DE10045182A1 - Verwendung von Palatinase- und Trehalulase-Sequenzen als nutritive Marker in transformierten Zellen - Google Patents
Verwendung von Palatinase- und Trehalulase-Sequenzen als nutritive Marker in transformierten ZellenInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante Nukleinsäuremoleküle, die eine DNA-Sequenz enthalten, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinose-Hydrolase, auch als Palatinase bezeichnet, bzw. einer Trehalulose-Hydrolase, auch als Trehalulase bezeichnet, kodiert, und die Verwendung dieser Nukleinsäuremoleküle als Selektionsmarker in transformierten Zellen. Insbesondere betrifft die Erfindung rekombinante Nukleinsäuremoleküle, die eine DNA-Sequenz enthalten, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. einer Trehalulase kodiert, und worin diese DNA-Sequenz unter Kontrolle von regulatorischen Sequenzen eines in Pflanzen aktiven Promotors steht. Weiter betrifft die Erfindung Vektoren und Wirtszellen, die die erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremoleküle enthalten. Weiter werden Verfahren zur Herstellung transformierter Pflanzenzellen und Pflanzen unter Verwendung der rekombinanten Nukleinsäuremoleküle und Vektoren bereitgestellt. Weiter betrifft die Erfindung transgene Pflanzen, deren Ernteprodukte und Vermehrungsmaterial sowie transgene Pflanzenzellen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle oder Vektoren enthalten oder durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt werden. Die Erfindung betrifft insbesondere auch die Verwendung von DNA-Sequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinose-Hydrolase bzw. einer Trehalulose-Hydrolase kodieren, als nutritiver Selektionsmarker in ...
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante Nukleinsäuremoleküle, die eine DNA-
Sequenz enthalten, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinose-Hydro
lase, auch als Palatinase bezeichnet, bzw. einer Trehalulose-Hydrolase, auch als Trehalulase
bezeichnet, kodiert, und die Verwendung dieser Nukleinsäuremoleküle als Selektionsmarker
in transformierten Zellen. Insbesondere betrifft die Erfindung rekombinante Nuklein
säuremolelüle, die eine DNA-Sequenz enthalten, die ein Protein mit der enzymatischen
Aktivität einer Palatinase bzw. einer Trehalulase kodiert, und worin diese DNA-Sequenz
unter Kontrolle von regulatorischen Sequenzen eines in Pflanzen aktiven Promotors steht.
Weiter betrifft die Erfindung Vektoren und Wirtszellen, die die erfindungsgemäßen
rekombinanten Nukleinsäuremoleküle enthalten. Weiter werden Verfahren zur Herstellung
transformierter Pflanzenzellen und Pflanzen unter Verwendung der rekombinanten
Nukleinsäuremoleküle und Vektoren bereitgestellt. Weiter betrifft die Erfindung transgene
Pflanzen, deren Ernteprodukte und Vermehrungsmaterial sowie transgene Pflanzenzellen, die
die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle oder Vektoren enthalten oder durch das
erfindungsgemäße Verfahren hergestellt werden. Die Erfindung betrifft insbesondere auch die
Verwendung von DNA-Sequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer
Palatinose-Hydrolase bzw. einer Trehalulose-Hydrolase kodieren, als nutritive
Selektionsmarker in Pflanzenzellen zur Selektion transformierter Pflanzenzellen und
Pflanzen. Des weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Selektion von
Mikroorganismen auf Palatinose- bzw. Trehalulose-haltigem Medium.
Mittels gentechnischer Verfahren ist es möglich, gezielt Fremdgene in das pflanzliche Genom
einzuführen. Dieser Prozeß wird als Transformation und die resultierende Pflanzenzelle bzw.
Pflanze als transformiert oder transgen oder auch als Transformante bezeichnet. Die vornehm
lichen Ziele der klassischen wie der modernen, auf gentechnischen Methoden basierenden
Pflanzenzüchtung sind zum einen der Pflanzenschutz, also insbesondere die Steigerung der
pflanzlichen Widerstandskraft gegenüber Phytopathogenen, und zum anderen eine Verbesse
rung der Qualität der Ernteprodukte. Beispiele für Pflanzenschutzmaßnahmen sind: i) herbi
zidtolerante Pflanzen, ii) insektenresistente, virusresistente und pilzresistente Pflanzen und iii)
ozonresistente Pflanzen. Beispiele für Qualitätssteigerungen sind: i) die Erhöhung der Halt
barkeit von Früchten, ii) die Erhöhung der Stärkeproduktion in Kartoffelknollen, iii) die Ver
änderung der Kohlenhydrat- und Lipidzusammensetzung und iv) die Produktion pflanzen
fremder Polymere.
Grundvoraussetzung für die Erzeugung transgener Pflanzen ist die Verfügbarkeit geeigneter
Transformationssysteme und das Vorhandensein selektionierbarer Marker, die die Identifi
zierung erfolgreich transformierter Pflanzenzellen ermöglichen.
Zur Transformation stehen derzeit mehrere Verfahren zur Verfügung. Die am häufigsten ein
gesetzte Methode zur Pflanzentransformation ist der Agrobakterium-vermittelte Gentransfer.
Hierbei wird die Fähigkeit des Bodenbakteriums ausgenutzt, genetisches Material in das
pflanzliche Genom zu integrieren. Weitere geeignete Verfahren sind beispielsweise die
Transformation von Protoplasten durch PEG-induzierte DNA-Aufnahme, die Elektroporation,
die Sonikation oder Mikroinjektion sowie die Transformation intakter Zellen oder Gewebe
durch Mikro- oder Makroinjektion in Gewebe oder Embryonen, Gewebeelektroporation, die
Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, Vakuuminfiltration von Samen
und der biolistische Gentransfer.
Da unabhängig vom Transformationsverfahren nur wenige Zellen die gewünschten Eigen
schaften tragen, wird herkömmlicher Weise neben dem Zielgen, also dem aus agronomischer
Sicht interessierenden Gen, ein selektionierbares Markergen in das pflanzliche Genom inte
griert, das die Identifizierung transgener Zellen auf relativ einfache und effiziente Weise
ermöglicht. Derzeit werden zur Selektion transformierter Pflanzenzellen vornehmlich Gene
eingesetzt, die eine Herbizid- oder Antibiotikatoleranz vermitteln. Geeignete Resistenzgene
sind beispielsweise das bar-Gen aus Streptomyces hygroscopicus, das Resistenz gegen das
Totalherbizid Phosphinotricin (BASTA®) vermittelt (De Block et a/l (1987) EMBO J. 6: 2513-2518),
oder das nptII-Gen aus dem Transposon Tn5 von Escherichia coli, das Resistenz
gegenüber dem Antibiotikum Kanamycin bewirkt (Herrera-Estrella et al. (1983) EMBO J.
2: 987-995).
Weitere Selektionsmarker, die in der Pflanzentransformation Verwendung finden, vermitteln
den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber G 418, Bleomycin, Hygromycin,
Methotrexat, Glyphosat, Streptomycin, Sulfonylharnstoff und Gentamycin.
Allerdings sind je nach Pflanzenart die genannten Selektionsmaßnahmen nicht immer effektiv
und beeinflussen häufig die Pflanzenregeneration negativ. Darüber hinaus ist der Einsatz von
Genen, die Antibiotikaresistenz vermitteln, im Lebensmittelbereich unerwünscht. Des
weiteren ist zur Steuerung komplexer Stoffwechselprozesse die Manipulation mehrerer
enzymatischer Schritte notwendig. D. h. die Möglichkeit transgene Pflanzen mehrfach zu
transformieren ist im Bereich des "Metabolic Modellings" essentiell. Die genannten Gründe
haben dazu geführt, dass die Suche nach weiteren selektionierbaren Markern verstärkt
vorangetrieben wird. Trotz intensiver Bemühungen sind nur wenige neue Marker zur
Selektion transformierter Pflanzenzellen erfolgreich eingesetzt worden. So konnte bspw.
durch Expression einer Mannose-6-Phosphat-Isomerase eine positive Selektion auf Mannose
haltigem Nährmedium für transformierte Pflanzenzellen etabliert werden. Ein weiteres
Verfahren nutzt die Fähigkeit einer Deaminase aus Aspergillus terreus aus, das Insektizid
Blasticidin S zu detoxifizieren.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, einen neuen Marker für die
Selektion transformierter Pflanzenzellen und Pflanzen bereitzustellen. Diese und weitere
Aufgaben werden durch die in den Patentansprüchen definierten Ausführungsformen gelöst.
Es wurde jetzt überraschenderweise gefunden, dass sich DNA-Sequenzen, die ein Protein mit
der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. einer Trehalulase, auch als Palatinose-
Hydrolase bzw. Trehalulose-Hydrolase bezeichnet, kodieren, für die Selektion transformierter
Pflanzenzellen und Pflanzen eignen.
Während Antibiotika und Herbizide zum Absterben nicht-transformierter Zellen führen, was
auch negative Auswirkungen auf die Regenerationsfähigkeit transformierter Zellen hat, führt
die erfindungsgemäße Selektion auf bzw. in Palatinose-haltigem Medium bzw. Trehalulose-
haltigem Medium nicht zum Absterben nicht-transformierter Zellen. Die erfindungsgemäßen,
transformierten Zellen können anders als die nicht-transformierten Zellen die Palatinose bzw.
Trehalulose verstoffwechseln und haben somit einen Selektionsvorteil. Ähnliches gilt für das
oben erwähnte Mannosesystem. Da allerdings viele Pflanzen Mannose natürlicherweise
verstoffwechseln können, kann der Mannose-Marker nicht in allen Nutzpflanzen eingesetzt
werden.
Die Erfindung betrifft somit ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, umfassend
- a) regulatorische Sequenzen eines in Pflanzenzellen aktiven Promotors;
- b) operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzyma tischen Aktivität einer Palatinase bzw. einer Trehalulase kodiert; und
- c) operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem Protein mit der
enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. Trehalulase ein Protein verstanden, das in der
Lage ist, Palatinose bzw. Trehalulose zu spalten, insbesondere die Umsetzung des
Disaccharids Palatinose bzw. Trehalulose in die Monosaccharide Fructose und Glucose zu
katalysieren. In dem Disaccharid Palatinose liegen die beiden Monosaccharideinheiten in
einer α1→6 glykosidischen Bindung vor, während in Trehalulose Fructose und Glucose über
eine α1→α1 glykosidische Bindung verknüpft sind.
