stelle von pCGN1547 kloniert. Das 1-kb-BamHI-KpnI-NOS-Fragment wurde in die einzigartige BamHI-KpnI-Stelle von pCGN1547 kloniert.
Das 4,25-kb-EcoRI-Fragment der Wildform sowie des mutierten ETR1-1-Allels wurden unabhängig voneinander in die einzigartige BamHI-Stelle des obigen pCGN18-Vektors unter Verwendung von BamHI-Linkern kloniert. Dieses genomische 4,25-kb-EcoRI-Fragment enthält die gesamte kodierende Sequenz, einschließlich fünf Introns und ungefähr 1 kb genomischer DNA stromab der Polyadenylierungsstelle. Es enthält nicht den ETR1-Promotor, der sich am 3.1-EcoRI-Fragment 2 in 5 befindet.
Diese Vektoren wurden verwendet, um Wurzel-Explantate wie in Beispiel 3 beschrieben zu transformieren. Kanamycin-resistente, das mutierte ERT1-1-Gen enthaltende Pflanzen wurden erhalten, und es wurde ein Ethylen-Unempfindlichkeits-Phänotyp ähnlich jenem nachgewiesen, der in Beispiel 3 gefunden wurde. Mit dem ETR1-Gen der Wildform transformierte Kontrollpflanzen produzierten ausschließlich Ethylenempfindliche Selbst-Nachkommenschaft.
Beispiel 5
Vektorkonstrukt unter Einsatz von Antisense-ETR1
Ethylen-Unempfindlichkeit wurde Arabidopsis der Wildform durch Expression einer ETR1-Antisense-Nucleinsäure verliehen, die unter Anwendung des standardmäßigen Agrobacterium-Wurzeltransformationsverfahrens eingeführt wurde. Valvekens et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5536 (1988). Die Antisense-Nucleinsäure bestand aus einem 1,9-kb-ETR1-cDNA-Fragment. Die Expression dieses Fragments, das sich von der MscI-Restriktionsstelle am Nucleotid 220 zur ersten SmaI-Stelle am Nucleotid 2176 in den 3A, 3B, 3C und 3D erstreckte, wurde in reverser Ausrichtung durch den 35S-Promtor CaMV angetrieben. Um die Antisense-Nucleinsäure zu konstruieren, wurden BamHI-Linker an die Enden des 1,9-kb-MscI-SmaI-DNA-Fragments ligiert und das so gebildete Fragment in die BamHI-Stelle des Transformationsvektors pCGN 18 ligiert. Jack et al., Cell 76, 703 (1994). Das Konstrukt wurde in Agrobacterium-Stamm ASE wie oben beschrieben und dann in Arabidopsis transformiert.
Von diesem Transformationsexperiment hergeleitete Keimlinge wurden auf Empfindlichkeit gegen Ethylen wie früher beschrieben getestet. Das Antisense-Konstrukt enthaltende Keimlinge waren gegen Ethylen unempfindlich.
Beispiel 6
Identifizierung von QITR, einer zweiten ETR-Nucleinsäure in Arabidopsis
Genomische DNA aus Arabidopsis thaliana wurde partiell mit Sau3A verdaut und in ein von Promega, Madison, Wisconsin, erhaltenes λGEM11 (Halbstellen-Arme) klo niert. Der genomische Verdau wurde vor der Klonierung mit λGEM11 an den Enden partiell aufgefüllt und wie vom Hersteller empfohlen auf Medium ausplattiert.
Die so klonierte Bibliothek wurde mit einem ³²P-markierten cDNA-XbaI-Fragment gescreent, das sich über die Nucleotide 993–2308 erstreckte, wie in den 3B, 3C und 3D dargelegt ist. Die Hybridisierungsbedingungen waren 50°C und 5 × SSPE. Waschschritte wurden bei 50°C in 0,2 × SSPE durchgeführt. Mehrere positiv hybridisierende Klone wurden identifiziert, neu ausplattiert und neu gescreent. Positiv hybridisierende Klone wurden mit SacI verdaut (das innerhalb der Arme des Klonierungsphagen und innerhalb des Inserts spaltet). Die daraus erhaltenen mehreren Fragmente wurden in bakterielle Plasmide zur Sequenzierung subkloniert. Die genomische DNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 45) ist gemeinsam mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 46 und 48) in 12 dargelegt. Diese ETR-Nucleinsäureund -Aminosäuresequenz wird als QITR-Nucleinsäure- bzw. -Aminosäuresequenz bezeichnet. Die QITR-cDNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 47) und die QITR-Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 46 und 48) sind in 13 gezeigt.
