CN102695793A - 具有改进的产品特异性的蔗糖变位酶 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于从蔗糖生物技术制备异麦芽酮糖和含异麦芽酮糖的组合物的改进的工具，所述工具尤其是具有改进的产品特异性的蔗糖变位酶以及包含所述改进的蔗糖变位酶的微生物细胞。
Description
说明书
本发明涉及由蔗糖生物技术制备异麦芽酮糖和含异麦芽酮糖的组合物和为此提供改进的工具(Mittel)，尤其是具有改进的产品特异性的蔗糖变位酶以及包含所述改进的蔗糖变位酶的微生物细胞。
众所周知，在生物技术工艺中可通过酶促异构化由蔗糖（甘蔗糖、甜菜糖）制备异麦芽酮糖（帕拉金糖）。异麦芽酮糖是一种生理学有价值的糖，其作为蔗糖替代物质在食品和相关产品中的重要性日益增长。异麦芽酮糖是非致龋的并且在与蔗糖能量含量基本相同的情况下具有低的血糖指数。自2005年以来，异麦芽酮糖已被允许用于食品中。此外，异麦芽酮糖是用于制备糖醇异麦芽酮糖醇的原料，异麦芽酮糖醇是1,6-GPS（6-O-α-D-吡喃葡萄糖基-D-山梨醇）和1,1-GPM（1-O-α-D-吡喃葡萄糖基-D-甘露醇）的消旋混合物及其修饰物，尤其是GPS或GPM富集的混合物。
众所周知，由蔗糖生物技术制备异麦芽酮糖在使用显示细菌酶活性的蔗糖变位酶，E.C.5.4.99.11（同义词：蔗糖变位酶、蔗糖异构酶、异麦芽酮糖合成酶）的优选固定的细菌细胞或其碎片的条件下进行。已知具有蔗糖变位酶活性且可以用于生物技术工艺的微生物，尤其是红色精朊杆菌(Protaminobacter rubrum）、大黄欧文菌（Erwinia rhapontici）、嗜中酸假单胞菌（Pseudomonas mesoacidophila）、分散泛菌（Pantoea dispersa）和普利茅斯沙雷氏菌（Serratia plymuthica)。其内源性蔗糖变位酶以SmuA、Pall、SmtA、MutB、SIM等缩写而闻名。蔗糖变位酶由染色体基因编码。
在已知的生物技术体系中，蔗糖被不完全酶促异构为异麦芽酮糖。确切地说，其生成其它的异构产物和副产物。一种重要的其它异构产物是海藻糖。在微生物红色精朊杆菌(Protaminobacter rubrum）中存在蔗糖变位酶SmuA，其产品特异性被如此设计，使得即使在最佳的培养条件下也仅使最高约85％的蔗糖异构化为异麦芽酮糖。所述蔗糖变位酶SmuA的产品特异性是值得改善的。但是，用生物技术方法的异麦芽酮糖工业化生产是基于红色精朊杆菌(P.rubrum）的蔗糖变位酶SmuA。
所以，本发明的目的在于，提供一种改进的基于SmuA的蔗糖变位酶以及一种包含这种改进的蔗糖变位酶的微生物，所述微生物具有改进的产品特异性和异麦芽酮糖选择性，由此提高异构化产品中异麦芽酮糖的比例，这样也可以更有效地在其它已知的生物技术工艺中进行蔗糖向异麦芽酮糖的转化。这里，本发明的目的特别在于，提供一种改进的基于SmuA的蔗糖变位酶，其可以用于基本无改变的、已经确立的工业化生物技术工艺中，而不必高成本地调整已确立的工艺中的反应条件和工艺流程。应避免使用来自其它生物的蔗糖变位酶和调整为新的生物技术工艺。
作为本发明的基础的技术问题通过提供一种新的聚氨基酸分子得以完全解决，对于蔗糖向异麦芽酮糖的转化，所述聚氨基酸分子具有改进的蔗糖变位酶活性，即对异麦芽酮糖较高的产品特异性。根据本发明，所述改进的蔗糖变位酶具有氨基酸序列，其优选直接来源于红色精朊杆菌(Protaminobacterrubrum）的蔗糖变位酶SmuA的野生型序列，其中分别相对于SEQ ID NO.1中的野生型序列的位置号，在至少一个下述氨基酸位置中具有一个或多个以下列举的氨基酸取代：S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q以及两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或者所有十种的组合。这里，根据本发明，所述位置取决于活性中心的位置而定。
所以，本发明提供如下解决办法：改进的新型的蔗糖变位酶，其特征在于，其具有、仅具有或其包含修饰的氨基酸序列，其选自相对于以SEQ IDNO.1表示的序列具有一个或多个下列氨基酸取代的氨基酸序列：S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q。
本发明也涉及其功能性的修饰，即聚氨基酸分子具有、仅具有或包含根据本发明对以SEQ ID NO.1表示的序列进行修饰的氨基酸序列的片段，从而聚氨基酸分子具有根据本发明改善的新型蔗糖变位酶的功能。本领域技术人员可以容易地由这里给出的序列数据制造相应的功能性修饰并以熟悉的方式测试其作为蔗糖变位酶的功能。
在本发明的第一个实施方式中，所述氨基酸取代在位置S303处；优选取代为氨基酸P。
在本发明一个替代的或另外的实施方式中，所述氨基酸取代在位置D302处；优选取代为氨基酸Y。特别优选S303P与D302Y的取代组合。
在本发明一个替代的或另外的实施方式中，所述氨基酸取代在位置K180处；优选取代为氨基酸P。
在本发明一个替代的或另外的实施方式中，所述氨基酸取代在位置M199处；优选取代为氨基酸I（M199I）。
在本发明一个替代的或另外的实施方式中，所述氨基酸取代在位置Q276处；优选取代为氨基酸A。
在本发明一个替代的或另外的实施方式中，所述氨基酸取代在位置A198处；优选取代为氨基酸D。
在本发明一个替代的或另外的实施方式中，所述氨基酸取代在位置Y219处；优选取代为氨基酸F。
在本发明一个替代的或另外的实施方式中，所述氨基酸取代在位置V324处；优选取代为氨基酸T。
在本发明一个替代的或另外的实施方式中，所述氨基酸取代在位置T369处；优选取代为氨基酸L。
在本发明一个替代的或另外的实施方式中，所述氨基酸取代在位置A346处；优选取代为氨基酸Q。
除下文中详细描述的优选的多种氨基酸取代的组合而外，可以是单独的或组合的下列另外氨基酸：M199I组合V114I、Q122R、Q276A、N423E、L426I、L426F。
还优选的是S303P与选自由D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合。一种优选的组合是S303P+D302Y。一种优选的组合是S303P+M199I。另一种优选的组合是S303P+Q276A。另一种优选的组合是S303P+A198D。另一种优选的组合是S303P+Y219F。另一种优选的组合是S303P+V324T。另一种优选的组合是S303P+T369L。另一种优选的组合是S303P+A346Q。
S303P与D302Y以及选自由K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
S303P与K180P以及选自由D302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
S303P与M199I以及选自由D302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
S303P与Q276A以及选自由D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
S303P与A198D以及选自由D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F、V324T、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
S303P与Y219F以及选自由D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、V324T、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
S303P与V324T以及选自由D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
S303P与T369L以及选自由D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
S303P与A346Q以及选自由D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T和T369L组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
其一种优选的组合是S303P+D302Y+K180P。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q。优选S303P+D302Y+K180P+S303P+D302Y+K180P+M199I、S303P+D302Y+K180P+S303P+D302Y+K180P+Q276A、S303P+D302Y+K180P+A198D、S303P+D302Y+K180P+Y219F、S303P+D302Y+K180P+V324T、S303P+D302Y+K180P+T369L和/或S303P+D302Y+K180P+A346Q。
另一种优选的组合是S303P+D302Y+M199I。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：K180P、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q。优选S303P+D302Y+M199I+S303P+D302Y+M199I+Q276A、S303P+D302Y+M199I+A198D、S303P+D302Y+M199I+Y219F、S303P+D302Y+M199I+V324T、S303P+D302Y+M199I+T369L和/或S303P+D302Y+M199I+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+D302Y+Q276A。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：K180P、M199I、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q。优选S303P+D302Y+Q276A+A198D、S303P+D302Y+Q276A+Y219F、S303P+D302Y+Q276A+V324T、S303P+D302Y+Q276A+T369L、S303P+D302Y+Q276A+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+D302Y+A198D。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：K180P、M199I、Q276A、Y219F、V324T、T369L和A346Q。优选S303P+D302Y+A198D+Y219F、S303P+D302Y+A198D+V324T、S303P+D302Y+A198D+T369L和/或S303P+D302Y+A198D+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+D302Y+Y219F。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：K180P、M199I、Q276A、A198D、V324T、T369L和A346Q。优选S303P+D302Y+Y219F+V324T、S303P+D302Y+Y219F+T369L和/或S303P+D302Y+Y219F+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+D302Y+V324T。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、T369L和A346Q。优选S303P+D302Y+V324T+T369L和/或S303P+D302Y+V324T+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+D302Y+T369L。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T和A346Q。优选S303P+D302Y+T369L+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+D302Y+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T和T369L。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+K180P+M199I。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：D302Y、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q。优选S303P+K180P+M199I+S303P+K180P+M199I+Q276A、S303P+K180P+M199I+A198D、S303P+K180P+M199I+Y219F、S303P+K180P+M199I+V324T、S303P+K180P+M199I+T369L和/或S303P+K180P+M199I+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+K180P+Q276A。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：D302Y、M199I、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q。优选S303P+K180P+Q276A+A198D、S303P+K180P+Q276A+Y219F、S303P+K180P+Q276A+V324T、S303P+K180P+Q276A+T369L和/或S303P+K180P+Q276A+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+K180P+A198D。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：D302Y、M199I、Q276A、Y219F、V324T、T369L和A346Q。优选S303P+K180P+A198D+Y219F、S303P+K180P+A198D+V324T、S303P+K180P+A198D+T369L和/或S303P+K180P+A198D+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+K180P+Y219F。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：D302Y、M199I、Q276A、A198D、V324T、T369L和A346Q。优选S303P+K180P+Y219F+V324T、S303P+K180P+Y219F+T369L和/或S303P+K180P+Y219F+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+K180P+V324T。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：D302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219F、T369L和A346Q。优选S303P+K180P+V324T+T369L和/或S303P+K180P+V324T+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+K180P+T369L。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：D302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T和A346Q。优选S303P+K180P+T369L+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+K180P+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：D302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T和T369L。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+M199I+Q276A。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：D302Y、K180P、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q。优选S303P+M199I+Q276A+S303P+M199I+Q276A+A198D、S303P+M199I+Q276A+Y219F、S303P+M199I+Q276A+V324T和/或S303P+M199I+Q276A+T369L、S303P+M199I+Q276A+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+M199I+A198D。