Sequenzen, die eine Palatinase kodieren, sind im Stand der Technik beschrieben worden. So
offenbart PCT/EP 95/00165 die Sequenz eines Palatinase-Gens aus dem Bakterium
Protaminobacter rubrum sowie die Sequenz eines Palatinase-Gens aus dem Bakterium
Pseudomonas mesoacidophila MX-45.
Nukleinsäuremoleküle, in denen eine eine Palatinase kodierende DNA-Sequenz unter
Kontrolle eines pflanzlichen Promotors steht, und die Expression eines Proteins mit
Palatinase-Aktivität in Pflanzen sind ebenso neu wie die im Rahmen dieser Erfindung jetzt
erstmals offenbarte DNA-Sequenz aus Erwinia rhapontici, die ein Protein mit der enzyma
tischen Aktivität einer Palatinase kodiert. Diese Sequenz ist im beigefügten Sequenzprotokoll
unter SEQ ID No. 1 angegeben, die abgeleitete Aminosäuresequenz ist unter SEQ ID No. 2
und SEQ ID No. 3 angegeben.
Ferner wird bei der vorliegenden Erfindung erstmals eine DNA-Sequenz bereitgestellt, die ein
Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Trehalulase kodiert. Diese Sequenz ist im
beigefügten Sequenzprotokoll unter SEQ ID No. 25 angegeben, die abgeleitete Amino
säuresequenz ist unter SEQ ID No. 26 bzw. 27 angegeben.
Die Erfindung betrifft somit auch die in SEQ ID No. 1 bzw. SEQ ID No. 25 angegebenen
Nukleotidsequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw.
Trehalulase kodieren, sowie die Verwendung von Nukleinsäuremolekülen, die Proteine mit
der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. Trehalulase kodieren, zur Selektion von
transformierten Pflanzenzellen und Pflanzen.
Es wurde jetzt überraschenderweise beobachtet, dass transformierte Pflanzenzellen bzw.
Pflanzen, die eine Palatinase bzw. Trehalulase exprimieren, aufgrund dieser neuen
enzymatischen Eigenschaft auf bzw. in Palatinose- bzw. Trehalulose-haltigem Medium
wachsen und regenerieren können, während Wildtyp-Pflanzenzellen bzw. Pflanzen nicht in
der Lage sind, Palatinose bzw. Trehalulose als Kohlenhydratquelle zu verwerten, und daher
auf bzw. in Palatinose- bzw. Trehalulose-haltigem Medium weder wachsen noch
regenerieren. Diese Beobachtung läßt sich in idealer Weise für die Selektion transformierter
Pflanzenzellen und Pflanzen nutzen. Dabei sind Palatinase und Trehalulase als neue nutritive
Marker in allen Pflanzen einsetzbar, die die Disaccharide Palatinose bzw. Trehalulose
natürlicherweise nicht umsetzen und verwerten können. Da bislang Pflanzen, die Palatinose
bzw. Trehalulose verwerten können, nicht bekannt sind, können die neuen Selektionsmarker
ubiquitär eingesetzt werden. Die auf der Grundlage ihrer neuen Palatinase-Aktivität bzw.
neuen Trehalulose-Aktivität selektionierten Pflanzenzellen und Pflanzen sind phänotypisch
normal.
Dabei umfasst die vorliegende Erfindung sowohl die Möglichkeit, Pflanzen alternativ mit
einem Palatinase-Gen oder einem Trehalulose-Gen zu transformieren als auch die
Möglichkeit, Pflanzen mit einem Palatinase-Gen und mit einem Trehalulase-Gen zu
transformieren.
Die jetzt erstmals für Pflanzenzellen beobachtete Nützlichkeit von Palatinase-Sequenzen bzw.
Trehalulase-Sequenzen als nutritive Selektionsmarker, lässt sich auch erfolgreich für andere
transformierte Zellen nutzen. Grundsätzlich kann das erfindungsgemäße Prinzip der
Nutzbarmachung der nicht verwertbaren Zucker Palatinose bzw. Trehalulose auf jede Zelle
bzw. jeden Organismus übertragen werden, der natürlicherweise nicht in der Lage ist,
Palatinose bzw. Trehalulose zu verwerten.
Die Erfindung betrifft somit auch den Einsatz von DNA-Sequenzen, die ein Protein mit der
enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. Trehalulase kodieren, als Marker für die
Selektion transformierter Zellen, bei denen es sich nicht um Pflanzenzellen, sondern andere
eukaryontische oder prokaryontische Zellen bzw. Organismen handelt. Bevorzugt handelt es
sich hierbei um Mikroorganismen wie Bakterien, Viren, Pilze, Hefen und Algen.
So kann z. B. eine sekretierte Palatinase bzw. Trehalulase in beispielsweise E. coli zur
Expression gebracht und erfolgreich transformierte Bakterienzellen anschließend auf
Palatinose-haltigem bzw. Trehalulose-haltigem Medium selektioniert werden. Gleiches gilt
natürlich auch für andere Zellen bzw. Organismen. Der Fachmann ist mit den hierfür
erforderlichen Klonierungs-, Expressions- und Transformationstechniken wohl vertraut.
Die Palatinase kann auch im Zellinneren der zu selektionierenden Zelle exprimiert werden,
also z. B. im Cytosol einer E. coli-Zelle. Dies hat den Vorteil, dass weder die Palatinase noch
die durch die Palatinase-Aktivität entstehenden Hexosen in das Medium diffundieren können.
Hier bietet sich die zusätzliche Expression des im Rahmen dieser Erfindung erstmals isolier
ten und charakterisierten Palatinosetransporters an. Die vorstehenden Ausführungen gelten
analog für die Expression einer Trehalulase.
Wie in den beigefügten Beispielen im Detail erläutert wird, wurde im Rahmen dieser
Erfindung der gesamte Palatinose-Gencluster, auch als Palatinose-Operon bezeichnet, aus
Erwinia rhapontici kloniert, das folgende Gene umfasst:
| Gen | |
| Funktion des Genprodukts | |
| palI | Saccharoseisomerase |
| palR | Regulatorprotein der LysR-Familie |
| palE | Palatinose-bindendes Protein, Bestandteil des ABC-Transportsystems zur Aufnahme von Palatinose in die Zelle |
| palF | integrales Membranprotein, Permease, Bestandteil des ABC-Transportsystems |
| palG | integrales Membranprotein, Permease, Bestandteil des ABC-Transportsystems |
| palH | vermutlich Hydrolase-Aktivität |
| palK | ATP-bindendes Protein, Bestandteil des ABC-Transportsystems, energetisiert Palatinose-Aufnahme in die Zelle |
| palQ | Palatinase |
| palZ | Trehalulase |
Entsprechend führt die Übertragung des gesamten Operons oder zumindest der am ABC-
Transportsystem beteiligten Gene palE, palF, palG und palK zur Expression des Palatinose-
Transporters in den transformierten Zellen, vorzugsweise Mikroorganismen. Die den
Transporter exprimierenden Zellen können die Palatinose bzw. Trehalulose aus dem Medium
aufnehmen, so dass die Hydrolyse durch den Selektionsmarker Palatinase bzw. Trehalulase
im Cytosol der Zelle erfolgen kann.
Die DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw.
Trehalulase kodiert, kann aus natürlichen Quellen isoliert oder nach herkömmlichen
Verfahren synthetisiert werden. Mittels gängiger molekularbiologischer Techniken (siehe bei
spielsweise Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) ist es möglich,
gewünschte Konstrukte für die Transformation von Pflanzenzellen vorzubereiten bzw.
herzustellen. Die für die gentechnische Manipulation in prokaryontischen Zellen
üblicherweise eingesetzten Klonierungs-, Mutagenisierungs-, Sequenzanalyse-,
Restriktionsanalyse- und weitere biochemisch-molekularbiologischen Methoden sind dem
Durchschnittsfachmann wohl bekannt. So können nicht nur geeignete chimäre Genkonstrukte
mit der gewünschten Fusion von Promotor und Palatinase- bzw. Trehalulase-DNA-Sequenz
und ggf. weiteren Regulations- und/oder Signalsequenzen hergestellt werden, vielmehr kann
der Fachmann, falls erwünscht, zusätzlich mittels Routmetechniken, verschiedenartige
Mutationen in die die Palatinase bzw. Trehalulase kodierende DNA-Sequenz einführen,
wodurch es zur Synthese von Proteinen mit eventuell veränderten biologischen Eigenschaften
kommt.
Hierbei ist zum einen die Erzeugung von Deletionsmutanten möglich, bei denen durch
fortschreitende Deletion vom 5'- oder vom 3'-Ende der kodierenden DNA-Sequenz die
Synthese entsprechend verkürzter Proteine erreicht werden kann. Ferner ist es möglich,
gezielt Enzyme herzustellen, die durch Addition entsprechender Signalsequenzen in
bestimmten Kompartimenten der Pflanzenzelle lokalisiert sind. Derartige Sequenzen sind in
der Literatur beschrieben und dem Durchschnittsfachmann wohl bekannt (siehe z. B. Braun et
ait (1992) EMBO J. 11: 3219-3227; Wolter F. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85: 846-850; Sonnewald U. et al. (1991) Plant J. 1: 95-106).
Weiterhin ist auch die Einführung von Punktmutationen denkbar an Positionen, bei denen
eine Veränderung der Aminosäuresequenz einen Einfluss beispielsweise auf die Enzymakti
vität oder die Regulierung des Enzyms hat. Auf diese Weise können z. B. Mutanten hergestellt
werden, die nicht mehr den normalerweise in der Zelle herrschenden Regulationsmechanis
men über allosterische Regulation oder kovalente Modifizierung unterliegen.
