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Diese
Erfindung wurde mit vom Energieministerium vergebener Regierungsunterstützung, Vertrag
Nr. DE-FG02-94ER20138, gemacht. Die Regierung macht bestimmte Rechte
an der Erfindung geltend.
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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Gegenstand
der Erfindung ist das Gebiet der Molekularbiologie und der Regulation
der Proteinsynthese durch die Einführung von Fremdgenen in Pflanzengenome.
Das Verfahren betrifft spezifischer die Modifikation der Zusammensetzung
von Pflanzenlignin in einer Pflanzenzelle durch die Einführung eines
Fremdpflanzengens, das ein aktives Ferulat-5-Hydroxylase-Enzym (F5H-Enzym)
kodiert. Pflanzentransformanten, die das F5H-Gen beherbergen, lassen
erhöhte
Konzentrationen von Syringyl-Monomerresten in ihrem Lignin erkennen,
eine Eigenschaft, von der angenommen wird, dass sie das Polymer
anfälliger
für eine
Delignifizierung macht.
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HINTERGRUND
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Lignin
ist eines der wichtigsten Produkte des allgemeinen Phenylpropanoid-Pfades
und ist eines in der Biosphäre
am reichlichsten vorkommenden organischen Moleküle (Crawford, (1981) Lignin
Biodegradation and Transformation, New York: John Wiley and Sons).
In der Natur stellt die Lignifizierung Rigidität für Holz bereit und ist größtenteils
für die
strukturelle Integrität
von trachealen Elementen der Pflanze verantwortlich. Lignin eignet
sich aufgrund seiner physikalischen Merkmale und seiner Beständigkeit
gegenüber
biochemischem Abbau gut für
diese Kapazitäten.
Bedauerlicherweise weist diese gleiche Abbaubeständigkeit eine signifikante
Auswirkung auf die Verwertung des Pflanzenmaterials aus Lignocellulose
auf (Whetten et al., Forest Ecol. Management 43, 301, (1991)).
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Die
monomere Zusammensetzung von Lignin besitzt signifikante Effekte
auf seinen chemischen Abbau während
des industriellen Aufschlusses (Chiang et al., Tappi, 71, 173, (1988).
Die Guaiacyl-Lignine (die sich von der Ferulasäure herleiten), die für Weichholz,
wie zum Beispiel Kieferholz charakteristisch sind, erfordern im
Wesentlichen mehr Alkali und längere
Inkubationen während
des Aufschlusses im Vergleich zu den Guaiacyl-Syringyl-Ligninen
(die sich von Ferulasäure
und Sinapinsäure
herleiten), wie sie in Harthölzern,
wie zum Beispiel Eiche, gefunden werden. Die Gründe für die Unterschiede zwischen
diesen beiden Lignintypen wurden mittels Messung des Abbaus von
Modellverbindungen, wie zum Beispiel Guaiacylglycerol-β-guaiacylether,
Syringylglycerol-β-guaiacylether
und Syringylglycerol-β-(4-methylsyringyl)ether
(Kondo et al., Holzforschung, 41, 83, (1987)) unter Bedingungen,
welche die nachahmen, die beim Aufschlussverfahren verwendet werden,
untersucht. In diesen Experimenten wurden die Mono- und insbesondere
Disyringyl-Verbindungen drei- bis fünfzehnmal schneller gespalten
als ihre entsprechenden Diguaiacyl-Homologa. Diese Modellstudien stehen
im Einklang mit Studien, welche den Aufschluss von Douglasien und
Holz vom Amerikanischen Amberbaum vergleichen, in denen die wichtigsten
Unterschiede in der Auffschlussrate bei über 150°C auftraten, wenn Arylglycerol-β-arylether-Verknüpfungen
gespalten wurden (Chiang et al., Holzforschung, 44, 309, (1990)).
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Bei
einem anderen Faktor, der sich auf den chemischen Abbau der beiden
Ligninformen auswirkt, kann es sich um die Kondensation von sich
von Lignin herleitenden Guaiacyl- und Syringylresten zur Bildung von
Diphenylmethan-Einheiten handeln. Die Anwesenheit von Syringylresten
in Hartholz-Ligninen
führt zur
Bildung von Syringyl enthaltenden Diphenylmethan-Derivaten, die
während
des Aufschlusses löslich
bleiben, während
die während
des Weichholzaufschlusses produzierten Diphenylmethan-Einheiten
in Alkali unlöslich sind
und folglich mit den Celluloseprodukten assoziiert bleiben (Chiang
et al., Holzforschung, 44, 147, (1990); Chiang et al., Holzforschung,
44, 309, (1990)). Es besteht weiter die Annahme, dass die Reichhaltigkeit
der 5-5'-Diaryl-Verknüpfungen,
die zwischen Guaiacylresten auftreten können, zur chemischen Abbaubeständigkeit
beiträgt.
Diese Verknüpfung
ist beständig
gegen Alkalispaltung und wird aufgrund der Anwesenheit der 5-O-Methylgruppe
in Syringylresten viel weniger häufiger
in Lignin angetroffen, das reich an Syringylresten ist. Die Inkorporation
von Syringylresten führt
zu, was als „nicht
kondensiertes Lignin" bekannt
ist, ein Material, das signifikant leichter als kondensiertes Lignin
aufzuschließen
ist.
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Auf ähnliche
Weise stellen die Ligninzusammensetzung und der Gehalt von Lignin
in Gräsern
einen bedeutenden Faktor bei der Bestimmung der Verdaulichkeit von
dem Vieh verfütterten
Lignocellulosematerialien dar (Jung, H. G. und Deetz, D. A. (1993)
Cell wall lignification and degradability in Forage Cell Wall Structure
und Digestibility (H. G. Jung, D. R. Buxton, R. D. Hatfield und
J. Ralph, Hrsg.), ASA/CSSA/SSSA Press, Madison, WI). Die Inkorporation
des Lignin-Polymers in die Pflanzenzellwand verhindert den Zugang
mikrobieller Enzyme zu Zellwandpolysacchariden, aus denen die Wand
aufgebaut ist. Aufgrund dessen können
diese Polysaccharide nicht abgebaut werden und ein großer Teil
der in Tierfuttermitteln enthaltenen wertvollen Kohlenhydrate passieren
unverdaut durch die Tiere. Folglich wird einer Zunahme der Trockensubstanz
von Gräsern über die
Wachstumssaison durch eine Verminderung der Verdaulichkeit entgegengewirkt,
die hauptsächlich
durch eine erhöhte
Zellwandlignifizierung verursacht wird. Aus diesen Beispielen geht
deutlich hervor, dass die Modifikation der Lignin-Monomer-Zusammensetzung ökonomisch
vorteilhaft wäre.
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Das
Problem, dem begegnet werden muss, besteht deshalb darin, ein Verfahren
zur Entwicklung von Pflanzen mit erhöhten Konzentrationen an Syringylresten
in ihrem Lignin zu entwickeln, um seinen chemischen Abbau zu erleichtern.
Die Modifikation des für
die Herstellung von Lignin-Monomeren verantwortlichen Enzymwegs
stellt eine mögliche
Route zur Lösung
dieses Problems dar.
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Der
Mechanismus/die Mechanismen, über
welchen/welche Pflanzen die Lignin-Monomer-Zusammensetzung kontrollieren, gab Anlass
zu viel Spekulation. Wie bereits früher erwähnt, synthetisieren Gymnospermien
keine nennenswerten Syringylligninmengen. In Angiospermien ist die
Syringylligninablagerung von der Entwicklung her geregelt: primäres Xylem
enthält
Guaiacyllignin, während
das Lignin des sekundären
Xylems und Sklerenchyms Guaiacyl-Syringyl-Lignin darstellt (Venverloo,
Holzforschung 25, 18 (1971); Chapple et al., Plant Cell 4, 1413,
(1992)). Es wurden keine Pflanzen gefunden, die lediglich Syringlyllignin
enthalten. Es ist noch nicht klar, wie diese Spezifität kontrolliert
wird; es sind jedoch mindestens fünf mögliche enzymatische Kontrollstellen
vorhanden, nämlich
Kaffeesäure/5-Hydroxyferulasäure-O-methyltransferase
(OMT), F5H, (Hydroxy)cinnamoyl-CoA-Ligase (4CL), (Hydroxy)cinnamoyl-CoA-Reduktase
(CCR) und (Hydroxy)cinnamoylalkohol-Dehydrogenase (CAD). So werden
zum Beispiel die Substratspezifitäten von OMT (Shimada et al.,
Phytochemistry, 22, 2657, (1972); Shimada et al., Phytochemistry,
12, 2873, (1973); Gowri et al., Plant Physiol., 97, 7, (1991); Bugos
et al., Plant Mol. Biol. 17, 1203, (1992)) und CAD (Sarni et al.,
Eur. J. Biochem., 139, 259. (1984); Goffner et al., Planta., 188,
48, (1992); O'Malley
et al., Plant Physiol., 98, 1364, (1992)) mit den Unterschieden
der Lignin-Monomer-Zusammensetzung, die in Gymnospermien und Angiospermien
gesehen werden, korreliert, und es wurde vorgeschlagen, dass die Expression
von 4CL-Isozymen (Grand et al., Physiol. Veg. 17, 433, (1979); Grand
et al., Plattta., 158, 225, (1983) mit der in Angiospermien gesehenen
Gewebespezifität
der Lignin-Monomer-Zusammensetzung verwandt ist.
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Obwohl
es mindestens fünf
mögliche
Enzym-Targets gibt, die genutzt werden könnten, wurden kürzlich nur
OMT und CAD in Versuchen untersucht, die Lignin-Monomer-Zusammensetzungen
in transgenen Pflanzen zu manipulieren (Dwivedi et al., Plattt Mol.