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：D302Y、K180P、Q276A、Y219F、V324T、T369L和A346Q。优选S303P+M199I+A198D+Y219F、S303P+M199I+A198D+V324T、S303P+M199I+A198D+T369L和/或S303P+M199I+A198D+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+M199I+Y219F。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：D302Y、K180P、Q276A、A198D、V324T、T369L和A346Q。优选S303P+M199I+Y219F+V324T和/或S303P+M199I+Y219F+T369L、S303P+M199I+Y219F+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+M199I+V324T。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：D302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219F、T369L和A346Q。优选S303P+M199I+V324T+T369L和/或S303P+M199I+V324T+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+M199I+T369L。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：D302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219F、V324T和A346Q。优选S303P+M199I+T369L+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+M199I+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：D302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219F、V324T和T369L。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+Q276A+A198D。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：D302Y、K180P、M199I、Y219F、V324T、T369L和A346Q。优选S303P+Q276A+A198D+Y219F、S303P+Q276A+A198D+V324T、S303P+Q276A+A198D+T369L和/或S303P+Q276A+A198D+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+Q276A+Y219F。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：D302Y、K180P、M199I、A198D、V324T、T369L和A346Q。优选S303P+Q276A+Y219F+V324T、S303P+Q276A+Y219F+T369L和/或S303P+Q276A+Y219F+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+Q276A+V324T。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F、T369L和A346Q。优选S303P+Q276A+V324T+T369L和/或S303P+Q276A+V324T+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+Q276A+T369L。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F、V324T和A346Q。优选S303P+Q276A+T369L+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+Q276A+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F、V324T和T369L。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+A198D+Y219F。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：D302Y、K180P、M199I、Q276A、V324T、T369L和A346Q。优选S303P+A198D+Y219F+V324T、S303P+A198D+Y219F+T369L和/或S303P+A198D+Y219F+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+A198D+V324T。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F、T369L和A346Q。优选S303P+A198D+V324T+T369L、S303P+A198D+V324T+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+A198D+T369L。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F、V324T和A346Q。优选S303P+A198D+T369L+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+A198D+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F、V324T和T369L。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+Y219F+V324T。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、T369L和A346Q。优选S303P+Y219F+V324T+T369L和/或S303P+Y219F+V324T+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+Y219F+T369L。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、V324T和A346Q。优选S303P+Y219F+T369L+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+Y219F+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、V324T和T369L。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+V324T+T369L。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F和A346Q。优选S303P+V324T+T369L+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+V324T+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F和T369L。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是S303P+T369L+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F和V324T。其另外优选的实施方式如上所述。
D302Y与选自S303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q的至少另外一种或恰好另外一种的组合是优选的。一种优选的组合是D302Y+K180P。另一种优选的组合是D302Y+M199I。另一种优选的组合是D302Y+Q276A。另一种优选的组合是D302Y+A198D。另一种优选的组合是D302Y+Y219F。另一种优选的组合是D302Y+V324T。另一种优选的组合是D302Y+T369L。另一种优选的组合是D302Y+A346Q。
D302Y与K180P以及选自由S303P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
D302Y与M199I以及选自由S303P、K180P、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
D302Y与Q276A以及选自由S303P、K180P、M199I、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
D302Y与A198D以及选自由S303P、K180P、M199I、Q276A、Y219F、V324T、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
D302Y与Y219F以及选自由S303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、V324T、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
D302Y与V324T以及选自由S303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
D302Y与T369L以及选自由S303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
D302Y与A346Q以及选自由S303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T和T369L组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
D302Y与选自由S303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
另一种优选的组合是D302Y+K180P+M199I。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q。优选D302Y+K180P+M199I+D302Y+K180P+M199I+Q276A、D302Y+K180P+M199I+A198D、D302Y+K180P+M199I+Y219F、D302Y+K180P+M199I+V324T、D302Y+K180P+M199I+T369L和/或D302Y+K180P+M199I+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是D302Y+K180P+Q276A。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、M199I、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q。(优选)D302Y+K180P+Q276A+A198D、D302Y+K180P+Q276A+Y219F、D302Y+K180P+Q276A+V324T、D302Y+K180P+Q276A+T369L和/或D302Y+K180P+Q276A+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是D302Y+K180P+A198D。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、M199I、Q276A、Y219F、V324T、T369L和A346Q。优选D302Y+K180P+A198D+Y219F、D302Y+K180P+A198D+V324T、D302Y+K180P+A198D+T369L和/或D302Y+K180P+A198D+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是D302Y+K180P+Y219F。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、M199I、Q276A、A198D、V324T、T369L和A346Q。优选D302Y+K180P+Y219F+V324T、D302Y+K180P+Y219F+T369L和/或D302Y+K180P+Y219F+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是D302Y+K180P+V324T。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、T369L和A346Q。优选D302Y+K180P+V324T+T369L和/或D302Y+K180P+V324T+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是D302Y+K180P+T369L。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T和A346Q。优选D302Y+K180P+T369L+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是D302Y+K180P+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T和T369L。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是D302Y+M199I+Q276A。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、K180P、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q。(优选)D302Y+M199I+Q276A+A198D、D302Y+M199I+Q276A+Y219F、D302Y+M199I+Q276A+V324T和/或D302Y+M199I+Q276A+T369L、D302Y+M199I+Q276A+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是D302Y+M199I+A198D。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、K180P、Q276A、Y219F、V324T、T369L和A346Q。优选D302Y+M199I+A198D+Y219F、D302Y+M199I+A198D+V324T、D302Y+M199I+A198D+T369L和/或D302Y+M199I+A198D+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是D302Y+M199I+Y219F。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、K180P、Q276A、A198D、V324T、T369L和A346Q。优选D302Y+M199I+Y219F+V324T、D302Y+M199I+Y219F+T369L和/或D302Y+M199I+Y219F+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是D302Y+M199I+V324T。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、K180P、Q276A、A198D、Y219F、T369L和A346Q。优选D302Y+M199I+V324T+T369L、D302Y+M199I+V324T+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是D302Y+M199I+T369L。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、K180P、Q276A、A198D、Y219F、V324T和A346Q。优选D302Y+M199I+T369L+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是D302Y+M199I+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、K180P、Q276A、A198D、Y219F、V324T和T369L。