Des weiteren können Mutanten hergestellt werden, die eine veränderte Substrat- oder
Produktspezifität aufweisen. Weiterhin können Mutanten hergestellt werden, die ein ver
ändertes Aktivitäts-, Temperatur- und/oder pH-Profil aufweisen.
Für die gentechnische Manipulation in prokaryontischen Zellen können die erfindungs
gemäßen rekombinanten Nukleinsäuremoleküle oder Teile davon in Plasmide eingebracht
werden, die eine Mutagenese oder eine Sequenzveränderung durch Rekombination von DNA-
Sequenzen erlauben. Mit Hilfe von Standardverfahren (siehe z. B. Sambrook et al. (1989),
vide supra) können Basenaustausche vorgenommen oder natürliche oder synthetische
Sequenzen hinzugefügt werden. Für die Verbindung der DNA-Fragmente untereinander
können an die Fragmente, wo erforderlich, Adapter oder Linker angefügt werden. Ferner
können mittels enzymatischer und anderer Manipulationen passende Restriktionsschnittstellen
zur Verfügung gestellt oder überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernt werden.
Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen in Frage kommen, können in vitro-
Mutagenese, "primer repair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Als Analyse
methoden werden im allgemeinen Sequenzanalyse, Restriktionsanalyse und weitere
biochemisch-molekularbiologische Methoden durchgeführt.
Wie oben erwähnt, wird im Rahmen dieser Erfindung eine neue Palatinase-DNA-Sequenz aus
Erwinia rhapontici bereitgestellt. Weitere im Rahmen dieser Erfindung geeignete DNA-
Sequenzen, die ein Protein mit Palatinase-Aktivität kodieren, sind in PCT/EP 95/00165
beschrieben. Auf die Offenbarung dieser Patentanmeldung wird hiermit Bezug genommen,
sowohl hinsichtlich der offenbarten Sequenzen selbst, als auch im Hinblick auf die Auffin
dung und Charakterisierung dieser Palatinase-Sequenzen.
Weiterhin werden im Rahmen dieser Erfindung neben einer neuen Palatinase-DNA-Sequenz
und einer neuen Trehalulase-DNA-Sequenz weitere für die Palatinoseaufnahme in Zellen
notwendige Gene eines Palatinose-Transportersystems aus Erwinia rhapontici bereitgestellt.
Darüber hinaus kann der Fachmann weitere DNA-Sequenzen, die Proteine mit Palatinase-
bzw. Trehalulase-Aktivität kodieren, der einschlägigen Literatur und den Gendatenbanken
unter Verwendung geeigneter Suchprofile und Computerprogramme für das Screening nach
homologen Sequenzen bzw. für Sequenzvergleiche entnehmen.
Darüber hinaus kann der Fachmann weitere DNA-Sequenzen, die Proteine mit Palatinase-
bzw. Trehalulase-Aktivität kodieren, aus anderen Organismen mittels herkömmlicher
molekularbiologischer Techniken selbst auffinden und im Rahmen der vorliegenden
Erfindung einsetzen. So kann der Fachmann bspw. geeignete Hybridisierungssonden von den
bekannten Palatinase-Sequenzen ableiten und für das Screening von cDNA- und/oder
genomischen Banken des jeweils gewünschten Organismus, aus dem ein neues Palatinase-
Gen isoliert werden soll, einsetzen. Hierbei kann der Fachmann auf geläufige
Hybridisierungs-, Klonierungs- und Sequenzierungsmethoden zurückgreifen, die in jedem
bio- oder gentechnologischen Labor wohl bekannt und etabliert sind (siehe z. B. Sambrook et
al. (1989), vide supra). Diese im Zusammenhang mit Palatinase-DNA-Sequenzen gemachten
Ausführungen gelten auch für die übrigen, im Rahmen dieser Erfindung erstmals zur
Verfügung gestellten DNA-Sequenzen aus Erwinia rhapontici, insbesondere für die
erfindungsgemäße Trehalulase-DNA-Sequenz.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzyma
tischen Aktivität einer Palatinase kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
- a) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die die in SEQ ID No. 3 angegebene Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren,
- b) DNA-Sequenzen, die die in SEQ ID No. 1 angegebene Nukleotidsequenz oder Teile davon umfassen,
- c) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz, die mit einem komplementären Strang der Nukleotidsequenz von a) oder b) hybridisieren, oder Teile dieser Nukleotidsequenz umfassen,
- d) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz, die zu einer Nukleotidsequenz von c) degeneriert ist, oder Teile dieser Nukleotidsequenz umfassen,
- e) DNA-Sequenzen, die ein Derivat, Analog oder Fragment einer Nukleotidsequenz von a), b), c) oder d) darstellen.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist die DNA-Sequenz, die ein Protein mit der
enzymatischen Aktivität einer Palatinase kodiert, ausgewählt aus den in PCT/EP 95/00165 in
SEQ ID No. 7 und SEQ ID No. 15 angegebenen DNA-Sequenzen sowie DNA-Sequenzen, die
eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die mit einem komplementären Strang dieser DNA-
Sequenzen hybridisieren, sowie DNA-Sequenzen, die eine Nukleinsäuresequenz umfassen,
die zu einer der vorangehend genannten Nukleinsäuresequenzen degeneriert ist und DNA-
Sequenzen, die ein Derivat, Analog oder Fragment einer der vorangehenden Nukleinsäure
sequenzen darstellen und ein Protein mit Palatinase-Aktivität kodieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzyma
tischen Aktivität einer Trehalulase kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
- a) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die die in SEQ No. 27 angegebene Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren,
- b) DNA-Sequenzen, die die in SEQ ID No. 25 angegebene Nukleotidsequenz oder Teile davon umfassen,
- c) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz, die mit einem komplementären Strang der Nukleotidsequenz von a) oder b) hybridisieren, oder Teile dieser Nukleotidsequenz umfassen,
- d) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz, die zu einer Nukleotidsequenz von c) degeneriert ist, oder Teile dieser Nukleotidsequenz umfassen,
- e) DNA-Sequenzen, die ein Derivat, Analog oder Fragment einer Nukleotidsequenz von a), b), c) oder d) darstellen.
Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet im Rahmen dieser Erfindung eine Hybridisierung unter
konventionellen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen,
wie sie beispielsweise in Sambrook et al. (1989, vide supra) beschrieben sind. Besonders
bevorzugt sind die stringenten Bedingungen wie folgt: 1 × SSC, 0,1% SDS bei einer
Hybridisierungstemperatur von 55°C für eine Dauer von 1 h.
DNA-Sequenzen, die mit den DNA-Sequenzen hybridisieren, die ein Protein mit der
enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. Trehalulase kodieren, können z. B. aus
genomischen oder cDNA-Bibliotheken eines beliebigen Organismus, der Palatinase-DNA-
Sequenzen bzw. Trehalulase-DNA-Sequenzen natürlicherweise besitzt, isoliert werden. Die
Identifizierung und Isolierung derartiger DNA-Sequenzen kann dabei z. B. unter Verwendung
von DNA-Sequenzen erfolgen, die exakt oder im wesentlichen die in SEQ ID No. 1 bzw.
SEQ ID No. 25 angegebene Nukleotidsequenz oder Teile davon oder eine der oben erwähnten
eine Palatinase bzw. Trehalulase kodierenden Nukleotidsequenzen des Standes der Technik
oder Teile dieser Sequenzen aufweisen, bzw. der reversen Komplemente dieser DNA-
Sequenzen, z. B. mittels Hybridisierung nach Standardverfahren (siehe z. B. Sambrook et al.
(1989), vide supra). Bei den als Hybridisierungssonde verwendeten Fragmenten kann es sich
auch um synthetische Fragmente handeln, die mit Hilfe üblicher Synthesetechniken
hergestellt wurden und deren Sequenz im wesentlichen mit einer der oben erwähnten
Palatinase-DNA-Sequenzen bzw. Trehalulase-DNA-Sequenzen oder einem Teil davon
übereinstimmt. Die DNA-Sequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer
Palatinase bzw. Trehalulase kodieren, umfassen auch DNA-Sequenzen, deren Nukleotid
sequenzen zu der einer der vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen degeneriert ist. Die
Degeneration des genetischen Codes bietet dem Fachmann u. a. die Möglichkeit, die Nukle
otidsequenz der DNA-Sequenz an die Codonpräferenz (codon usage) der Zielpflanze, also der
aufgrund der Expression der Palatinase-DNA-Sequenz auf bzw. in Palatinose-haltigem
Medium selektionierbaren Pflanze bzw. Pflanzenzelle anzupassen und die Expression dadurch
zu optimieren.
Die oben beschriebenen DNA-Sequenzen umfassen auch Fragmente, Derivate und allelische
Varianten der oben beschriebenen DNA-Sequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen
Aktivität einer Palatinase bzw. Trehalulase kodieren. Unter "Fragmenten" werden dabei Teile
der DNA-Sequenz verstanden, die lang genug sind, um eines der beschriebenen Proteine zu
kodieren. Der Ausdruck "Derivat" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die Sequenzen
sich von den oben beschriebenen DNA-Sequenzen an einer oder mehreren Positionen unter
scheiden, aber einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufweisen. Homologie
bedeutet dabei eine Sequenzidentität von mindestens 40 Prozent, insbesondere eine Identität
von mindestens 60 Prozent, vorzugsweise über 80 Prozent und besonders bevorzugt über 90
Prozent. Dabei weisen die durch diese DNA-Sequenzen kodierten Proteine eine
Sequenzidentität zu der in SEQ ID No. 2 und 3 bzw. SEQ ID No. 26 und 27 angegebenen
Aminosäuresequenz von mindestens 80 Prozent, vorzugsweise 85 Prozent und besonders
bevorzugt über 90 Prozent, 95 Prozent und 98 Prozent auf. Die Abweichungen zu den oben
beschriebenen DNA-Sequenzen können dabei beispielsweise durch Deletion, Substitution,
Insertion oder Rekombination entstanden sein.