Biol. 26, 61, (1994); Halpin et al., Plant J. 6, 339, (1994); Ni
et al., Trattsgett. Res. 3, 120 (1994); Atanassova et al., Plant
J. 8, 465, (1995); Doorsselaere et al., Plattt J. 8, 855, (1995)).
Die meisten dieser Studien haben sich auf die Sense- und Antisense-Suppression
der OMT-Expression konzentriert. Dieser Ansatz hat zu verschiedenen
Ergebnissen geführt,
wahrscheinlich aufgrund des in den verschiedenen Studien erreichten
OMT-Suppressionsgrades. Die dramatischsten Wirkungen wurden unter
Verwendung homologer OMT-Konstrukte zur Suppression der OMT-Expression
in Tabak (Atanassova et al., supra) und Pappeln (Doorsselaere et
al., supra) gesehen. Anhand dieser beiden Studien wurde gefunden,
dass aufgrund der transgenen Expression eine Verminderung des Gehalts
an Syringyllignin und ein konkomittierendes Auftreten von 5-Hydroxyguaiacylresten
vorhanden war. Aufgrund dieser Studien offenbaren Doorsselaere et
al., (WO 9305160) ein Verfahren zur Regulation der Lignin-Biosynthese
durch die genomische Inkorporation eines OMT-Gens in entweder der
Sense- oder Antisense-Richtung. Im Gegensatz dazu weisen Dixon et
al. (WO 9423044) eher die Reduktion des Lignin-Gehalts in Pflanzen,
die mit einem OMT-Gen transformiert wurden, als eine Änderung
der Lignin-Monomer-Zusammensetzung nach. Ähnliche Forschungsarbeiten
haben sich auf die Suppression der CAD-Expression gerichtet. Die
Umwandlung von Coniferaldehyd und Sinapinaldehyd in ihre entsprechenden
Alkohole in transgenen Tabakpflanzen wurde mit der Inkorporation
eines CAD-Gens von A. cordata in Antisense-Richtung modifiziert
(Hibino et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 59, 929, (1995)). Ähnliche
Bemühungen
richteten sich an die Antisense-Inhibition der CAD-Expression, die
ein Lignin mit erhöhtem
Aldehydgehalt, aber nur eine mäßige Änderung
der Lignin-Monomer-Zusammensetzung herbeiführte (Halpin
et al., supra). Diese Forschung hat zur Offenbarung von Verfahren
zur Reduktion der CAD-Aktivität
unter Verwendung von Sense- und Antisense-Expression eines klonierten
CAD-Gens zur Bewirkung der Inhibition der endogenen CAD-Expression
in Tabak [Boudet et al., (
US
5,451,514 ) und Walter et al., (WO 9324638); Bridges et
al., (
CA 2005597 )] geführt. Keine
dieser Strategien erhöhte
den Syringylgehalt von Lignin, eine Eigenschaft, die mit der verbesserten
Verdaulichkeit und chemischen Abbaubarkeit von Lignocellulosematerial
korreliert ist (Chiang et al., supra, Chiang und Funaoka, Holzforschung
44, 309 (1990); Jung et al., supra).
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Obwohl
F5H auch ein Schlüsselenzym
bei der Biosynthese von Syringyl-Lignin-Monomeren darstellt, wurde
es bisher nicht in Bemühungen
zum technischen Manipulieren der Lignin-Qualität genutzt. Seit der Zeit seiner
Entdeckung vor über
30 Jahren (Higuchi et al.; Can. J. Biochem. Physiol., 41, 613, (1963))
wurde tatsächlich
nur ein Nachweis der F5H-Aktivität
veröffentlicht
(Grand, C., FEBS Lett. 169, 7, (1984)). Grand wies nach, dass F5H
von der Pappel, wie anhand der klassischen Kriterien der Abhängigkeit
von NADPH und der Licht-reversiblen Inhibition durch Kohlenmonoxid
analysiert, eine Cytochrom-P450-abhängige Monooxygenase
(P450) war. Grand wies weiter nach, dass F5H mit dem endoplasmatischen
Retikulum der Zelle in Zusammenhang steht. Die mangelnde Aufmerksamkeit,
die F5H in den letzten Jahren geschenkt wurde, kann im Allgemeinen
den Schwierigkeiten zugeschrieben werden, die mit der Handhabung
der Membran-gebundenen Enzyme und spezifisch der Labilität von F5H
in Verbindung stehen, wenn es mit den für die Solubilisierung notwendigen
Detergenzien behandelt wird (Grand, supra). Die das F5H-Gen umgebende
neueste Entdeckung wurde von Chapple et al. (supra) gemacht, der über eine
Mutante von Arabidopsis thaliana L. Heynh, als fah1 bezeichnet,
berichtete, die bei der Akkumulation von sich von Sinapinsäure herleitenden
Metaboliten, einschließlich
dem für
Angiospermien typischen Guaiacyl-Synringyl-Lignin, defizient ist.
Dieser als FAH1 bezeichnete Locus kodiert F5H. Das Klonieren des
F5H kodierenden Gens würde
die Gelegenheit zum Testen der Hypothese bereitstellen, dass F5H
ein nützliches
Target für
die Manipulation der Lignin-Monomer-Zusammensetzung darstellt.
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Trotz
der spärlichen
Informationen über
F5H in der veröffentlichten
Literatur war der Anmelder bei der Isolation, beim Klonieren und
bei der Sequenzierung des F5H-Gens erfolgreich. Der Anmelder hat
auch nachgewiesen, dass die stabile Integration des F5H-Gens in
das Pflanzengenom, wo sich die Expression des F5H-Gens unter der
Kontrolle eines Promotors mit Ausnahme des endogenen Promotors des
Gens befindet, zu einer veränderten
Regulation der Lignin-Biosynthese führt.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist ein isoliertes Nukleinsäurefragment,
kodierend ein aktives Enzym F5H in einer Pflanze, das eine Aminosäuresequenz
aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus (1)
der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 2 und (2) einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2,
umfassend Aminosäuresubstitutionen,
-additionen und -deletionen, die nicht die Funktion des aktiven Enzyms
F5H in einer Pflanze verändern.
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Gegenstand
der Erfindung ist weiter ein isoliertes Nukleinsäurefragment, kodierend ein
aktives Enzym F5H in einer Pflanze, wobei das Fragment aus der Gruppe
ausgewählt
ist, bestehend aus dem Nukleinsäurefragment
von SEQ ID NO: 1, dem Nukleinsäurefragment
von SEQ ID NO: 3 und einem Nukleinsäurefragment von SEQ ID NO:
1 oder SEQ ID NO: 3, umfassend Basenänderungen, die nicht die Funktion
des kodierten Enzyms F5H in einer Pflanze verändern.
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Gegenstand
der Erfindung ist weiter ein chimäres Gen, das veränderte Verhältnisse
von Guaiacyl:Syringyl-Lignin-Monomer in einer transformierten Pflanze
herbeiführt,
wobei das Gen ein Nukleinsäurefragment umfasst,
das ein aktives Enzym F5H in einer Pflanze kodiert, das funktionsfähig in entweder
Sense- oder Antisense-Richtung mit geeigneten Regulatorsequenzen
verknüpft
ist. Bei den Nukleinsäurefragmenten
handelt es sich um die vorstehend beschriebenen.
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Auch
bereitgestellt ist ein Verfahren zur Änderung der Aktivität von F5H
in einer Pflanze mittels Transformation von Pflanzenzellen in einer
ganzen Pflanze mit einem chimären
Gen, das veränderte
Verhältnisse von
Guaiacyl:Syringyl-Lignin-Monomer in einer transformierten Pflanzenzelle,
worin das Gen exprimiert wird, herbeiführt; Züchten der Pflanzen unter Bedingungen,
die Samenentwicklung erlauben; und Screening der sich von diesen
transformierten Samen herleitenden Pflanzen auf diejenigen, die
ein aktives F5H-Gen oder Fragment davon exprimieren.
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Es
wird ein Verfahren zur Änderung
der Aktivität
des Enzyms F5H in einer Pflanze bereitgestellt durch: (i) Transformieren
einer Zelle, eines Gewebes oder Organs aus einer geeigneten Wirtspflanze
mit dem vorstehend beschriebenen chimären Gen, worin das chimäre Gen exprimiert
wird; (ii) Auswählen
von transformierten Zellen, Zellcallus, somatischen Embryos oder
Samen, die das chimäre
Gen enthalten; (iii) Regenerieren ganzer Pflanzen aus den transformierten
Zellen, dem Zellcallus, den somatischen Embryos oder den in Schritt
(ii) ausgewählten
Samen; (iv) Auswählen
von in Schritt (iii) regenerierten ganzen Pflanzen, die einen Phänotyp aufweisen,
gekennzeichnet durch (1) eine Fähigkeit
der ganzen Pflanze, Verbindungen zu akkumulieren, die sich von Sinapinsäure oder
(2) einem veränderten
Syringyl-Lignin-Monomergehalt im Vergleich zu einer nicht transformierten
Wirtspflanze herleiten.
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Es
ist erfindungsgemäß ein zusätzliches
Verfahren zur Veränderung
der Zusammensetzung von Lignin in einer Pflanze mittels stabiler
Inkorporation in das Genom der Wirtspflanze durch Transformation
eines chimären
Gens bereitgestellt, das veränderte
Verhältnisse
von Guaiacyl:Syringyl-Lignin-Monomer in einer transformierten Pflanze
herbeiführt;
Expression des inkorporierten Gens dergestalt, dass F5H exprimiert
wird und worin die Verhältnisse
von Guaiacyl:Syringyl-Lignin-Monomer im Vergleich zu den Verhältnissen
der nicht transformierten Wirtspflanze verändert sind.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER FIGUREN EINES SEQUENZPROTOKOLLS
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1 erläutert die
Biosynthese von monomeren Lignin-Präkursoren über den allgemeinen Phenylpropanoid-Pfad;
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2 stellt
eine Erläuterung
des pBIC20-F5H-Cosmids und des F5H-Überexpressionskonstrukts (pGA482-35S-F5H)
dar, worin das F5H-Gen unter der Kontrolle des konstitutiven 35S-Promotors
des Blumenkohl-Mosaikvirus exprimiert wird;
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3 zeigt
eine Analyse der sich von Sinapinsäure herleitenden sekundären Metaboliten
im Wildtyp, die fah1-2-Mutante, und sich unabhängig herleitende transgene
fah1-2-Pflanzen, welche die sich vom pBIC20-F5H-Cosmid herleitende
T-DNA oder das pGA484-35S-F5H-Überexpressionskonstrukt
tragen;
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4 zeigt
die Auswirkung der F5H-Überexpression
durch Vergleich der Steady-state-Spiegel von F5H-mRNA im Wildtyp,
die fah1-2-Mutante und sich unabhängig herleitende transgene
fah1-2-Pflanzen, welche die sich vom 35S-F5H-Überexpressionskonstrukt herleitende
T-DNA tragen;
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5 zeigt
eine GC-Analyse der Nitrobenzen-Oxidationsprodukte von Lignin, um
die Auswirkung der F5H-Überexpression
auf die Lignin-Monomer-Zusammensetzung im Wildtyp, die fah1-2-Mutante,
und eine fah1-2-Mutante, die das sich von dem 35S-F5H-Überexpressionskonstrukt
herleitende T-DNA trägt,
zu erläutern;
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6 erläutert eine
Southern-Blot-Analyse, welche die Hybridisierung der F5H-cDNA mit
der mit EcoRI aufgeschlossenen genomischen DNA vergleicht, die aus
dem Wildtyp von Arabidopsis thaliana und einer Anzahl von fah1-Mutanten
isoliert wurde;
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7 stellt
eine Northern-Blot-Analyse dar, welche die Hybridisierung der F5H-cDNA
an RNA, die aus dem Wildtyp von Arabidopsis thaliana und einer Anzahl
von fah1-Mutanten isoliert wurde, vergleicht;
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8 zeigt
die genomische Nukleotid- (SEQ ID NO:3) und Aminosäuresequenzen
(SEQ ID NO:2) des F5H-Gens von Arabidopsis und das F5H-Enzym, das
es kodiert.
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Der/die
Anmelder haben in Konformität
mit 37 C. F. R. 1.821–1.825
und Anlagen A und B („Anforderungen
für Anmeldungsoffenbarungen
enthaltend Nukleotide und/oder Aminosäuresequenzen") und in Konformität mit „Regeln
für die
Standarddarstellung von Nukleotid- und Aminosäuresequenzen in Patentanmeldungen" und Annex I und
II zur Entscheidung des Präsidenten
des EPO, veröffentlicht
in Supplement Nr. 2 zu OJ EPO, 12/1992, drei Sequenzprotokolle bereitgestellt.