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是D302Y+Q276A+A198D。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、K180P、M199I、Y219F、V324T、T369L和A346Q。优选D302Y+Q276A+A198D+Y219F、D302Y+Q276A+A198D+V324T、D302Y+Q276A+A198D+T369L和/或D302Y+Q276A+A198D+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是D302Y+Q276A+Y219F。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、K180P、M199I、A198D、V324T、T369L和A346Q。优选D302Y+Q276A+Y219F+V324T和/或D302Y+Q276A+Y219F+T369L、D302Y+Q276A+Y219F+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是D302Y+Q276A+V324T。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、K180P、M199I、A198D、Y219F、T369L和A346Q。优选D302Y+Q276A+V324T+T369L、D302Y+Q276A+V324T+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是D302Y+Q276A+T369L。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、K180P、M199I、A198D、Y219F、V324T和A346Q。优选D302Y+Q276A+T369L+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是D302Y+Q276A+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、K180P、M199I、A198D、Y219F、V324T和T369L。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是D302Y+A198D+V324T。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、K180P、M199I、Q276A、Y219F、T369L和A346Q。优选D302Y+A198D+V324T+T369L和/或D302Y+A198D+V324T+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是D302Y+A198D+T369L。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、K180P、M199I、Q276A、Y219F、V324T和A346Q。优选D302Y+A198D+T369L+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是D302Y+A198D+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、K180P、M199I、Q276A、Y219F、V324T和T369L。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是D302Y+Y219F+V324T。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、T369L和A346Q。优选D302Y+Y219F+V324T+T369L、D302Y+Y219F+V324T+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是D302Y+Y219F+T369L。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、V324T和A346Q。优选D302Y+Y219F+T369L+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是D302Y+Y219F+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、V324T和T369L。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是D302Y+V324T+T369L。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F和A346Q。优选D302Y+V324T+T369L+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是D302Y+V324T+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F和T369L。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是D302Y+T369L+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F和V324T。其另外优选的实施方式如上所述。
K180P与选自由S303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合是优选的。另一种优选的组合是K180P+Q276A。另一种优选的组合是K180P+A198D。另一种优选的组合是K180P+Y219F。另一种优选的组合是K180P+V324T。另一种优选的组合是K180P+T369L。另一种优选的组合是K180P+A346Q.
K180P与M199I以及选自由S303P、D302Y、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
K180P与Q276A以及选自由S303P、D302Y、M199I、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
K180P与A198D以及选自由S303P、D302Y、M199I、Q276A、Y219F、V324T、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
K180P与Y219F以及选自由S303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、V324T、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
K180P与V324T以及选自由S303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219F、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
K180P与T369L以及选自由S303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
K180P与A346Q以及选自由S303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T和T369L组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
另一种优选的组合是K180P+M199I+Q276A。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q。(优选)K180P+M199I+Q276A+A198D、K180P+M199I+Q276A+Y219F、K180P+M199I+Q276A+V324T、K180P+M199I+Q276A+T369L和/或K180P+M199I+Q276A+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是K180P+M199I+A198D。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、Q276A、Y219F、V324T、T369L和A346Q。优选K180P+M199I+A198D+Y219F、K180P+M199I+A198D+V324T、K180P+M199I+A198D+T369L和/或K180P+M199I+A198D+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是K180P+M199I+Y219F。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、Q276A、A198D、V324T、T369L和A346Q。优选K180P+M199I+Y219F+V324T、K180P+M199I+Y219F+T369L和/或K180P+M199I+Y219F+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是K180P+M199I+V324T。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、Q276A、A198D、Y219F、T369L和A346Q。优选K180P+M199I+V324T+T369L、K180P+M199I+V324T+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是K180P+M199I+T369L。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、Q276A、A198D、Y219F、V324T和A346Q。优选K180P+M199I+T369L+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是K180P+M199I+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、Q276A、A198D、Y219F、V324T和T369L。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是K180P+Q276A+A198D。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、M199I、Y219F、V324T、T369L和A346Q。优选K180P+Q276A+A198D+Y219F、K180P+Q276A+A198D+V324T、K180P+Q276A+A198D+T369L和/或K180P+Q276A+A198D+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是K180P+Q276A+Y219F。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、M199I、A198D、V324T、T369L和A346Q。优选K180P+Q276A+Y219F+V324T、K180P+Q276A+Y219F+T369L和/或K180P+Q276A+Y219F+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是K180P+Q276A+V324T。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、M199I、A198D、Y219F、T369L和A346Q。优选K180P+Q276A+V324T+T369L和/或K180P+Q276A+V324T+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是K180P+Q276A+T369L。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、M199I、A198D、Y219F、V324T和A346Q。优选K180P+Q276A+T369L+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是K180P+Q276A+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、M199I、A198D、Y219F、V324T和T369L。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是K180P+A198D+Y219F。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、M199I、Q276A、V324T、T369L和A346Q。优选K180P+A198D+Y219F+V324T、K180P+A198D+Y219F+T369L和/或K180P+A198D+Y219F+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是K180P+A198D+V324T。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、M199I、Q276A、Y219F、T369L和A346Q。优选K180P+A198D+V324T+T369L和/或K180P+A198D+V324T+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是K180P+A198D+T369L。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、M199I、Q276A、Y219F、V324T和A346Q。优选K180P+A198D+T369L+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是K180P+A198D+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、M199I、Q276A、Y219F、V324T和T369L。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是K180P+Y219F+V324T。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、T369L和A346Q。优选K180P+Y219F+V324T+T369L、K180P+Y219F+V324T+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是K180P+Y219F+T369L。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、V324T和A346Q。优选K180P+Y219F+T369L+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是K180P+Y219F+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、V324T和T369L。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是K180P+V324T+T369L。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219F和A346Q。优选K180P+V324T+T369L+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是K180P+V324T+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219F和T369L。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是K180P+T369L+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219F和V324T。其另外优选的实施方式如上所述。
M199I与选自由S303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合是优选的。另一种优选的组合是M199I+Q276A。另一种优选的组合是M199I+A198D。另一种优选的组合是M199I+Y219F。另一种优选的组合是M199I+V324T。另一种优选的组合是M199I+T369L。另一种优选的组合是M199I+A346Q。