Im Vergleich mit der Arabidopsis-ETR1-Nucleinsäure- und -Aminosäuresequenz (siehe 2 und 3) scheint das QITR-Protein einen aminoterminalen Abschnitt, der einen relativ hohen Grad an Homologie mit dem aminoterminalen Abschnitt des ETR1-Proteins aufweist, und einen Histidin-Kinase-Abschnitt mit einem mäßigen Grad an Homologie mit derselben Sequenz in ETR1 zu enthalten. Die in ETR1 gefundene Reaktionsregulationsregion ist im QITR-Protein nicht vorhanden. Die Gesamt-Nucleinsäurehomologie beträgt ungefähr 69%. Bezüglich des aminoterminalen Abschnitts (d. h. zwischen Resten1 bis 316) beträgt die Homologie ungefähr 71% Identität bezüglich der Aminosäuresequenz und 72% bezüglich der Nucleinsäuresequenz.
Beispiel 7
Modifizierung der QITR-Nucleinsäure zur Verleihung von Ethylen-Unempfindlichkeit
Es wurde eine Aminosäuresubstitution in einem genomischen 5-kb-QITR-Klon durchgeführt, der analog zu dem für die ETR1-4-Mutation war, nämlich die Substitution des Isoleucins an Position 62 durch Phenylalanin. Vergleiche 3A mit 5A am Rest 62. Wie an 12 und 13 näher angegeben, ist der Rest 62 im QITR-Protein wie im ETR1-Protein ebenfalls Isoleucin.
Die Aminosäuresubstitution wurde an der QITR-Nucleinsäure unter Verwendung Oligonucleotid-gerichteter In-vitro-Mutagense durchgeführt. Kunkel et al., Methods in Enzymology 154, 367–382 (1987). Ein Muta-gene-Set von Bio-Rad Laboratories, Hercules, Kalifornien, wurde in Verbindung mit dieser speziellen Mutation verwendet. Die Sequenz des verwendeten Oligonucleotids war 5'GGA GCC TTT TTC ATT CTC. Der Ersatz von Nucleotid A durch T im Codon ATC änderte die Aminosäure Ile am Rest 62 auf Phe in der abgeleiteten Proteinsequenz.
Die ungefähr 5 kb von der ersten HindlII-Stelle zur zweiten KpnI-Stelle umfassende QITR-Nucleinsäure enthielt ungefähr 2,4 kb von Nucleotiden stromauf des Startcodons. Dieses 5-kb-Fragment wurde in den Transformationsvektor pCGN1547 ligiert (s. o.). Dieses Konstrukt wurde dann in Agrobacterium-Stamm ASE wie oben beschrieben und dann in Arabidopsis transformiert.
Von diesem Transformationsexperiment hergeleitete Keimlinge wurden auf Empfindlichkeit gegen Ethylen wie früher beschrieben gestestet. Die QITR-Nucleinsäure enthaltende Keimlinge, welche die Modifizierung am Rest 62 enthielten, waren gegen Ethylen unempfindlich.
Beispiel 8
Identifizierung der Arabidopsis-ETR-Nucleinsäure Q8
Die ETR-Nucleinsäure Q8 (Seq.-ID Nr. 41 und 43) wurde durch direkten Sequenzvergleich mit der ETR1-Nucleinsäure aus Arabidopsis identifiziert. Die Arabidopsis- Nucleinsäure Q8 wurde in Verbindung mit einem Chromosomen-Walk am Chromosom 3 von Arabidopsis thaliana identifiziert.
Zusammenfassend wurden überlappende YAC-Klone erzeugt, die anschließend in Plasmide subkloniert wurden. Die genomischen Inserts in solchen Plasmiden wurden durch Verdau mit Restriktionsendonuclease freigesetzt und an eine cDNA-Bibliothek aus Arabidopsis-Blütengewebe hybridisiert.
Positiv hybridisierende Inserts wurden sequenziert, um die genomische Gesamt-Sequenz (Seq.-ID Nr. 41) gemeinsam mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 42 und 44), wie in 14 dargelegt, herzustellen. Die cDNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 43) und abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 42 und 44) ist in 15 dargelegt.
Die Gesamt-Nucleinsäure-Homologie zwischen der Q8-Nucleinsäure und der ETR1-Nucleinsäure beträgt ungefähr 69%. Bezüglich des aminoterminalen Abschnitts, der sich von Rest 1 bis 316 erstreckt, beträgt die Gesamt-Aminosäuresequenz-Homologie ungefähr 72%, wogegen die für diese Sequenz kodierende Nucleinsäure eine Sequenzhomologie von ungefähr 71% wie zwischen Q8- und ETR1-Nucleinsäure aufweist.