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Die
Sequenz der F5H-cDNA von Arabidopsis thaliana ist in SEQ ID NO:1
angegeben, und die Sequenz des genomischen F5H-Klons von Arabidopsis
thaliana ist in SEQ ID NO:3 angegeben. Die Sequenz des F5H-Proteins
ist in SEQ ID NO:2 angegeben.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist ein Gen, das F5H, ein Schlüsselenzym
in der Lignin-Biosynthese,
kodiert. Es ist erfindungsgemäß weiter
ein Verfahren zur Veränderung
der Ligninzusammensetzung in Pflanzen durch Transformation von Pflanzen
mit dem F5H-Gen bereitstellt, worin das Gen exprimiert wird und
eine erhöhte
Umwandlung von Ferulasäure
in Sinapinsäure
veranlasst, wodurch der Syringylgehalt des Lignin-Polymers erhöht wird.
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Die
Wirkung in Pflanzen von Ligninzusammensetzungen, die einen höheren Syringyl-Monomergehalt enthalten,
besteht darin, dass das Lignin für
die chemische Delignifizierung empfänglicher ist. Dies ist von
besonderem Nutzen in den Papier- und Zellstoffindustrien, wo beim
Lignifizierungsverfahren sehr große Mengen an Energie und Zeit
aufgewendet werden. Hölzerne
Pflanzen, die mit einem aktiven F5H-Gen transformiert sind, würden im
Vergleich zu üblichen
Papiereinträgen
einen signifikanten Vorteil beim Delignifizierungsverfahren darstellen.
Auf ähnliche
Weise bietet die Modifikation der Ligninzusammensetzung in Gräsern durch
die Insertion und Expression eines heterologen F5H-Gens ein einzigartiges
Verfahren zur Steigerung der Verdaulichkeit von Nutztierfutter.
Die Maximierung der Verdaulichkeit von Gräsern auf diese Weise bietet
ein großes Potenzial
für ökonomische
Vorteile für
den landwirtschaftlichen Betrieb und die landwirtschaftlichen Industrien.
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PFLANZEN, BEI DENEN DIE
ERFINDUNG ANGEWENDET WERDEN KANN
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Es
wird erfindungsgemäß ein Gen
und ein chimäres
Genkonstrukt bereitgestellt, die zur Transformation von Pflanzengewebe
zur Veränderung
der Lignin-Monomer-Zusammensetzung nützlich sind. Erfindungsgemäß geeignete
Pflanzen umfassen Pflanzen, denen Syringyllignin natürlich mangelt
oder diejenigen, die Lignin mit einem hohen Verhältnis von Guaiacyl:Syringyl
akkumulieren. Erfindungsgemäß geeignete
Pflanzen umfassen auch Pflanzen, deren Lignin unter Verwendung von
Antisense-Transformationskonstrukten,
die den Syringylgehalt des Lignins der transgenen Pflanze reduzieren,
wenn eine derartige Veränderung
erwünscht wäre, modifiziert
werden könnten.
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Geeignete
Pflanzen können
folgende einschließen,
sind aber nicht darauf beschränkt:
Alfalfa (Medicago sp.), Reis (Oryza sp.), Mais (Zea mays), Ölsamenraps
(Brassica sp.), Futtergräser
und auch Nutzbaumpflanzen, wie zum Beispiel Eukalyptus (Eucalyptus
sp.), Kiefer (Pinus sp.), Fichte (Picea sp.) und Pappel (Populus
sp.) ebenso wie Arabidopsis sp., und Tabak (Nicotiana sp.).
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DEFINITIONEN
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Wie
hierin verwendet, können
die folgenden Begriffe zur Interpretation der Ansprüche und
der Beschreibung verwendet werden.
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Unter
dem Begriff „FAH1" versteht man den
Locus oder den Chromosomenort, an dem das F5H-Gen kodiert ist. Unter
dem Begriff „FAH1" versteht man das
Wildtyp-Allel des Gens, kodierend das F5H-Gen. Unter dem Begriff „fah1" versteht man jedwede
mutante Version dieses Gens, die zu einem veränderten Grad der Enzymaktivität, des Syringyllignin-Gehalts
oder des Sinapatestergehalts führt,
der mithilfe der Dünnschichtchromatographie,
der Hochdruckflüssigkeitschromatographie
oder mithilfe der Fluoreszenz in vivo gemessen werden kann.
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Unter „Gen" versteht man ein
Nukleinsäurefragment,
das ein spezifisches Protein exprimiert, einschließlich Regulationssequenzen,
die der Kodierungsregion vorangehen (5' nicht kodierend) und folgen (3' nicht kodierend).
Unter „nativem" Gen versteht man
das Gen wie es in der Natur mit seinen eigenen Regulationssequenzen,
gefunden wird.
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Unter
einem „chimären Gen" versteht man ein
Gen, das heterogene Regulations- und Kodierungssequenzen umfasst.
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Unter
einem „endogenen
Gen" versteht man
das native Gen, das in der Regel an seinem natürlichen Ort im Genom gefunden
wird.
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Unter „Fremdgen" oder „Transgen" versteht man ein
Gen, das in der Regel nicht im Wirtsorganismus gefunden wird, sondern
eines, das durch Gentransfer eingeführt wird.
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Unter
dem Begriff „Promotor" versteht man eine
DNA-Sequenz in einem Gen, gewöhnlich
oberstromig (5')
zu seiner Kodierungssequenz, das die Expression der Kodierungssequenz
durch Bereitstellung des Erkennungsortes für RNA-Polymerase und andere
Faktoren, die zur ordnungsgemäßen Transkription
erforderlich sind, kontrolliert. Ein Promotor kann auch DNA-Sequenzen
enthalten, die an der Bindung der Proteinfaktoren, welche die Wirksamkeit
der Transkriptionsinitüerung
als Antwort auf physiologische oder entwicklungsmäßige Bedingungen
kontrolliert, beteiligt sind.
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Unter
dem Begriff „funktionsfähig verknüpft" versteht man Nukleinsäuresequenzen
an einem einzelnen Nukleinsäuremolekül, die dergestalt
in Verbindung stehen, dass die Funktion der einen von der anderen beeinflusst
wird.
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Wie
hierin verwendet, versteht man unter geeigneten „Regulationssequenzen" oberstromig (5') lokalisierte Nukleotidsequenzen,
darin und/oder unterstromig (3')
von einer Kodierungssequenz, welche die Transkription und/oder Expression
der Kodierungssequenzen im Zusammenhang mit dem Protein-Biosyntheseapparat
der Zelle kontrollieren. Diese Regulationssequenzen schließen Promotoren,
Translations-Leader-Sequenzen, Transkriptionsterminierungssequenzen
und Polyadenylierungssequenzen ein.
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Unter
dem Begriff „T-DNA" versteht man die
DNA, die aus einem T-DNA-Plasmid, das von einem Stamm von Agrobacterium
tumefaciens getragen wird, der zum Infizieren von Pflanzen zu Zwecken
der Pflanzentransformation verwendet wird, in das Pflanzengenom
transferiert wird.
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Unter
dem Begriff „T-DNA-Plasmid" versteht man ein
Plasmid, das von Agrobacterium tumefaciens getragen wird, das einen
Replikationsstartpunkt trägt,
selektierbare Marker, wie zum Beispiel Antibiotika-Resistenz und
DNA-Sequenzen, auf die als rechte und linke Border verwiesen wird,
die zur Pflanzentransformation erforderlich sind. Die DNA-Sequenz,
die während
dieses Vorgangs transferiert wird, ist die, die zwischen den rechten
und linken an einem T-DNA-Plasmid vorhandenen T-DNA-Bordersequenzen lokalisiert
ist. Die DNA zwischen diesen Borders kann auf solche Weise manipuliert
werden, dass jedwede gewünschte
Sequenz in das Pflanzengenom insertiert werden kann.
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Unter
dem Begriff „Ferulat-5-hydroxylase" oder „F5H" versteht man ein
Enzym im Phenylpropanoid-Biosynthesepfad der Pflanze, welches die
Umwandlung von Ferulat in 5-Hydroxyferulat katalysiert und die Produktion
von Sinapinsäure
und ihren sich ergebenden Metaboliten, einschließlich Sinapoylmalat und Syringyllignin,
erlaubt.
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Unter
den Begriffen „kodieren" und „kodieren
für" versteht man den
Vorgang, über
den ein Gen, über die
Mechanismen von Transkription und Translation, die Informationen
an eine Zelle bereitstellt, von der eine Reihe von Aminosäuren in
eine spezifische Aminosäuresequenz
zur Herstellung eines aktiven Enzyms assembliert werden können. Es
ist zur Kenntnis zu nehmen, dass der Vorgang des Kodierens einer
spezifischen Aminosäuresequenz
DNA-Sequenzen einschließt,
die Basenänderungen
beinhalten können,
die zu keiner Änderung
in der kodierten Aminosäure
führen
oder die Basenänderungen
beinhalten, die eine oder mehr Aminosäure(n) ändern können, sich aber nicht auf die
Funktionseigenschaften des durch die DNA-Sequenz kodierten Proteins
auswirken. Es ist deshalb zur Kenntnis zu nehmen, dass die Erfindung
mehr als die spezifischen erläuternden
Sequenzen umfasst. Modifikationen an der Sequenz, wie zum Beispiel
Deletionen, Insertionen oder Substitutionen in der Sequenz, welche
stille Änderungen
herbeiführen,
die sich nicht weitgehend auf die Funktionseigenschaften des sich
ergebenden Proteinmoleküls
auswirken, werden auch in Betracht gezogen. Veränderungen in der Gensequenz,
welche zum Beispiel die Degeneration des genetischen Kodes widerspiegeln
oder die in der Produktion einer chemisch äquivalenten Aminosäure an einer
gegebenen Stelle resultieren, werden in Betracht gezogen. Folglich
kann ein Codon für
die Aminosäure
Alanin, eine hydrophobe Aminosäure,
durch ein Codon substituiert werden, das einen anderen, weniger
hydrophoben Rest, wie zum Beispiel Glycin, oder einen hydrophoberen
Rest, wie zum Beispiel Valin, Leucin oder Isoleucin kodiert. Auf ähnliche
Weise würde
auch erwartet werden, dass Änderungen,
welche zur Substitution eines negativ geladenen Restes für einen
anderen, wie zum Beispiel Asparaginsäure für Glutaminsäure, oder einen positiv geladenen Rest
für einen
anderen, wie zum Beispiel Lysin für Arginin, ein biologisch äquivalentes
Produkt herbeiführen. Es
würde auch
nicht erwartet werden, dass Nukleotid-Änderungen, die in einer Änderung
der N-terminalen und C-terminalen Anteile des Protein-Moleküls resultieren,
die Aktivität
des Proteins verändern
würden.
In einigen Fällen
könnte
es tatsächlich
wünschenswert
sein, Mutanten von der Sequenz herzustellen, um die Änderungswirkung
auf die biologische Aktivität
des Proteins zu untersuchen. Jede der vorgeschlagenen Modifikationen wie
auch die Bestimmung zur Beibehaltung der biologischen Aktivität in den
kodierten Produkten liegt durchaus in der Fähigkeit des Durchschnittsfachmanns.