M199I与Q276A以及选自由S303P、D302Y、K180P、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
M199I与A198D以及选自由S303P、D302Y、K180P、Q276A、Y219F、V324T、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
M199I与Y219F以及选自由S303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、V324T、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
M199I与V324T以及选自由S303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219F、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
M199I与T369L以及选自由S303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219F、V324T和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
M199I与A346Q以及选自由S303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219F、V324T和T369L组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
另一种优选的组合是M199I+Q276A+A198D。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、Y219F、V324T、T369L和A346Q。优选M199I+Q276A+A198D+Y219F、M199I+Q276A+A198D+V324T、M199I+Q276A+A198D+T369L和/或M199I+Q276A+A198D+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是M199I+Q276A+Y219F。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、A198D、V324T、T369L和A346Q。优选的是M199I+Q276A+Y219F+V324T和/或M199I+Q276A+Y219F+T369L、M199I+Q276A+Y219F+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是M199I+Q276A+V324T。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、A198D、Y219F、T369L和A346Q。优选M199I+Q276A+V324T+T369L和/或M199I+Q276A+V324T+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是M199I+Q276A+T369L。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、A198D、Y219F、V324T和A346Q。优选M199I+Q276A+T369L+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是M199I+Q276A+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、A198D、Y219F、V324T和T369L。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是M199I+A198D+Y219F。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、Q276A、V324T、T369L和A346Q。优选M199I+A198D+Y219F+V324T和/或M199I+A198D+Y219F+T369L、M199I+A198D+Y219F+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是M199I+A198D+V324T。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、Q276A、Y219F、T369L和A346Q。优选M199I+A198D+V324T+T369L、M199I+A198D+V324T+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是M199I+A198D+T369L。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、Q276A、Y219F、V324T和A346Q。优选M199I+A198D+T369L+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是M199I+A198D+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、Q276A、Y219F、V324T和T369L。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是M199I+Y219F+V324T。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、T369L和A346Q。优选M199I+Y219F+V324T+T369L和/或M199I+Y219F+V324T+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是M199I+Y219F+T369L。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、V324T和A346Q。优选M199I+Y219F+T369L+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是M199I+Y219F+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、V324T和T369L。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是M199I+V324T+T369L。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219F和A346Q。优选M199I+V324T+T369L+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是M199I+V324T+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219F和T369L。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是M199I+T369L+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219F和V324T。其另外优选的实施方式如上所述。
Q276A与选自由S303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合是优选的。另一种优选的组合是Q276A+A198D。另一种优选的组合是Q276A+Y219F。另一种优选的组合是Q276A+V324T。另一种优选的组合是Q276A+T369L。另一种优选的组合是Q276A+A346Q。
Q276A与A198D以及选自由S303P、D302Y、K180P、M199I、Y219F、V324T、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
Q276A与Y219F以及选自S303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、V324T、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
Q276A与V324T以及选自S303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
Q276A与T369L以及选自S303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F、V324T和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
Q276A与A346Q以及选自S303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F、V324T和T369L组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
Q276A与选自由S303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合是优选的。
另一种优选的组合是Q276A+A198D+Y219F。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、M199I、V324T、T369L和A346Q。优选Q276A+A198D+Y219F+V324T和/或Q276A+A198D+Y219F+T369L、Q276A+A198D+Y219F+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是Q276A+A198D+V324T。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、M199I、Y219F、T369L和A346Q。优选Q276A+A198D+V324T+T369L和/或Q276A+A198D+V324T+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是Q276A+A198D+T369L。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、M199I、Y219F、V324T和A346Q。优选Q276A+A198D+T369L+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是Q276A+A198D+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、M199I、Y219F、V324T和T369L。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是Q276A+Y219F+V324T。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、T369L和A346Q。优选Q276A+Y219F+V324T+T369L和/或Q276A+Y219F+V324T+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是Q276A+Y219F+T369L。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、V324T和A346Q。优选Q276A+Y219F+T369L+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是Q276A+Y219F+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、V324T和T369L。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是Q276A+V324T+T369L。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F和A346Q。优选Q276A+V324T+T369L+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是Q276A+V324T+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F和T369L。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是Q276A+T369L+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F和V324T。其另外优选的实施方式如上所述。
A198D与选自由S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F、V324T、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合是优选的。一种优选的组合是A198D+Y219F。另一种优选的组合是A198D+V324T。另一种优选的组合是A198D+T369L。另一种优选的组合是A198D+A346Q。
A198D与Y219F以及选自由S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、V324T、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
A198D与V324T以及选自由S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
A198D与T369L以及选自由S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F、V324T和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
A198D与A346Q以及选自由S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F、V324T和T369L组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
A198D与选自由S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F、V324T、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
一种优选的组合是A198D+Y219F+V324T。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、T369L和A346Q。优选A198D+Y219F+V324T+T369L和/或A198D+Y219F+V324T+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是A198D+Y219F+T369L。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、V324T和A346Q。优选A198D+Y219F+T369L+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是A198D+Y219F+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、V324T和T369L。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是A198D+V324T+T369L。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F和A346Q。优选A198D+V324T+T369L+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是A198D+V324T+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F和T369L。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是A198D+T369L+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F和V324T。其另外优选的实施方式如上所述。
Y219F与选自由S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、V324T、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合是优选的。一种优选的组合是Y219F+V324T。另一种优选的组合是Y219F+T369L。另一种优选的组合是Y219F+A346Q.
