WO2000060101A1 - Metabolische selektionsmarker für pflanzen - Google Patents

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plant
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Holger Hesse
Rainer Höfgen
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MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)

Definitions

  • the present invention relates to the use of DNA sequences which are able to complement a metabolic defect in a plant as a selection marker in plant cells for the selection of transformed plants. Furthermore, this invention relates to recombinant DNA molecules which contain such DNA sequences, these being operatively linked to regulatory sequences of a promoter active in plants and optionally transcription termination and / or polyadenylation signals. Furthermore, vectors, host cells and kits are described which contain such recombinant DNA molecules, and plant cells and plants transformed with the recombinant DNA molecules. The present invention also relates to methods for producing transgenic plants which can be selected on selective media due to the introduction of the recombinant DNA molecules described above. Furthermore, the present invention relates to transgenic plants, plant cells and tissues which contain the DNA molecule according to the invention or are obtained by the process described above, as well as harvest products and propagation material of the described transgenic plants.
  • Plant protection measures are: (i) herbicide-tolerant plants (Stalker (1988) Science 242, 419), (ii) insect-resistant plants (Vaek (1987) Plant Cell 5, 159-169), (iii) Virus Resistant Plants (Powell (1986) Science 232, 738-743) and (iv) Ozone Resistant Plants (Van Camp (1994) BioTech. 12, 165-168 ).
  • Examples of quality increases are: (i) increasing the shelf life of fruit (Oeller (1991) Science 254, 437-439), (ii) increasing the starch production in potato tubers (Stark (1992) Science 242, 419), (iii) changing the Starch (Visser (1991) Mol. Gen. Genet. 225, 289-296) and lipid composition (Voelker (1992) Science 257, 72-74) and (iv) production of non-plant polymers (Poirer (1992) Science 256, 520-523 ).
  • the basic prerequisite for the generation of transgenic plants is the availability of suitable transformation systems and the presence of selection markers that enable the identification of successfully transformed plant cells.
  • genes are overexpressed that generate resistance to methotrexate or 2-difluoromethylomithine or that allow the use of non-metabolic substrates, for example indole / thryptophane, histinol / histidine or mannose.
  • the present invention is therefore based on the object of making available means and methods which can be used for the production of transgenic plant cells and plants.
  • the present invention relates to a process for the production of transgenic plant cells, plant tissues or plants comprising
  • a metabolic defect is understood to mean a defect caused by naturally or artificially produced mutation in the genome of the plant or plant cell, by which the plant cell or plant is no longer able to add a metabolite essential for it in sufficient quantity synthesize so that it is dependent on the supply of this metabolite or suitable precursors from the outside in order to compensate for or preferably to abolish the phenotype caused by the metabolite deficiency.
  • this is a metabolite that is normally produced by plant cells, i.e. from genetically unmodified plant cells.
  • the term “complement” is understood to mean the ability to compensate for or abolish the aforementioned phenotype caused by the metabolic defect.
  • Examples of “metabolites” in the sense of the present invention include amino acids or their precursors, for example the amino acids methionine and threonine or homocysteine.
  • the “phenotype” is understood to mean the expression of a characteristic which can be read out by means of an obvious observation, biochemical analyzes or, preferably, selective conditions. In the sense of the present invention, the phenotype caused is expressed in a slower growth of the plants up to the death of the plant.
  • the present invention is based on the surprising finding that the genetic complementation of metabolic defects in plants, for example can serve as a selection system for the production of transgenic plants within the amino acid biosynthesis of the aspartate family, by means of expression of homologous or heterologous genes.
  • the metabolic mutants can be obtained by various methods and propagated in vitro using metabolite supplementation. By using this method, other selection markers can be dispensed with, in that the metabolic defect is returned to the wild-type state with simultaneous expression of the new desired property.
  • homologous genes to complement the defects the proportion of foreign DNA in the generated transgenic lines is advantageously reduced.
  • the process according to the invention is explained in the examples with reference to the production and complementation of a methionine auxotrophic potato plant.
  • the gene for the cystathionin beta-lyase (CbL; EC 4.4.1.8), which plays an essential role in the biosynthesis of the amino acid methionine, was isolated by the complementation of the methionine auxotrophic E. coli mutant GUC41.
  • in vivo excision plasmids (pBluescript SK " ), which contain various cDNAs, were isolated in their entirety and established in the mutant.
  • pBluescript SK " which contain various cDNAs
  • the protein derived from the cDNA sequence has a high homology to the derived proteins from E. coli (Belfazia, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 867-871) and Arabidopsis thaliana (Ravanel, Plant Mol. Biol. 29 (1995), 875-882).
  • DNA sequences that can be used to produce metabolic defects in plants or to complement them can be isolated from natural sources, preferably plants, for example by complementing corresponding auxotrophic bacterial or yeast mutants, preferably E. coli and Saccharomyces cerevisae . Examples of such DNA sequences are described in Kim, Plant Mol. Biol. 32 (1996), 1117-1124; Ravanel et al., Biochem. J. 331 (1998), 639-648; Curien et al., FEBS Letters 390 (1996), 85-90; Leggewie et al., Plant Cell 9 (1997), 381-392.
  • Such sequences are known (see, for example, Braun, EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846 850; Sonnewald, Plant J. 1 (1991), 95-106).
  • Preferred signal sequences are the transit peptide from Rubisco (Krebbers et al., Plant Mol. Biol. 11 (1988), 745-759) and signal sequences for targeting in mitochondria (Boutry et al., Nature 328 (1987), 340-342) .
  • the introduction of point mutations is also conceivable at positions in which a change in the amino acid sequence has an influence, for example on the enzyme activity or the regulation of the enzyme.
  • mutants can be produced which have a changed K m value or are no longer subject to the regulatory mechanisms normally present in the cell via allosteric regulation or covalent modification. Furthermore, mutants can be produced which have an altered substrate or product specificity. Furthermore, mutants can be produced which have a changed activity-temperature profile.
  • the DNA molecules or parts of these molecules can be introduced into plasmids which allow mutagenesis or a sequence change by recombination of DNA sequences.
  • base exchanges can be carried out or natural or synthetic sequences can be added.
  • adapters or linkers can be attached to the fragments.
  • Manipulations which provide suitable restriction sites or which remove superfluous DNA or restriction sites can also be used. Where insertions, deletions or substitutions are possible, in vitro mutagenesis, "primer repair", restriction or ligation can be used.
  • Sequence analysis, restriction analysis and other biochemical-molecular biological methods are generally carried out as the analysis method.
  • the degeneration of the genetic code offers the person skilled in the art the possibility, inter alia, of adapting the nucleotide sequence of the DNA sequence to the codon preference of the respective host, preferably plants.
  • the desired DNA sequence can be produced synthetically or obtained naturally or contain a mixture of synthetic and natural DNA components.
  • synthetic DNA sequences are generated with codons that are preferred by plants. These plant-preferred codons can be determined from triplets with the highest protein abundance expressed in most interesting plant species.
  • various DNA fragments can be manipulated to obtain a DNA sequence that reads in the correct direction and is equipped with a correct reading frame. To connect the DNA fragments to one another, adapters or linkers can be attached to the fragments.
  • a generally chimeric gene is introduced into the plant. It consists of a promoter active in the plant, a coding sequence of the enzyme bound to the promoter in the antisense direction, the activity of which has to be reduced (3 'end of the coding sequence at the 3' end of the promoter) and one in the plant functional termination signal for transcription.
  • the generation of metabolic mutants can of course also be carried out by other common techniques such as cosuppression effects and expression of ribozymes, see for example Hans Heldt, Plant Biochemistry, Spektrum, Akad.
  • transformation methods are available here that allow transformation without classic selection markers, ie the selection of transformed cells without the expression of an antibiotic resistance gene or herbicide resistance gene. Examples of this are the system of co-expression (Wakita et al., Genes & Genetic Systems 73 (1998), 219-226), or systems which use new selection markers, such as phosphomannose isomerase (Joersbo et al., Physiol.
  • Intact transgenic plants can be regenerated from the transformed cells, among which those with the desired phenotype (reduction in the activity of the target enzyme) are determined.
  • the aforementioned metabolically defective plants are preferably auxotrophic mutants which depend, for example, on the external supply of (an) amino acid (s) or their precursors.
  • the metabolic defect is present in the amino acid biosynthesis, preferably in the amino acid biosynthesis of the aspartate family.
  • the metabolic defect lies in the biosynthesis of the amino acid cysteine, methionine or threonine.
  • the defect very particularly preferably leads to a reduction or a loss of the activity of the cystathionin beta-lyase or the threonine synthase.
  • the metabolic defect in the plant cells and plants for the method according to the invention can be generated by a mutation, antisense, cosuppression, or a dominant mutant effect.
  • Such techniques are known to the person skilled in the art; see, for example, Negrutiu et al., Mol. Gen. Genet. 199 (1985), 330-337, or the references cited above.
  • the DNA sequences described above also include fragments, derivatives and allelic variants of the DNA sequences described above, which can be used to generate the metabolic defect or to complement it.
  • “Fragments” mean parts of the DNA sequence that are long enough to encode one of the proteins described.
  • the term "derivative" in this context means that the sequences differ from the DNA sequences described above at one or more positions but have a high degree of homology to these sequences.
  • Homology means a sequence identity of at least 40%, in particular an identity of at least 60%, preferably over 80% and particularly preferably over 90%.
  • the deviations from the DNA sequences described in the prior art can arise, for example, from deletion, substitution, insertion and / or recombination.
  • the DNA sequences which are homologous to the sequences described above and which are derivatives of these sequences are generally variations of these sequences which are modifications which have the same biological function. These can be both naturally occurring variations, for example sequences from other organisms, or mutations, wherein these mutations can have occurred naturally or have been introduced by targeted mutagenesis. Furthermore, the variations can be synthetically produced sequences.
  • the allelic variants can be both naturally occurring variants and also synthetically produced variants or those produced by recombinant DNA techniques. The person skilled in the art is of course also aware that the gene used to complement the genetic defect need not necessarily be homologous to or identical to the corresponding defective gene in the plant.
  • a gene product which is able to complement the gene defect for example a protein which, at least as one of its enzymatic activities, has that of the protein which, due to the genetic defect, no longer or not in sufficient quantity or is formed in inactive form.
  • CbL for example, a gene from E. coli is known (maiY, Zdych et al., J. Bacteriol. 177 (1995), 5035-5039), which encodes an enzyme from another metabolic pathway and nevertheless has significant CbL activity and thus can potentially be used to complement the genetic defect.
  • methods are also provided to isolate suitable selection markers that are capable of complementing the genetic defects described above.
  • the proteins encoded by the different variants of the DNA sequences contained in the recombinant DNA molecules preferably have certain common characteristics, such as enzyme activity, molecular weight, immunological reactivity or conformation or physical properties, ie the running behavior in gel electrophoresis, chromatographic behavior, sedimentation coefficient, solubility, spectroscopic properties, stability; pH optimum, temperature optimum.
  • DNA sequence contained in the recombinant DNA molecules according to the invention in plant cells is linked to regulatory sequences which ensure transcription in plant cells.
  • regulatory sequences which ensure transcription in plant cells.
  • These include promoters in particular.
  • any promoter active in plant cells can be used for the expression.
  • the promoter can preferably be selected so that expression takes place constitutively or only in a specific tissue, at a specific time in plant development or at a time determined by external influences.
  • the promoter can be homologous or heterologous to the plant.
  • Useful promoters are e.g. the 35S RNA promoter of the Cauliflower Mosaic Virus and the maize ubiquitin promoter for constitutive expression.
  • Particularly preferred is a promoter that is active during plant transformation, plant regeneration or certain stages of these processes, e.g. B. Cell division specific promoters; see, for example, the meristematic promoter meri-5 (Medford et al., Plant Cell 3 (1991), 359-370).
  • An overview of other possible promoters is e.g. in Ward (1993) Plant Mol. Biol. 22, 361-366.
  • a transcription termination sequence is preferably present, which serves for the correct termination of the transcription and can serve for the addition of a poly-A tail to the transcript, which is assigned a function in stabilizing the transcripts.
  • Such elements e.g. the terminator of the octopine synthase gene from agrobacteria are described in the literature (cf. Gielen, EMBO J. 8 (1989), 23-29) and are interchangeable.
  • the aforementioned DNA sequences come from bacteria or plants.
  • auxotrophic plants can be successfully complemented by the expression of the CbL gene from E. coli. Phenotypic and physiological studies of these transgenic lines showed no difference to the control plants also examined. This method therefore does not lead to any change in the plants, as is desirable when using this technique in biotechnology. An influence on other metabolites can therefore be excluded.
  • the DNA sequence encodes an enzyme, preferably cystathionin beta-lyase or threonine synthase.
  • DNA molecules according to the invention are preferably introduced into plant cells using vectors such as plasmids which ensure stable integration of the introduced DNA into the plant genome.
  • vectors such as plasmids which ensure stable integration of the introduced DNA into the plant genome.