Der Fachmann erkennt überdies,
dass diese erfindungsgemäßen Sequenzen
auch durch ihre Fähigkeit
unter stringenten Bedingungen (2 × SSC, 0,1% SDS, 65°C) mit den
hierin erläuterten
Sequenzen zu hybridisieren, definiert sind.
-
Unter
dem Begriff „Expression", wie hierin verwendet,
versteht man die Produktion des durch ein Gen kodierten Proteinprodukts.
Unter „Überexpression" versteht man die
Produktion eines Genproduktes in transgenen Organismen, die Produktionsspiegel
in normalen oder nicht transformierten Organismen überschreiten.
-
Unter „Transformation" versteht man den
Transfer eines Fremdgens in das Genom eines Wirtsorganismus und
seine genetisch stabile Vererbung. Beispiele von Pflanzentransformationsverfahren
schließen Agrobacterium-vermittelte
Transformation und teilchenbeschleunigte oder „Gen-Pistolen"-Transformationstechnologie, wie in
US 5,204,253 beschrieben,
ein.
-
Unter
dem Begriff „Plasmid-Rescue" versteht man ein
Verfahren zur Zirkularisierung einer durch ein Restriktionsenzym
aufgeschlossenen genomischen Pflanzen-DNA, die T-DNA-Fragmente trägt, die
einen bakteriellen Replikationsstartpunkt und Antibiotikaresistenz
(kodiert durch das β-Lactamase-Gen
von E. coli) dergestalt trägt,
dass dieses zirkularisierte Fragment als ein Plasmid in einer Bakterienwirtszelle,
wie zum Beispiel E. coli, propagiert werden kann.
-
Unter
dem Begriff „Lignin-Monomer-Zusammensetzung" versteht man die
relativen Verhältnisse
von Guaiacyl-Monomer und Syringyl-Monomer, die in lignifiziertem
Pflanzengewebe gefunden werden.
-
DER BIOSYNTHETISCHE
PHENYLPROPANOID-PFAD
-
Der
biosynthetische Lignin-Pfad ist gut untersucht und die wichtigsten
Pfade sind in 1 erläutert. Die Lignin-Biosynthese
wird durch die Umwandlung von Phenylalanin in Cinnamat mittels der
Wirkung von Phenylalamin-Ammoniumlyase (PAL) initiiert. Das zweite
Enzym des Pfades stellt Cinnamat-4-hydroxylase (C4H), eine Cytochrom-P450-abhängige Monooxygenase
(P450), dar, welche für
die Umwandlung von Cinnamat in p-Coumarat verantwortlich ist. Die
zweite Hydroxylierung des Pfades wird durch ein relativ schlecht
charakterisiertes Enzym, p-Coumarat-3-hydroxylase (C3H), dessen
Produkt Kaffeesäure
ist, katalysiert. Kaffeesäure
wird anschließend
durch OMT zur Bildung von Ferulasäure, einem direkten Präkursor von
Lignin, O-methyliert. Die letzte Hydroxylierungsreaktion des allgemeinen
Phenylpropanoid-Pfades wird durch F5H katalysiert. Das durch F5H-produzierte
5-Hydroxyferulat wird dann durch OMT, das gleiche Enzym, das die
O-Methylierung der Kaffeesäure
durchführt,
O-methyliert. Diese duale Spezifität von OMT wurde durch das Klonieren
des OMT-Gens und der Expression des Proteins in E. coli bestätigt (Bugos
et al., (1991) supra, Gowri et al., (1991) supra).
-
Die
festgelegten Schritte der Lignin-Biosynthese werden durch 4CL, (Hydroxy)cinnamoyl-CoA-Reduktase (CCR) und
CAD katalysiert, die letztendlich Coniferylalkohol aus Ferulasäure und
Sinapoylalkohol aus Sinapinsäure
bildet. Coniferylalkohl und Sinapoylalkohol werden durch extrazelluläre Oxidasen
polymerisiert, um Guaiacyllignin bzw. Syringyllignin zu ergeben,
obwohl Syringyllignin genauer als ein Copolymer von beiden Monomeren
beschrieben ist.
-
Obwohl
Ferulasäure,
Sinapinsäure
und in einigen Fällen
p-Coumarinsäure
der Lignin-Biosynthese zugeführt
werden, stellen diese Verbindungen in einigen Pflanzen Präkursoren
für andere
sekundäre
Metaboliten dar. Bei Arabidopsis dient die Sinapinsäure als
ein Präkursor
für die
Lignin-Biosynthese, sie wird aber auch der Synthese von löslichen
Estern der Sinapinsäure
zugeführt.
Auf diesem Pfad wird Sinapinsäure
in Sinapoylglucose umgewandelt, die als ein Intermediärprodukt
bei der Biosynthese von Sinapoylmalat dient (5). Sinapinsäure und
ihre Ester sind fluoreszent und können als ein Marker von Pflanzen
verwendet werden, denen diese Enzyme mangeln, die zur Herstellung
von Sinapinsäure
benötigt
werden (Chapple et al., supra).
-
IDENTIFIKATION DES FAH1-LOCUS
UND VON FAH1-ALLELEN
-
Eine
Reihe von Mutanten von Arabidopsis, die kein Sinapoylmalat akkumulieren,
wurden identifiziert und kollektiv als fah1-Mutanten bezeichnet.
Die fluoreszente Natur von Sinapoylmalat erlaubt die leichte Identifizierung
von Sinapinsäureestern
mittels Dünnschichtchromatographie
(DC) gefolgt von der Beobachtung unter Ultraviolett-Licht (UV-Licht).
Die Fluoreszenz von Sinapoylmalat kann auch in vivo sichtbar gemacht
werden, weil Sinapoylmalat in der adaxialen Blattepidermis akkumuliert
wird. Der Wildtyp von Arabidopsis weist unter UV-Licht eine blassblaue
Fluoreszenz auf, während
fah1-Mutanten aufgrund des Mangels der blauen Fluoreszenz von Sinapoylmalat
und der Fluoreszenz von Chlorophyll gegenüber Mesophyll dunkelrot aussehen
(Chapple et al., supra).
-
Eine
DC-basierende Mutantendurchsuchung von 4 200 Ethylmethansulfonat-mutagenisierten
Arabidopsis-Pflanzen identifizierte eine Anzahl unabhängiger Mutantenlinien,
die signifikant niedrigere Sinapoylmalat-Spiegel akkumulierten.
Die Mutationen in diesen Linien wurden als fah1-1 durchweg bis fah1-5
identifiziert. Die visuelle UV-Fluoreszenz-Durchsuchung in vivo
wurde zur Identifizierung von mehr Mutantenlinien, welche die fah1-Mutation
tragen, verwendet. Zwei dieser Mutanten (fah1-6 und fah1-7) wurden
aus EMS-mutagenisierten Populationen ausgewählt. Eine Mutantenlinie (fah1-8)
wurde unter einer Mutantenpopulation ausgewählt, die durch schnelle Neutronenbombardierung
herbeigeführt
wurde (Nilan, R. A. Nucl. Sci. Abstr., 28 (3), 5940 (1973); Kozer
et al., Genet. Pol., 26 (3), 367, (1985)). Eine endgültige Mutantenlinie,
(fah1-9) wurde unter Verwendung des gleichen Verfahrens von einer
mit T-DNA getaggten Pflanzenpopulation identifiziert. Vor der weiteren
Analyse wurde jede Mutantenlinie mindestens zweimal in den Wildtyp
rückgekreuzt,
und es wurden homozygote Linien etabliert.
-
Zur
Bestimmung, ob die neu isolierten Mutantenlinien am gleichen Locus,
das heißt
im F5H kodierenden Gen, defekt waren, wurden genetische Komplementierungsexperimente
durchgeführt.
In diesen Tests wurde jede Mutantenlinie in fah1-2 gekreuzt, von
der bekannt ist, dass sie in F5H defekt ist. In jedem Fall wurde die
neu isolierte Mutantenlinie als das weibliche Elternteil verwendet
und wurde mit Pollen von einer homozygoten fah1-2-Mutanten befruchtet.
Unter Verwendung von fah1-2 als das weibliche Elternteil und der
neuen Mutantenlinie als der Pollenspender wurde auch eine reziproke
Kreuzung durchgeführt.
Die Samen von diesen Kreuzungen wurden mehrere Wochen später gesammelt
und wurden zur sich anschließenden
Analyse gepflanzt. Die Abkömmlinge
wurden mittels DC, Hochdruckflüssigkeitschromatographie
und mittels Beobachtung unter UV-Licht auf Sinapoylmalat-Produktion
analysiert. Von diesen Kreuzungen waren alle untersuchten F1-Abkömmlinge
Sinapoylmalat-defizient, was darauf hindeutete, dass alle identifizierten
Mutationen allel waren.
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Die
fah1-9-Linie wurde in Anwesenheit der T-DNA-Insertion im F5H-Gen
zur weiteren Untersuchung ausgewählt.
Die T-DNA-Insertion im FAH1-Locus erleichterte die Klonierung der
flankierenden DNA von Arabidopsis, die dann zur Wiedergewinnung
des F5H-Gens des Wildtyps aus cDNA und genomischen Bibliotheken
verwendet werden konnte (Meyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
93 6869 (1996)).
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KLONIEREN DES FAH1-LOCUS
-
Ein
DNA-Fragment aus dem FAH1-Locus wurde aus dem mit T-DNA getaggten
fah1-9-Mutanten unter Verwendung des Plasmid-Rescue-Verfahrens isoliert
(Meyer et al., supra). Das Plasmid-Rescue- Verfahren wird häufig eingesetzt und ist im
Stand der Technik weithin bekannt und kann zur Isolation spezifischer
Allele aus mit T-DNA transformierten Pflanzen verwendet werden (Behringer,
et al., Plant Mol. Biol. Rep., 10, 190, (1992)). Der Vektor, der – um es
kurz zu fassen – zur
Herbeiführung
der mit T-DNA getaggten Population von Arabidopsis verwendet wurde,
trägt Sequenzen,
die für
die autonome Replikation von DNA in Bakterien erforderlich sind
und Sequenzen, die Antibiotikaresistenz verleihen. Sobald diese
DNA in das Pflanzengenom integriert ist, können Aufschlüsse von
spezifischen Restriktionsendonukleasen eingesetzt werden, um Fragmente herbeizuführen, die
zirkularisiert, ligiert und in E. coli transformiert werden können. Zirkularisierte
DNA von der T-DNA bildet funktionelle Plasmide, die ihren Bakterienwirten
Antibiotika-Resistenz dergestalt verleihen, dass sie durch Wachstum
auf Selektivmedien identifiziert werden können. Diese Plasmide, die aus
den Sequenzen, einschließlich
der rechten und linken Border gebildet werden, tragen auch die Pflanzen-Genomsequenzen,
die die T-DNA-Insertion
flankieren, mit sich. Von einer der beiden T-DNA-Borders gebildeten
Plasmide, die flankierende DNA-Sequenzen tragen, können durch
Analyse der Produkte von den diagnostischen Restriktionsenzymaufschlüssen auf
Agarosegelen identifiziert werden. Die Plasmide mit flankierenden
Sequenzen können dann
als einen Ausgangspunkt zum Klonieren von Pflanzensequenzen dienen,
die die Homologie zur DNA am Punkt der T-DNA-Insertion teilen (Behringer,
et al., supra).