Y219F与V324T以及选自由S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
Y219F与T369L以及选自由S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、V324T和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
Y219F与A346Q的选自由S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、V324T和T369L组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
Y219F与选自由S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、V324T、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合是优选的。
另一种优选的组合是Y219F+V324T+T369L。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D和A346Q。优选Y219F+V324T+T369L+A346Q。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是Y219F+V324T+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D和T369L。其另外优选的实施方式如上所述。
另一种优选的组合是Y219F+T369L+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D和V324T。其另外优选的实施方式如上所述。
V324T与选自由S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、T369L和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合是优选的。一种优选的组合是V324T+T369L。另一种优选的组合是V324T+A346Q。
V324T与T369L以及选自由S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
V324T与A346Q以及选自由S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F和T369L组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
一种优选的组合是V324T+T369L+A346Q。在其它变体中，该组合与选自以下的一种或多种组合：S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D和Y219F。其另外优选的实施方式如上所述。
T369L与选自由S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T和A346Q组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合是优选的。一种优选的组合是T369L+A346Q。
T369L与A346Q以及选自由S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F和V324T组成的组的至少另外一种或恰好另外一种的组合也是优选的。
本发明也涉及核酸分子，即多核苷酸分子，其各自编码前述的通过氨基酸取代修饰的SmuA氨基酸序列。不言而喻，这包含了大量多核苷酸分子，由于简并性遗传密码(degenerativen genetischen Code)，其可以出现在多种实施方式中，但仍然编码同样的根据本发明的聚氨基酸分子。本领域技术人员熟悉适于由给出的根据本发明的氨基酸序列找到编码该氨基酸序列的多核苷酸分子的确定的组的生物信息方法。
在第一个实施方式中，根据本发明的多核苷酸分子作为分离的聚核酸分子存在。
在一个替代的实施例中，根据本发明的多核苷酸分子以构建体的形式或作为构建体的组成部分存在，所述构建体介导根据本发明的修饰的蔗糖变位酶在生物体系中，尤其在生物细胞中，优选在细菌细胞中的表达。在一个第一个实施方式中，这样的构建体是包含一个或多个拷贝的根据本发明的多核苷酸分子的表达盒。所述表达盒优选另外包含用于调控所述多核苷酸分子表达的至少一个启动子元件和任选的终止子序列。
本发明的另一目的是包含至少一个或优选多个表达盒的载体构建体。
表达盒和载体构建体的启动子可以是用于在生物体系中表达本发明的多核苷酸分子的公知启动子。优选蔗糖变位酶野生型基因的天然启动子。或者优选更好地介导根据本发明修饰的蔗糖变位酶表达的启动子元件，其尤其可以实现数倍提高的活性，即尤其是表达的蔗糖变位酶的体积活性
除了上述用于根据本发明修饰的蔗糖变位酶的优选染色体外表达的表达载体，本发明也涉及适合于用编码根据本发明修饰的蔗糖变位酶的根据本发明的多核苷酸分子取代包含在生物细胞的基因组内的编码蔗糖变位酶的野生型基因的构建体。此外，这样的交换质粒起到将根据本发明的多核苷酸分子整合在细胞的染色体基因组中的作用。介导基因取代的交换质粒尤其被设置为使得其自身在其被引入的宿主细胞中不被复制。优选的载体构建体是基于R6K复制原点的pUT衍生物。该载体尤其不在红色精朊杆菌(P. rubrum)菌种的宿主细胞内复制，至少并非有条件地复制。
根据本发明的多核苷酸分子可以以染色体外表达构建体的形式或者通过染色体基因取代而被引入至宿主细胞中，所述宿主细胞选自在其它情况下适于将蔗糖转化为异麦芽酮糖的宿主细胞。
本发明也涉及上述根据本发明的多核苷酸分子、取代启动子及其片段或完整的蔗糖变位酶表达盒用于制备根据本发明的细胞的应用。
本发明也涉及上述载体用于制备这样的细胞的应用，所述载体按照本发明的第一方面即为交换质粒，按照本发明的第二方面即为表达载体。
本发明也包括具有新型产物谱的生物细胞，即能够由含蔗糖的底物合成具有至少85重量％或更多（基于异麦芽酮糖组分的干物质重量计），优选86重量％或更多，87重量％或更多，88重量％或更多，89重量％或更多，90重量％或更多，91重量％或更多，92重量％或更多，93重量％或更多，94重量％或更多，特别优选95重量％或更多的异麦芽酮糖组合物的细胞。
选自伽玛变形菌和未分类的伽玛变形菌的组的微生物的宿主细胞是优选的。选自由以下属的微生物组成的组的细胞是优选的：埃希菌属（Escherichia）、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷菌属（Serratia）、欧文菌属（Erwinia）、肠杆菌属(Enterobacter）、克雷伯菌属（Klebsiella）、拉乌尔菌属（Rauoltella）、果胶杆菌属（Pectobacterium）、假单胞菌属（Pseudomonas）、固氮菌属（Azotobacter）、泛菌属（Pantoea）、银合欢属（Leucanea）以及精朊杆菌属（Protaminobacter)。尤其优选的是选自由以下组成的组的细胞：克雷伯菌属（Klebsiella sp.)，尤其是菌株LX3和菌株NK33-98-8；肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)，尤其是菌株342；肠杆菌属（Enterobacter sp.)，尤其是菌株SZ62；肠杆菌属（Enterobacter sp.)，尤其是菌株FMB1；植生拉乌尔菌（Rauoltella planticola)；分散泛菌（Pantoea dispersa）；大黄欧文菌（Erwinia rhapontici）；塔斯马尼亚欧文菌（Erwinia tasmaniensis），尤其是菌株Et1/99；黑腐果胶杆菌（Pectobacterium atrosepticum)，尤其是菌株SCRI1043；胡萝卜果胶杆菌（Pectobacterium carovotum)，尤其是巴西（brasiliensis）亚种，尤其是菌株PBR1692；红色精朊杆菌（Protaminobacter rubrum)；嗜中酸假单胞菌（Pseudomonas mesoacidophila)；普利茅斯沙雷氏菌（Serratiaplymuthica）以及维氏固氮菌（Azotobacter vinelandii)和白头银合欢（Leucanealeucocephalia)。在一个特别优选的变种中，所述细胞是红色精朊杆菌(P.rubrum)或由其衍生的生物技术可用的菌株。本发明也包括这些宿主细胞的固定的和/或以其它方式修饰的形式，使其尤其适用于生物技术方法。