  • the binary vectors BIN 19 and derivatives can be used for the present invention.
  • the vector BIN 19 was described by Bevan (Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711-8721) and is commercially available (Clontech Laboratories, Inc., USA).
  • any other plant transformation vector into which an expression cassette can be integrated and which ensures the integration of the expression cassette into the plant genome is also suitable.
  • cloning vectors which contain a replication signal for E. coli and a marker gene for the selection of transformed bacterial cells.
  • examples of such vectors are pBR322, pUC derivatives, M13mp derivatives, pBluescript derivatives, pACYC184, etc.
  • the desired DNA sequence can be introduced into the vector at a suitable restriction site.
  • the plasmid obtained is used for the transformation of E. coli cells.
  • Transformed E. coli cells are cultivated in a suitable medium, then harvested and lysed.
  • the plasmid is recovered using standard methods. Restriction analyzes and sequence analyzes are generally used as the analysis method for characterizing the plasmid DNA obtained. After each manipulation, the plasmid DNA can be cleaved and resulting DNA fragments can be linked to other DNA sequences.
  • the vector according to the invention contains at least one further recombinant DNA molecule.
  • any information contained in another recombinant DNA molecule can be transferred to plants or plant cells and then selected for the desired information by means of selection on suitable media.
  • the recombinant DNA molecule which contains the additional information does not necessarily have to be present in the vector which carries the selection marker, but can also be co-transformed with it (Lyznik (1989) Plant Mol. Biol. 13, 151-161; Peng (1995) Plant Mol. Biol. 27, 91-104). This option is useful, for example, if no physical coupling of the marker gene and the information to be transmitted is desired. In this case, after selection of the primary transgenic plant, the marker gene and the desired information can segregate independently of one another in subsequent crossings.
  • the further recombinant DNA molecule contains a DNA sequence which encodes a peptide, protein, antisense, sense RNA, viral RNA or ribozyme.
  • Herbers & Sonnewald (1996) TIBTECH 14, 198-205 summarizes some examples of heterologous (over) expression and antisense inhibition with the aim of manipulating metabolic flows in transgenic plants.
  • An example of ribozymes has been published by Feyter (1996) Mol. Gen. Genet. 250, 329-338. By expressing a "hammerhead" ribozyme, the authors succeeded in generating TMV resistance in transgenic tobacco plants.
  • a wide variety of possible uses of transgenic plants which can be generated with the aid of the recombinant DNA molecules and vectors according to the invention are also described in TIPTEC Plant Product & Crop Biotechnology, 13 (1995), 312-397.
  • the vectors according to the invention can have further functional units which bring about a stabilization of the vector in the host organism, such as one bacterial origin of replication or the 2 micron DNA for stabilization in Saccharomyces cerevisiae.
  • "left border” and "right border” sequences of agrobacterial T-DNA can be contained, which enables a stable integration into the genome of plants.
  • Another strategy to generate marker-free transgenic plants is the use of sequence-specific recombinases.
  • two strategies can be used, for example: (i) re-transforming a starting line expressing recombinase and crossing out the recombinase after removal of the selection marker which was associated with the desired gene. (ii) Co-transformation followed by outcrossing.
  • Prerequisites for this recombinase strategy are (i) flanking the selection marker with recognition sequences for the recombinase and (ii) a recombinase which is active in plants and does not use any plant-specific sequences for recombination.
  • Such processes can be found in the prior art by a person skilled in the art, for example RecA (Reiss (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93, 3094-3098), Cre / lox (Bayley (1992) Plant Mol. Biol. 18, 353 -361), FLP / FRT (Lloyd (1994) Mol. Gen. Genet. 242, 653-657), Gin (Maeser (1991) Mol. Gen. Genet. 230, 170-176) and R / RS (Onouchi ( 1991) Nucl. Acids Res. 19, 6373-6378).
  • a variety of techniques are available for introducing DNA into a plant host cell. These techniques include the transformation of plant cells with T-DNA using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes as the transformation agent, the fusion of protoplasts, the injection, the electroporation of DNA, the introduction of DNA using the biolistic method and other possibilities.
  • Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes as the transformation agent
  • the fusion of protoplasts the injection
  • the electroporation of DNA the introduction of DNA using the biolistic method and other possibilities.
  • Simple plasmids such as e.g. pUC derivatives can be used.
  • the presence of a selectable marker gene is necessary.
  • the Ti or Ri plasmid is used for the transformation of the plant cell, at least the right one must be used Limitation, but often the right and left limitation of the Ti and Ri plasmid T-DNA as a flank region with the genes to be introduced.
  • the DNA to be introduced must be cloned into special plasmids, either in an intermediate vector or in a binary vector.
  • the intermediate vectors can be integrated into the Ti or Ri plasmid of the agrobacteria on the basis of sequences which are homologous to sequences in the T-DNA by homologous recombination.
  • Intermediate vectors cannot replicate in agrobacteria. Using a helper plasmid, the intermediate vector can be transferred to Agrobacterium tumefaciens (conjugation).
  • Binary vectors can replicate in E. coli as well as in Agrobacteria. They contain a selection marker gene and a left or polylinker, which are framed by the right and left T-DNA border region. They can be transformed directly into the agrobacteria (Holsters et al., Mol. Gen. Genet. (1978), 181-187).
  • the plasmids used to transform the agrobacteria also contain a selection marker gene, for example the NPT II gene, which allows the selection of transformed bacteria.
  • the agrobacterium serving as the host cell is said to contain a plasmid which carries a vir region. The vir region is necessary for the transfer of the T-DNA into the plant cell. Additional T-DNA may be present.
  • the agrobacterium transformed in this way is used to transform plant cells.
  • T-DNA for the transformation of plant cells has been intensively investigated and is sufficient in EP 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters BV, Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plan Be. 4, 1-46; Ann et al., EMBO J. 4 (1985), 277-287). Binary vectors are already commercially available in some cases.
  • plant explants can be co-cultivated with Agrobacterium tumefaciens or A. rhizogenes.
  • Whole plants can then be regenerated from the infected plant material (for example leaf pieces, stem segments, roots, but also protoplasts or suspension-cultivated plant cells) in a suitable medium, which can contain antibiotics or biocides for the selection of transformed cells.
  • a suitable medium which can contain antibiotics or biocides for the selection of transformed cells.
  • the so plants obtained can then be examined for the presence of the introduced DNA.
  • the introduced DNA is integrated in the genome of the plant cell, it is generally stable there and is also retained in the offspring of the originally transformed cell. It normally contains a selection marker that shows the transformed plant cells resistance to a biocide or an antibiotic such as kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin or phosphinotricin and others. taught.
  • the individually chosen marker should therefore allow the selection of transformed cells from cells that lack the inserted DNA.
  • the metabolically defective plant cells, plant tissue or plants used for the methods according to the invention are preferably cultivated on complementation medium, in particular when the metabolic defect is lethal for the plant.
  • the transformed cells grow within the plant in the usual way (see also McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84).
  • the metabolically defective plants are grown with the addition of methionine.
  • the resulting plant cells, plant tissue and plants can be cultivated on media which do not contain the metabolic product which is missing in the metabolically defective plants or a corresponding intermediate included more.
  • a suitable selection medium can be used directly at the beginning of the cultivation of the transformed transgenic plant cells, plant tissue and plants or in any stage of the regeneration of transgenic plants.
  • the choice of when to use the selective medium may depend, for example, on the choice of promoters which are jointly responsible for the metabolic defect and / or which control the DNA sequence which is able to complement or eliminate the corresponding metabolic defect.
  • Two or more generations should be grown to ensure that the phenotypic trait is stably maintained and inherited. All plant species, in particular cultivated plant species, are suitable as host plants. Cultivated plant species are, for example, sugar beet, potato, tobacco, tomato, rapeseed, wheat and maize, but also other cultivated plant species, in particular also those species which can be used as auxiliary agricultural plants.
  • the present invention thus also relates to transgenic plant cells which contain a recombinant DNA molecule or a vector according to the invention or which have been obtained by the method according to the invention and to transgenic plant cells which originate from plant cells transformed in this way.
  • Such cells can be distinguished from naturally occurring plant cells in that they contain at least one recombinant DNA molecule according to the invention which does not naturally occur in these cells or in that such a molecule is integrated at a location in the genome of the line in which it is natural does not occur, ie in a different genomic environment.
  • the plant cell according to the invention contains at least one further foreign gene.
  • the manipulation of several enzymatic steps is necessary for the possibility of controlling complex metabolic processes, and the possibility of transforming transgenic plants several times is therefore essential.
  • the person skilled in the art can now resort to new markers for the selection of multiply transformed plant cells.
  • transgenic plant cells can be regenerated into whole plants using techniques known to those skilled in the art.
  • the plants obtainable by regeneration of the transgenic plant cells according to the invention are also Subject of the present invention.
  • the invention also relates to
  • transgenic plants can in principle be plants of any plant species, i.e. both monocot and dicot plants. It is preferably useful plants such as wheat, barley, rice, rapeseed, pea, corn, sugar beet, sugar cane or potato.
  • the invention also relates to propagation material and harvest products of the plants according to the invention, for example fruits, seeds, tubers, rhizomes, seedlings, cuttings, etc., the propagation material or the harvest products containing cells according to the invention.
  • the present invention relates to a method for producing selection markers for plants comprising
  • RNA libraries the so-called expression banks. Both eukaryotic and prokaryotic organisms can serve as donors. Starting from RNA, which is overwritten in cDNA (copy-DNA), or from genomic DNA, DNA fragments are cloned into expression vectors. The fragments in these vectors are then under the control of a host-specific promoter which, inter alia, allows the expression of the protein / enzyme sought. Bacteria (eg E. coli) and yeast (eg S. cerevisiae) mutants that serve as a host serve as hosts have a biosynthetic step, for example in amino acid biosynthesis.
  • Bacteria eg E. coli
  • yeast eg S. cerevisiae mutants that serve as a host serve as hosts have a biosynthetic step, for example in amino acid biosynthesis.
  • the metabolic defect preferably relates to a metabolic defect as defined in one of the above embodiments.
  • the microorganism is E. coli.
  • the present invention provides new selection markers for plants.
  • the present invention therefore also relates to selection markers in the form of recombinant DNA molecules
  • Suitable promoters and termination or polyadenylation signals are described in the prior art; see also above.
  • the invention further relates to vectors which contain recombinant DNA molecules according to the invention.
  • vectors which contain recombinant DNA molecules according to the invention.
  • These are preferably plasmids, cosmids, viruses, bacteriophages and other vectors customary in genetic engineering.
  • There is a large one in preparation for the introduction of foreign genes into higher plants Number of cloning vectors available which contain a replication signal for E. coli and a marker gene for the selection of transformed bacterial cells. Examples of such vectors are pBR322, pUC series, M13mp series, pACYC184 etc.
  • the desired sequence can be introduced into the vector at a suitable restriction site.
  • the plasmid obtained is used for the transformation of E. coli cells. Transformed E. coli cells are grown in a suitable medium, then harvested and lysed.
  • the plasmid is recovered. Restriction analyzes, gel electrophoresis and other biochemical-molecular biological methods are generally used as the analysis method for characterizing the plasmid DNA obtained. After each manipulation, the plasmid DNA can be cleaved and DNA fragments obtained can be linked to other DNA sequences. Each plasmid DNA sequence can be cloned into the same or different plasmids.
  • the invention relates to host cells which contain the recombinant DNA molecules or vectors according to the invention transiently or stably.
  • a host cell is understood to mean an organism which is capable of taking up recombinant DNA in vitro and, if appropriate, of expressing the DNA sequence contained in the recombinant DNA molecules according to the invention.
  • the invention relates to plant cells which contain the vector systems or derivatives according to the invention or parts thereof. Because of the inclusion of the vector systems, derivatives or parts of the vector systems according to the invention, these preferably have one of the metabolic defects described above. These plant cells or plants regenerated therefrom can then in turn be used in one of the methods according to the invention described above.
  • the cells according to the invention are preferably characterized in that the introduced recombinant DNA molecule according to the invention is either heterologous with respect to the transformed cell, ie does not naturally occur in these cells, or is located at a different location in the genome than the corresponding naturally occurring sequence.
  • kits which contain a recombinant DNA molecule or a vector according to the invention and, if appropriate, a suitable selection medium for the plants described above.
  • the DNA molecules and vectors described above can be packaged in containers in the kit according to the invention, for example in vessels, optionally in buffers and / or solutions.
  • the kits according to the invention can be used in a variety of ways. Exemplary areas of application such as breeding have been given above.
  • the kits themselves are preferably produced using standard processes.
  • the present invention provides recombinant DNA molecules and vectors which act as selection markers in plant cells for the selection of transformed plant cells as well as transgenic plants, plant cells and / or tissues derived therefrom.
  • the present invention thus also relates to the use of a recombinant DNA molecule according to the invention, a vector according to the invention or the selection markers produced according to the invention for producing transgenic plants, plant cells and / or tissues and their use as selectable markers in plant cell and tissue culture and / or plant breeding .