-
Plasmid-Rescue
wurde unter Verwendung von EcoRI-aufgeschlossener DNA, die aus homozygoten fah1-9-Pflanzen
hergestellt wurde, durchgeführt.
EcoRI-aufgeschlossene genomische DNA wurde ligiert und dann in kompetente
DH5α von
E. coli elektroporiert. DNA aus geretteten Plasmiden wurde weiter
mit sowohl EcoRI und SalI aufgeschlossen, und die Aufschlüsse wurden
mittels Gelelektrophorese zur Identifizierung von Plasmiden, die
flankierende DNA von Arabidopsis enthielten, analysiert. Ein SacII-EcoRI-Fragment
von diesem geretteten Plasmid wurde zur Identifizierung eines F5H-Klons
aus einer cDNA-Bibliothek von Arabidopsis verwendet (Newman, T.
et al., Plant. Physiol. 106, 1241, (1994)).
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DNA-SEQUENZIERUNG
DER F5H-CDNA UND GENOMISCHEN KLONE
-
Die
Sequenzanalyse der F5H-cDNA und genomischen Klone wurde an Plasmid-DNA
manuell unter Verwendung eines United States Biochemical Sequenase
Kit v. 2,0 an einem DuPont Genesis® 2000
Sequencer oder einem Applied Biosystems 373A DNA-Sequencer unter
Verwendung von standardmäßigen Vektor-basierenden
Sequenzier-Oligonukleotiden oder gegebenenfalls kundenspezifisch
synthetisierten Oligonukleotiden durchgeführt. Die Sequenz F5H-cDNA von
Arabidopsis thaliana ist in SEQ ID NO:1 angegeben, und die Sequenz
des genomischen F5H-Clons von Arabidopsis thaliana ist in SEQ ID
NO:3 angegeben.
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Die
F5H-cDNA enthält
einen Open Reading Frame von 1560 bp, der ein Protein mit einem
Molekulargewicht von 58 728 kodiert. Das putative ATG-Initiierungscodon
ist von einem A bei –3
und einem G bei +4 flankiert, im Einklang mit den im Allgemeinen
gefundenen Nukleotiden, die das Initiator-Methionin in Pflanzen-mRNAs flankieren
(Lutcke et al., EMBO J. 6, 43, (1987)). Sofort nach dem erschlossenen
Initiator-Methionin befindet sich eine aus 17 Aminosäuren bestehende
Sequenz, die neun Hydroxyaminosäuren
enthält (8).
Die sich anschließende
aus 15 Aminosäuren
bestehende Sequenz ist reich an hydrophoben Aminosäuren; elf
hydrophoben Resten, die aus Phenylalanin-, Isoleucin-, Leucin- und Valinresten
bestehen. Dieser hydrophoben Strecke folgt unmittelbar eine putative
Stoptransfersequenz von Arg-Arg-Arg-Arg. F5H teilt sich auch die
signifikante Sequenzidentität
mit anderen P450s. Am bemerkenswertesten ist die Strecke zwischen Pro-450
und Gly-460. Diese Region enthält
acht Reste, die die Hämbindungsdomäne umfassen
und unter den meisten P450s hoch konserviert sind, wobei eine Ausnahme
die Allenoxid-Synthese von Linum usitatissimum bildet (Song et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8519, (1993)). Die Pro-450- bis Gly-460-Region
enthält Cys-458
in F5H, die anhand der Analogie höchst wahrscheinlich den Hämbindungsliganden
in diesem Enzym darstellt.
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TRANSFORMATION VON FAH1-2-ARABIDOPSIS
UND WIEDERHERSTELLUNG DER SINAPOYLMALAT-AKKUMULATION
-
Die
Identität
des F5H-Gens wurde durch Komplementierung der fah1-2-Mutante mit
einem genomischen Klon und einem Konstrukt bestätigt, wo die genomische F5H-Kodierungssequenz
unter der Kontrolle des 35S-Promotors des Blumenkohl-Mosaikvirus
exprimiert wurde. Kurzgefasst wurde die F5H-cDNA als eine Sonde
zum Durchsuchen einer Transformations-kompetenten Bibliothek (Meyer
et al., (1994) Science, 264, 1452–1455) für genomische Klone verwendet.
Unter Verwendung dieses Verfahrens wurde ein Cosmid-Klon (pBIC20-F5H)
isoliert, der ein aus 17 kb bestehendes genomisches Insert trug,
enthaltend die erschlossenen Start- und Stopcodons des F5H-Gens
(2). Der Anteil dieses Cosmids, das den F5H Open
Reading Frame trug, wurde aus dem Cosmid exzidiert und in einen
Vektor subkloniert, in dem es funktionsfähig mit dem 35S-Promotor des
Blumenkohl-Mosaikvirus (pGA482-35S-F5H) verknüpft wurde (2).
Sowohl das Ausgangscosmid als auch dieses derivative Plasmidkonstrukt
wurden in Agrobacterium tumefaciens elektroporiert und zum Transformieren
von fah1-2-Mutanten verwendet. Der Erfolg der Transformationen wurde
mittels der DC-Assays belegt, die eine Sinapoylmalat-Akkumulation
in Blattgeweben der fah1-2-Transformanten nachwies, die das T-DNA
aus dem pBIC20-F5H-Cosmid oder dem pGA482-35S-F5H-Plasmid trugen
(3). Diese Daten zeigten deutlich an, dass das
F5H kodierende Gen identifiziert wurde.
-
MODIFIKATION DER LIGNINZUSAMMENSETZUNG
IN PFLANZEN, DIE MIT F5H UNTER DER KONTROLLE DES 35S-PROMOTORS DES
BLUMENKOHL-MOSAIKVIRUS TRANSFORMIERT WURDEN
-
Für das fah1-2-Allel
homozygote Arabidopsis-Pflanzen wurden mit Agrobacterium, welches
das pGA482-35S-F5H-Plasmid trägt,
transformiert, das das unter der Kontrolle des konstitutiven 35S-Promotors des
Blumenkohl-Mosaikvirus chimäre
F5H-Gen enthält
(Odell, et al., Nature 313, 810–812,
(1985)). Unabhängige
homozygote Transformanten, die das F5H-Transgen an einem einzelnen
genetischen Locus tragen, wurde durch Selektion auf Kanamycin enthaltendem
Wachstumsmedium, die im Boden gezogen wurden, identifiziert, und
das Pflanzengewebe wurde auf die Lignin-Monomer-Zusammensetzung
analysiert. Die Nitrobenzen-Oxidationsanalyse des Lignins im Wildtyp,
fah1-2, und Transformanten, die die T-DNA aus dem pG482-35S-F5H-Konstrukt
tragen, zeigten an, dass die F5H-Überexpression, wie anhand der
Northem-Blot-Analyse gemessen (
4), zu einer
signifikanten Zunahme des Syringylgehalts des transgenen Lignins
führte
(
5). Das Lignin der Pflanzen mit F5H-Überexpression
wiesen einen Syringylgehalt von so hoch wie 29 Mol-% im Gegensatz
zu dem Syringylgehalt des Wildtyp-Lignins, der 18 Mol-% betrug,
auf (Tabelle 1) (Beispiel 5). Diese Daten weisen eindeutig nach,
dass die Überexpression
des F5H-Gens für
die Änderung der
Ligninzusammensetzung in transgenen Pflanzen nützlich ist. TABELLE
I AUSWIRKUNG
DER 35S-PROMOTOR-GETRIEBENEN F5H-EXPRESSION AUF DIE LIGNIN-MONOMER-ZUSAMMENSETZUNG
IN ARABIDOPSIS
| Linie | Mol-%
S |
| Wildtyp | 18,4
+/– 0,91 |
| 88 | 5,06
+– 0,17 |
| 172 | 13,7
+– 0,55 |
| 170 | 19,2
+– 0,56 |
| 122 | 19,9
+– 0,86 |
| 108 | 22,7
+– 0,82 |
| 107 | 25,3
+– 1,23 |
| 180 | 25,8
+– 0,78 |
| 117 | 28,8
+– 0,92 |
| 128 | 27,5
+– 1,80 |
-
Auf ähnliche
Weise wurden die F5H-Transformanten von T1-Tabak (Nicotiana tabacum)
herbeigeführt, gezogen
und auf die Lignin-Monomer-Zusammensetzung analysiert. Die Nitrobenzen-Oxidationsanalyse
wies nach, dass der Syringyl-Monomer-Gehalt der Blatt-Mittelrippen
von 14 Mol-% im Wildtyp auf 40 Mol-% in der transgenen Linie, die
sehr stark das F5H-Transgen exprimierte, gesteigert wurde (Tabelle
2). TABELLE
2 AUSWIRKUNG
DER 35S-PROMOTOR-GETRIEBENEN F5H-EXPRESSION AUF DIE LIGNIN-MONOMER-ZUSAMMENSETZUNG
IM XYLEM DER MITTELRIPPE DES TABAKBLATTES
| Linie | Mol-%
S |
| Wildtyp | 14,3
+/– 1,09 |
| 40 | 22,4
+/– 1,53 |
| 27 | 31,3
+/– 0,50 |
| 48 | 35,7
+– 6,06 |
| 33 | 40,0
+– 1,86 |
-
KONSTRUKTION
CHIMÄRER
GENE ZUR EXPRESSION VON F5H IN PFLANZEN
-
Die
Expression von Fremdgenen in Pflanzen ist gut etabliert (De Blaere
et al. (1987) Meth. Enzymol. 143: 277–291), und es ist erfindungsgemäß ein Verfahren
zur Applikation dieser Technologie auf die Einführung eines chimären Gens
zur Überexpression
des F5H-Gens in Pflanzen zur Manipulation der Lignin-Monomer-Zusammensetzung
bereitgestellt. Die Expression der F5H-mRNAs bei einem angemessenen
Spiegel kann die Verwendung verschiedener chimärer Gene erforderlich machen,
die sich verschiedene Promotoren zunutze machen. Eine bevorzugte
Klasse heterologer Wirte zur Expression der Kodierungssequenz des F5H-Gens
sind eukaryotische Wirte, insbesondere die Zellen höherer Pflanzen.
Insbesondere bevorzugt unter den höheren Pflanzen und den sich
von ihnen herleitenden Samen sind Alfalfa (Medicago sp.). Reis (Oryza sp.),
Mais (Zea mays), Ölsamenraps
(Brassica sp.), Futtergräser
und auch Nutzbaumpflanzen, wie zum Beispiel Eukalyptus (Eucalyptus
sp.), Kiefer (Pinus sp.), Fichte (Picea sp.) und Pappel (Populus
sp.) wie auch Arabidopsis sp., und Tabak (Nicotiana sp.). Die Expression
in Pflanzen verwendet in solchen Pflanzen funktionelle Regulationssequenzen.