Beispiel 9
Isolierung der TETR-cDNA
Eine ³²P-markierte Hybridisierungssonde wurde durch Zufallsprimer-Markierung eines durch PCR-Amplifikation des Arabidopsis-ETR1-Gens erzeugten 1,3-kb-PCR-Fragments mit den PCR-Primern „5'BamHI" (CCCGGATCCATAGTGTAAAAAATT-CATAATGG) und „3'BamHIB" (CCGGATCCGTTGAAGACTTCCATCTTCTAACC) hergestellt.
Diese Sonde wurde verwendet, um eine cDNA-Bibliothek der in die EcoRI-Stelle des Lambda-ZAP-II-Vektors von Stratagene, LaJolla, CA, klonierten mRNA der roten Tomatenfrucht zu screenen. Zwanzig (20) positive primäre Plaques wurden identifiziert, die an diese Sonde hybridisierten (Waschbedingungen 2X SSC bei 65°C), und es wurden sekundäre Screenings an diesen durchgeführt, um reine Plaques zu erhalten. Ausschneiden in vivo wurde dann mit dem resultierenden rekombinanten Phagen durchgeführt, und es wurden 19 unabhängige Plasmidklone erhalten.
Komplementäre DNAs aus Plasmidklonen, welche die größten an die ETR1-Sonde hybridisierenden Fragmente enthielten, wurden sequenziert, und die Nucleotidsequenz und vorhergesagte Aminosäuresequenzen der längsten Tomaten-cDNA (TETR14, auch als TXTR bezeichnet) wurden mit den ETR1- und QITR-Sequenzen verglichen. Die Nucleotidsequenz von TETR14 sagte vorher, dass das kodierte Protein dem QITR-Peptid ähnlicher war als dem ETR1-Peptid. Diese Schlussfolgerung basierte auf der Tatsache, dass die Reaktionsregulationsdomäne (die in ETR1 zugegen ist) in TETR14 sowie QITR fehlt. Die Sequenz (oder Teilsequenz) mehrerer der anderen cDNA-Klone wurde ermittelt, und es zeigte sich, dass sie demselben Gen entsprechen.
Beispiel 10
Analyse der TETR14-Genexpression
Northern-Analyse wurde mit mRNA aus sich entwickelnden Früchten normaler oder mutierten Tomaten-(Ripening-inhibitor-(rin-), Non-ripening-(nor-) oder Never-ripe(nr-)) Früchte durchgeführt. Die verwendeten Stadien sich entwickelnder Früchte waren reif, grün, aufbrechend, aufbrechend plus 7 Tage und reife grüne, mit Ethylen behandelte Früchte. Messenger-RNA, die an die TETR14-Gensonde hybridisierte, war im reifen grünen Stadium nicht vorhanden, war jedoch in aufbrechender, aufbrechender plus 7 Tage und Ethylen-behandelter reifer grüner Frucht vorhanden. Folglich wurde der Schluss gezogen, dass die Akkumulierung der ETR14-mRNA durch Ethylen reguliert war. Die Akkumulierung der TETR14-mRNA wurde in allen drei reifenden Mutanten abgeschwächt, was die Erkenntnis, dass die mRNA-Akkumulierung durch Ethylen reguliert wird, weiter unterstützt.