宿主细胞尤其是在细胞中可能存在的蔗糖变位酶-野生型基因的缺失突变体。
一个优选的变体是一种细胞，在其中存在于细胞中的染色体蔗糖变位酶野生型基因在染色体中被编码根据本发明修饰的蔗糖变位酶的核苷酸序列取代。在第一个变体中，该根据本发明修饰的基因由野生型蔗糖变位酶基因的启动子控制。在进一步优选的变体中，该根据本发明修饰的基因由优选内源性同源取代启动子控制。这样的启动子尤其选自由以下组成的组：3,4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸盐合成酶ribB的基因的启动子、编码旧膜蛋白的基因ompA的启动子、编码推定的转录激活子ECA2934的基因的启动子、核糖核酸酶Erne的基因的启动子、50S-核糖体L21-蛋白的操纵子的启动子、冷休克蛋白CspE的操纵子的启动子、50S-核糖体L28-蛋白的操纵子的启动子和NAD依赖性差向异构酶-脱氢酶的基因的启动子及其功能性启动子片段，其可以控制根据本发明修饰的蔗糖变位酶的表达。参考DE 10 2009 053566的全部公开内容，尤其是表1A、1B和序列表的序列SEQ ID No:2-21。
本发明也涉及一种细胞，根据本发明修饰的蔗糖变位酶在其中被染色体外（游离）地表达，尤其在至少一种前述启动子的调节下被表达。
本发明也涉及用于制备这种细胞的工具。一种这样的工具是多核苷酸分子，其包含至少一个或多个拷贝的编码根据本发明修饰的蔗糖变位酶的可表达的片段，还包含至少一个或多个拷贝的调节所述蔗糖变位酶表达的其他元件，尤其是启动子元件。在本发明这方面一个替代的变体中，根据本发明的多核苷酸分子作为表达盒以分离的形式存在。因此，例如可以将其以已知的方式转移至宿主细胞内。本发明的另一目的是用于制备根据本发明的能够将蔗糖转化为异麦芽酮糖或含异麦芽酮糖的组合物的细胞的方法，其中所述方法至少包含下列步骤：在第一步中，提供细胞的野生型菌株或已经经典地或重组地修饰的菌株；在第二步中，使该菌株与至少一种编码根据本发明修饰的蔗糖变位酶的根据本发明的前述多核苷酸分子和/或至少一种前述载体接触或结合，以此将根据本发明的多核苷酸分子以可表达的形式引入细胞中。
在本发明的上下文中，“异麦芽酮糖组合物(或含异麦芽酮糖的组合物)”被理解为由于蔗糖变位酶的作用而由底物蔗糖生成的异麦芽酮糖产物。其包含占绝大部分比例的异麦芽酮糖。其它的组分尤其是海藻糖、异松三糖和果糖以及葡萄糖。其中尤其主要被理解为以下组成：80-99％异麦芽酮糖、1-10％海藻糖、0-0.5％异松三糖、0-0.2％三糖、0-5％单糖和0-0.2％其它糖。
在异麦芽酮糖组合物中，特别优选异麦芽酮糖的比例为至少85重量％或更多（基于异麦芽酮糖组合物的干物质重量），优选86重量％或更多，87重量％或更多，88重量％或更多，89重量％或更多，90重量％或更多，91重量％或更多，92重量％或更多，93重量％或更多，94重量％或更多，特别优选95重量％或更多。本发明也涉及由蔗糖底物或含蔗糖的底物生物技术制备异麦芽酮糖和/或含异麦芽酮糖的组合物的方法。
在第一个方面，所述方法是由含蔗糖的底物生物技术制备异麦芽酮糖和/或异麦芽酮糖组合物的方法，其中，在第一步中，特别地，在使得底物能够转化成异麦芽酮糖或异麦芽酮糖组合物的条件下，使含蔗糖的底物与根据本发明的蔗糖变位酶或与生物催化剂接触。
在另一方面，所述方法是由含蔗糖的底物生物技术制备异麦芽酮糖和/或异麦芽酮糖组合物的方法，其中，在第一步中包含下述步骤：在使得底物能够转化成异麦芽酮糖或异麦芽酮糖组合物的条件下，在含所述底物的培养基中培养前述细胞。优选在一个优选的后续步骤中，从培养基中把异麦芽酮糖或异麦芽酮糖组合物分离出来。在一个特别的基于细胞制备的实施方式中，以已知的方式将细胞固定在基质上或基质中，尤其是藻酸盐基质等。这是特别为蔗糖工业化转化成异麦芽酮糖或异麦芽酮糖组合物而设计的。
因此，本发明的目的还是根据本发明的前述细胞用于优选地由蔗糖或含蔗糖的底物，并且优选按照本文描述的方法，生物技术生产异麦芽酮糖或异麦芽酮糖组合物的应用。
进一步提供根据本发明的多核苷酸分子，其尤其以分离的形式或作为细胞碎片的组分用于开发无细胞体系和生物催化剂。在一个优选的实施方式中，生物催化剂具有支持物
根据本发明修饰的蔗糖变位酶固定于其上。在另一个优选的实施方式中，将根据本发明的多核苷酸分子(尤其以分离的形式)未固定地作为蔗糖变位酶生物催化剂(尤其以溶解的形式)使用。
因此，本发明也涉及生物催化剂，其基本上是不含细胞的，且其特点优选为，在其上固定地存在有根据本发明修饰的蔗糖变位酶。一个优选的第一变体是固定在支持物(优选过滤膜)上的细胞碎片。或者，优选存在分离的(优选以已知方式合成制备的)根据本发明的多核苷酸分子，其具有根据本发明修饰的蔗糖变位酶活性。在一个替代优选的实施方式中，所述生物催化剂通过未固定的、分离的根据本发明的具有蔗糖变位酶活性的多核苷酸分子形成。
通过下列附图和实施例进一步说明本发明，但不应理解为将其仅限于此：
图1示例性地显示了根据本发明制备的，smuA缺失质粒pUT-GntR-P3C1-DsmuA的载体图，所述缺失质粒包含取代序列SEQ ID NO:1（深灰色方框）。该区域在上游smuA-缺失区域1267bp显示与红色精朊杆菌（P.rubrum）染色体的同源性。该区域具有与GntR型转录调节子基因和无痕插入的3C1-启动子的同源性。smuA-缺失区域的下游存在655bp的同源DNA序列。在取代序列内的smuA基因的真正缺失区域显示为放大的黑体核苷酸序列。天然的smuA起始密码子ATG和TAA终止密码子以下划线标出。对于限制酶Nsil和Pmel的界面识别序列同样通过虚线标出。pUT衍生物基于R6K ori（“转移起点”）且为了选择而具有耐卡那霉素的基因aphII和用于编码儿茶酚-2,3双加氧酶的xylE基因。
图2图示并示例性地说明了根据本发明的用于制备smuA缺失突变体红色精朊杆菌(P.rubrum）3C1DsmuA的方法：通过同源重组取代天然smuA基因。基于在宿主细胞红色精朊杆菌(P.rubrum）3C1内优选不复制的载体（例如pUT载体），优选在大肠杆菌(E.coli）中构建smuA-取代质粒。为此，将smuA基因的上游和下游的两个DNA片段准确扩增并融合（参见图1）。连接以后形成XmaI/PstI-片段（参见SEQ ID No:2），其在缺失的smuA基因的上游为长1267bp的DNA片段（其编码推定的gntR-调节子并带有3C1-启动子），和下游为长655bp的DNA片段。这样生成的质粒被转移到宿主细胞中，这里：红色精朊杆菌(P.rubrum）3C1。通过优选对卡那霉素的选择，由此选择出这样的菌群：其在染色体中具有交换质粒，该质粒优选经两个同源区域的至少一个整合到染色体中。在不含卡那霉素的培养基中的孵育，允许选择缺失的菌株，其中整合的质粒经第二次交换（第二次重组）再从染色体去整合。这样的菌落优选是由于xylE-活性的缺乏而以已知的方法在加入儿茶酚后，通过表型检测的（不泛黄）。随后，可以通过分子生物学的方法（例如PCR）以已知的方法来检验缺失菌株的成功制备，以能够额外排除导致重建野生型的取代质粒完全去整合。
图3图示并示例性地说明了根据本发明的用于在smuA缺失突变体红色精朊杆菌(P.rubrum）3C1DsmuA中表达smuA序列变体的方法：基于在宿主细胞红色精朊杆菌（P.rubrum)3C1DsmuA中优选非复制的载体（例如pUT载体），优选在大肠杆菌（E.coli）中构建整合的smuA*-表达质粒。为此，将编码前述根据本发明通过氨基酸取代而修饰的SmuA的氨基酸序列的smuA*-基因与编码推定的gntR-调节子并带有用于表达必需的3C1-启动子的1267bp的DNA片段融合。然后，将融合产物插入到优选非复制的载体（例如pUT载体）中。将生成的质粒转移到宿主细胞中，这里为：红色精朊杆菌(P.rubrum）3C1DsmuA。通过对优选卡那霉素的选择，由此选择出这样的菌群：其smuA*-表达质粒经由同源重组而整合到染色体中。随后，可以通过成熟的分子生物学的方法（例如PCR）来检验整合菌株的成功制备。整合的smuA*-变体基因的表达通过强3C1启动子进行。
序列表包含：