-
Der
Ausgangspunkt des zum Antrieb der Expression der Kodierungssequenz
gewählten
Promotors ist nicht kritisch, so lange er eine ausreichende transkriptionale
Aktivität
zum Erlangen der Erfindung durch Expression translatierbarer mRNA
für das
F5H-Gen im gewünschten
Wirtsgewebe aufweist. Bevorzugte Promotoren targetieren wirksam
die F5H-Expression auf die Gewebe, die der Lignifizierung unterzogen
werden. Diese Promotoren können
Promotoren von Genen, die Enzyme des Phenylpropanoid-Pfades kodieren,
wie zum Beispiel den PAL-Promotor (Ohl et al., Plant Cell, 2, 837,
(1990)) und den 4CL-Promotor (Hauffed et al., Plant Cell, 3, 435,
(1991)) einschließen,
sind aber nicht beschränkt
darauf.
-
Abhängig von
der Applikation kann es wünschenswert
sein, Promotoren auszuwählen,
die für
die Expression in einem oder mehr Organen) der Pflanze spezifisch
sind. Beispiele schließen
die Licht-induzierbaren Promotoren
der kleinen Subeinheit von Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase
ein, wenn die Expression in photosynthetischen Organen oder Promotoren,
die spezifisch in Wurzeln aktiv sind, erwünscht ist.
-
EXPRESSION
DER CHIMÄREN
F5H-GENE IN PFLANZEN
-
Verschiedene
Verfahren zum Einführen
einer DNA-Sequenz (d. h. des Transformierens) in eukaryotische Zellen
höherer
Pflanzen stehen dem Fachmann zur Verfügung (siehe EPO-Veröffentlichungen
0 295 959 A2 und 0 138 341 A1). Solche Verfahren schließen die
ein, die auf Transformationsvektoren basieren, die auf den Ti- und
Ri-Plasmiden von Agrobacterium spp. basieren. Die Verwendung der
binären
Typen dieser Vektoren ist insbesondere bevorzugt. Ti-hergeleitete
Vektoren transformieren viele verschiedene Varietäten höherer Pflanzen,
einschließlich
monokotyledoner und dikotyledoner Pflanzen, wie zum Beispiel die
Sojabohne, Baumwolle, Tabak, Arabidopsis und Raps (Pacciotti et
al., Bio/Technology 3, 241, (1985); Byrne et al., Plant Cell Tissue
and Organ Culture 8, 3, (1987); Sukhapinda et al., Plant Mol. Biol.
8, 209, (1987); Lorz et al., Mol. Gen. Genet. 199, 178, (1985);
Potrykus Mol. Gen. Genet. 199, 183, (1985)).
-
Zur
Einführung
in Pflanzen können
die erfindungsgemäßen chimären Gene
in binäre
Vektoren, wie in Beispiel 5 beschrieben, insertiert werden.
-
Andere
Transformationsverfahren stehen dem Fachmann zur Verfügung, wie
zum Beispiel die direkte Aufnahme von Fremd-DNA-Konstrukten [siehe
EPO-Veröffentlichung
0 295 959 A2], Verfahren zur Elektroporation [siehe Fromm et al.
(1986) Nature (London) 319: 791] oder die ballistische Bombardierung
bei hoher Geschwindigkeit mit Metallpartikeln, die mit den Nukleinsäure-Konstrukten beschichtet
sind (siehe Kline et al., Nature (London) 327: 70 (1987) und siehe
US-Patent Nr. 4,945,050). Sobald sie transformiert sind, können die Zellen
vom Fachmann regeneriert werden.
-
Die
folgenden Beispiele sind zur Erläuterung
der wichtigsten erfindungsgemäßen Ausführungsformen beabsichtigt,
sollten aber in keiner Weise als einschränkend ausgelegt werden.
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BEISPIELE
-
ALLGEMEINE
VERFAHREN
-
Restriktionsenzymaufschlüsse, Phosphorylierungen,
Ligationen und Transformationen wurden, wie in Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989) Cold Spring
Harbor Laboratory Press, beschrieben, durchgeführt. Alle für das Wachstum und die Aufrechterhaltung
von Bakterienzellen verwendeten Reagenzien und Materialien wurden,
sofern nicht anderweitig angegeben, von Aldrich Chemicals (Milwaukee,
WI), DIFCO Laboratories (Detroit, MI), GIBCO/BRL (Gaithersburg,
MD) oder der Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) bezogen.
-
Die
Bedeutung der Abkürzungen
ist wie folgt: „h" bedeutet Stunde(n), „min" bedeutet Minute(n)", „sec" bedeutet Sekunde(n), „d" bedeutet Tag(e), „μl" bedeutet Mikroliter, „ml" bedeutet Milliliter, „1" bedeutet „Liter, „g" bedeutet Gramm, „mg" bedeutet Milligramm, „μg" bedeutet „Mikrogramm", „nm" bedeutet Nanometer, „m" bedeutet Meter, „E" bedeutet Einstein.
-
PFLANZENMATERIAL
-
Arabidopsis
thaliana wurde unter einer Photoperiode von 16 h hell/8 h dunkel
bei 100 mE m–2 s–1 bei 24°C gezogen,
die in Metronix 2000 Pflanzenerdegemisch (Scotts, Marysville OH)
kultiviert wurden. Die Mutantenlinien fah1-1 durchweg bis fah1-5
wurden mittels DC, wie nachstehend beschrieben, identifiziert. Unter Verwendung
ihrer roten Fluoreszenz unter UV-Licht als ein Marker wurden die
Mutantenlinien fah1-6, fah1-7 und fah1-8 aus Ethylmethansulfonat
(fah1-6, fah1l-7) oder durch schnelle Neutronen (fah1-8) mutagenisierte Populationen
von Landsberg erecta M2-Samen ausgewählt. Die mit T-DNA getaggte
Linie 3590 (fah1-9) wurde auf ähnliche
Weise in der mit T-DNA getaggten Population von DuPont identifiziert
(Feldmann, K. A., Malmberg, R. L. und Dean, C. (1994) Mutagensis
in Arabidopsis in Arabidopsis, (E. M. Meyerowitz und C. R. Somerville,
Hrsg.) Cold Spring Harbor Press). Alle Linien wurden mindestens
zweimal vor der experimentellen Verwendung zur Entfernung nicht
verknüpfter
Hintergrundmutationen zum Wildtyp rückgekreuzt.
-
SEKUNDÄRE METABOLIT-ANALYSE
-
Aus
100 mg Proben aus frischem Blattgewebe, das in 1 ml 50%igem Methanol
suspendiert war, wurden Blattextrakte hergestellt. Die Proben wurden
kurz gevortext, danach bei –70°C eingefroren.
Die Proben wurden aufgetaut, gevortext und 5 min bei 12 000 xg zentrifugiert.
Der Sinapoylmalat-Gehalt wurde nach der DC mit Silikagel, in einer
mobilen Phase aus n-Butanol/Ethanol/Wasser (4:1:1) qualitativ bestimmt.
Die Sinapinsäure
und ihre Ester wurden unter langwelligem UV-Licht (365 nm) mittels
ihrer charakteristischen Fluoreszenz sichtbar gemacht.
-
SOUTHERN-ANALYSE
-
Für die Southern-Analyse
wurde DNA aus Blattmaterial extrahiert (Rogers, et al., (1985) Plant.
Mol. Biol. 5, 69), mit Restriktionsendonukleasen aufgeschlossen
und gemäß Standardprotokollen
auf eine Hybond N+-Membran transferiert
(Amersham, Cleveland, Ohio). cDNA-Sonden wurden mit 32P
radioaktiv markiert und in Dehnhardt's Hybrydisierungspuffer (900 mM Natriumchlorid,
6 mM Dinatrium-EDTA, 60 mM Natriumphosphat pH 7,4, 0,5% SDS, 0,01%
denaturierter Heringspermien-DNA und 0,1% von jeweils Polyvinylpyrrolidon, bovinem
Serumalbumin und Ficoll 400) enthaltend 50% Formamid bei 42°C, an die
Target-Membran hybridisiert. Zur Entfernung ungebundener Sonde wurden
die Membranen zweimal bei Raumtemperatur und zweimal bei 65°C in 2 × SSPE (300
mM Natriumchlorid, 2 mM Dinatrium-EDTA, 20 mM Natriumphosphat, pH
7,4), enthaltend 0,1% SDS, gewaschen und auf den Film aufgelegt.
-
NORTHERN-ANALYSE
-
RNA
wurde zuerst gemäß dem folgenden
Protokoll aus Blattmaterial extrahiert.
-
Zur
Extraktion von RNA wurde durch Auflösen von 1% (w/v) TIPS (Triisopropyl-naphthalensulfonat, Natriumsalz),
6% (w/v) PAS (p-Aminosalicylat, Natriumsalz) in 50 mM Tris pH 8,4,
enthaltend 5% (v/v) Kirby-Phenol, Covey-Extraktionspuffer hergestellt.
Kirby-Phenol wurde durch Neutralisieren von verflüssigtem Phenol,
enthaltend 0,1% (w/v) 8-Hydroxychinolin mit 0,1 M Tris-HCl, pH 8,8,
hergestellt. Für
jede RNA-Aufbereitung wurde eine Probe von 1 g aus Pflanzengewebe
in flüssigem
Stickstoff zerkleinert und in 5 ml Covey-Extraktionspuffer, enthaltend
10 μl β-Mercaptoethanol,
extrahiert. Die Probe wurde mit 5 ml eines Gemischs von 1:1 Kirby-Phenol
und Chloroform extrahiert, gevortext und 20 min bei 7 000 xg zentrifugiert.
Der Überstand wurde
entfernt und die Nukleinsäuren
wurden mit 500 μl
3 M Natriumacetat und 5 ml Isopropanol präzipitiert und durch Zentrifugation
10 min bei 10 000 xg gesammelt. Das Pellet wurde in 500 μl Wasser
erneut aufgelöst und
die RNA wurde auf Eis mit 250 μl
8 M LiCl präzipitiert
und durch Zentrifugation 10 min bei 10 000 xg gesammelt. Das Pellet
wurde in 200 μl
Wasser resuspendiert und mit einem gleichen Volumen von Chloroform:Isoamylalkohol
1:1 unter Vortexen extrahiert. Nach der Zentrifugation 2 min bei
10 000 xg wurde die obere wässrige
Phase entfernt und die Nukleinsäuren
wurden bei –20°C durch Zufügen von
20 μl 3
M Natriumacetat und 200 μl
Isopropanol präzipitiert.
Das Pellet wurde mit 1 ml kaltem 70%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und
in 100 μl
Wasser resuspendiert. Der RNA-Gehalt wurde spektrophotometrisch
bei 260 nm bestimmt. Proben, die 1 bis 10 μg RNA enthielten, wurden der
denaturierenden Gelelektrophorese, wie anderswo beschrieben, unterworfen
(Sambrook et al., supra).
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Die
extrahierte RNA wurde auf die Hybond N+-Membran
(Amersham, Cleveland, Ohio) transferiert und mit radioaktiv markierten
Sonden, die aus cDNA-Klonen hergestellt wurden, sondiert. Die Blots
wurden über Nacht
hybridisiert, zweimal bei Raumtemperatur und einmal bei 65°C in 3 × SSC (450
mM Natriumchlorid, 45 mM Natriumcitrat, pH 7,0), enthaltend 0,1%
SDS, gewaschen und auf den Film aufgelegt.