  • the vector pBluescript SK- (Stratagene) was used for cloning in E. coli.
  • the gene constructions were cloned into the binary vectors BIN 19 (Bevan, Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711-8720). Unless otherwise noted, the techniques described in Sambrook, 1989 or Ausubel et al., Eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, USA were used.
  • the E. coli strain XL-1 Blue (Stratagene) was used for the plasmid vectors mentioned under 1. and the auxotrophic E. coli strain GUC41 (Gutermann, J. Bact. 114 (1973), 1225-1230) was used for complementation .
  • a cDNA bank of potato leaves was used to complement the E. coli mutant.
  • the cDNA library was cloned in a phage vector ( ⁇ ZAP II, Stratagene, USA).
  • the phage vector contains the plasmid Bluescript SK " (Stratagene, USA) integrated, into which the cDNA is cloned. With the help of a helper phage, the plasmid was cut out and used for the transformation.
  • the bacteria were complemented on a minimal medium (M9 Medium) (Sambrook et al., 1989) and incubated for three days at 37 ° C.
  • the DNA was transferred by direct transformation using the method of Höfgen & Willmitzer (Nucl. Acids Res. 7 (1989), 1513-1523) isolated and analyzed by gel electrophoresis after suitable restriction cleavage.
  • the leaves were then used for callus induction on MS medium with 1.6% glucose, 5 mg / l naphthylacetic acid, 0.2 mg / l benzylaminopurine, 250 mg / l claforan or 125 mg / l b-bactyl, 50 mg / l Kanamycin or 1 mg 1 mg / l hygromycin B, and 0.8% Bacto Agar. After incubation at 25 ° C.
  • the leaves were used for shoot expression on MS medium with 1.6% giucose, 1.4 mg / l zeatin ribose, 20 mg / l naphthylacetic acid, 20 mg / l giberellic acid, 250 mg / l Claforan or 125 mg / l b-bactyl, 50 mg / l kanamycin or 3 mg / l hygromycin B and 0.8% Bacto agar.
  • the radioactive labeling of DNA fragments was carried out with the aid of a DNA random primer labeling kit from Boehringer (Germany) according to the manufacturer's instructions.
  • Complementation medium of the bacteria M9 medium (Sambrook et al.,
  • Supplementation medium for antisense plants MS medium (Murashige, MS medium (Murashige, MS medium (Murashige, MS medium (Murashige, MS medium (Murashige, MS medium (Murashige, MS medium (Murashige, MS medium (Murashige, MS medium (Murashige, MS medium (Murashige, MS medium (Murashige, MS medium (Murashige, MS medium (Murashige,
  • Genomic plant DNA was isolated according to Rogers & Bendich (Plant Mol. Biol. 5 (1985), 69-76). With the help of "Southern Blof" analyzes, 10-30 ⁇ g of DNA were examined after suitable restriction cleavage of the introductory DNA sequences.
  • the gene for the cystathionin beta-lyase was isolated by the complementation of the methionine auxotrophic E. coli mutant GUC41.
  • in vivo excision plasmids (pBluescript SK " ), which contain various cDNAs, were isolated in their entirety and established in the E. coli mutant. Initially, only the resistance resulting from the plasmid introduced was established selected and in a second run for the auxotrophy of the mutant on a suitable selection medium (M9 without methionine). Analysis of the colonies resulting from this screening yielded a uniform image with cDNA fragments of a length.
  • N. plumbaginifolia plants were grown in tissue culture on 2MS medium (Murashige and Skoog, Plant Physiol. 15 (1962), 573-497) with 0.3 mM methionine (Negrutiu et al., Int. J. Dev. Biol. 36 (1992 ), 73-84) and Casein hydrolyzate (200 mg / l) supplemented. The plants were illuminated for 16 hours a day.
  • the E. coli metC gene was isolated by means of PCR from genomic DNA from E. coli K12 (Laber et al., FEBS Letter 379 (1996), 94-96) with primers which contain a BamHI site.
  • the amplified DNA fragment with a length of 1187 bp was digested with BamHI and ligated into the BamHI site of the pBinAR vector (Höfgen and Willmitzer, Plant Sei. 66 (1990), 221-230).
  • the binary vector contains the CaMV 35S promoter and the OCS terminator, as well as the nptll gene for a kanamycin selection of the transformed plants.
  • the transit peptide of the small subunit of the Spinach Rubisco was fused with the open reading frame of the CbL.
  • the resulting plasmid was called pEc-TP-metC.
  • Leaf pieces of the N. plumbaginifolia mutant were cut using the Agrobacterium tumefaciens strain GV2260 (Deblaere et al., Nucl. Acids. Res. 13 (1985), 4777-4788) according to a protocol by Rosahl et al. (EMBO J. 6 (1987), 1155-1159).
  • the kanamycin concentration was 50 ⁇ g / ml.
  • Methionine was adjusted to 0.3 mM until the plants were examined for metC expression.
  • N. plumbaginifolia genomic DNA was obtained by the method of Dellaporta et al. (Plant Mol. Biol. Reporter 1 (1983), 19-21). The Southern blot was carried out with 10 ⁇ g DNA per restriction digest. Positively charged nylon membranes were purchased from Boehringer. Total RNA was determined using a modified protocol according to Rerie et al. (Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 148-157) isolated from two g of fresh leaf material. For the Northern blots, 10 ⁇ g RNA were applied per lane. An RNA ladder (Gibco BRL) was used as a marker.
  • RNA gels Uniform loading of the RNA gels was checked after transfer to the membrane by staining with methylene blue (Brown and Mackey, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley and Sons, USA (1995), 4.9.1-4.9.16 ).
  • the pellet was resuspended in 1 ml buffer D (50 mM KHPO 4 , pH 7.5, 1 mM EDTA, 20% glycerol, 1 mM DTT).
  • the protein fraction was desalted using a Sephadex G-25 column, which had previously been equilibrated with buffer D. Cystathionin beta-lyase activity co-elutes with the dark green fraction. The fractions were collected and stored at -20 ° C until used. The protein content was determined using the Bradford method (Anal. Biochem. 72 (1976), 248-254) using the BIO-Rad protein assay with bovine serum as the standard.
  • the 200 ⁇ l reaction mix consists of 60 ⁇ l desalted protein extract, 200 mM Tris buffer, pH 8.6, 5 mM cystathionin. After an hour of incubation at 37 ° C, the reaction was stopped by adding 120 ul TCA. The denatured proteins were pelleted by centrifugation at 13,000 rpm for 10 minutes.
  • the keto acid content in the supernatant was determined after adding 80 ⁇ l dinitrophenylhydrazone (0.05% in HCl) and incubating for 10 minutes at room temperature. After adding 800 ⁇ l of 0.4 N NaOH and a further 30 min incubation, the absorption was then measured at 505 nm. The pyruvate concentration was determined using a pyruvate calibration line for the concentration range between 0 and 800 ⁇ M. CbL activity is given in pmol pyruvate per min and mg protein.
  • Protein samples were separated in a vertical small gel according to Laemmli (Nature 227 (1970), 680-685) in native 7.5% Acryiamid PAGE gels at 4 ° C. After electrophoresis, the gel was washed twice in 10 mM Tris / HCl, pH 8.6 and then at 37 ° C. with a reaction mixture consisting of 10 mM Tris / HCl, pH 8.6, 5 mM cystathionin, 0.8% (w / v) tetraphenylborate (TPB). The ammonium released during the reaction forms an insoluble precipitate with TPB that can be easily detected on a dark background (Turner, Ph.D. Thesis, University of Lancaster, UK (1994)). Controls without cystathionin were included. , Free amino acid extraction
  • N. plumbaginifolia mutant With the aim of restoring the autotrophy of the met " (10.1 / 9) N. plumbaginifolia mutant, a chimeric gene consisting of the coding region of the metC gene and the transit peptide of the small subunit of Rubisco was constructed and cloned into a binary vector.
  • Agrobacteria- mediated gene transfer in N. plumbaginifolia mutant 10.1 / 9 with the construct led to callus development and shoot formation on 2MS medium without addition of methionine in the presence of kanamycin In contrast to this, only shoots of the untransformed mutant could be regenerated if methionine was added to the culture medium even under these conditions.
  • Five Primary transformants labeled EcCbL 1-5 showed a normal phenotype and were selected for further analysis.
  • EcCbL 1-5 plants are similar in phenotype to the wild type of N. plumbaginifolia. They also showed the same fertility and semen formation as that
  • Enzyme activity were two lines (EcCbL 1 and 4) with approximately the same
  • the size of the signals obtained correspond to the calculated sizes of the corresponding restriction sites in the T-DNA, the BamHI and Hindill bands differing by about 0.3 kb due to the termination signal.
  • the EcoRI digestion made it possible to determine one copy for EcCbL 1 and two copies for EcCbL 4.

Abstract

Beschrieben wird die Verwendung von DNA-Sequenzen, die in der Lage sind, einen Stoffwechseldefekt in einer Pflanze zu komplementieren, als Selektionsmarker in Pflanzenzellen zur Selektion transformierter Pflanzen. Weiterhin werden rekombinante DNA-Moleküle bereitgestellt, die derartige DNA-Sequenzen enthalten, wobei diese mit regulatorischen Sequenzen eines im Pflanzen aktiven Promotors und gegebenenfalls Transkriptions-Terminations- und/oder Polyadenylierungssignalen operativ verbunden sind. Ferner werden Vektoren, Wirtszellen und Kits beschrieben, die derartige rekombinante DNA-Moleküle enthalten, sowie mit den rekombinanten DNA-Molekülen transformierte Pflanzenzellen und Pflanzen. Es werden ebenfalls Verfahren bereitgestellt zur Herstellung transgener Pflanzen, die aufgrund der Einführung der oben beschriebenen rekombinanten DNA-Moleküle auf selektiven Medien selektioniert werden können. Ferner werden transgene Pflanzen, Pflanzenzellen und Gewebe beschrieben, die das erfindungsgemässe DNA-Molekül enthalten oder durch das vorstehend beschriebene Verfahren erhalten werden, sowie Ernteprodukte und Vermehrungsmaterial der beschriebenen transgenen Pflanzen.

Description

METABOLISCHE SELEKTIONSMARKER FÜR PFLANZEN
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von DNA-Sequenzen, die in der Lage sind einen Stoffwechseldefekt in einer Pflanze zu komplementieren, als Selektionsmarker in Pflanzenzellen zur Selektion transformierter Pflanzen. Weiterhin betrifft diese Erfindung rekombinante DNA-Moleküle, die derartige DNA-Sequenzen enthalten, wobei diese mit regulatorischen Sequenzen eines in Pflanzen aktiven Promotors und gegebenenfalls Transkriptions-Terminations und/oder Polyadenylierungssignalen operativ verbunden sind. Ferner werden Vektoren, Wirtszellen und Kits beschrieben, die derartige rekombinante DNA-Moleküle enthalten, sowie mit den rekombinanten DNA-Molekülen transformierte Pflanzenzellen und Pflanzen. Die vorliegenden Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, die aufgrund der Einführung der oben beschriebenen rekombinanten DNA-Moleküle auf selektiven Medien selektioniert werden können. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung transgene Pflanzen, Pflanzenzellen und Gewebe, die das erfindungsgemäße DNA-Molekül enthalten oder durch das vorstehend beschriebene Verfahren erhalten werden, sowie Ernteprodukte und Vermehrungsmaterial der beschriebenen transgenen Pflanzen.
Nachfolgend werden Dokumente aus dem Stand der Technik zitiert, deren Offenbarungsgehalt hiermit durch Bezugnahme in dieser Anmeldung enthalten ist.
Mittels gentechnischer Verfahren ist es möglich, gezielt Fremdgene in das pflanzliche Genom zu übertragen. Dieser Prozeß- wird als Transformation und die resultierenden Pflanzen als transgen bezeichnet. Die vomehmlichen Ziele sind zum einen der Pflanzenschutz und zum anderen eine Qualitätssteigerung der Ernteprodukte. Beispiele für Pflanzenschutzmaßnahmen sind: (i) Herbizidtolerante Pflanzen (Stalker (1988) Science 242, 419), (ii) Insektenresistente Pflanzen (Vaek (1987) Plant Cell 5, 159-169), (iii) Virusresistente Pflanzen (Powell (1986) Science 232, 738-743) und (iv) Ozon-resistente Pflanzen (Van Camp (1994) BioTech. 12, 165-168). Beispiele für Qualitätssteigerungen sind: (i) Erhöhung der Haltbarkeit von Früchten (Oeller (1991 ) Science 254, 437-439), (ii) Erhöhung der Stärkeproduktion in Kartoffelknollen (Stark (1992) Science 242, 419), (iii) Veränderung der Stärke (Visser (1991 ) Mol. Gen. Genet. 225, 289-296) und Lipidzusammensetzung (Voelker (1992) Science 257, 72-74) und (iv) Produktion pflanzenfremder Polymere (Poirer (1992) Science 256, 520-523). Grundvoraussetzung für die Erzeugung transgener Pflanzen ist die Verfügbarkeit geeigneter Transformationssysteme und das Vorhandensein von Selektionsmarkem, die die Identifizierung erfolgreich transformierter Pflanzenzellen ermöglichen.