SEQ ID NO:1根据Ravaud等人2009(FEBS Letters 583,1964-1968)，来自红色精朊杆菌(P.rubrum）的野生型蔗糖变位酶SmuA的氨基酸序列：TQQPLLNEKSIEQSKTIPKWWKEAVFYQVYPRSFKDTNGDGIGDINGIIEKLDYLKALGIDAIWINPHYDSPNTDNGYDIRDYRKIMKEYGTMEDFDRLISEMKKRNMRLMIDVVINHTSDQNEWFVKSKSSKDNPYRGYYFWKDAKEGQAPNNYPSFFGGSAWQKDEKTNQYYLHYFAKQQPDLNWDNPKVRQDLYAMLRFWLDKGVSGLRFDTVATYSKIPDFPNLTQQQLKNFAAEYTKGPNIHRYVNEMNKEVLSHYDIATAGEIFGVPLDQSIKFFDRRRDELNIAFTFDLIRLDRDSDQRWRRKDWKLSQFRQIIDNVDRTAGEYGWNAFFLDNHDNPRAVSHFGDDRPQWREPSAKALATLTLTQRATPFIYQGSELGMTNYPFKAIDEFDDIEVKGFWHDYVETGKVKADEFLQNVRLTSRDNSRTPFQWDGSKNAGFTSGKPWFKVNPNYQEINAVSQVTQPDSVFNYYRQLIKIRHDIPALTYGTYTDLDPANDSVYAYTRSLGAEKYLVVVNFKEQMMRYKLPDNLSIEKVIIDSNSKNVVKKNDSLLELKPWQSGVYKLNQ
SEQ ID NO:21942bp的XmaI/PstI-片段的DNA序列，所述片段在克隆后产生非复制载体，例如smuA-缺失质粒pUT-GntR-P3C1-DSmuA(图1)，并且可通过同源重组删除用于smuA基因。所述DNA序列由两个DNA片段的融合产生，其位于红色精朊杆菌（P.rubrum）3C1中待除去的smuA基因的上游和下游。
CCCGGGATCGCATTCATGTTTTCTCCTTCGGTGAAGTGGTCTACTTTTATGGCGATTTGTATACATTAAAGTGATCAAGGAAAAAATAGCCAGAGGAATAGCCAAATAAATTTCAGGTTTTACAGTGCGGTAACCTCTTTTTGTTGCGCGGTTATCAGGATTCATTTAGGGATAAAGAGGTCTTCAAGTGATCTACAAAACGCTTGCTGAACGTCTGAGAATACGTATCAATTCTGCTGATTTTGCTATCGGCGATGCTTTACCCAGTGAGAAACGTCTGGCTGCCGAATTTTCTGTATCGAGGATGACACTCCGCAAAGCGGTAAATTTACTGATTGAATGGGGGCTGGTACGTCGCTGTCACGGCAGCGGAACCTTCGTCGCGCAGAAAGATCTCCAACATGAAACTCGTGGGCTGATGGGGTTTTCAGAACTGATGAAAGAACTGGGCCGCCCCACGGTGAGCGAGGTGCTGGAGTTTCGAATGATGGGAGCCCCCCCAGCCATCGCCAGCCAGCTGCGAATCAAGGCCGATGAACGCATTTACTATTCGCGTCGCGTAAGGTTTGTGGAAGGGAAGCCTGTGGTGCTGGAAGATAGTTACATGCCTGGCAGGTTATTTGGCAACCTTTCAGTCGCACATCTGGAGGGTTCAAAGTTTTCGTATATAGAAGACGAATGCCATATCAATATCGCAGGGAATTACGAAAGCTTCAGCCCGATCTTGGCAGACAGCACGATCGGCGCGCTACTGCACGTTGCCGAAGGCACGCCGCTGCTGCGCCTGACATCGCTTTCTTACAGTGATACCGGCGACTATATCAACTATTCGGTGATATTCAGAAATGCCAATGAATACCACGTGGACTACCATTTGAAGAGGAATAAATAGCGGGCGAAGGGGAGCTACATTCCTACTATATAGCAATTCTGTTGCCTAGTGTAATGCGAGTTGCCCGCCGGATAAACCAATAACCGCATTCTCCGCAGGGGGCCGAATTGTGCTTTTGCCAATTGCCCTGATTAATCATTAGCGTTATAGTCAGAATGCTTATTCTCAGGGCGGGGTGCAAGTCCCCACCGGCGGTAAATCACCTTCTACGGTGAAAGCCCGCGAGCGCTCAGCCAGTCTCTTGTAGTTTGGTTAGAGGTCAGCAGATCCGGTGTAATTCCGGGGCCGACGGTTATAGTCCGGATGGGAGAGAGTAACGGTATCTGCCGGGCTTGCGCCCGCTTGCGTTATTTTTTTAGAAACAGGAGAGTATTGTAATGCATTTTGTTTAAACTAAATCAATAAATCTCATAGTCACGCCAAATAATGTAAATATATTGAAACTATTAAAACCGGCATTTTATGCCGGTTTTTTTAGCGCAAAATAGGGCTGGCAAAGATAAAGCAGGAGGCTACCACCGTGAGCTATATGCTTTTTTAAAAGGCAAGATTCTCCATCGAGGCTCTGCCGTCACCCGAACGCGATAAACCGCGTTTATCCTCAGATGCCTGGCCGTTGCGCGCAAACGAAGACCGGGGTTTGAGGGCTTGTGGGGCAACGCCGGCGAGCCAGTCAGCTTCTCGTGGGTGCGAGCACATTGCTAATGAACAATCTCGCTTCAAATGTTATCGTGAGAATGAAGTGTTGCAGTGGCGCCGCCGGGGTTTGCGCTCGATTCAGGTCTGATTCACATAACAAGGTCACATGGAAATGAAAGTGTTATTCATCGCTTCGCTAGGCGCTTTATCGTTAATGCAAGCATCATTCTCCTTCGCGGATAATGCCAATGGGAAAAACATCTATTCACAGAGATGTACTATGTGCCACGGAACCGATCTCAAAGGCACGGGGCCATTGGCTGATAAAACCAACCCGCCGACACCTGATCTGACAACCCCCGCTTTCAAAGCACGCCTCAATGATTATCCGGGCGTTATTGTATCCTGCAG
SEQID No:3用于编码SmuA-氨基酸取代变体D302Y的全长基因的核苷酸序列。被取代的核苷酸以黑体显示。
ATGCCCCGTCAAGGATTGAAAACTGCACTAGCGATTTTTCTAACCACATCATTATGCATCTCATGCCAGCAAGCCTTCGGTACGCAACAACCCTTGCTTAACGAAAAGAGTATCGAACAGTCGAAAACCATACCTAAATGGTGGAAGGAGGCTGTTTTTTATCAGGTGTATCCGCGCTCCTTTAAAGACACCAACGGAGATGGCATCGGGGATATTAACGGCATCATAGAAAAATTAGACTATCTAAAAGCCTTGGGGATTGATGCCATTTGGATCAACCCACATTATGATTCTCCGAACACGGATAATGGTTACGATATACGTGATTATCGAAAAATCATGAAAGAATATGGCACGATGGAGGATTTTGACCGCCTGATTTCTGAAATGAAAAAACGGAATATGCGGTTGATGATTGATGTGGTCATCAACCACACCAGCGATCAAAACGAATGGTTTGTTAAAAGTAAAAGCAGTAAGGATAATCCTTATCGCGGCTATTATTTCTGGAAAGATGCTAAAGAAGGGCAGGCGCCTAATAATTACCCTTCATTCTTTGGTGGCTCGGCGTGGCAAAAAGATGAAAAGACCAATCAATACTACCTGCACTATTTTGCTAAACAACAGCCTGACCTAAACTGGGATAATCCCAAAGTCCGTCAAGATCTTTATGCAATGTTACGTTTCTGGTTAGATAAAGGCGTGTCTGGTTTACGTTTTGATACGGTAGCGACCTACTCAAAAATTCCGGATTTCCCAAATCTCACCCAACAACAGCTGAAGAATTTTGCAGCGGAGTATACCAAGGGCCCTAATATTCATCGTTACGTCAATGAAATGAATAAAGAGGTCTTGTCTCATTACGACATTGCGACTGCCGGTGAAATCTTTGGCGTACCCTTGGATCAATCGATAAAGTTCTTCGATCGCCGCCGTGATGAGCTGAACATTGCATTTACCTTTGACTTAATCAGACTCGATCGAA