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IDENTIFIKATION
VON CDNA UND GENOMISCHEN KLONEN
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cDNA
und genomische Klone für
F5H wurden mithilfe von Standardverfahren unter Verwendung eines SacII/EcoRI-Fragmentes
von 2,3 kb aus dem geretteten Plasmid (pCC1) (Beispiel 2) als eine
Sonde identifiziert. Der cDNA-Klon pCC30 wurde in der λPRL2-Bibliothek
identifiziert (Newman et al., (1994) supra), freundlicherweise überlassen
von Dr. Thomas Newman (DOE Plant Research Laboratory, Michigan State
University, East Lansing, MI). Eine genomische Cosmid-Bibliothek
von Arabidopsis thaliana (Ecotyp Landsberg erecta), die im binären Cosmid-Vektor
pBIC20 (Beispiel 3) herbeigeführt
wurde (Meyer et al., Science 264, 1452, (1994)) wurde mit dem sich
von pCC30 herleitenden radioaktiv markierten cDNA-Insert durchsucht.
Genomische Inserts in der pBIC20-T-DNA sind durch das Neomycin-Phosphotransferase-Gen
für die
Kanamycin-Selektion unmittelbar benachbart zu der rechten Border-Sequenz
der T-DNA und dem β-Glucuronidase-Gen
für die
histochemische Selektion unmittelbar benachbart zur linken Border
flankiert. Positive Klone wurden durch Restriktionsaufschluss und
die Southern-Analyse im Vergleich zur genomischen DNA von Arabidopsis
charakterisiert.
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PFLANZENTRANSFORMATION
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Die
Transformation von Arabidopsis thaliana wurde mit geringfügiger Modifikation
mittels Vakuum-Infiltration durchgeführt (Bent et al., Science 265,
1856, (1994)). Es wurden, um es kurz zu fassen, 500 ml Kulturen
von transformiertem Agrobacterium, welches das pBIC20-F5H-Cosmid
beherbergte, oder das pGA482-35S-F5H-Konstrukt bis zur stationären Phase
in Luria-Bouillon, enthaltend 10 mg l–1 Rifampicin
und 50 mg l–1 Kanamycin,
gezüchtet.
Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und in 1 l Infiltrationsmedium, enthaltend
2,2 g MS-Salze (Murashige und Skoog, Physiol. Plat. 15, 473, (1962)),
Gamborgs B5-Vitamine (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50, 151, (1968)),
0,5 g MES, 50 g Saccharose, 44 nM Benzylaminopurin und 200 μl Silwet
L-77 (OSI Specialities) bei pH 5,7 resuspendiert. Vorzeitig Samen
bildende Arabidopsis-Pflanzen T0-Generation),
die 5 bis 10 cm hoch waren, wurden in die Bakteriensuspension invertiert
und drei bis fünf
Minuten einem Vakuum (> 500
mm Hg) ausgesetzt. Infiltrierte Pflanzen wurden zur Samenproduktion
unter Standardwachstumsbedingungen zurückgebracht. Transformierte
Sämlinge
(T1) wurden durch Auswahl auf MS-Medien,
enthaltend 50 mg l–1 Kanamycin und 200
mg l–1 Timentin
(SmithKlineBeecham) identifiziert und wurden in den Boden transferiert.
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Die
Transformation von Tabak wurde unter Verwendung des Blatt-Diskverfahrens
von Horsch et al. (Science 227, 1229, (1985)) erlangt.
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NITROBENZEN-OXIDATION
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Für die Bestimmung
der Lignin-Monomer-Zusammensetzung wurde Stengelgewebe in flüssigem Stickstoff
zu einem Pulver zermahlen und mit 20 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer,
pH 7,2, 30 min bei 37°C, gefolgt
von drei Extraktionen mit 80%igem Ethanol bei 80°C extrahiert. Das Gewebe wurde
dann einmal mit Aceton extrahiert und vollkommen getrocknet. Das
Gewebe wurde durch Behandlung mit 1,0 M NaOH 24 Stunden bei 37°C verseift,
dreimal mit Wasser, einmal mit 80%igem Ethanol, einmal mit Aceton
gewaschen und getrocknet. Die Nitrobenzen-Oxidation von Stengelgewebeproben
wurde gemäß einem
modifizierten Protokoll nach Iiyama et al. (J. Sci. Food Agric.
51, 481–491,
(1990) durchgeführt.
Proben aus Lignocellulosematerial (jeweils 5 mg) wurden mit 500 μl 2 M NaOH
und 25 μl
Nitrobenzen gemischt. Dieses Gemisch wurde in einem verschlossenen
Glasröhrchen
3 h bei 160°C
inkubiert. Die Reaktionsprodukte wurden auf Raumtemperatur abgekühlt, und
5 μl einer
20 mg ml–1 Lösung aus
3-Ethoxy-4-hydroxybenzaldehyd in Pyridin wurden als ein interner
Standard zugefügt,
bevor das Gemisch zweimal mit 1 ml Dichlormethan extrahiert wurde.
Die wässrige
Phase wurde mit HCl (pH 2) angesäuert
und zweimal mit 900 μl
Ether extrahiert. Die kombinierten Etherphasen wurden mit wasserfreiem
Natriumsulfat getrocknet und der Ether wurde in einem Stickstoffstrom verdampft.
Der getrocknete Rückstand
wurde in 50 μl
Pyridin resuspendiert, es wurden 10 μl BSA (N,O-Bis-(trimethylsilyl)trifluoracetamid
zugefügt,
und 1 μl
Aliquote der silylierten Produkte wurden unter Verwendung eines Hewlett-Packard
5890 Serie II Gaschromatographen, der mit einer Supelco SPB I-Säule (30
m × 0,75
mm) ausgerüstet
war, analysiert. Die Lignin-Monomer-Zusammensetzung wurde aus den
integrierten Bereichen der Peaks berechnet, die die trimethylsilylierten
Vanillin-Derivate, Syringaldehyd, Vanillinsäure und Syringasäure darstellten.
Die insgesamt für
die Nitrobenzen-Oxidation anfälligen
Guaiacyleinheiten (Vanillin und Vanillinsäure) und Syringyleinheiten
(Syringaldehyd und Syringasäure)
wurde n nach der Bereinigung für
Rückgewinnuungseffizienzen
von jedem der Produkte während
des Extraktionsverfahrens im Vergleich zum internen Standard berechnet.
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BEISPIEL 1
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IDENTIFIKATION DES MIT
T-DNA GETAGGTEN FAH1-ALLELS
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Eine
putativ mit T-DNA getaggte fah1-Mutante wurde in einer Sammlung
von mit T-DNA getaggten Linien (Feldmann et al., Mol. Gen. Genet.
208, 1, (1987)) (Dr. Tim Caspar, DuPont, Wilmington, DE) durch Screening
von adulten Pflanzen unter langwelligem UV-Licht identifiziert.
Es wurde eine rot fluoreszierende Linie (Linie 3590) ausgewählt und
ihre Abkömmlinge
wurden mittels DC auf Sinapoylmalat untersucht. Die Analysen wiesen
darauf hin, dass Linie 3590 kein Sinapoylmalat akkumulierte. Reziproke
Kreuzungen von Linie 3590 zu einer fah1-2-Homozygote, gefolgt von
der Analyse der F1-Generation auf den Sinapoylmalatgehalt wies nach, dass
Linie 3590 ein neues fah1-Allel war, und es wurde als fah1-9 bezeichnet.
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Vorläufige Experimente
deuteten auf eine Cosegregation des Kanamycin-resistenten Phänotyps der mit
T-DNA getaggten Mutante mit dem fah1-Phänotyp hin. Geselbsteter Samen
von 7 Kanamycin-resistenten (fah1-9 × FAH1]
F1-Pflanzen segregiert 1:3 für
Kanamycin-Resistenz (kanempfindlich kanresistent) und 3:1 für Sinapoylmalat-Defizienz (FAH1:fah1).
Von diesen Linien gaben fah1-Pflanzen Anlass zu lediglich den kanresistent, fah1-Abkömmlingen. Zur Bestimmung der
genetischen Distanz zwischen der T-DNA-Insertion und dem FAH1-Locus
wurden mehrere Testkreuzungen zwischen [fah1-9 × FAH1] F1 und einer fah1-2-Homozygoten durchgeführt. Die
Distanz zwischen dem FAH1-Locus und der T-DNA-Insertion wurde mittels Bestimmung der Häufigkeit
bewertet, bei der die FAH1/kanempfindlich-Abkömmlinge
in der Testkreuzung F1 wiedergefunden wurden. In Abwesenheit von
Crossover-Ereignissen wären
die gesamten Kanamycin-resistenten F1-Abkömmlinge nicht in der Lage,
Sinapoylmalat zu akkumulieren und würde folglich unter UV-Licht
rot fluoreszieren. In 682 untersuchten kanresistenten F1-Abkömmlingen
wurden keine Sinapoylmalat-profizienten Pflanzen identifiziert, was
auf eine sehr engmaschige Verknüpfung
zwischen der T-DNA-Insertionsstelle und dem FAH1-Locus hindeutete.
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BEISPIEL 2
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PLASMID-RESCUE
UND c-DNA-KLONIERUNG DES fah1-GENS
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Plasmid-Rescue
wurde unter Verwendung von EcoRI-aufgeschlossener DNA durchgeführt, die
aus homozygoten fah1-9-Pflanzen hergestellt wurde (Behringer et
al., (1992), supra). Fünf μg EcoRI-aufgeschlossene
genomische DNA wurde mit 125 U T4-DNA-Ligase über Nacht bei 14°C in einem
Endvolumen von 1 ml inkubiert. Das Ligationsgemisch wurde um das
ca. 4fache mittels zwei Extraktionen mit gleichen Volumina von 2-Butanol
konzentriert und wurde dann mit Ethanol präzipitiert und in kompetente
DH5-α-Zellen,
wie beschrieben, elektroporiert (Newman et al., (1994), supra).
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DNA
von geretteten Plasmiden wurde mit EcoRI und SalI doppelt aufgeschlossen.
Die aus internen T-DNA-Sequenzen herbeigeführten Plasmide wurden anhand
der Anwesenheit von Triplettbanden bei 3,8, 2,4 und 1,2 kb identifiziert
und verworfen. Ein Plasmid (pCC1), das Anlass zur erwarteten 3,8-kb-Bande plus einer neuen
5,6-kb-Bande gab, wurde als putativ externes Plasmid der rechten
Border identifiziert. Unter Verwendung eines SacII/EcoRI-Fragments
von pCC1, das DNA von Arabidopsis darzustellen schien, wurden putative cDNA-Klone
(pCC30) für
F5H identifiziert. Der putative F5H-Klon trug ein SalI-NotI-Insert
von 1,9 kb, dessen Sequenz bestimmt wurde. Die Blastx-Analyse (Altschul
et al., J. Mol. Biol. 215, 403, (1990)) wies darauf hin, dass diese
cDNA eine Cytochrom-P450-abhängige
Monooxygenase kodiert, was mit früheren Berichten konsistent
ist, dass (i) die fah1-Mutante in F5H defekt ist (Chapple et al.,
supra) und (ii) F5H eine Cytochrom-P450-abhängige Monooxygenase (Grand,
supra) darstellt.