Die Entwicklung neuer Selektionsmarker gewinnt durch den stärker werdenden Einsatz von Pflanzen in der Biotechnologie immer mehr an Bedeutung. Bislang wurden vornehmlich Antibiotika- oder Herbizidresistenzen, beispielsweise Kanamycin, Hygromycin oder BASTA, zur Selektion transgener Pflanzen eingesetzt, die je nach Pflanzenart, nicht immer effektiv sind und häufig die Pflanzenregeneration negativ beeinflussen. Darüber hinaus ist der Einsatz von Genen, die Antibiotikaresistenzen vermitteln, im Lebensmittelbereich unerwünscht. Desweiteren ist zur Steuerung komplexer Stoffwechselprozesse die Manipulation mehrerer enzymatischer Schritte notwendig. Als weitere Selektionsmarker werden Gene überexprimiert, die Resistenzen gegen Methotrexat bzw. 2-Difluoromethylomithin erzeugen oder die Verwendung stoffwechselfremder Substrate, beispielsweise Indol/Thryptophan, Histinol/Histidin oder Mannose, zulassen.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Mittel und Verfahren zur Verfügung zu stellen, die zur Herstellung transgener Pflanzenzellen und Pflanzen genutzt werden können.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst. Somit betrifft die vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von trangenen Pflanzenzellen, Pflanzengeweben oder Pflanzen umfassend
(a) Transformation der Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzen, die einen Stoffwechseldefekt aufweisen, mit einem DNA-Molekül, das eine DNA-Sequenz enthält die in der Lage ist den Stoffwechseldefekt zu komplementieren oder aufzuheben;
(b) Selektion der transformierten Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzen auf geeignetem Selektionsmedium.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem Stoffwechseldefekt ein durch natürlich oder künstlich erzeugte Mutation im Genom der Pflanze oder Pflanzenzelle hervorgerufener Defekt verstanden, durch den die Pflanzenzelle oder Pflanze nicht mehr in der Lage ist, einen für sie essentiellen Metaboliten in ausreichender Menge selbst zu synthetisieren, so daß sie auf die Zuführung dieses Metaboliten oder geeigneter Vorstufen von außen angewiesen ist, um den durch den Metabolitenmangel verursachten Phänotyp zu kompensieren oder vorzugsweise aufzuheben. Dabei handelt es sich insbesondere um einen Metaboliten, der normalerweise von pflanzlichen Zellen hergestellt wird, d.h. von genetisch nicht veränderten Pflanzenzellen. Unter dem Begriff "komplementieren" wird in der vorliegenden Erfindung die Fähigkeit verstanden, den vorgenannten durch den Stoffwechseldefekt verursachten Phänotyp zu kompensieren oder aufzuheben.
Beispiele für "Metabolite" im Sinne der vorliegenden Erfindung umfassen Aminosäuren bzw. ihre Vorstufen bspw. die Aminosäuren Methionin und Threonin bzw. Homocystein. Unter "Phänotyp" wird die Ausprägung eines Merkmals verstanden, das mittels augenscheinlicher Betrachtung, biochemischer Analysen oder vorzugsweise selektiven Bedingungen ausgelesen werden kann. Im Sinne der vorliegenden Erfindung äußert sich der verursachte Phänotyp in einem verlangsamten Wachstum der Pflanzen bis hin zum Absterben der Pflanze.
Die vorliegende Erfindung basiert auf dem überraschenden Befund, daß die genetische Komplementation von Stoffwechseldefekten in Pflanzen, beispielsweise innerhalb der Aminosäurebiosynthese der Aspartatfamilie, mittels Expression homologer bzw. heterologer Gene als Selektionssystem für die Herstellung transgener Pflanzen dienen kann. Die Stoffwechsel mutanten können durch verschiedene Verfahren erlangt und mittels Metabolitensupplementation in vitro propagiert werden. Durch Anwendung dieses Verfahrens kann auf andere Selektionsmarker verzichtet werden, indem der Stoffwechseldefekt zum Wildtypzustand zurückgeführt wird bei gleichzeitiger Expression der neuen gewünschten Eigenschaft. Unter Verwendung homologer Gene zur Komplementation der Defekte wird vorteilhafterweise der Anteil an Fremd-DNA in den erzeugten transgenen Linien reduziert. Das erfindungsgemäße Verfahren wird in den Beispielen anhand der Erzeugung und Komplementation einer Methionin-auxotrophen Kartoffelpflanze erläutert. Das Gen für die Cystathionin beta-Lyase (CbL; EC 4.4.1.8), die eine essentielle Rolle in der Biosynthese der Aminosäure Methionin spielt, wurde durch die Komplementation der Methionin-auxotrophen E. coli-Mutante GUC41 isoliert. Ausgehend von einer λZAPII cDNA-Bank von Kartoffelblättern wurden mittels in vivo Excision Plasmide (pBluescript SK"), die verschiedene cDNAs enthalten, in ihrer Gesamtheit isoliert und in der Mutante etabliert. Zunächst wurde lediglich auf die vom eingebrachten Plasmid ausgehende Resistenz selektiert und in einem zweiten Durchgang auf die Auxotrophie der Mutante auf einem geeigneten Selektionsmedium. Die Analyse der aus dieser Durchmusterung hervorgegangenen Kolonien ergab ein einheitliches Bild mit cDNA-Fragmenten einer Größe. Das von der cDNA-Sequenz abgeleitete Protein weist eine hohe Homologie zu den abgeleiteten Proteinen aus E. coli (Belfazia, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83 (1986), 867-871 ) und Arabidopsis thaliana (Ravanel, Plant Mol. Biol. 29 (1995), 875-882) auf. Durch das Einbringen der cDNA für Cystathionin beta-Lyase in inverser Orientierung bezüglich des Promotors konnten Kartoffelpflanzen regeneriert werden, die auf Komplementationsmedium keine Veränderung zum Wildtyp aufweisen. Werden die transgenen Linien jedoch in Töpfen ins Gewächshaus gebracht, ist ein breit gefächertes Phänotypenspektrum sichtbar. In der Regel findet man in Anhängigkeit vom Grad des Antisense-Effektes eine Retardierung des Wachstums bis zum Verlust der Pflanze; siehe auch Beispiel 1. Der bei den Antisensepflanzen von Anwendungsbeispiel 1 beobachtete Phänotyp konnte durch Supplementation (gießen bzw. sprühen mit Methionin-haltigem Wasser) zum Wildtyp revertiert werden. In einem ähnlichen Experiment konnte durch Expression des CbL Gens aus E. coli der genetische Defekt einer Tabak-Mutante, die den gleichen Phänotyp aufweist wie die Antisensepflanzen, erfolgreich komplementiert werden (Beispiel 2). Für andere toxische Verbindungen, die als Selektionsmarker in der Pflanzentransformation eingesetzt werden, sind vielfältige Wirkungen auf den Metabolismus der Pflanze beschrieben. So führt z. B. die Zugabe von manchen Antibiotika oftmals zur Regeneration von transgenen Pflanzen, die physiologische und morphologische Veränderungen gegenüber dem Phänotyp des Wildtyps aufweisen und/oder steril sind. Hingegen werden bei Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens in Verbindung mit der Selektion auf geeigneten Kompiementationsmedien phänotypisch normale und fertile transgene Pflanzen regeneriert.
DNA-Sequenzen, die zur Erzeugung von Stoffwechseldefekten in Pflanzen genutzt werden können, bzw. zu deren Komplementation, können aus natürlichen Quellen isoliert werden, vorzugsweise Pflanzen, beispielsweise durch Komplementation von entsprechenden auxotrophen Bakterien- oder Hefemutanten, vorzugsweise, E. coli und Saccharomyces cerevisae. Beispiele solcher DNA-Sequenzen sind beschrieben in Kim, Plant Mol. Biol. 32 (1996), 1117-1124; Ravanel et al., Biochem. J. 331 (1998), 639-648; Curien et al., FEBS Letters 390 (1996), 85-90; Leggewie et al., Plant Cell 9 (1997), 381-392.
Mittels gängiger molekularbiologischer Techniken ist es möglich (siehe z.B. Sambrook, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), verschiedenartige Mutationen in die vorgenannten DNA-Sequenzen einzuführen, wodurch es zur Synthese von RNA und gegebenenfalls Proteinen mit eventuell veränderten biologischen Eigenschaften kommt. Hierbei ist zum einen die Erzeugung von Deletionsmutanten möglich, bei denen durch fortschreitende Deletionen vom 5'- oder vom 3'- Ende der codierenden DNA-Sequenz, die Synthese entsprechend verkürzter Proteine erreicht werden kann. Ferner ist es möglich, gezielt Enzyme herzustellen, die aufgrund der Addition entsprechender Signalsequenzen in bestimmten Kompartimenten der Pflanzenzelle lokalisiert sind. Derartige Sequenzen sind bekannt (siehe beispielsweise Braun, EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85 (1988), 846 850; Sonnewald, Plant J. 1 (1991), 95-106). Bevorzugte Signalseqenzen sind das Transitpeptid von Rubisco (Krebbers et al., Plant Mol. Biol. 11 (1988), 745-759) und Signalsequenzen für das Targeting in Mitochondrien (Boutry et al., Nature 328 (1987), 340-342). Andererseits ist auch die Einführung von Punktmutationen denkbar an Positionen, bei denen eine Veränderung der Aminosäuresequenz einen Einfluß beispielsweise auf die Enzymaktivität oder die Regulierung des Enzyms hat. Auf diese Weise können z.B. Mutanten hergestellt werden, die einen veränderten Km-Wert besitzen oder nicht mehr den normalerweise in der Zelle vorliegenden Regulationsmechanismen über allosterische Regulation oder kovalente Modifizierung unterliegen. Desweiteren können Mutanten hergestellt werden, die eine veränderte Substrat- oder Produktspezifität aufweisen. Weiterhin können Mutanten hergestellt werden, die ein verändertes Aktivitäts-Temperatur-Profil aufweisen.
Für die gentechnische Manipulation in prokaryontischen Zellen können die DNA-Moleküle oder Teile dieser Moleküle in Plasmide eingebracht werden, die eine Mutagenese oder eine Sequenzveränderung durch Rekombination von DNA-Sequenzen erlauben. Mit Hilfe von Standardverfahren (vgl. Sambrook, 1989, Molecular Cloning: A laboratory manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) können Basenaustausche vorgenommen oder natürliche oder synthetische Sequenzen hinzugefügt werden. Für die Verbindung der DNA-Fragmente untereinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden. Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen zur Verfügung stellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primer repair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Als Analysemethode werden im allgemeinen eine Sequenzanalyse, eine Restriktionsanalyse und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden durchgeführt. Die Degeneration des genetischen Codes bietet dem Fachmann u.a. die Möglichkeit, die Nucleotidsequenz der DNA-Sequenz an die Codon-Präferenz des jeweiligen Wirts, vorzugsweise Pflanzen, anzupassen.
Die gewünschte DNA-Sequenz kann synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten. Im allgemeinen werden synthetische DNA-Sequenzen mit Codons erzeugt, die von Pflanzen bevorzugt werden. Diese von Pflanzen bevorzugten Codons können aus Tripletts mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert werden. Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine DNA-Sequenz zu erhalten, die in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Verfahren zur Verringerung der Aktivität bzw. der Menge eines bestimmten Enzyms, die zur Erzeugung von Stoffwechseldefekten in Pflanzen genutzt werden können, sind gängiger Stand der Technik. Hierzu wird ein in der Regel chimäres Gen in die Pflanze eingeführt. Es besteht aus einem in der Pflanze aktiven Promotor, einer in antisense-Richtung an den Promotor gebundenen codierenden Sequenz des Enzyms, dessen Aktivität zu verringern ist (3'-Ende der codierenden Sequenz am 3'-Ende des Promotors) und einem in der Pflanze funktionalen Terminationssignal für die Transkription. Die Erzeugung von Stoffwechselmutanten kann natürlich auch durch andere gängige Techniken wie Cosuppressionseffekten und Expression von Ribozymen erfolgen, siehe beispielsweise Hans Heldt, Pflanzenbiochemie, Spektrum, Akad. Verl., 1996; Benjamin Lewin, Molekularbiologie der Gene, Akad. Verl., 1998; William Dashek, Methods in plant biochemistry and molecular biology, CRC Press, 1997. Zur Einführung derartiger Gene in Pflanzenzellen stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung. Insbesondere bieten sich hier Transformationsmethoden an, die eine Transformation ohne klassische Selektionsmarker erlauben, d.h. die Selektion transformierter Zellen ohne die Expression eines Antibiotikaresistenzgens oder Herbizidresistenzgens. Beispiele hierfür sind das System der Co-Expression (Wakita et al., Genes & Genetic Systems 73 (1998), 219-226), oder Systeme, die neue Selektionsmarker, wie z.B. Phosphomannose-Isomerase (Joersbo et al., Physiol. Plant 105 (1999), 109-115) oder Isopentenyltransferase (Kunkel et al., Nature Biotech. 17 (1999), 916-919) verwenden. Aus den transformierten Zellen können intakte transgene Pflanzen regeneriert werden, unter denen solche mit dem gewünschten Phänotyp (Verringerung der Aktivität des Zielenzyms) ermittelt werden. Vorzugsweise handelt es sich bei den vorgenannten stoffwechseldefekten Pflanzen um auxotrophe Mutanten, die beispielsweise auf die äußere Zufuhr von (einer) Aminosäure(n) oder deren Vorstufen angewiesen sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt der Stoffwechseldefekt innerhalb der Aminosäurebiosynthese vor, vorzugsweise in der Aminosäurebiosynthese der Aspartatfamilie.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt der Stoffwechseldefekt in der Biosynthese der Aminosäure Cystein, Methionin oder Threonin. Ganz besonders bevorzugt führt der Defekt zu einer Reduzierung oder zu einem Verlust der Aktivität der Cystathionin beta-Lyase oder der Threoninsynthase.