Beispiel 11
Analyse des TETR14-Gens aus Pearson- und Never-ripe-DNA
PCR-Primer wurden erhalten, die üblicherweise die N-terminale Region des TETR14-Gens spezifisch amplifizieren. Der amplifizierte Abschnitt befand sich zwischen Met1 und Ile214 in den 16A und 16B. Die Primer waren (CCGGATCCA-TGGAATCCTGTGATTGCATTG) und TETR4A (GATAATAGGAAGATTAATTGGC). PCR-Bedingungen (Perkin-Elmer Cetus): 1 μg genomische Tomaten-DNA, 40 Picomol jedes Primers, 1 min 94°C, 2 min 45°C, 2 min 72°C, 35 Zyklen. Mit diesen Primern erhaltene PCR-Produkte, die aus zwei unabhängigen Amplifikationsreaktionen von Pearson- und Nr-DNA resultieren, wurden im Agarosegel gereinigt und entweder in den T/A-Vektor (Invitrogen) subkloniert oder mit BamHI und XhoI verdaut und in Bluescript KS- subkloniert, das mit BamHI und SalI linearisiert worden ist. Einzelsträngige Templat-DNA wurde aus den resultierenden Plasmiden hergestellt und sequenziert. Die Sequenz der PCR-Produkte aus der Pearson-DNA war mit der Sequenz des TETR14-Klons identisch. Die Sequenzanalyse offenbarte, dass die aus der PCR der Nr-DNA (TETR14-Nr) resultierenden PCR-Fragmente mit jenen, die aus der Pearson-DNA erhalten wurden, nicht identisch waren. Das Cytosin-Nucleotid an Position 395 des TETR14-Gens ist ein Thymin im aus der Nr-DNA amplifizierten Gen. Diese Nucleotidsubstitution in TETR14-Nr tauscht das Prolin an der Aminosäureposition 36 des vorhergesagten Peptids gegen ein Leucin aus. Siehe 22 und Seq.-ID Nr. 49 und 50 für die Gesamt-Nucleinsäure- bzw. Aminosäuresequenz. Dieses Pro-36 des TETR14 entspricht dem Pro-36 des ETR1-Peptids und dem Pro-36 des QITR-Peptids. Diese Ergebnisse zeigen an, dass eine Mutation im Tomaten-TETR14-Gen dominante Ethylen-Unempfindlichkeit verleiht. Und folglich ist es möglich vorherzusagen, dass andere Änderungen im TETR14-Gen und anderen Toma ten-ETR1-Homologen eine Ethylen-Unempfindlichkeit in der Tomate bewirken werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte Nucleinsäure, die für ein ETR-Protein kodiert, bei dem es sich um ein Protein (i) handelt, das eine Aminosäuresequenz wie in Seq.-ID-Nr. 3 dargelegt aufweist, oder um ein Protein (ii) handelt, das zumindest 50% Sequenzhomologie mit der Aminosäuresequenz von Seq.-ID-Nr. 3 aufweist und das einen Amino-terminalen Abschnitt aufweist, der zumindest 55% Sequenzhomologie mit der Amino-terminalen Sequenz von Seq.-ID-Nr. 3, Reste 1 bis 316, aufweist.
Isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 1, die für ein ETR-Protein kodiert, wobei das ETR-Protein eine Aminosäuresequenz aufweist, bei der es sich um die Aminosäuresequenz von Seq.-ID-Nr. 3 handelt, wobei zumindest eine Aminosäure der Amino-terminalen Region von Seq.-ID-Nr. 3 substituiert, insertiert oder deletiert ist.
Isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 2, die für ein ETR-Protein kodiert, das eine Aminosäuresequenz von Seq.-ID-Nr. 3 aufweist, wobei zumindest eine Aminosäure an Position 31 (Ala), 36 (Pro), 62 (Ile), 65 (Cys) oder 102 (Ala) substituiert, insertiert oder deletiert ist.
Rekombinante Nucleinsäure, umfassend einen Promotor, der mit Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die für das Protein (ii) kodiert, operabel verbunden ist.
Rekombinante Nucleinsäure nach Anspruch 4, worin der Promotor heterolog zu Nucleinsäure ist, die für das Protein (ii) kodiert, und fähig ist, die Expression der Nucleinsäure in einer Pflanzenzelle zu bewirken.
Rekombinante Nucleinsäure nach Anspruch 4 oder 5, worin der Promotor gewebespezifisch, fruchtspezifisch oder zeitspezifisch ist.
Rekombinante Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 4 bis 6, worin der Promotor induzierbar ist.
Pflanzenzelle, die mit rekombinanter Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 4 bis 7 transformiert ist.
Pflanze, die Pflanzenzellen nach Anspruch 8 umfasst.
Pflanze nach Anspruch 9, worin die Pflanze einen Phänotyp aufweist, der durch eine Verringerung der Reaktion der Pflanze auf Ethylen im Vergleich zu einer Pflanze der Wildform gekennzeichnet ist.
Pflanze nach Anspruch 9 oder 10, worin die Pflanze fruchttragend ist und der Promotor fruchtspezifisch ist.
Pflanze nach Anspruch 11, worin die Pflanze einen Phänotyp aufweist, der durch eine Verringerung der Fruchtreifungsgeschwindigkeit gekennzeichnet ist.
Frucht einer Pflanze nach Anspruch 11 oder Anspruch 12.
Frucht nach Anspruch 13, worin die Frucht eine Tomate ist.
Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit einem Phänotyp, der durch eine Verringerung der Reaktion der Pflanze auf Ethylen im Vergleich zu einer Pflanze der Wildform gekennzeichnet ist, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: a) Transformieren zumindest einer Pflanzenzelle mit rekombinanter Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 4 bis 7, b) Regenerieren von Pflanzen aus einer oder mehreren transformierten Pflanzenzelle(n) und c) Selektieren zumindest einer Pflanze mit dem Phänotyp.
Verfahren nach Anspruch 15, worin die Pflanze eine Tomatenpflanze ist.