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SOUTHERN-
UND NORTHERN-BLOT-ANALYSE
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Zur
Bestimmung, ob die putative F5H-cDNA tatsächlich das Gen darstellte,
das in der T-DNA getaggten Linie unterbrochen war, wurden die Southern-
und Northern-Analyse zur Charakterisierung der verfügbaren fah1-Mutanten
unter Verwendung der putativen F5H-cDNA eingesetzt.
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In 6 ist
ein Southern-Blot ersichtlich, das die Hybridisierung der F5H-cDNA
an EcoRI-aufgeschlossene genomische DNA vergleicht, die aus dem
Wildtyp (Ecotypen Columbia (Col), Landsberg, erecta (LER) und Wassilewskija
(WS)) und den neun fah1-Allelen, einschließlich des T-DNA getaggten fah1-9-Allels
isoliert wurde. WS stellt den Ecotyp dar, aus dem die T-DNA getaggte
Linie herbeigeführt
wurde.
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Diese
Daten wiesen auf die Anwesenheit eines Polymorphismus von Restriktionsfragmentlänge zwischen
der getaggten Linie und dem Wildtyp hin. Diese Daten deuten auch
auf einen Polymorphismus von Restriktionsfragmentlänge im fah1-8-Allel
hin, der mit schnellen Neutronen herbeigeführt wurde, einem Verfahren,
von dem berichtet wurde, dass es Deletionsmutationen veranlasst.
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Wie
in 6 gezeigt, wird die genomische DNA der fah1l-8-
und fah1-9-Allele (der T-DNA getaggten Linie) in dem der putativen
F5H-cDNA entsprechenden Bereich unterbrochen. Diese Daten deuten
auch darauf hin, dass F5H durch ein einzelnes Gen in Arabidopsis
wie erwartet kodiert wird, wenn man in Betracht zieht, dass die
Mutation in der fah1-Mutante als ein einzelnes Mendelsches Gen segregiert.
Diese Daten stellen den ersten Hinweis bereit, dass die putative
F5H-cDNA dem Gen entspricht, das in den fah1l-Mutanten unterbrochen
ist.
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Pflanzenmaterial,
das für
neun sich unabhängig
herleitende fah1-Allele homozygot war, wurde auf die Reichhaltigkeit
von Transkripts untersucht, die der putativen F5H-cDNA unter Verwendung
der Northern-Blot-Analyse entsprechen. Die Daten sind in 7 ersichtlich.
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Wie
aus den Daten hervorgeht, wurde die putative F5H-mRNA bei ähnlichen
Spiegeln im Blattgewebe von Columbia-, Landsberg erecta- und Wassilewskija-Ecotypen
und in den EMS-induzierten fah1-1, fah1-4 und fah1-5 wie auch dem
durch schnelle Neutronen induzierten fah1-7 dargestellt. Die Reichhaltigkeit
der Transkripte war in Blättern
aus Pflanzen, die für
die fah1-2, fah1-3 und fah1-6 homozygot waren, die alle EMS-induziert
waren, der durch schnelle Neutronen induzieren Mutante fah1-8 und
in der getaggten Linie fah1-9 reduziert. Die mRNA in der fah1-8-Mutante
scheint auch trunkiert zu sein. Diese Daten stellten einen starken
Hinweis bereit, dass der cDNA-Klon, der identifiziert worden war,
durch den FAH1-Locus kodiert ist.
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BEISPIEL 3
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NACHWEIS DER
IDENTITÄT
DER F5H-cDNA DURCH TRANSFORMATION VON MUTANTEN fah1-PFLANZEN MIT
F5H DES WILDTYPS UND WIEDERHERSTELLUNG DER SINAPOYLMALAT-AKKUMULATION
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Zum
Nachweis der Identität
des F5H-Gens auf der funktionellen Ebene wurde die Transformations-kompetente
pBIC20-Cosmidbibliothek (Meyer et al., supra) unter Verwendung der
F5H-DNA der vollen Länge
als eine Sonde auf entsprechende genomische Klone durchsucht. Ein
Klon (pBIC20-F5H), der ein genomisches Insert von 17 kb trägt, das
2,2 kb der Sequenz oberstromig vom putariven F5H-Startcodon und
12,5 kb der Sequenz unterstromig vom Stopcodon des F5H-Gens (2)
enthält,
wurde durch Vakuuminfiltration in die fah1-2-Mutante transformiert.
Dreißig
unabhängige
Infiltrationsexperimente wurden durchgeführt und 167 Kanamycin-resistente
Sämlinge,
die mindestens 3 Transformanten aus jeder Infiltration darstellen,
wurden in den Boden transferiert und wurden in Bezug auf die sich
von Sinapinsäure
herleitende Metaboliten analysiert. Wie anhand der DC (3)
bestimmt wurde, akkumulierten 164 von diesen Pflanzen Sinapoylmalat
in ihrem Blattgewebe. Diese Komplementierungsdaten weisen darauf
hin, dass das Gen, das in der fah1-Mutanten defekt ist, auf dem
binären
Cosmid pBIC20-F5H vorliegt.
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Zur
Delimitierung der DNA-Region auf dem pBIC20-F5H-Cosmid, das für die Komplementierung
des mutanten Phänotyps
verantwortlich ist, wurde ein 2,7-kb-Fragment der F5H-Genomsequenz
unterstromig vom 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaikvirus im binären Plasmid
pGA482 verwendet, und dieses Konstrukt (pGA482-35S-F5H) (2)
wurde in die fah1-2-Mutante transformiert. Die Anwesenheit von Sinapoylmalat
in 109 von 110 der mittels DC oder mittels In-vivo-Fluoreszenz unter
UV-Licht analysierten transgenen Linien zeigte an, dass der fah1-mutante
Phänotyp
komplementiert wurde (3). Diese Daten stellen einen
schlüssigen
Hinweis bereit, dass die F5H-cDNA identifiziert wurde.
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BEISPIEL 4
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DNA-SEQUENZIERUNG
DER F5H-cDNA UND GENOMISCHEN KLONE
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Die
F5H-cDNA und ein HindIII-Xhol-Fragment von 5156 bp des genomischen
pBIC20-F5H-Klons wurden beide an beiden Strängen vollkommen sequenziert
und die Sequenz des F5H-Proteins (SEQ ID NO:2) wurde aus der cDNA-Sequenz
hergeleitet (8). Die Sequenz der F5H-cDNA
ist in SEQ ID NO:1 angegeben. Die Sequenz des genomischen F5H-Klons
von Arabidopsis thaliana ist in SEQ ID NO:3 angegeben.
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BEISPIEL 5
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MODIFIKATION
DER LIGNIN-MONOMER-ZUSAMMENSETZUNG IN F5H ÜBEREXPRIMIERENDEN TRANSGENEN
PFLANZEN
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HERBEIFÜHRUNG VON
TRANSGENEN PFLANZEN, DIE DAS F5H-GEN EKTOPISCH EXPRIMIEREN
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Unter
Verwendung einer Adaptor-basierenden Klonierungsstrategie, wurden
die Regulationssequenzen 5' der
Translationsinitiierungsstelle des F5H-Gens, wie in 2 gezeigt,
durch den starken konstitutiven 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaikvirus
ersetzt (Odell et al., Nature 313, 810–812. (1985)). Das sich ergebende
Konstrukt trägt
2719 bp der F5H-Genomsequenz, die durch den 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaikvirus,
der 50 bp oberstromig vom erschlossenen ATG-Startcodon fusioniert
ist, getrieben werden. Aufgrund dessen treibt der 35S-Promotor des
Blumenkohl-Mosaikvirus die Expression des F5H-Gens durch Verwendung
der Transkriptionsstartstelle des viralen Promotors und des Terminationssignals,
das an der F5H-Genomsequenz vorhanden ist, an. Diese Expressionskassette
für die
ektopische Expression von F5H wurde in die T-DNA des binären Vektors
pGA482 insertiert (An, G. (1987), Binary Ti vectors for plant transformation
and promotor analysis in: Methods in enzymology. Wu, R. Hrsg. Academic
Press, NY 153: 292–305)
und durch Elektroporation in Agrobacterium tumefaciens eingeführt.
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Transgene
Arabidopsis-Pflanzen des Ecotyps Columbia, die für das fah1-2-Allel homozygot
waren (Chapple et al., supra), wurden mit Agrobacterium-Kulturen
transformiert, die das pGA482-35S-F5H-Konstrukt gemäß dem Verfahren
Bent et al. (supra) beherbergen. Transgene Pflanzen der T2- und
T3-Generation wurden durch Auswahl auf Medien, enthaltend Kanamycin,
identifiziert und anschließend
in den Boden transferiert.
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BESTIMMUNG DER LIGNIN-MONOMER-ZUSAMMENSETZUNG
VON STENGELGEWEBE VON ARABIDOPSIS
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Das
Gesamtstengelgewebe wurde von 4 Wochen alten Pflanzen geerntet,
die bei 22°C
unter einer Photoperiode von 16 h/8 h hell/dunkel im Boden gezüchtet wurden.
Die Nitrobenzen-Oxidationsanalyse führte Syringyl-Werte für 9 verschiedene
Transformantenlinien in Mol-% herbei (Tabelle 1), die im Bereich
von 5,06 +/– 0,17
Mol-% bis 28,8 +/– 0,92
Mol-% gegenüber
der Wildtyp-Kontrolle lagen, die einen Wert von 18,4 +/– 0,91 Mol-%
nachwies. Dem fah1-2-Mutantenhintergrund, in dem die transgenen
Linien herbeigeführt
wurden, mangelt vollkommen das Syringyl-Lignin (Tabelle 1). Durch
die geringe Expression des F5H-Transgens in einem genetischen Hintergrund,
dem die endogene F5H-„Message" mangelt, lässt sich
erklären,
wie Linie 88 Syringyl-Lignin-Spiegel aufweisen kann, die niedriger
als der Wildtyp sind.
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Außer Arabidopsis
wurden Tabakpflanzen unter Kontrolle vom 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaikvirus
auf ähnliche
Weise mit dem F5H-Gen transformiert. T2- und T3-positive Transformanten
wurden gescreent und auf Lignin-Modifikation analysiert, und die
Daten sind in Tabelle 2 ersichtlich. Die Nitrobenzen-Oxidationsanalyse
der Mittelrippen der Tabakblätter
führten
Syringyl-Werte in Mol-% für
4 verschiedene Transformantenlinien herbei (Tabelle 2), die gegenüber der
Wildtyp-Kontrolle, die einen Wert von 14,3 +/– 1,09 Mol-% aufwies, im Bereich
von 22,4 +/– 1,53
Mol-% bis 40,0 +/– 1,86
Mol-% lagen.
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Die
Daten in Tabellen 1 und 2 weisen deutlich nach, dass eine Überexpresssion
des F5H-Gens in transgenen Pflanzen zur Modifikation der Lignin-Monomer-Zusammensetzung
führt.
Es wird durchaus erwartet, dass die transformierte Pflanze einen
Syringyl-Lignin-Monomergehalt aufweist, der im Bereich von ca. 0 Mol-%
bis ca. 95 Mol-%, wie im gesamten Pflanzengewebe gemessen, liegt.
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