Im allgemeinen kann der Stoffwechseldefekt in den Pflanzenzellen und Pflanzen für das erfindungsgemäße Verfahren durch eine Mutation, Antisense, Cosuppression, oder einen dominanten Mutanten Effekt erzeugt werden. Derartige Techniken sind dem Fachmann bekannt; siehe beispielsweise Negrutiu et al., Mol. Gen. Genet. 199 (1985), 330-337, oder die oben angegebenen Literaturstellen.
Die oben beschriebenen DNA-Sequenzen umfassen auch Fragmente, Derivate und allelische Varianten der oben beschriebenen DNA-Sequenzen, die zur Erzeugung des Stoffwechseldefekt oder dessen Komplementation eingesetzt werden können. Unter "Fragmenten" werden dabei Teile der DNA-Sequenz verstanden, die lang genug sind, um eines der beschriebenen Proteine zu codieren. Der Ausdruck "Derivat" bedeutet in diesem Zusammenhang, daß die Sequenzen sich von den oben beschriebenen DNA-Sequenzen an einer oder mehreren Positionen unterscheiden aber einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufweisen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentität von mindestens 40 %, insbesondere eine Identität von mindestens 60 %, vorzugsweise über 80 % und besonders bevorzugt über 90 %. Die Abweichungen zu den im Stand der Technik beschriebenen DNA-Sequenzen können dabei beispielsweise durch Deletion, Substitution, Insertion und/oder Rekombination entstanden sein. Bei den DNA-Sequenzen, die homolog zu den oben beschriebenen Sequenzen sind und Derivate dieser Sequenzen darstellen, handelt es sich in der Regel um Variationen dieser Sequenzen, die Modifikationen darstellen, die dieselbe biologische Funktion ausüben. Es kann sich dabei sowohl um natürlicherweise auftretende Variationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus anderen Organismen, oder um Mutationen, wobei diese Mutationen auf natürliche Weise aufgetreten sein können oder durch gezielte Mutagenese eingeführt wurden. Ferner kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. Bei den allelischen Varianten kann es sich sowohl um natürlich auftretende Varianten handeln, als auch um synthetisch hergestellte oder durch rekombinante DNA-Techniken erzeugte Varianten. Dem Fachmann ist natürlich auch bekannt, daß das zur Komplementation des genetischen Defekts verwendete Gen nicht unbedingt homolog zu oder identisch mit dem entsprechenden defekten Gen in der Pflanze sein muß. Es muß lediglich ein Genprodukt codieren und exprimieren das in der Lage ist den Gendefekt zu komplementieren, beispielsweise ein Protein, das zumindest als eine seiner enzymatischen Aktivitäten diejenige(n) des Proteins aufweist, das durch den genetischen Defekt nicht mehr oder nicht in genügender Menge oder in inaktiver Form gebildet wird. Mit CbL ist beispielsweise ein Gen aus E. coli bekannt (maiY, Zdych et al., J. Bacteriol. 177 (1995), 5035-5039), das ein Enzym aus einem anderen Stoffwechselweg codiert und trotzdem signifikante CbL- Aktivität aufweist und somit potentiell zur Komplementation des genetischen Defekes eingesetzt werden kann. Wie weiter in der vorliegenden Anmeldung beschrieben, werden auch Verfahren bereitgestellt, um geeignete Seletionsmarker zu isolieren, die in der Lage sind, die oben beschriebenen genetischen Defekte zu komplementieren.
Die von den verschiedenen Varianten der in den rekombinanten DNA-Molekülen enthaltenen DNA-Sequenzen codierten Proteine, weisen vorzugsweise bestimmte gemeinsame Charakteristika auf, wie Enzymaktivität, Molekulargewicht, immunologische Reaktivität oder Konformation oder physikalische Eigenschaften, ie das Laufverhalten in Gelelektrophoresen, chromatographisches Verhalten, Sedimentationskoeffizienten, Löslichkeit, spektroskopische Eigenschaften, Stabilität; pH-Optimum, Temperatur-Optimum.
Zur Expression der in den erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Molekülen enthaltenen DNA-Sequenz in pflanzlichen Zellen ist diese mit regulatorischen Sequenzen verknüpft, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten. Hierzu zählen insbesondere Promotoren. Generell kommt für die Expression jeder in pflanzlichen Zellen aktive Promotor in Frage.
Der Promotor kann dabei vorzugsweise so gewählt sein, daß die Expression konstitutiv erfolgt oder nur in einem bestimmten Gewebe, zu einem bestimmten Zeitpunkt der Pflanzenentwicklung oder zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt. In Bezug auf die Pflanze kann der Promotor homolog oder heterolog sein. Sinnvolle Promotoren sind z.B. der Promotor der 35S RNA des Cauliflower Mosaic Virus und der Ubiquitin-Promotor aus Mais für eine konstitutive Expression. Besonders bevorzugt ist ein Promotor, der während der Pflanzentransformation, der Pflanzenregeneration oder bestimmten Stadien dieser Prozesse aktiv ist, z. B. Zellteilungsspezifische Promotoren; siehe beispielsweise den meristematischen Promotor meri-5 (Medford et al., Plant Cell 3 (1991 ), 359- 370). Eine Übersicht weiterer in Frage kommender Promotoren ist z.B. in Ward (1993) Plant Mol. Biol. 22, 361 -366 gegeben.
Ferner ist vorzugsweise eine Transkriptions-Terminationssequenz vorhanden, die der korrekten Beendigung der Transkription dient sowie der Addition eines Poly-ASchwanzes an das Transkript dienen kann, dem eine Funktion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen wird. Derartige Elemente, z.B. der Terminator des Octopinsynthasegens aus Agrobakterien, sind in der Literatur beschrieben (vgl. Gielen, EMBO J. 8 (1989), 23-29) und sind beliebig austauschbar.
In einer bevorzugten Ausführungsform stammen die vorgenannten DNA-Sequenzen aus Bakterien oder Pflanzen.
Wie in den Beispielen beschrieben konnten Stoffwechsel auxotrophe Pflanzen erfolgreich durch die Expression des CbL-Gens aus E. coli komplementiert werden. Phänotypische und physiologische Untersuchungen dieser transgenen Linien zeigten keinen Unterschied zu den ebenfalls untersuchten Kontroll pflanzen. Diese Methode führt demzufolge zu keiner Veränderung der Pflanzen, wie es bei Anwendung dieser Technik in der Biotechnologie erwünscht ist. Ein Einfluß auf andere Metabolite kann demzufolge ausgeschlossen werden.
Daher codiert in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die DNA-Sequenz ein Enzym, vorzugsweise Cystathionin beta-Lyase oder Threoninsynthase.
Die Einführung erfindungsgemäßer DNA-Moleküle in pflanzliche Zellen erfolgt vorzugsweise unter Verwendung von Vektoren wie Plasmiden, die eine stabile Intergration der eingeführten DNA in das pflanzliche Genom gewährleisten. Für die vorliegende Erfindung können beispielsweise die binären Vektoren BIN 19 und Derivate verwendet werden. Der Vektor BIN 19 wurde von Bevan (Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711-8721 ) beschrieben und ist kommerziell erhältlich (Clontech Laboratories, Inc., USA). Es ist jedoch auch jeder anderer Pflanzentransformationsvektor geeignet, in den eine Expressionskassette integriert werden kann, und die Integration der Expressionskassette in das pflanzliche Genom gewährleistet.
Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Derivate, M13mp-Derivate, pBluescript-Derivate, pACYC184, usw. Die gewünschte DNA-Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation von E. coli-Zellen verwendet. Transformierte E. coli-Zellen werden in einem 'geeigneten Medium kultiviert, anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird nach Standardmethoden wiedergewonnen. Als Analysemethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen und Sequenzanalysen eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten werden und resultierende DNA-Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der erfindungsgemäße Vektor mindestens ein weiteres rekombinantes DNA-Molekül. Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle und Vektoren kann jede beliebige Information, die in einem weiteren rekombinanten DNA-Molekül enthalten ist, auf Pflanzen bzw. Pflanzenzellen übertragen werden und anschließend mittels Selektion auf geeigneten Medien auf die gewünschte Information selektioniert werden. Natürlich weiß der Fachmann, daß das rekombinante DNA-Molekül, das die zusätzliche Information enthält, nicht unbedingt in dem Vektor, der den Selektionsmarker trägt, anwesend sein muß, sondern auch mit diesem co-transformiert werden kann (Lyznik (1989) Plant Mol. Biol. 13, 151-161 ; Peng (1995) Plant Mol. Biol. 27, 91-104). Diese Möglichkeit bietet sich zum Beispiel an, wenn keine physikalische Koppelung des Markergens und der zu übertragenden Information gewünscht wird. In diesem Fall können nach der Selektion der primären transgenen Pflanze das Markergen und die gewünschte Information in nachfolgenden Kreuzungen unabhängig voneinander seggregieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das weitere rekombinante DNA- Molekül eine DNA-Sequenz, die ein Peptid, Protein, Antisense-, Sense-RNA, virale RNA, oder Ribozym codiert. Einige Beispiele zur heterologen (Über)expression und zur Antisense-Inhibierung mit dem Ziel, Stoffwechselflüsse in transgenen Pflanzen zu manipulieren, sind in Herbers & Sonnewald (1996) TIBTECH 14, 198-205 zusammengefaßt. Ein Beispiel für Ribozyme wurde von Feyter (1996) Mol. Gen. Genet. 250, 329-338 publiziert. Durch Expression eines "hammerhead"-Ribozyms gelang es den Autoren, eine TMV-Resistenz in transgenen Tabakpflanzen zu erzeugen. Vielfältige Anwendungsmöglichkeiten von transgenen Pflanzen, die mit Hilfe der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Moleküle und Vektoren erzeugt werden können, sind auch in TIPTEC Plant Product & Crop Biotechnology, 13 (1995), 312-397 beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Vektoren können weitere Funktionseinheiten besitzen, die eine Stabilisierung des Vektors im Wirtsorganismus bewirken, wie einen bakteriellen Replikationsursprung oder die 2-Mikron-DNA zur Stabilisation in Saccharomyces cerevisiae. Ferner können "left border"- und "right border"-Sequenzen agrobakterieller T-DNA enthalten sein, wodurch eine stabile Integration in das Erbgut von Pflanzen ermöglicht wird. Eine weitere Strategie, markerfreie transgene Pflanzen zu erzeugen, ist die Verwendung von Sequenz-spezifischen Rekombinasen. Zu diesem Zweck sind z.B. zwei Strategien einsetzbar: (i) Re-Transformation einer Rekombinase exprimierenden Ausgangslinie und Auskreuzung der Rekombinase nach erfolgter Entfernung des Selektionsmarkers, welches mit dem gewünschten Gen assoziiert war. (ii) Co-Transformation mit anschließender Auskreuzung. Voraussetzung für diese Rekombinase-Strategie sind (i) Flankierung des Selektionsmarkers mit Erkennungssequenzen für die Rekombinase und (ii) eine Rekombinase, die in Pflanzen aktiv ist und keine pflanzeneigenen Sequenzen zur Rekombination nutzt. Derartige Verfahren kann der Fachmann dem Stand der Technik entnehmen, z.B. RecA (Reiss (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93, 3094-3098), Cre/lox (Bayley (1992) Plant Mol. Biol. 18, 353-361 ), FLP/FRT (Lloyd (1994) Mol. Gen. Genet. 242, 653-657), Gin (Maeser (1991 ) Mol. Gen. Genet. 230, 170-176) und R/RS (Onouchi (1991 ) Nucl. Acids Res. 19, 6373-6378).
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten. Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden an sich keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie z.B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig.
Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in Pflanzenzellen können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z.B. für die Transformation der Pfianzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden. Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen linker oder polylinker, weiche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al., Mol. Gen. Genet. (1978), 181-187). Die zur Transformation der Agrobakterien verwendeten Plasmide enthalten weiterhin ein Selektionsmarkergen, beispielsweise das NPT Il-Gen, das die Selektion transformierter Bakterien erlaubt. Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.
Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sei. 4, 1-46; Ann et al., EMBO J. 4 (1985), 277-287) beschrieben worden. Binäre Vektoren sind bereits z.T. kommerziell erhältlich. Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate mit Agrobacterium tumefaciens oder A. rhizogenes cokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z.B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden.
Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einen Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin u.a. vermittelt. Der individuelle gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten.
Die für die erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten stoffwechseldefekten Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzen werden vorzugsweise auf Komplementationsmedium kultiviert, insbesondere dann, wenn der Stoffwechseldefekt letal für die Pflanze ist. Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). Beispielsweise werden die stoffwechseldefekten Pflanzen unter Zugabe von Methionin angezogen. Nach Transformation mit einem der vorstehend beschriebenen DNA-Moleküle, die in der Lage sind, den Stoffwechseldefekt zu komplementieren oder aufzuheben, können die resultierenden Pflanzenzellen, Pflanzengewebe und Pflanzen auf Medien kultiviert werden, die das in den stoffwechseldefekten Pflanzen fehlende Stoffwechselprodukt oder ein entsprechendes Intermediat nicht mehr enthalten. Ein entsprechendes Selektionsmedium kann direkt zu Anfang der Kultivierung der transformierten transgenen Pflanzenzellen, Pflanzengewebe und Pflanzen verwendet werden oder in jeder beliebigen Stufe der Regeneration transgener Pflanzen. Die Wahl des Zeitpunktes Einsatzes des selektiven Mediums mag beispielsweise von der Wahl der Promotoren abhängen, die mitverantwortlich für Stoffwechseldefekt sind und/oder die die DNA-Sequenz steuern, die in der Lage ist, den entsprechenden Stoffwechseldefekt zu komplementieren oder aufzuheben. Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, daß das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Als Wirtspflanzen sind alle Pflanzenspezies, insbesondere Kulturpflanzenspezies, geeignet. Unter Kulturpflanzenspezies sind z.B. Zuckerrübe, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Weizen und Mais, aber auch andere Kulturpflanzenspezies zu verstehen, insbesondere auch solche Spezies, die als landwirtschaftliche Hilfspflanzen verwendbar sind.
Durch die Bereitstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, neue Selektionsmittei für die Pflanzentransformation zu benutzen, vorzugsweise zur Selektion transformierter Pflanzen, die von Hochleistungssorten abstammen, für die die im Stand der Technik beschriebenen Selektionsmarker oftmals nur im beschränkten Maße von Nutzen sind. Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch transgene Pflanzenzellen, die ein erfindungsgemäßes rekombinantes DNA-Molekül oder einen erfindungsgemäßen Vektor enthalten oder durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten wurden sowie transgene Pflanzenzellen, die von derartig transformierten Pflanzenzellen abstammen. Derartige Zellen lassen sich von natürlicherweise vorkommenden Pflanzenzellen dadurch unterscheiden, daß sie mindestens ein erfindungsgemäßes rekombinantes DNA-Molekül enthalten, das natürlicherweise in diesen Zellen nicht vorkommt oder dadurch, daß ein solches Molekül an einem Ort im Genom der Zeile integriert vorliegt, in dem es natürlicherweise nicht vorkommt, d.h. in einer anderen genomischen Umgebung.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße Pflanzenzelle mindestens ein weiteres Fremdgen. Wie bereits in der Einleitung dieser Patentanmeldung erwähnt, ist für die Möglichkeit der Steuerung komplexer Stoffwechselprozesse die Manipulation mehrerer enzymatischer Schritte notwendig und daher die Möglichkeit transgene Pflanzen mehrfach zu transformieren essentiell. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Moleküle und Vektoren kann der Fachmann nun auf neue Marker zur Selektion mehrfach transformierter Pflanzenzellen zurückgreifen.
Die transgenen Pflanzenzellen können nach dem Fachmann bekannten Techniken zu ganzen Pflanzen regeneriert werden. Die durch Regeneration der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen erhältlichen Pflanzen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Ferner sind Gegenstand der Erfindung
Pflanzen und Pflanzengewebe, die die oben beschriebenen transgenen Pflanzenzellen enthalten. Bei den transgenen Pflanzen kann es sich prinzipiell um Pflanzen jeder beliebigen Pflanzenspezies handeln, d.h. sowohl monokotyle als auch dikotyle Pflanzen. Bevorzugt handelt es sich um Nutzpflanzen wie Weizen, Gerste, Reis, Raps, Erbse, Mais, Zuckerrübe, Zuckerrohr oder Kartoffel.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Vermehrungsmaterial und Ernteprodukte der erfindungsgemäßen Pflanzen, beispielsweise Früchte, Samen, Knollen, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge etc., wobei das Vermehrungsmaterial bzw. die Ernteprodukte erfindungsgemäße Zellen enthalten.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Selektionsmarkem für Pflanzen umfassend
(a) Transformation eines durch einen Stoffwechseldefekt auxotrophen Mikroorganismus mit einer DNA-Bibliothek;
(b) Züchten des Mikroorganismus unter geeigneten Bedingungen die die Komplementation des Stoffwechseldefekts erlauben,
(c) Durchmustern des Mikroorganismus auf geeignetem Selektionsmedium;
(d) Isolierung der(s) DNA-Moleküle(s), die (das) den Stoffwechseldefekt komplementieren (kann) können; und gegebenenfalls
(e) Verknüpfung der(s) DNA-Moleküle(s) aus (d) mit den regulatorischen Sequenzen eines in Pflanzen aktiven Promotors.
Grundlage für dieses Verfahren ist die Herstellung geeigneter DNA-Bibliotheken, den sogenannten Expressionsbanken. Als Spender können dabei sowohl eukaryontische als auch prokaryontische Organismen dienen. Ausgehend von RNA, die in cDNA (copy-DNA) überschrieben wird, bzw. von genomischer DNA werden DNA-Fragmente in Expressionsvektoren kloniert. In diesen Vektoren stehen dann die Fragmente unter der Kontrolle eines Wirts-spezifischen Promotors, der u.a. die Expression des gesuchten Proteins/Enzyms zuläßt. Als Wirt dienen Bakterien- (z.B. E. coli) und Hefe- (z.B. S. cerevisiae) Mutanten, die einen Defekt in einem biosynthetischen Schritt aufweisen, bspw. in der Aminosäurebiosynthese. Werden dann mit den hergestellten DNA-Bibliotheken transformierte Mikroorganismen auf Medium ausplattiert, das lediglich Grundbestandteile enthält (z.B. für Bakterien M9-Medium, für Hefen SD-Medium) werden nur solche Zellen überleben, die das Gen exprimieren, das den Defekt der verwendeten Mutante komplementiert. Material und Methoden die im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens genutzt werden können sind beschrieben, beispielsweise in Kim, Leustek, Plant. Mol. Biol. 32 (1996), 1117 - 1124; Curien et al., FEBS Letters 390 (1996), 85 - 90; Leggewie et al., Plant Cell 9 (1997), 381-392.
Vorzugsweise betrifft der Stoffwechseldefekt einen Stoffwechseldefekt wie er in einem der vorstehenden Ausführungsformen definiert wurde.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Mikroorganismus E. coli.
Wie bereits oben dargelegt stellt die vorliegende Erfindung neue Selektionsmarker für Pflanzen bereit. Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch Selektionsmarker in der Form von rekombinanten DNA-Molekülen umfassend
(a) regulatorische Sequenzen eines in Pflanzen aktiven Promotors;
(b) funktioneil verknüpft mit einem in einem der vorstehenden Ausführungsform definierten oder nach einem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen DNA- Molekül; und gegebenenfalls
(c) funktioneil daran verknüpft regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions- Terminations und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzen dienen können.
Geeignete Promotoren und Terminations- bzw. Polyadenylierungssignale sind im Stand der Technik beschrieben; siehe auch oben.
Die Erfindung betrifft ferner Vektoren, die erfindungsgemäße rekombinante DNA- Moleküle enthalten. Vorzugsweise handelt es sich dabei um Plasmide, Cosmide, Viren, Bacteriophagen und andere in der Gentechnik übliche Vektoren. Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen stehen eine große Anzahl von Clonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation von E. coli-Zellen verwendet. Transformierte E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet, anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysemethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden. Jede Plasmid-DNA-Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden cloniert werden.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Wirtszellen, die die erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Moleküle oder Vektoren transient oder stabil enthalten. Unter einer Wirtszelle wird ein Organismus verstanden, der in der Lage ist, in vitro rekombinierte DNA aufzunehmen und gegebenenfalls die in den erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Molekülen enthaltene DNA-Sequenz zu exprimieren.
Vorzugsweise sind dies prokaryontische oder eukaryontische Zellen. Insbesondere betrifft die Erfindung Pflanzenzellen, die die erfindungsgemäßen Vektorsysteme oder Derivate oder Teile davon enthalten. Diese weisen vorzugsweise aufgrund der Aufnahme der erfindungsgemäßen Vektorsysteme, Derivate oder Teile der Vektorsysteme einen der oben beschriebenen Stoffwechseldefekte auf. Diese Pflanzenzellen bzw. daraus regenerierte Pflanzen können dann wiederum in einem der vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren benutzt werden. Vorzugsweise sind die erfindungsgemäßen Zellen dadurch gekennzeichnet, daß das eingeführte erfindungsgemäße rekombinante DNA-Molekül entweder heterolog in Bezug auf die transformierte Zelle ist, d.h. natürlicherweise nicht in diesen Zellen vorkommt, oder an einem anderen Ort im Genom lokalisiert ist als die entsprechende natürlicherweise auftretende Sequenz. In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Kits, die ein erfindungsgemäßes rekombinantes DNA Molekül oder einen erfindungsgemäßen Vektor enthalten und gegebenenfalls ein geeignetes Selektionsmedium für die vorstehend beschriebenen Pflanzen. Die vorstehend beschriebenen DNA-Moleküle und Vektoren können in dem erfindungsgemäßen Kit in Behältern verpackt sein, beispielsweise in Gefäßen, gegebenenfalls in Puffern und/oder Lösungen. Die erfindungsgemäßen Kits können vielseitig eingesetzt werden. Beispielhafte Anwendungsbereiche wie die Züchtung wurden vorstehend angegeben. Die Herstellung der Kits selbst erfolgt vorzugsweise nach Standardverfahren.
Wie oben bereits dargelegt, stellt die vorliegende Erfindung rekombinante DNA- Moleküle und Vektoren zur Verfügung, die als Selektionsmarker in Pflanzenzellen zur Selektion transformierter Pflanzenzellen sowie davon abgeleitete transgene Pflanzen, Pflanzenzellen und/oder Gewebe zur Verfügung. So betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Moleküls, eines erfindungsgemäßen Vektors oder der erfindungsgemäß hergestellten Selektionsmarker zur Herstellung von transgenen Pflanzen, Pflanzenzellen und/oder Gewebe sowie deren Nutzung als selektierbare Marker in pflanzlicher Zeil- und Gewebekultur und/oder Pflanzenzüchtung.
Diese und andere Ausführungsformen sind dem Fachmann offenbart und offensichtlich und umfaßt durch die Beschreibung und die Beispiele der vorliegenden Erfindung. Weiterführende Literatur kann zu einer der oben angeführten Methoden, Mittel und Verwendungen, die im Sinne der vorliegenden Erfindung angewendet werden können, dem Stand der Technik entnommen werden, z. B. aus öffentlichen Bibliotheken unter z. B. der Benutzung von elektronischen Hilfsmitteln. Zu diesem Zweck bieten sich unter anderem öffentliche Datenbanken an wie die "Medline", die über Internet zur Verfügung stehen, z. B. unter der Adresse http://www.ncbi.nim.nih.gov/PubMed/mediine.html. Weitere Datenbanken und Adressen sind dem Fachmann geläufig und können aus dem Internet entnommen werden, z. B. unter der Adresse http://www.lycos.com. Eine Übersicht über Quellen und Informationen zu Patenten bzw. Patentanmeldungen in der Biotechnologie ist in Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364 gegeben.
In den Beispielen verwendete Methoden (wenn nicht anders angegeben):
1. Klonierungsverfahren
Zur Klonierung in E. coli wurde der Vektor pBluescript SK- (Stratagene) verwendet. Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in die binären Vektoren BIN 19 (Bevan, Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711-8720) kloniert. Wenn nicht anders erwähnt, wurden die in Sambrook, 1989 oder Ausubel et al., eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, USA, beschriebenen Techniken verwendet.