Bei den DNA-Sequenzen, die homolog zu den oben beschriebenen Sequenzen sind und Deri
vate dieser Sequenzen darstellen, handelt es sich in der Regel um Variationen dieser Sequen
zen, die Modifikationen darstellen, die dieselbe biologische Funktion ausüben. Es kann sich
dabei sowohl um natürlicherweise auftretende Variationen handeln, beispielsweise um Se
quenzen aus anderen Organismen oder um Mutationen, wobei diese Mutationen auf natürliche
Weise aufgetreten sein können oder durch gezielte Mutagenese eingeführt wurden. Ferner
kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. Bei den
allelischen Varianten kann es sich sowohl um natürlich auftretende Varianten handeln, als
auch um synthetisch hergestellte oder durch rekombinante DNA-Techniken erzeugte
Varianten. Obige, im Zusammenhang mit Palatinase- bzw. Trehalulase-DNA-Sequenzen
gemachten Ausführungen gelten auch für die übrigen, im Rahmen dieser Erfindung erstmals
zur Verfügung gestellten DNA-Sequenzen aus Erwinia rhapontici.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stammen die beschriebenen, für eine
Palatinase bzw. Trehalulase kodierenden DNA-Sequenzen aus Erwinia rhapontici.
Für die Expression der in den erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremolekülen
enthaltenen DNA-Sequenz in pflanzlichen Zellen ist diese mit regulatorischen Sequenzen
verknüpft, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten. Hier kommt jeder in
pflanzlichen Zellen aktive Promotor in Frage.
Dabei kann der Promotor so gewählt sein, dass die Expression konstitutiv erfolgt oder nur in
einem bestimmten Gewebe oder Organ, zu einem bestimmten Zeitpunkt der Pflanzenentwick
lung und/oder zu einem durch äußere Einflüsse, biotische oder ablotische Stimuli bestimmten
Zeitpunkt (induzierte Genexpression). In Bezug auf die zu transformierende Pflanze kann der
Promotor homolog oder heterolog sein.
Geeignete Promotoren sind z. B. der 35S RNA-Promotor des Cauliflower Mosaic Virus und
der Ubiquitin-Promotor aus Mais für eine konstitutive Expression, ein Promotor, der eine
Expression lediglich in photosynthetisch aktiven Geweben garantiert, z. B. der ST-LS1-
Promotor (Stockhaus et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7943-7947; Stockhaus et al.
(1989) EMBO J. 8: 2445-2451) oder ein Promotor, der während der Pflanzentransformation,
der Pflanzenregeneration oder bestimmten Stadien dieser Prozesse aktiv ist, wie z. B.
zellteilungsspezifische Promotoren wie der Histon H3-Promotor (Kapros et al. (1993) InVitro
Cell Cev. Biol. Plant 29: 27-32) oder das chemisch induzierbare Tet-Repressor-System (Ganz
et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227: 229-237). Weitere geeignete Promotoren können der
Literatur, z. B. Ward (1993, Plant Mol. Biol. 22: 361-366), entnommen werden. Gleiches gilt für
induzierbare und zell- bzw. gewebespezifische Promotoren, wie Meristem-spezifische
Promotoren, die ebenfalls in der Literatur beschrieben worden sind und im Rahmen der
Erfindung ebenfalls geeignet sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor der 35S RNA-Promotor von CaMV.
Ferner sind Transkriptions- bzw. Terminationssequenz vorhanden, die der korrekten Beendi
gung der Transkription dient, sowie der Addition eines polyA-Schwanzes an das Transkript
dienen kann, dem eine Funktion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen wird.
Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben (z. B. Gielen (1989) EMBO J. 8: 23-29)
und beliebig austauschbar, z. B. der Terminator des Octopinsynthasegens aus Agrobacterium
tumefaciens.
Die Erfindung betrifft weiterhin Vektoren, die erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle
enthalten und deren Verwendung die Selektion transformierter Pflanzenzellen und Pflanzen
ermöglicht. Dabei handelt es sich insbesondere um Plasmide, Cosmide, Viren, Bakterio
phagen und andere in der Gentechnik gängige Vektoren.
Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen bzw. deren Zellen stehen
eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E. coli
und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für
derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewün
schte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt
werden. Das erhaltene Plasmid wird dann für die Transformation von E. coli-Zellen verwen
det. Transformierte E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet und an
schließend geerntet und lysiert, und das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysenmetho
de zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktions
analysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden ein
gesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten und gewonnene DNA-
Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße rekombinante
Nukleinsäuremolekül, das eine eine Palatinase bzw. Trehalulase kodierende DNA-Sequenz
enthält, oder der erfindungsgemäße Vektor, enthaltend ein erfindungsgemäßes Nuklein
säuremolekül mit einer Palatinase- bzw. Trehalulase-DNA-Sequenz, mindestens ein weiteres
rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das eine beliebige genetische Information trägt, die
zusammen mit der Palatinase-DNA-Sequenz auf Pflanzenzellen bzw. Pflanzen übertragen
werden soll. Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle und
Vektoren kann jede beliebige Information, die in dem weiteren rekombinanten Nuklein
säuremolekül enthalten ist, auf Pflanzen und Pflanzenzellen übertragen und anschließend
mittels Selektion auf Palatinose- bzw. Trehalulose-haltigem Medium auf die gewünschte
Information selektioniert werden.
Dem auf dem Gebiet der pflanzlichen Molekularbiologie tätigen Fachmann ist daneben auch
bekannt, dass die zusätzliche genetische Information, die auf Pflanzenzellen transferiert
werden soll, nicht unbedingt zusammen mit den Selektionsmarkern Palatinase und
Trehalulase auf demselben Vektor vorliegen muß. Vielmehr können das Nukleinsäure
molekül, das den Selektionsmarker trägt, einerseits und das Nukleinsäuremolekül, das die
zusätzliche Information trägt, andererseits auch getrennt voneinander in eine Pflanzenzelle
eingebracht werden, sog. Co-Transformation. Dieses Vorgehen bietet sich besonders in den
Fällen an, in denen eine physikalische Kopplung des Markergens und der zu übertragenen
Information nicht gewünscht wird. In diesem Fall können nach der Selektion der
Primärtransformanten das Markergen und die gewünschte Information in nachfolgenden
Kreuzungen unabhängig voneinander segregieren.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält das weitere rekombinante
Nukleinsäuremolekül eine DNA-Sequenz, die ein Peptid, ein Protein, eine Antisense-RNA,
eine Sense-RNA, eine virale RNA oder ein Ribozym kodiert. Einige Beispiele zur
heterologen Expression bzw. Überexpression und zur Antisense-Inhibierung mit dem Ziel,
Stoffwechselwege in transgenen Pflanzen zu manipulieren, sind in Herbers and Sonnewald
(1996, TIBTECH 14: 198-205) zusammengefaßt. Andere Ziele sind insbesondere die
Übertragung von Resistenzen, die Nutzung von Pflanzen als Produktionsstätte für Proteine,
Kohlenhydrate, Fette, nachwachsende Rohstoffe und andere, von Pflanzen synthetisierbaren
Stoffen.
Die erfindungsgemäßen Vektoren und Nukleinsäuremoleküle können weitere regulatorische
Sequenzen und/oder Funktionseinheiten besitzen, die z. B. als Enhancer wirken oder eine
Stabilisierung des Vektors in der Wirtszelle bewirken. Wie oben erwähnt, können die
kodierenden Sequenzen auch durch Signalsequenzen ergänzt sein, die für den Transport des
Genprodukts, also vorliegend des Proteins mit Palatinase- bzw. Trehalulase-Aktivität, zu
einem bestimmten Kompartiment sorgen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sorgen Signalsequenzen dafür, das die
Palatinase bzw. Trehalulase in die Zellwand der transformierten Pflanzenzellen transportiert
wird, d. h. die transformierten Pflanzen exprimieren eine chimäre Palatinase bzw. Trehalulase,
die ein Signalpeptid für den Transport in die Zellwand umfasst. In der Zellwand spaltet das
jeweilige Enzym die im Medium angebotene Palatinose bzw. Trehalulose zu Glukose und
Fruktose, welche in die Zelle aufgenommen und verstoffwechselt werden.
Geeignete Signalsequenzen, die die Aufnahme in das Endoplasmatische Retikulum
gewährleisten, kann der Fachmann der einschlägigen Literatur entnehmen. Besonders
geeignet ist bspw. die für das Signalpeptid des Proteinase-Inhibitor II-Gens aus Kartoffel
kodierende Sequenz (Keil et al. (1996) Nucl. Acids Res. 14: 5641-5650; Genbank Accession
No. X04118).
Die Erfindung betrifft auch Wirtszellen, die die erfindungsgemäßen rekombinanten Nuklein
säuremolekül oder Vektoren enthalten, wobei die Moleküle oder Vektoren transient oder
stabil vorliegen können. Wirtszelle kann dabei jede Zelle und jeder Organismus sein, die bzw.
der in der Lage ist, rekombinante DNA aufzunehmen und ggf. aufgenommene DNA-Sequenz
zu exprimieren. Hier kommen prokaryontische und eukaryontische Zellen bzw. Organismen
in Frage, insbesondere Mikroorganismen wie Bakterien, Viren, Pilze, Hefen und Algen, aber
auch Pflanzenzellen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle oder Vektoren oder
Teile oder Derivate davon enthalten. Vorzugsweise sind diese Pflanzenzellen aufgrund der
Aufnahme der erfindungsgemäßen, eine Palatinase bzw. Trehalulase kodierenden DNA-
Sequenzen in der Lage, Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw.
Trehalulase zu synthetisieren.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Kits, die i) ein erfindungsgemäßes
rekombinantes Nukleinsäuremolekül oder einen erfindungsgemäßen Vektor, wobei das
Nukleinsäuremolekül oder der Vektor auch in einer Wirtszelle vorliegen können, und ii) ggf.
Palatinose oder ein zu Palatinose äquivalentes Kohlenhydrat enthalten.
Bei dem zu Palatinose äquivalenten Kohlenhydrat kann es sich allgemein um ein Disaccharid
handeln, bei dem ein Fructose- und ein Glucosemolekül über eine α-glykosidische Bindung
verknüpft sind, wie bspw. Turanose (3-O-α-D-glucopyranosyl-D-fructose) oder Trehalulose
(1-O-α-D-glucopyranosyl-D-fructose). Die Gewinnung und Reinigung von Trehalulose ist
beispielsweise in T. Veronese et al., Biotechnology Techniques (1999) 13: 43-48 beschrieben.
Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremoleküle und
Vektoren ist es möglich, Palatinase bzw. Trehalulase als nutritive Selektionsmarker und
Palatinose bzw. Trehalulose als nutritive Selektionsmittel für die Pflanzentransformation
einzusetzen. Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur Selektion
transformierter Pflanzenzellen, umfassend die Schritte:
- a) Einführung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, umfassend
- a) regulatorische Sequenzen eines in Pflanzenzellen aktiven Promotors;
- b) operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. Trehalulase kodiert; und
- c) operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Termi nations- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können,
- b) Selektion der transformierten Pflanzenzellen auf bzw. in Palatinose bzw. Trehalulose oder ein zu Palatinose äquivalentes Kohlenhydrat enthaltendem Medium.
Voraussetzung für die Einführung der erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäure
moleküle und Vektoren in Pflanzenzellen ist die Verfügbarkeit geeigneter Transformations
systeme. Hier wurde während der letzten zwei Jahrzehnte ein breites Spektrum an Transfor
mationsmethoden entwickelt und etabliert. Diese Techniken umfassen die Transformation
pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder
Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, Diffusion von Protoplasten, den
direkten Gentransfer isolierter DNA in Protoplasten, die Injektion und Elektroporation von
DNA in Pflanzenzellen, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methoden sowie
weitere Möglichkeiten, wobei der Fachmann die jeweils geeignete Methode problemlos
ermitteln kann. Sämtliche Transformationsverfahren sind seit vielen Jahren gut etabliert und
gehören zweifelsohne zum Standardrepertoire des Fachmanns in der pflanzlichen Molekular
biologie, Pflanzenbiotechnologie und Zell- und Gewebekultur.
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden per se keine spe
ziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Ähnliches gilt für den direkten
Gentransfer. Es können einfache Plasmide, wie z. B. pUC-Derivate, verwendet werden. Sollen
aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesen
heit eines selektierbaren Markergens empfehlenswert.
Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-
Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti-
oder Ri-Plasmid verwendet, so muss mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die
rechte und linke Begrenzung der im Ti- bzw. Ri-Plasmid enthaltenen T-DNA als Flanken
bereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden. Werden für die Transformation
Agrobakterien verwendet, muss die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert wer
den, und zwar entweder in einen intermediären oder in einen binären Vektor. Die interme
diären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA
sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert
werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region.
Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplas
mids kann der intermediäre Vektor aufAgrobacterium tumefaciens übertragen werden (Kon
jugation). Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren.
Sie enthalten ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker, welche von der
rechten und linken T-DNA-Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agro
bakterien transformiert werden. Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid,
das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die
Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transfor
mierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet. Die Verwen
dung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und
ausreichend in allseits bekannten Übersichtsartikeln und Handbüchern zur Pflanzentrans
formation beschrieben worden.
Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßiger
weise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kultiviert werden. Aus
dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch
Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten
Medium, welches Palatinose bzw. Trehalulose oder ein äquivalentes Kohlenhydrat zur
Selektion transformierter Pflanzenzellen enthält, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden.
Das Selektionsmedium sollte allgemein mindestens 0,1% Palatinose bzw. Trehalulose,
möglichst zwischen 0,1 und 3,0% Palatinose bzw. Trehalulose enthalten. Bevorzugt liegt die
Palatinose- bzw. Trehalulose-Konzentration zwischen 0,8 und 2,4% und besonders bevorzugt
zwischen 1,0 und 2,0%. Am meisten bevorzugt wird ein Palatinose- bzw. Trehalulose-Gehalt
im Medium von 1,6%. Dabei sind Palatinose bzw. Trehalulose als Selektionsmedien die
einzigen Kohlenstoffquellen im Medium.
Die Regeneration der transgenen Pflanzen aus transgenen Pflanzenzellen erfolgt nach übli
chen Regenerationsmethoden unter Verwendung üblicher Nährmedium und Phytohormone,
mit der Abweichung, dass Palatinose bzw. Trehalulose als Selektionsmittel anwesend ist.
Falls die Selektionsmarker Palatinase bzw. Trehalulase nach erfolgter Transformation und
Identifizierung erfolgreich transformierter Zellen bzw. Pflanzen wieder entfernt werden soll,
stehen dem Fachmann hierfür verschiedene Strategien zur Verfügung. So können z. B.
sequenzspezifische Rekombinasen verwendet werden, z. B. in Form der Retransformation
einer Rekombinase-exprimierenden Ausgangslinie und Auskreuzung der Rekombinase nach
erfolgter Entfernung des Selektionsmarkers (siehe z. B. Reiss et al. (1996) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 93: 3094-3098; Bayley et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 353-361; Lloyd et al.
(1994) Mol. Gen. Genet. 242: 653-657; Mäser et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170-176;
Onouchi et al. (1991) Nucl. Acids Res. 19: 6373-6378). Der Selektionsmarker kann auch, wie
oben erwähnt, durch Cotransformation mit anschließender Auskreuzung entfernt werden.
Des weiteren betrifft die Erfindung Pflanzenzellen, die ein erfindungsgemäßes Nukleinsäure
molekül oder einen erfindungsgemäßen Vektor mit Palatinase- bzw. Trehalulase-DNA-
Sequenzen enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße
Pflanzenzelle mindestens ein weiteres Fremdgen. Wie bereits oben erwähnt, ist für die
Möglichkeit der Beeinflussung komplexer Stoffwechselwege die Manipulation mehrerer
enzymatischer Schritte notwendig und daher die Möglichkeit transgene Pflanzen mehrfach zu
transformieren essentiell. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen rekombinanten
Nukleinsäuremoleküle und Vektoren stehen dem Fachmann jetzt neue Marker zur Selektion
transformierter, insbesondere mehrfach transformierter Pflanzenzellen zur Verfügung.
Gegenstand der Erfindung sind auch die durch Regeneration der erfindungsgemäßen Pflan
zenzellen erhältlichen transgenen Pflanzen. Bei der transgenen Pflanze bzw. den transgenen
Pflanzenzellen kann es sich um jede beliebige monokotyle oder dikotyle Pflanze bzw.
Pflanzenzelle handeln, vorzugsweise handelt es sich um Nutzpflanzen bzw. Zellen von
Nutzpflanzen.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Ernteprodukte und Vermehrungsmaterial transgener Pflanzen,
deren Zellen oder Geweben ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül enthalten. Bei den
Ernteprodukten und dem Vermehrungsmaterial handelt es sich insbesondere um Früchte,
Samen, Knollen, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge, etc.
Wenn die Expression der Palatinase bzw. Trehalulase in den transgenen Pflanzenzellen und
Pflanzen unter Kontrolle eines konstitutiven Promotors steht, können auch die Pflanzen,
Pflanzenteile, Ernteprodukte und Vermehrungsmaterial anhand der Fähigkeit, Palatinose bzw.
Trehalulose zu verwerten und daher auf bzw. in Palatinose-haltigem Medium bzw.
Trehalulose-haltigem Medium zu wachsen, identifiziert werden. Steht die Palatinase- bzw.
Trehalulase-DNA-Sequenz unter Kontrolle eines z. B. induzierbaren oder zell- bzw.
gewebespezifischen Promotor müssen die Pflanzen, Pflanzenteile, Ernteprodukte und
Vermehrungsmaterial ggf. mittels molekularbiologischer oder biochemischer Methoden
identifiziert werden.
Unabhängig von den verwendeten regulatorischen Sequenzen, unter deren Kontrolle die
Expression der Palatinase-DNA-Sequenzen steht, steht dem Fachmann ein breites Spektrum
an molekularbiologischen und/oder biochemischen Verfahren für die Analyse der
transformierten Pflanzenzellen, transgenen Pflanzen, Pflanzenteile, Ernteprodukte und
Vermehrungsmaterial zur Verfügung, z. B. PCR, Northern Blot-Analyse zum Nachweis
Palatinase-spezifischer RNA bzw. zur Bestimmung der Höhe der Akkumulation von
Palatinase-spezifischer RNA, Southern Blot-Analyse zur Identifizierung von Palatinase
kodierenden DNA-Sequenzen oder Western Blot-Analyse zum Nachweis des durch die
erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle kodierten Palatinase. Selbstverständlich kann der
Nachweis der enzymatischen Aktivität der Palatinase auch vom Fachmann mittels in der
Literatur erhältlicher Protokolle bestimmt werden. Weiter kann man z. B. den durch Selbstung
oder Kreuzungen erhaltenen Samen auf Palatinose-haltigem Medium auslegen und anhand
der Keimfähigkeit und des Wachstums der Tochtergeneration(en) und des
Segregationsmusters Rückschlüsse auf den Genotyp der jeweiligen Pflanze schließen.
Die vorstehenden Ausführungen gelten analog für die Analyse von mit Trehalulase-DNA-
Sequenzen transformierten Pflanzenzellen und Pflanzen.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von DNA-Sequenzen, die ein Protein mit
der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. Trehalulase kodieren, als Selektionsmarker
in der Pflanzentransformation bzw. der Zell- und Gewebekultur. In einer bevorzugten
Ausführungsform handelt es sich um die Verwendung eines erfindungsgemäßen
rekombinanten Nukleinsäuremoleküls oder Vektors als Selektionsmarker in der Herstellung
transgener Pflanzenzellen und Pflanzen.
Die Erfindung basiert auf der Beobachtung, dass sich DNA-Sequenzen, die ein Protein mit
der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. Trehalulase kodieren, als Selektionsmarker
in der Pflanzentransformation nutzen lassen, was in den nachfolgenden Beispielen, die nur der
Veranschaulichung der Erfindung dienen und in keiner Weise als Einschränkung zu verstehen
sind, erläutert wird.