2. Bakterienstämme
Für die unter 1. genannten Plasmid-Vektoren wurde der E. coli- Stamm XL-1 Blue (Stratagene) und zur Komplementation der auxotrophe E. coli Stamm GUC41 (Gutermann, J. Bact. 114 (1973), 1225-1230) verwendet. Für die Komplementation der E. coli-Mutante wurde eine cDNA-Bank von Kartoffelblättern eingesetzt. Die cDNA-Bank wurde in einem Phagenvektor kloniert (λZAP II, Stratagene, USA). Der Phagenvektor enthält das Plasmid Bluescript SK" (Stratagene, USA) integriert, in das die cDNA kloniert ist. Mit Hilfe eines Helfer-Phagen wurde das Plasmid herausgeschnitten und für die Transformation eingesetzt. Zur Komplementation wurden die Bakterien auf einem Minimal-Medium (M9-Medium) ausplattiert (Sambrook et al., 1989) und für drei Tage bei 37°C inkubiert.
Die Transformation der binären Plasmide in die Kartoffelpflanzen wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Stammes"C58C1 pGV2260 (Deblaere, Nucl. Acids Res. (1985), 4777-4788) durchgeführt. 3. Transformation von Agrobacterium tumefaciens
Der Transfer der DNA erfolgte durch direkte Transformation nach der Methode von Höfgen & Willmitzer (Nucl. Acids Res. 7 (1989), 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch analysiert.
4. Transformation von Kartoffel
Zehn kleine mit dem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffel-Sterilkultur (Solanum tuberosum L. cv. Desiree) wurden in 10 ml MS-Medium (Murashige & Skoog, Physiol. Plant. 15 (1962), 473-497) mit 2% Saccharose gelegt, welches 50 μl einer unter Selektion gewachsenen Agrobacterium tumefaciens-Übemachtkultur enthielt. Nach 3-5 minütigen leichtem Schütteln erfolgte eine weitere Inkubation für 2 Tage im Dunkeln. Daraufhin wurden die Blätter zur Kallusinduktion auf MS-Medium mit 1 ,6% Glucose, 5 mg/l Naphtylessigsäure, 0,2 mg/l Benzylaminopurin, 250 mg/l Claforan bzw. 125 mg/l b-Bactyl, 50 mg/l Kanamycin bzw. 1 mg 1 mg/l Hygromycin B, und 0,8% Bacto Agar gelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wurden die Blätter zur Sproßexpression auf MS-Medium mit 1 ,6% Giucose, 1 ,4 mg/l Zeatinribose, 20 mg/l Naphtylessigsäure, 20 mg/l Giberellinsäure, 250 mg/l Claforan bzw. 125 mg/l b-Bactyl, 50 mg/l Kanamycin bzw. 3 mg/l Hygromycin B und 0,8% Bacto Agar gelegt.
5. Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten
Die radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten wurde mit Hilfe eines DNA-Random Primer Labelling Kits der Firma Boehringer (Deutschland) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt.
6. Pflanzenhaltung
Kartoffelpflanzen wurden im Gewächshaus unter folgenden Bedingungen gehalten:
Lichtperiode 16 h bei 25 000 Lux und 22°C
Dunkelperiode 8 h bei 15°C
Luftfeuchte 60%
Komplementationsmedium der Bakterien: M9-Medium (Sambrook et al.,
1989), versetzt mit 1 mM IPTG, 40 mg/l Threonin, 40 mg/l Leucin.
Supplementationsmedium für Antisense-Pflanzen: MS-Medium (Murashige,
Skoog, Plant Physiol. 15, 573-497, 1962), versetzt mit 2% Saccharose, 125 mg/l ß-Bactyl, 45 mg/l Methionin, 200 mg/l Caseinhydrolysat
7. Analyse genomischer DNA aus transgenen Kartoffelpflanzen
Die Isolation genomischer Pflanzen-DNA erfolgte nach Rogers & Bendich (Plant Mol. Biol. 5 (1985), 69-76). Mit Hilfe von "Southern Blof'-Analysen wurden 10-30 μg DNA nach geeigneter Restriktionsspaltung der einführenden DNA-Sequenzen hin untersucht.
Die Beispiele erläutern die Erfindung
BEISPIEL 1 : HERSTELLUNG STOFFWECHSEL AUXOTROPHER PFLANZEN
Das Gen für die Cystathionin beta-Lyase wurde durch die Komplementation der Methionin-auxotrophen E. coli-Mutante GUC41 isoliert. Ausgehend von einer λZAPII cDNA-Bank von Kartoffelblättem wurden mittels in vivo Excision Plasmide (pBluescript SK"), die verschiedene cDNAs enthalten, in ihrer Gesamtheit isoliert und in der E. coli-Mutante etabliert. Zunächst wurde lediglich auf die vom eingebrachten Plasmid ausgehende Resistenz selektiert und in einem zweiten Durchgang auf die Auxotrophie der Mutante auf einem geeigneten Selektionsmedium (M9 ohne Methionin). Die Analyse der aus dieser Durchmusterung hervorgegangenen Kolonien ergab ein einheitliches Bild mit cDNA-Fragmenten einer Länge. Teile der Sequenz der genomischen DNA wurden durch Standardverfahren mittels der Didesoxynukleotidmethode (Sanger, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1977), 5463-5467) partiell bestimmt. Ein Vergleich der ermittelten Sequenzen mit der ermittelten Arabidopsis Sequenz belegte eindeutig, daß es sich bei der DNA-Insertion um ein Fragment nuklearer DNA handelt. Das von der cDNA-Sequenz abgeleitete Protein weist eine hohe Homologie zu den abgeleiteten Proteinen aus E. coli und Arabidopsis thaliana auf.
Durch das Einbringen der cDNA für Cystathionin beta-Lyase in inverser Orientierung bezüglich des Promotors (CaMV 35S) konnten Kartoffelpflanzen regeneriert werden, die auf Komplentationsmedium keine Veränderung zum Wildtyp aufweisen. Werden die transgenen Linien jedoch in Töpfen ins Gewächshaus gebracht, ist ein breit gefächertes Phänotypenspektrum sichtbar. In der Regel findet man in Anhängigkeit vom Grad des Antisenseeffektes eine Retardierung des Wachstums bis hin zu lethalen Effekten.
Über die Bedeutung der Cystathionin beta-Lyase im Stoffwechselweg konnte bislang nur spekuliert werden. Es liegen Enzymdaten vor, die eine cytosolische Isoform nicht ausschließen. Neuere Erkenntnisse können diese Hypothese jedoch nicht unterstützen. Bislang konnten aus Arabidopsis thaliana und Solanum tuberosum nur plastidär lokalisierte Varianten isoliert werden. Ferner konnte erfolgreich eine Tabakmutante, die einen Defekt für die Cystathionin beta-Lyase trägt, durch plastidäre Expression des E. coli metC-Gens (kodiert für Cystathionin beta-Lyase) komplementiert werden. Diese Tabakmutante ist auch bislang die einzige beschriebene Mutante innerhalb des Methioninstoffwechselweges. Der beobachtete Phänotyp bei den Antisensepflanzen unterstützt demzufolge die Ergebnisse der Tabakmutante. Daraus läßt sich die Essentialität der Cystathionin beta-Lyase für den Stoffwechselweg und demzufolge für die Pflanze ableiten.
BEISPIEL 2: KOMPLEMENTATION EINER AUXOTROPHEN TAKAKMUTANTE
1. Pflanzenkulturbedingungen
N. plumbaginifolia Pflanzen wurden in Gewebekultur auf 2MS Medium (Murashige und Skoog, Plant Physiol. 15 (1962), 573-497) mit 0,3 mM Methionin (Negrutiu et al., Int. J. Dev. Biol. 36 (1992), 73-84) und Caseinhydrolysat (200 mg/l) supplementiert. Die Pflanzen wurden 16 h pro Tag beleuchtet.
2. Binäre Vektorkonstruktion
Das E. coli metC Gen wurde mittels PCR aus genomischer DNA von E. coli K12 (Laber et al., FEBS Letter 379 (1996), 94-96) mit Primern isoliert, die eine BamHI-Schnittstelle enthalten. Das amplifizierte DNA-Fragment mit einer Länge von 1187 bp wurde mit BamHI verdaut und in die BamHI- Schnittstelle des pBinAR-Vektors (Höfgen und Willmitzer, Plant Sei. 66 (1990), 221-230) ligiert. Der binäre Vektor enthält den CaMV 35S Promotor und den OCS Terminator, sowie das nptll Gen für eine Kanamycin-Selektion der transformierten Pflanzen. Für die plastidäre Lokalisierung der E. coli CbL wurde das Transitpeptid der kleinen Untereinheit der Spinat Rubisco mit dem offenen Leseraster der CbL fusioniert. Das daraus resultierende Plasmid wurde pEc-TP-metC bezeichnet.
3. Pflanzentransformation
Blattstücke der N. plumbaginifolia-Mutante wurde mittels des Agrobacterium tumefaciens Stammes GV2260 (Deblaere et al., Nucl. Acids. Res. 13 (1985), 4777-4788) nach einem Protokoll von Rosahl et al. (EMBO J. 6 (1987), 1155-1159) transformiert. Zur Selektion betrug die Kanamycinkonzentration 50 μg/ml. Methionin wurde auf 0,3 mM eingestellt bis die Pflanzen auf metC Expression untersucht wurden.
4. DNA und RNA Analyse
Für molekularbiologische Arbeiten wurden Standardtechniken eingesetzt (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989). Das komplette metC Gen wurde als Hybridisierungssonde für Southern und Northern Blot Analysen eingesetzt. Das aus pMet33 mit herausgeschnittene 1 ,2 kb Fragment wurde in einen 0,8%-igem Agarosegel aufgetrennt, im Anschluß elektroeluiert und für die radioaktiven Markierungen mit 32P-dCTP nach den Angaben des Herstellers (Rediprime, Amersham) eingesetzt.
Genomische DNA von N. plumbaginifolia wurde nach der Methode von Dellaporta et al. (Plant Mol. Biol. Reporter 1 (1983), 19-21 ) isoliert. Der Southern Blot wurde mit 10 μg DNA pro Restriktionsverdau durchgeführt. Positiv geladene Nylonmembranen wurden von Boehringer bezogen. Gesamt RNA wurde nach einem veränderten Protokoll nach Rerie et al. (Mol. Gen. Genet. 225 (1991 ), 148-157) ausgehend von zwei g frischem Blattmaterial isoliert. Für die Northern Blots wurden je 10 μg RNA pro Spur aufgetragen. Als Marker wurde eine RNA-Leiter (Gibco BRL) verwendet. Gleichmäßige Beladung der RNA-Gele wurde nach dem Transfer auf die Membran durch Färbung mit Methylenblau kontrolliert (Brown und Mackey, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1 , John Wiley and Sons, USA (1995), 4.9.1-4.9.16).
5. Partiaireinigung der Cystathionin beta-Lyase
Alle Schritte wurden bei 4°C durchgeführt.
15 g gefrorenes Blattmaterial wurde in fl. Stickstoff gemörsert und anschließend in Puffer E (100 mM KHPO4, pH 8,0, 1 mM EDTA, 5 mM Thioharnstoff, 20 % Glycerin, 10 mM ß-Mercaptoethanol) homogenisiert. Der Extrakt wurde durch Miracloth (Calbiochem) filtriert und anschließend für 15 min bei 10 000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde durch sukzessive Zugaben von Ammoniumsulfat innerhalb einer Stunde auf 65 % Sättigung gebracht. Nach der Zentrifugation für 20 min bei 10 000 rpm wurde das Pellet in 1 ml Puffer D (50 mM KHPO4, pH 7,5, 1 mM EDTA, 20 % Glycerin, 1 mM DTT) resuspendiert. Die Proteinfraktion wurde mittels einer Sephadex G-25 Säule, die zuvor mit Puffer D equilibriert wurde, entsalzt. Cystathionin beta-Lyase Aktivität coeluiert mit der dunkelgrünen Fraktion. Die Fraktionen wurden gesammelt und bis zur Verwendung bei -20°C gelagert. Der Proteingehalt wurde nach der Methode von Bradford (Anal. Biochem. 72 (1976), 248-254) mittels des BIO-Rad Proteinassays mit Rinderserum als Standard gemessen.
6. Cystathionin beta-Lyase Aktivität
Zur Bestimmung der CbL Aktivität wurde partiell gereinigte Enzymextrakte mit Cystathionin inkubiert. Das bei der Reaktion freigesetzte Pyruvat wurde in ein Hydrazon in alkalischer Lösung umgesetzt und die Absorption bestimmt (Sharma und Mazumber, J. Biol. Chem. 245 (1970), 3008-3014). Der 200 μl Reaktionsmix besteht aus 60 μl entsalztem Proteinextrakt, 200 mM Tris-Puffer, pH 8,6, 5 mM Cystathionin. Nach einer Stunde Inkubation bei 37°C wurde die Reaktion durch Zugabe von 120 μl TCA gestoppt. Die denaturierten Proteine wurden durch Zentrifugation bei 13 000 rpm für 10 min pelletiert. Der Ketosäurengehalt im Überstand wurde nach Zugabe von 80 μl Dinitrophenylhydrazon (0,05 % in HCI) und 10 minütiger Inkubation bei Raumtemperatur bestimmt. Nach Zugabe von 800 μl 0,4 N NaOH und weiteren 30 min Inkubation wurde dann die Absorption bei 505 nm gemessen. Die Pyruvatkonzentration wurde anhand einer Pyruvat- Eichgeraden für den Konzentrationsbereich zwischen 0 und 800 μM bestimmt. CbL Aktivität wird in pmol Pyruvat pro min und mg Protein angegeben.
7. Cystathionin beta-Lyase Aktivitätsnachweis in nativen PAGE
Proteinproben wuden in einem vertikalen Kleingel nach Laemmli (Nature 227 (1970), 680-685) in nativen 7,5 %-igen Acryiamid PAGE-Gelen bei 4°C aufgetrennt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel zwei Mal in 10 mM Tris/HCI, pH 8,6 gewaschen und anschließend bei 37°C mit einem Reaktionsgemisch bestehend aus 10 mM Tris/HCI, pH 8,6, 5 mM Cystathionin, 0,8 % (w/v) Tetraphenylborat (TPB). Das bei der Reaktion freigesetzte Ammonium bildet mit TPB ein unlösliches Präzipitat, daß auf dunklem Hintergrund gut nachweisbar ist (Turner, Ph.D. Thesis, University of Lancaster, UK (1994)). Kontrollen ohne Cystathionin wurden einbezogen. . Freie Aminosäureextraktion
Zwischen 100 und 500 mg Pflanzenmaterial wurden im Mörser homogenisiert und mit einem Gemisch aus Methanol: Chloroform: Wasser (12: 5: 1 ) versetzt (Bieleski und Turner, Anal. Biochem. 17 (1966), 278-293). Das Homogenat wurde zentrifugiert und der Überstand in ein neues Gefäß überführt. Das Pellet wurde drei Mal hintereinander extrahiert und die Überstände vereinigt. Chlorophyll wurde durch Zugabe von zwei Volumen Chloroform und einem Teil Wasser entfernt. Die wässrige, Aminosäuren, enthaltene Phase wurde komplett zur Trockne eingeengt. Der Rest wurde in Wasser aufgenommen und durch einen 1 ,3 μm Filter gegeben. HCI wurde ad 2 N zugegeben und im Anschluß zur Hydrolyse der Amide bei 110°C für 2 h inkubiert. Nach einer zweiten Trocknung wurde der Rest in einem Probenpuffer (Na-Citrat-Puffer, pH 2,2) aufgenommen und durch einen 0,45 μm Filter filtriert. Die Aminosäuren wurden mittels Ninhydrin Nachsäulenderivatisierung auf einer Beckman System Gold Anlage gemessen.
9. Ergebnisse
Transformation der auxotrophen Mutante und ihre Entwicklung
Mit dem Ziel die Autotrophie der met" (10.1/9) N. plumbaginifolia Mutante wieder herzustellen, wurde ein chimäres Gen bestehend aus der kodierenden Region des metC Gens und des Transitpeptids der kleinen Untereinheit von Rubisco konstruiert und in einen binären Vektor kloniert. Agrobacterien-vermittelter Gentransfer bei N. plumbaginifolia Mutante 10.1/9 mit dem Konstrukt führte auf 2MS Medium ohne Methioninzugabe in Gegenwart von Kanamycin zur Kallusentwicklung und Sproßbildung. Im Gegensatz dazu konnten lediglich Sprosse der untransformierten Mutante regeneriert werden, wenn zum Kulturmedium Methionin zugegeben wurde. Transformierte Sprosse wurzelten auch unter diesen Bedingungen. Fünf Primärtransformanten, die mit EcCbL 1-5 bezeichnet wurden, zeigten einen normalen Phänotyp und wurden für die weitere Analyse ausgewählt.
Zur Überprüfung der phänotypischen Reversion unter
Gewächshausbedingungen wurden die fünf regenerierten Linien in Erde gepflanzt. EcCbL 1-5 Pflanzen ähneln im Phänotyp dem Wildtyp von N. plumbaginifolia. Sie zeigten auch gleiche Fertilität und Samenbildung wie die
Kontrollpflanzen.
Basierend auf den vorläufigen Analysen der Northern Blots und
Enzymaktivität wurden zwei Linien (EcCbL 1 und 4) mit annähernd gleicher
Expression und Aktivität für eine weitere detailiertere Untersuchung ausgewählt.
Molekulare Analyse
Primärtransformanten wurden auf Integration des Konstruktes in die DNA und auf Expression untersucht. Gesamt-RNA wurde aus Kontrollpflanzen und den transgenen Linien EcCbL 1 und 4 isoliert und durch Northern Blot analysiert. Starke Expressionssignale mit einer Größe von 1 ,7 kb wurden lediglich für die transgenen Pflanzen erhalten, während kein Signal in den Kontrollpflanzen detektiert wurde. Genomische DNA wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut und auf Integration des E. coli metC Genes in das pflanzliche Genom der Primärtransformanten untersucht. Es konnte das Ergebnis der Northern Blot Analyse bestätigt werden. Eine Kreuzreaktion zwischen der E. coli DNA-Probe und dem pflanzlichen Gen konnte nicht beobachtet werden. Die Größe der erhaltenen Signalen stimmen mit den kalkulierten Größen der korrespondierenden Restriktionsstellen in der T-DNA überein, wobei die BamHI und Hindill Banden um ca. 0,3 kb durch das Terminationssignal abweichen. Durch den EcoRI-Verdau konnte für EcCbL 1 eine Kopie und für EcCbL 4 zwei Kopien ermittelt werden. CbL Enzymaktivität
Teilgereinigtes Protein von Kontrollpflanzen, der Mutante und den transformierten Linien EcCbl 1und 4 wurden für die Analyse der CbL Aktivität eingesetzt. In den Extrakten von Kontrollpflanzen konnte nur eine geringe Aktivität, in der auxotrophen Mutante gar keine Aktivität bestimmt werden. Dagegen wurden für die beiden transgenen Linien bis zu 500 mal höhere Aktivitäten als in den Kontrollpflanzen ermittelt werden. Diese Zunahme konnte auch in nativen PAGE-Gelen durch Aktivitätsfärbung gezeigt werden. Gleiche Proteinmengen wurden dazu geladen und nur in den transgenen Linien konnte eine weiße, dicke Präzipitationsbande nachgewiesen werden. Dies konnte für den Wildtyp aufgrund des geringen Vorkommens nicht gezeigt werden. Eine weitere Aufreinigung wäre dazu nötig, um dies zu zeigen.
Freier Aminosäuregehalt
Um die Wirkung der Überexpression der CbL auf die Aminosäurebiosynthese zu zeigen wurden die freien Aminosäuren von Blättern unter Berücksichtigung der Aminosäuren der Aspartatfamilie in vitro gewachsener transgener Pflanzen analysiert. Der Aminosäuregehalt der transgenen Linien hat sich im Vergleich zu den Kontrollpflanzen einschließlich des Methionningehaltes nicht verändert. Es konnte zwar die Methioninmenge auf Wildtypniveau zurückgeführt werden aber es kam zu keiner Erhöhung. Während der gesamten Pflanzenentwicklung konnte keine Veränderung der freien Aminosäuregehalte in den verschiedenen Linien beobachtet werden. Auch für S-Adenosylmethionin- und Methioninsulfoxidgehalte, die aus dem Methioninmetabolismus hervorgehen, konnte keine Veränderung festgestellt werden. Der Methioningehalt der auxotrophen Mutante rührt von der Aufnahme der Aminosäure vom supplementierten Kulturmedium. BEISPIEL 3: ALTERNATIVE ANSÄTZE
Derzeitig stehen neben bereits vorhandenen supplementierbaren Mutanten verschiedene Verfahren zur Erzeugung von Pflanzenmaterial mit definierten Stoffwechseldefekten zur Anwendung der beschriebenen Technik zur Verfügung; siehe beispielsweise Negrutiu, Mol. Gen. Genet. 199 (1985), 330-337. Zum einen sind es Mutageneseverfahren, bei denen Protoplasten durch Verwendung alkylierender Agentien derart modifiziert werden, daß sie in der Folge auf speziellen Selektionsmedien komplementiert werden müssen. Zum anderen erlaubt ein Verfahren durch "Gene knock out" mittels RNA/DNA-Hybriden gezielt Gene zu verändern. Die anschließende Selektion erfolgt wie bei einer Mutagenese. Ferner ist die Anwendung der Antisense-Technik ohne Antibiotikamarker aufgrund der hohen Transformationseffizienz möglich. Die Selektion von lethalen Mutanten ist im Gewächshaus durchführbar und kann mittels Metabolitenkomplentation in vivo propagiert werden.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzenzellen, Pflanzengeweben oder Pflanzen umfassend
(a) Transformation der Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzen, die einen Stoffwechseldefekt aufweisen, mit einem DNA-Molekül, das eine DNA-Sequenz enthält die in der Lage ist den Stoffwechseldefekt zu komplementieren oder aufzuheben;
(b) Selektion der transformierten Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzen auf geeignetem Selektionsmedium.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei der Stoffwechseldefekt innerhalb der Aminosäurebiosynthese vorliegt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Aminosäurebiosynthese die Aspartatfamilie betrifft.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Aminosäure Cystein, Methionin oder Threonin ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Stoffwechseldefekt durch eine Mutation, Antisense, Cosuppression, oder einen dominanten Mutanten-Effekt erzeugt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die DNA-Sequenz an die regulatorische Sequenz eines in Pflanzen aktiven Promotor funktioneil verknüpft ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Promotor ein konstitutiver Promotor ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die DNA-Sequenz aus Bakterien oder Pflanzen stammt.
. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die DNA-Sequenz ein Enzym codiert.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Enzym Cystathionin beta-Lyase oder Threoninsynthase ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das DNA-Molekül in einem Vektor enthalten ist.
12. Verfahren nach Anspruch 11 , wobei der Vektor ein weiteres rekombinantes DNA-Molekül enthält, das eine DNA-Sequenz enthält, die ein Peptid, Protein, Antisense-, Sense-RNA, virale RNA oder Ribozym codiert.
13. Transgene Pflanzenzelle, Pflanzengewebe oder Pflanze hergestellt nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12 enthaltend ein nach einem der Ansprüche 1 bis 10 definiertes DNA-Molekül.
14. Ernteprodukte oder Vermehrungsmaterial einer Pflanze nach Anspruch 13 enthaltend Pflanzenzelien nach Anspruch 13.
15. Verfahren zur Herstellung von Selektionsmarkem für Pflanzen umfassend
(a) Transformation eines durch einen Stoffwechseldefekt auxotrophen Mikroorganismus mit einer DNA-Bibliothek;
(b) Züchten des Mikroorganismus unter geeigneten Bedingungen die die Komplementation des Stoffwechseldefekts erlauben;
(c) Durchmustern des Mikroorganismus auf geeignetem Selektionsmedium;
(d) Isolierung der(s) DNA-Moleküle(s), die (das) den Stoffwechseldefekt komplementieren (kann) können; und gegebenenfalls
(e) Verknüpfung der(s) DNA-Moleküle(s) aus (d) mit den regulatorischen Sequenzen eines in Pflanzen aktiven Promotors.
16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Stoffwechseldefekt wie in einem der Ansprüche 2 bis 5 definiert ist.
17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei der Mikroorganismus E. coli ist.
18. Rekombinantes DNA-Molekül umfassend
(a) regulatorische Sequenzen eines in Pflanzen aktiven Promotors;
(b) funktionell verknüpft mit einem in einem der Ansprüche 1 bis 10 definierten oder nach einem der Ansprüche 15 bis 17 erhaltenen DNA-Molekül; und gegebenenfalls
(c) funktionell daran verknüpft regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-Terminations und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzen dienen können.
19. Vektor umfassend ein rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 18.
20. Vektor nach Anspruch 19, der mindestens ein weiteres rekombinantes DNA Molekül mit einer DNA-Sequenz enthält, die ein Peptid, Protein, Antisense-, Sense-RNA, virale RNA oder Ribozym codiert.
21. Wirtszelle, enthaltend ein rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 18 oder einen Vektor nach Anspruch 19 oder 20.
22. Kit umfassend ein rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 18 oder einen Vektor nach Anspruch 19 oder 20 und gegebenenfalls ein geeignetes Selektionsmedium für Pflanzen.
23. Verwendung eines DNA-Moleküls nach Anspruch 18 oder wie es in einem der Ansprüche 1 bis 10 definiert ist, eines Vektors nach Anspruch 19 oder 20 oder wie er in Anspruch 11 oder 12 definiert ist oder des Selektionsmarkers erhältlich nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17 als Selektionsmarker zur Herstellung von transgenen Pflanzen, Pflanzenzellen und/oder Gewebe oder in pflanzlicher Zeil- und Gewebekultur und/oder Pflanzenzüchtung.
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