Gentechnische Verfahren, die den Ausführungsbeispielen zugrunde liegen:
Klonierungsverfahren wie z. B.: Restriktionsspaltungen, DNA-Isolierung, Agarose-Gelelek
trophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose
und Nylon Membranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli
Zellen, Anzucht von Bakterien, Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden nach Sambrook
et al. (1989, vide supra) durchgeführt. Die Transformation von Agrobacterium tumefaciens
wurde entsprechend der Methode von Höfgen und Willmitzer (1988, Nucl. Acids Res.
16: 9877) ausgeführt. Die Anzucht der Agrobacterien erfolgte in YEB Medium (Vervliet et al.
(1975) Gen. Virol. 26: 33).
Zur Herstellung einer genomischen Bank aus Erwinia rhapontici (DSM 4484) wurde chromo
somale DNA aus den Zellen einer 50 ml-Übernachtkultur nach Standardprotokoll isoliert.
Anschließend wurden ca. 300 µg der DNA mit dem Restriktionsenzym Sau3A partialverdaut
und auf einem präparativen Agarosegel aufgetrennt. Fragmente zwischen 5 und 12 kb wurden
mittels Qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden) aus dem Gel eluiert. Die so erhaltenen
DNA-Fragmente wurden in BamHI-verdaute Lambda ZAP-Express-Arme (Stratagene, La
Jolla, USA) ligiert und anschließend in vitro verpackt (Gigapack III Gold Packaging Extract,
Stratagene, nach Herstellerangaben). E. coli-Bakterien des Stammes XL-MRF' (Stratagene)
wurden mit rekombinanten Lambda-Phagen infiziert, der Titer der Bank bestimmt und
schließlich die Bank amplifiziert.
Zur Isolierung von genomischen Klonen wurden ca. 105 Phagen plattiert. Nach Transfer der
Phagen auf Nylonfilter (Genescreen, NEN) wurden die Filter mit einem radioaktiv markierten
DNA-Fragment hybridisiert. Positive Signale wurden mittels Autoradiographie sichtbar
gemacht und vereinzelt.
E. coli (XL-1 Blue, XL-MRF' und XLOLR)-Bakterien wurden von der Firma Stratagene
bezogen. Erwinia rhapontici (DSM 4484) wurde von der Deutschen Sammlung für Mikro
organismen und Zellkulturen GmbH (Braunschweig, Deutschland) bezogen. Der zur
Pflanzentransformation eingesetzte Agrobacterium-Stamm (C58C1 mit dem Plasmid pGV
3850kan) wurde von Debleare et al. (1985, Nucl. Acids Res. 13: 4777) beschrieben.
Zur Klonierung wurden die Vektoren pCR-Blunt (Invitrogen, Niederlande), pMAL-c2 (New
England Biolabs), pUC 19 (Yanish-Perron (1985) Gene 33: 103-119) und Bin19 (Bevan
(1984) Nucl. Acids Res. 12: 8711-8720) verwendet.
Zur Transformation von Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum L. cv. Samsun NN) wurden 10 ml
einer unter Selektion gewachsenen Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens abzentri
fugiert, der Überstand verworfen, und die Bakterien im gleichen Volumen Antibiotika-freien
Mediums resuspendiert. In einer sterilen Petrischale wurden Blattscheiben steriler Pflanzen
(Durchmesser ca. 1 cm) in dieser Bakterienlösung gebadet. Anschließend wurden die Blatt
scheiben in Petrischalen auf MS-Medium (Murashige und Skoog (1962) Physiol. Plant
15: 473) mit 2% Saccharose und 0,8% Bacto-Agar ausgelegt. Nach 2-tägiger Inkubation im
Dunkeln bei 25°C wurden sie auf MS-Medium mit 500 mg/l Claforan, 1 mg/l Benzylamino
purin (BAP), 0,2 mg/l Naphthylessigsäure (NAA), 1,6% Palatinose bzw. 1,6% Trehalulose
und 0,8% Bacto-Agar übertragen und die Kultivierung (16 Stunden Licht/8 Stunden
Dunkelheit) fortgesetzt. Wachsende Sprosse wurden auf hormonfreies MS-Medium mit 250 mg/l
Claforan und 0,8% Bacto-Agar überführt.
Die Klonierung eines Subfragments der Saccharoseisomerase erfolgte mittels Polymerase-
Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR). Als Matrizenmaterial diente genomische
DNA aus E. rhapontici, die nach Standardprotokoll isoliert wurde. Die Amplifizierung
erfolgte unter Verwendung der spezifischen Primer
- - FB 83 5'-GGATCCGGTACCGTTCAGCAATCAAAT-3' und
- - FB 84 5'-GTCGACGTCTTGCCAAAAACCTT-3',
die von einer Saccharoseisomerase-Sequenz des Standes der Technik abgeleitet wurden.
Primer FB 83 umfaßt die Basen 109-127 und Primer FB 84 die Basen 1289-1306 der
kodierenden Region des Saccharoseisomerase-Gens von E rhapontici. Das PCR-Reaktions
gemisch (100 µl) enthielt chromosomale Bakterien DNA (1 µg), Primer FB 83 und FB 84
(jeweils 250 ng), Pfu DNA-Polymerase-Reaktionspuffer (10 µl, Stratagene), 200 µM dNTPs
(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und 2,5 Einheiten Pfu DNA-Polymerase (Stratagene). Vor
Beginn der Amplifikationszyklen wurde das Gemisch für 5 min auf 95°C erhitzt. Die
Polymerisierungsschritte (30 Zyklen) wurden in einem automatischen T3-Thermocycler
(Biometra) nach folgendem Programm durchgeführt: Denaturierung 95°C (1 Minute),
Anlagerung der Primer bei 55°C (40 Sekunden), Polymerase-Reaktion bei 72°C (2
Minuten). Das erhaltene Fragment wurde in den Vektor pCR-Blunt (Invitrogen) kloniert. Die
Identität der amplifizierten DNA wurde mittels Sequenzanalyse verifiziert.
Zur Isolierung des Palatinose-Operons wurde eine genomische Bank mit einem Subfragment
der Saccharoseisomerase (siehe Beispiel 1) durchmustert. Dabei wurden mehrere positive
Klone isoliert. Durch vollständige Sequenzierung und Zusammensetzen dieser Klone konnten
mehrere offene Leserahmen identifiziert werden, welche für Enzyme des Palatinose-Stoff
wechsels kodieren (siehe obige Übersicht der Gene des Palatinose-Operons und der dazu
gehörigen Genprodukte). Die untenstehende Skizze zeigt eine schematische Übersicht des
klonierten Palatinose-Genclusters aus Erwinia rhapontici. Die Position der offenen
Leserahmen und die Richtung der Transkription sind durch Pfeile dargestellt.
Die DNA- und Aminosäuresequenzen der verschiedenen Gene sind im beigefügten
Sequenzprotokoll wie folgt angegeben:
| Gen | |
| SEQ ID No. | |
| palQ | 1-3 |
| palI | 4-6 |
| palR | 7-9 |
| palE | 10-12 |
| palF | 13-15 |
| palG | 16-18 |
| palK | 19-21 |
| palH | 22-24 |
| palZ | 25-27 |
Die Klonierung des vollständingen offenen Leserasters der Palatinase erfolgte mittels
Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR). Als Matrizenmaterial diente
genomische DNA aus E. rhapontici, die nach Standardprotokoll isoliert wurde. Die
Amplifizierung erfolgte unter Verwendung der spezifischen Primer
- - FB 180 5'-GAGATCTTGCGCAGCACACCGCACTGG-3'
- - FB 176 5 '-GTCGACTCACAGCCTCTCAATAAG-3'
Primer FB 180 umfaßt die Basen 2-21, Primer FB 176 die Basen 1638-1656 der
kodierenden Region des Palatinase-Gens. Zur Klonierung der DNA in Expressionsvektoren
tragen die Primer zusätzlich folgende Restriktonsschnittstellen: Primer FB 180 BglII; Primer
FB 176 SalI. Das PCR Reaktionsgemisch (100 µl) enthielt chromosomale Bakterien-DNA
(1 µg), Primer FB 180 und FB 176 (jeweils 250 ng), Pfu DNA-Polymerase-Reaktionspuffer
(10 µl, Stratagene), 200 µM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und 2,5 Einheiten Pfu DNA-
Polymerase (Stratagene). Vor Beginn der Amplifikationszyklen wurde das Gemisch für 5 min
auf 95°C erhitzt. Die Polymerisierungsschritte (30 Zyklen) wurden in einem automatischen
T3-Thermocycler (Biometra) nach folgendem Programm durchgeführt: Denaturierung 95°C
(1 Minute), Anlagerung der Primer bei 55°C (40 Sekunden), Polymerase-Reaktion bei 72°C
(2 Minuten). Das entsprechende Fragment wurde in den Vektor pCR-Blunt (Invitrogen)
kloniert, wodurch das Plasmid pCR-palQ erhalten wurde (siehe Abb. 1). Die Identität
der amplifizierten DNA wurde mittels Sequenzanalyse verifiziert.
Das Fragment A beinhaltet die Sequenz einer Palatinase aus E. rhapontici, die sich von
Nukleotid 2-1656 des Palatinase Gens erstreckt (siehe SEQ ID No. 1).
Die DNA-Sequenz, die für eine Palatinase kodiert, wurde mit einem für die Aufnahme in das
endoplasmatische Retikulum notwendigen Signalpeptides eines pflanzlichen Gens (Proteinase
Inhibitor II Gen aus Kartoffel (Solanum tuberosum, Keil et al (1986, vide supra)) fusioniert
und unter die Kontrolle des 35S RNA-Promotors gebracht, wodurch das Plasmid p35S-
cwpalQ entstand.
Dazu wurde das Palatinase-Fragment aus dem Konstrukt pCR palQ über die
Restriktionsschnittstellen BglII und SalI herausgeschnitten und in einen BamHI/SalI
geöffneten pMA Vektor ligiert. Der Vektor pMA stellt eine modifizierte Form des Vektors
pBinAR (Höfgen und Willmitzer (1990) Plant Sci. 66: 221-230) dar, welche den 35S-
Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus, der eine konstitutive Expression in transgenen
Pflanzen vermittelt, ein Signalpeptid des Proteinale-Inhibitors II aus Kartoffel (Keil et al.
1986, vide supra)), welches die Zielsteuerung des Fusionsproteins in die Zellwand vermittelt,
sowie ein pflanzliches Terminationssignal enthält. Das pflanzliche Terminationssignal
beinhaltet das 3'-Ende der Polyadenylierungsstelle des Octopin-Synthase Gens. Zwischen der
Teilsequenz der Proteinase-Inhibitors und dem Terminationsignal befinden sich Schnittstellen
für die Restriktionsenzyme BamHI, XbaI, SalI, PstI und SphI (in dieser Reihenfolge), welche
die Insertion entsprechender DNA-Fragmente ermöglichen, so dass ein Fusionsprotein
zwischen dem Proteinase-Inhibitor und dem eingefügten Protein entsteht, welches dann in die
Zellwand von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen befördert wird, die dieses Protein
exprimieren (siehe Abb. 2).
Das Fragment A beinhaltet den 35S RNA-Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus (CaMV).
Es enthält ein Fragment, welches die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV umfaßt (Franck
(1980) Cell 21, 285.
Das Fragment B enthält die Nukleotide 923-1059 eines Proteinase-Inhibitor II-Gens aus der
Kartoffel (Solanum tuberosum, Keil et al. 1986, vide supra), welcher über einen Linker mit
der Sequenz ACC GAA TTG GG an das Palatinase-Gen aus Erwinia rhapontici, welches die
Nukleotide 2-1656 umfaßt, fusioniert ist. Dadurch wird ein für die Aufnahme von Proteinen
in das endoplasmatische Retikulum notwendige Signalpeptid eines pflanzlichen Proteins N-
terminal an die Palatinase-Sequenz fusioniert.
Das Fragment C enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids
pTiACHS (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3, 835), Nukleotide 11749-11939.
Die funktionelle Charakterisierung des Palatinase-Gens erfolgte durch Expression des
rekombinanten Proteins in E. coli. Dazu wurde das Plasmid pQE palQ in E. coli (XL-I blue,
Stratagene) transformiert. Die Expression des rekombinanten Proteins erfolgte nach
Herstellerangaben (Qiagen, Hilden, Deutschland) in einem Kulturmaßstab von 50 ml. Nach
Ernte der Zellen durch Zentrifugation wurde das Pellet in 1 ml 30 mM HEPES (pH 7,5)
resuspendiert und die lösliche Proteinfraktion durch Ultraschallbehandlung freigesetzt. 20 µl
des Rohextraktes wurden mit 80 µl 100 mM Palatinose gemischt und für 40 Minuten bei 30°C
inkubiert. Zum Nachweis der Palatinaseaktivität wurde in einem Aliquot des Ansatzes die
freigesetzte Glucose durch einen gekoppelten optisch-enzymatischen Test bestimmt. Dabei
konnte die Palatinaseaktivität des rekombinanten Enzyms eindeutig nachgewiesen werden.
In weiteren Experimenten wurde gezeigt, daß das Enzym seine höchste Aktivität bei einer
Reaktionstemperatur von 30°C und einem pH von 7,0 entfaltet. Bei der Untersuchung der
Reaktionsgeschwindigkeit in Abhängigkeit von der Substratkonzentration konnte ein Km-
Wert für Palatinose von 10 mM und eine maximale Reaktionsgeschwindigkeit bei einer
Substratkonzentration von 90 mM Palatinose bestimmt werden.
Um nachzuweisen, dass Pflanzenzellen mit Palatinose als einziger Kohlenstoffquelle nicht
regeneriert werden können, wurden Blattstücke von sterilen Tabakpflanzen auf MS-Medium
(Murashige and Skoog 1962, vide supra; 500 mg/l Claforan, 1 mg/l Benzylaminopurin (BAP),
0,2 mg/l Naphthylessigsäure (NAA)), dem 0,8% bzw. 1,6% Palatinose als einzige
Kohlenstoffquelle zugesetzt wurden, für vier Wochen kultiviert.
Abb. 3 zeigt die Kultivierung von Tabakblattscheiben auf MS-Medium mit Palatinose
als alleiniger Kohlenstoffquelle (Abb. 3A: mit 0,8% Palatinose, Abb. 3B: mit 1,6% Pala
tinose) im Vergleich zu einer Blattscheibe, welche auf MS-Medium mit 1,6% Glukose
kultiviert wurde (Abb. 3C). Es ist ersichtlich, das Blattscheiben auf einem Medium mit
Palatinose als einziger Kohlenstoffquelle keine Kalli bilden. Der Zusatz von Palatinose hat
jedoch keinen toxischen Effekt auf die Pflanzenzellen.
Tabak wurde wie oben beschrieben mittels Agrobacterium-vermitteltem Gentransfer mit dem
Konstrukt p35S-cwPal (siehe Beispiel 4) transformiert (Leaf Disk-Transformation) und die
Blattscheiben im Anschluß an die Infektion und Inkubation mit Agrobakterien auf MS-
Regenerationsmedium mit 1,6% Palatinose als einziger Kohlenstoffquelle kultiviert. Nach ca.
3 Wochen waren transformierte Sprosse sichtbar, die auf hormonfreiem MS-Medium mit
Palatinose bewurzelt wurden.
Von den bewurzelten Sprossen wurden 20 Sprosse im Northern Blot unter Verwendung des
Palatinase-Gens als Hybridisierungssonde (BamHIISalI-Fragment aus pCR-Pal) auf die
Anwesenheit des Palatinase-Gens analysiert. Sämtliche untersuchten Sprosse zeigten
Akkumulation Palatinase-spezifischer mRNA und somit Expression der Palatinase.
Aus den erfolgreich selektionierten Sprossen wurden vollständige Pflanzen regeneriert. Die
erhaltenen transgenen Pflanzen waren phänotypisch normal.
Die Klonierung des vollständigen offenen Leserasters der Trehalulase erfolgte mittels
Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR). Als Matrizenmaterial diente
genomische DNA aus E. rhapontici, die nach Standardprotokoll isoliert wurde. Die
Amplifizierung erfolgte unter Verwendung der spezifischen Primer
- - FB 184 5'-GGGATCCGTGCAAACTGGTGGAAAGAG-3'
- - FB 185 5'-GTCGACTTACCGCTGATAAATTTGTGC-3'
Die Primer FB 184 und FB 185 umfassen die Basen 4-23 bzw. 1638-1659 der kodierenden
Region des Trehalulase-Gens.
Zur Klonierung der DNA in Expressionsvektoren tragen die Primer zusätzlich folgende
Restriktonsschnittstellen: Primer FB 96 bzw. FB 184, BamHI; Primer FB 185, SalI. Das PCR-
Reaktionsgemisch (100 µl) enthielt chromosomale Bakterien DNA (1 µg), Primer FB 184 und
FB 185 (jeweils 250 ng), Pfu DNA Polymerase Reaktionspuffer (10 µl, Stratagene), 200 µM
dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und 2,5 Einheiten Pfu DNA Polymerase (Stratagene).
Vor Beginn der Amplifikationszyklen wurde das Gemisch für 5 min auf 95°C erhitzt. Die
Polymerisierungsschritte (30 Zyklen) wurden in einem automatischen T3-Thermocycler
(Biometra) nach folgendem Programm durchgeführt: Denaturierung 95°C (1 Minute),
Anlagerung der Primer bei 55°C (40 Sekunden), Polymerase-Reaktion bei 72°C (2
Minuten). Das entsprechende Fragment wurde in den Vektor pCR-Blunt (Invitrogen) kloniert,
wodurch das Plasmid pCR-PaIZ erhalten wurde (siehe Abb. 4). Die Identität der
amplifizierten DNA wurde mittels Sequenzanalyse verifiziert.
Das Fragment A beinhaltet die Sequenz einer Trehalulase aus E. rhapontici, die sich von
Nukleotid 4-1659 des Trehalulase Gens erstreckt.
Die DNA-Sequenz, die für eine Trehalulase kodiert, wurde mit einem für die Aufnahme in
das endoplasmatische Retikulum notwendigen Signalpeptides eines pflanzlichen Gens
(Proteinase Inhibitor II Gen aus Kartoffel (Solanum tuberosum, Keil et al. 1986, vide supra))
fusioniert und unter die Kontrolle des 35S RNA-Promotors gebracht, wodurch das Plasmid
p35S-cwpalZ entstand.
Dazu wurde das Trehalulase-Fragment aus dem Konstrukt pCR-palZ über die
Restriktionsschnittstellen BamHI und SalI herausgeschnitten und in einen BamHI/SalI
geöffneten pMA Vektor ligiert. Der pMA stellt eine modifizierte Form des Vektors pBinAR
(Höfgen und Willmitzer 1990, vide supra) dar, welcher den 35S-Promotor des Cauliflower-
Mosaik-Virus, der eine konstitutive Expression in transgenen Pflanzen vermittelt, ein
Signalpeptid des Proteinase-Inhibitors II aus Kartoffel (Keil et al. 1986, vide supra), welches
die Zielsteuerung des Fusionsproteins in die Zellwand vermittelt, sowie ein pflanzliches
Terminationssignal enthält. Das pflanzliche Terminationssignal beinhaltet das 3'-Ende der
Polyadenylierungsstelle des Octopin-Synthasegens. Zwischen der Teilsequenz des Proteinase-
Inhibitors und dem Terminationssignal befinden sich Schnittstellen für Restriktionsenzyme
BamHI, XbaI, SalI, PstI und SphI (in dieser Reihenfolge), welche die Insertion
entsprechender DNA-Fragment ermöglichen, so dass ein Fusionsprotein zwischen dem
Proteinase-Inhibitor und dem eingefügten Protein entsteht, welches dann in die Zellwand von
transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen befördert wird, die dieses Protein exprimieren.
Das Fragment A beinhaltet den 35S Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus (CaMV). Es
enthält ein Fragment, welches die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV umfaßt (Franck
(1980) Cell 21: 285).
Das Fragment B enthält die Nukleotide 923-1059 eines Proteinase Inhibitor II Gens aus der
Kartoffel (Solanum tuberosum) (Keil et al. 1986, vide supra), welches über einen Linker mit
der Sequenz ACC GAA TTG GG an das Trehalulase-Gen aus Erwinia rhapontici, das die
Nukleotide 4-1659 umfaßt, fusioniert ist. Dadurch wird ein für die Aufnahme von Proteinen
in das endoplasmatische Retikulum notwendige Signalpeptid eines pflanzlichen Proteins N-
terminal an die Trehalulase Sequenz fusioniert.
Das Fragment C enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids
pTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3, 835), Nukleotide 11749-11939.
Claims (31)
1. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, umfassend
- a) regulatorische Sequenzen eines in Pflanzenzellen aktiven Promotors;
- b) operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase und/oder einer Trehalulase kodiert; und
- c) operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können.
2. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz
ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
- a) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die die in SEQ No. 3 angegebene Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren,
- b) DNA-Sequenzen, die die in SEQ ID No. 1 angegebene Nukleotidsequenz oder Teile davon umfassen,
- c) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die die in SEQ No. 27 angegebene Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren,
- d) DNA-Sequenzen, die die in SEQ ID No. 25 angegebene Nukleotidsequenz oder Teile davon umfassen,
- e) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz, die mit einem komplementären Strang der Nukleotidsequenz von a), b), c) oder d) hybridisieren, oder Teile dieser Nukleotidsequenz umfassen,
- f) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz, die zu einer Nukleotidsequenz von e) degeneriert ist, oder Teile dieser Nukleotidsequenz umfassen,
- g) DNA-Sequenzen, die ein Derivat, Analog oder Fragment einer Nukleotidsequenz von a), b), c), d), e) oder 9 darstellen.
3. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Promotor
ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise der 35S RNA-Promotor von CaMV ist.
4. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei die DNA-Sequenz durch Signalsequenzen ergänzt ist, die den Transport des Proteins
mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. Trehalulase zu einem bestimmten
Zellkompartiment oder einer bestimmten Zellorganelle gewährleisten.
5. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 4, wobei das
Zellkompartiment oder die Zellorganelle die Zellwand ist.
6. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 5, wobei die Signalsequenzen
aus einem pflanzlichen Proteinase-Inhibitor-Gen stammen.
7. Vektor, umfassend ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach einem der
vorangehenden Ansprüche.
8. Vektor nach Anspruch 7, der mindestens ein weiteres rekombinantes
Nukleinsäuremolekül enthält.
9. Vektor nach Anspruch 8, wobei das weitere rekombinante Nukleinsäuremolekül
eine DNA-Sequenz enthält, die für ein Peptid, Protein, eine Antisense-RNA, eine Sense-
RNA, eine virale RNA oder ein Ribozym kodiert.
10. Wirtszelle, enthaltend ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül oder einen Vektor
nach einem der vorangehenden Ansprüche.
11. Kit, umfassend ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül oder einen Vektor nach
einem der Ansprüche 1 bis 9 und ggf. Palatinose, Trehalulose oder ein zu Palatinose bzw.
Trehalulose äquivalentes Kohlenhydrat.
12. Verfahren zur Selektion transformierter Pflanzenzellen, umfassend die Schritte:
- a) Einführung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls oder eines Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 9 in Pflanzenzellen; und
- b) Selektion der transformierten Pflanzenzellen auf bzw. in Palatinose bzw. Trehalulose oder ein zu Palatinose bzw. Trehalulose äquivalentem Kohlenhydrat enthaltendem Medium.
13. Transgene Pflanzenzellen, enthaltend ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül
oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder hergestellt nach einem Verfahren
nach Anspruch 12.
14. Pflanzenzelle nach Anspruch 13, die mindestens ein weiteres Fremdgen enthält.
15. Transgene Pflanzen, enthaltend eine Pflanzenzelle nach Anspruch 13 oder 14 oder
hergestellt nach Anspruch 12, sowie Teile dieser Pflanzen, transgene Ernteprodukte und
transgenes Vermehrungsmaterial dieser Pflanzen, wie Protoplasten, Pflanzenzellen, Kalli,
Samen, Knollen, Stecklinge, sowie die transgenen Nachkommen dieser Pflanzen.
16. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls, das ein Protein mit der enzymatischen
Aktivität einer Palatinase bzw. Trehalulase kodiert, als Selektionsmarker.
17. Verwendung nach Anspruch 16 für die Selektion transformierter Pflanzenzellen.
18. Verwendung nach Anspruch 16 für die Selektion transformierter
Mikroorganismen.
19. Verwendung nach Anspruch 18, wobei zusätzlich die für einen Palatinose-
Transporter kodierenden DNA-Sequenzen auf den Mikroorganismus übertragen werden.
20. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, enthaltend die in SEQ ID No. 1 angegebene
DNA-Sequenz oder Teile davon, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer
Palatinase kodieren.
21. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, enthaltend die in SEQ ID No. 7 angegebene
DNA-Sequenz oder Teile davon, die ein Protein mit der biologischen Aktivität eines
Regulatorproteins der LysR-Familie kodieren.
22. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, enthaltend die in SEQ ID No. 10
angegebene DNA-Sequenz oder Teile davon, die ein Protein mit der biologischen Aktivität
eines Palatinose-bindenden Proteins kodieren.
23. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, enthaltend die in SEQ ID No. 13
angegebene DNA-Sequenz oder Teile davon, die ein Protein mit der biologischen Aktivität
einer Permease kodieren.
24. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, enthaltend die in SEQ ID No. 16
angegebene DNA-Sequenz oder Teile davon, die ein Protein mit der biologischen Aktivität
einer Permease kodieren.
25. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, enthaltend die in SEQ ID No. 19
angegebene DNA-Sequenz oder Teile davon, die ein Protein mit der biologischen Aktivität
eines ATP-bindenden Proteins kodieren.
26. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, enthaltend die in SEQ ID No. 22
angegebene DNA-Sequenz oder Teile davon, die ein Protein mit der biologischen Aktivität
einer Hydrolase kodieren.
27. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, enthaltend die in SEQ ID No. 25
angegebene DNA-Sequenz oder Teile davon, die ein Protein mit der biologischen Aktivität
einer Trehalulase kodieren.
28. Verfahren zur Selektion transformierter Mikroorganismen, umfassend die Schritte:
- a) Einführung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls enthaltend eine DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. Trehalulase kodiert; und
- b) Selektion der transformierten Mikroorganismen auf bzw. in Palatinose bzw. Trehalulose oder ein zu Palatinose äquivalentes Kohlenhydrat enthaltendem Medium.
29. Verfahren zur Selektion transformierter Mikroorganismen nach Anspruch 28,
wobei zusätzlich die in SEQ ID No. 10, 13, 16 und 19 angegebenen DNA-Sequenzen
eingeführt und coexprimiert werden.
30. Isolierte DNA-Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus
- a) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die die in SEQ No. 27 angegebene Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren,
- b) DNA-Sequenzen, die die in SEQ ID No. 25 angegebene Nukleotidsequenz oder Teile davon umfassen,
- c) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz, die mit einem komplementären Strang der Nukleotidsequenz von a) oder b) hybridisieren, oder Teile dieser Nukleotid sequenz umfassen,
- d) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz, die zu einer Nukleotidsequenz von c) degeneriert ist, oder Teile dieser Nukleotidsequenz umfassen,
- e) DNA-Sequenzen, die ein Derivat, Analog oder Fragment einer Nukleotidsequenz von a), b), c) oder d) darstellen.
31. DNA-Sequenz nach Anspruch 30, wobei die Hybridisierung unter stringenten
Bedingungen erfolgt.
Priority Applications (4)
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|---|---|---|---|
| DE10045182A DE10045182A1 (de) | 2000-02-14 | 2000-09-13 | Verwendung von Palatinase- und Trehalulase-Sequenzen als nutritive Marker in transformierten Zellen |
| AU2001237381A AU2001237381A1 (en) | 2000-02-14 | 2001-02-14 | Use of palatinase and trehalulase sequences as nutritive markers in transformed cells |
| EP01909747A EP1255841A2 (de) | 2000-02-14 | 2001-02-14 | Verwendung von palatinase- und trehalulase-sequenzen als nutritive marker in transformierten zellen |
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Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| DE10006463 | 2000-02-14 | ||
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|---|---|
| DE10045182A1 true DE10045182A1 (de) | 2001-08-16 |
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ID=7630829
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| DE10045182A Withdrawn DE10045182A1 (de) | 2000-02-14 | 2000-09-13 | Verwendung von Palatinase- und Trehalulase-Sequenzen als nutritive Marker in transformierten Zellen |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL1019308C2 (nl) * | 2001-11-06 | 2003-05-07 | Stichting Tech Wetenschapp | Werkwijze voor het selecteren van genetisch getransformeerde cellen. |
| WO2011076370A1 (de) * | 2009-12-23 | 2011-06-30 | Südzucker Aktiengesellschaft Mannheim/Ochsenfurt | Sucrosemutase mit verbesserter produktspezifität |
-
2000
- 2000-09-13 DE DE10045182A patent/DE10045182A1/de not_active Withdrawn
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL1019308C2 (nl) * | 2001-11-06 | 2003-05-07 | Stichting Tech Wetenschapp | Werkwijze voor het selecteren van genetisch getransformeerde cellen. |
| WO2003040377A1 (en) * | 2001-11-06 | 2003-05-15 | Stichting Voor De Technische Wetenschappen | Method fro selecting genetically transformed cells |
| WO2011076370A1 (de) * | 2009-12-23 | 2011-06-30 | Südzucker Aktiengesellschaft Mannheim/Ochsenfurt | Sucrosemutase mit verbesserter produktspezifität |
| CN102695793A (zh) * | 2009-12-23 | 2012-09-26 | 甜糖（曼海姆/奥克森富特）股份公司 | 具有改进的产品特异性的蔗糖变位酶 |
| US8691535B2 (en) | 2009-12-23 | 2014-04-08 | Südzucker Aktiengesellschaft Mannheim/Ochsenfurt | Sucrose mutase with improved product specificity |
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