TCTGATCAAAGATGGCGTCGAAAAGATTGGAAATTGTCGCAATTCCGGCAGATCATCGATAACGTTGACCGTACTGCAGGAGAATATGGTTGGAATGCCTTCTTCTTGGATAACCACGACAATCCGCGCGCTGTCTCGCACTTTGGCGATGATCGCCCACAATGGCGTGAGCCATCGGCTAAAGCGCTTGCAACCTTGACGCTGACTCAACGAGCAACACCTTTTATTTATCAAGGTTCAGAATTGGGCATGACCAATTACCCGTTTAAAGCTATTGATGAATTCGATGATATTGAGGTGAAAGGTTTTTGGCATGACTACGTTGAGACAGGAAAGGTCAAAGCCGACGAGTTCTTGCAAAATGTACGCCTGACGAGCAGGGATAACAGCCGGACGCCGTTCCAATGGGATGGGAGCAAAAATGCAGGATTCACGAGCGGAAAACCTTGGTTCAAGGTCAACCCAAACTACCAGGAAATCAATGCAGTAAGTCAAGTCACACAACCCGACTCAGTATTTAACTATTATCGTCAGTTGATCAAGATAAGGCATGACATCCCGGCACTGACCTATGGTACATACACCGATTTGGATCCTGCAAATGATTCGGTCTACGCCTATACACGCAGCCTTGGGGCGGAAAAATATCTTGTTGTTGTTAACTTCAAGGAGCAAATGATGAGATATAAATTACCGGATAATTTATCCATTGAGAAAGTGATTATAGACAGCAACAGCAAAAACGTGGTGAAAAAGAATGATTCATTACTCGAGCTAAAACCATGGCAGTCAGGGGTTTATAAACTAAATCAATAA
SEQ ID No:4用于编码SmuA-双突变体D302Y/S303P的全长基因的核苷酸序列。被取代的核苷酸以黑体显示。
ATGCCCCGTCAAGGATTGAAAACTGCACTAGCGATTTTTCTAACCACATCATTATGCATCTCATGCCAGCAAGCCTTCGGTACGCAACAACCCTTGCTTAACGAAAAGAGTATCGAACAGTCGAAAACCATACCTAAATGGTGGAAGGAGGCTGTTTTTTATCAGGTGTATCCGCGCTCCTTTAAAGACACCAACGGAGATGGCATCGGGGATATTAACGGCATCATAGAAAAATTAGACTATCTAAAAGCCTTGGGGATTGATGCCATTTGGATCAACCCACATTATGATTCTCCGAACACGGATAATGGTTACGATATACGTGATTATCGAAAAATCATGAAAGAATATGGCACGATGGAGGATTTTGACCGCCTGATTTCTGAAATGAAAAAACGGAATATGCGGTTGATGATTGATGTGGTCATCAACCACACCAGCGATCAAAACGAATGGTTTGTTAAAAGTAAAAGCAGTAAGGATAATCCTTATCGCGGCTATTATTTCTGGAAAGATGCTAAAGAAGGGCAGGCGCCTAATAATTACCCTTCATTCTTTGGTGGCTCGGCGTGGCAAAAAGATGAAAAGACCAATCAATACTACCTGCACTATTTTGCTAAACAACAGCCTGACCTAAACTGGGATAATCCCAAAGTCCGTCAAGATCTTTATGCAATGTTACGTTTCTGGTTAGATAAAGGCGTGTCTGGTTTACGTTTTGATACGGTAGCGACCTACTCAAAAATTCCGGATTTCCCAAATCTCACCCAACAACAGCTGAAGAATTTTGCAGCGGAGTATACCAAGGGCCCTAATATTCATCGTTACGTCAATGAAATGAATAAAGAGGTCTTGTCTCATTACGACATTGCGACTGCCGGTGAAATCTTTGGCGTACCCTTGGATCAATCGATAAAGTTCTTCGATCGCCGCCGTGATGAGCTGAACATTGCATTTACCTTTGACTTAATCAGACTCGATCGA
A
CTGATCAAAGATGGCGTCGAAAAGATTGGAAATTGTCGCAATTCCGGCAGATCATCGATAACGTTGACCGTACTGCAGGAGAATATGGTTGGAATGCCTTCTTCTTGGATAACCACGACAATCCGCGCGCTGTCTCGCACTTTGGCGATGATCGCCCACAATGGCGTGAGCCATCGGCTAAAGCGCTTGCAACCTTGACGCTGACTCAACGAGCAACACCTTTTATTTATCAAGGTTCAGAATTGGGCATGACCAATTACCCGTTTAAAGCTATTGATGAATTCGATGATATTGAGGTGAAAGGTTTTTGGCATGACTACGTTGAGACAGGAAAGGTCAAAGCCGACGAGTTCTTGCAAAATGTACGCCTGACGAGCAGGGATAACAGCCGGACGCCGTTCCAATGGGATGGGAGCAAAAATGCAGGATTCACGAGCGGAAAACCTTGGTTCAAGGTCAACCCAAACTACCAGGAAATCAATGCAGTAAGTCAAGTCACACAACCCGACTCAGTATTTAACTATTATCGTCAGTTGATCAAGATAAGGCATGACATCCCGGCACTGACCTATGGTACATACACCGATTTGGATCCTGCAAATGATTCGGTCTACGCCTATACACGCAGCCTTGGGGCGGAAAAATATCTTGTTGTTGTTAACTTCAAGGAGCAAATGATGAGATATAAATTACCGGATAATTTATCCATTGAGAAAGTGATTATAGACAGCAACAGCAAAAACGTGGTGAAAAAGAATGATTCATTACTCGAGCTAAAACCATGGCAGTCAGGGGTTTATAAACTAAATCAATAA
实施例1：在红色精朊杆菌(P.rubrum）3C1/Z12A中smuA野生型基因
被smuA序列变体基因取代
根据本发明的蔗糖变位酶变体（SmuA*）的表征在红色精朊杆菌（P.rubrum）菌株3C1中进行。在该菌株中，通过将天然smuA-启动子无痕取代成3,4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸酯-合成酶基因ribB的同源启动子，SmuA的表达被显著提高(ribB-启动子序列在菌株3C1中，参见SEQ ID No:2核苷酸位置1013-1270)。为确定根据本发明的SmuA*-序列变体的蔗糖变位酶产品特异性，首先将存在于红色精朊杆菌（P.rubrum）菌株3C1中的smuA野生型基因通过同源重组除去。然后，通过同源重组将编码SmuA*-变体的基因整合在smuA缺失突变体中。此操作方法允许序列修饰的基因在同源体系中的表达和根据本发明的序列变体的产品特异性的详细确定而不受SmuA-野生型活性的影响。
1.1红色精朊杆菌（P.rubrum）3C1/Z12A中smuA-野生型基因的缺失
所有克隆和DNA修饰均按照Sambrook等人1989(Molecular cloning:Alaboratory manual,2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)描述的进行。除非另外指明，PCR方法、用于核酸分离的试剂盒、检测方法和选择方法以及培养，均以已知的方式按照各生产商的说明进行。
红色精朊杆菌（P.rubrum）3C1/Z12A中smuA-野生型基因的缺失通过同源重组进行。为此，将smuA-基因的上游和下游的两个DNA片段精准扩增并通过例如无连接酶的克隆融合在一起(Geu-Flores,F.等人2007,Nucleic AcidsResearch 35(7):e55)（参见图1）。或者存在这样的可能性：通过DNA合成来制备希望的DNA片段。在连接或合成后，生成XmaI/PstI-片段(参见SEQ IDNo:2)，其为与缺失的smuA-基因上游的红色精朊杆菌（P.rubrum）3C1染色体同源的1267bp序列的区域。一方面，该区域编码与GntR型转录调节子高度同源的“开放阅读框”（ORF），且另一方面具有3,4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸酯-合成酶基因ribB的红色精朊杆菌（P.rubrum）同源启动子3C1。在缺失的smuA-基因的下游，与红色精朊杆菌（P.rubrum）染色体同源的区域为655bp。
为了进行真正的smuA-缺失，将1942bp的XmaI/PstI-片段克隆进入不在红色精朊杆菌（P.rubrum）中复制的合适的基因取代载体中。适于在红色精朊杆菌（P.rubrum）中进行基因取代的基础载体（Basisvektor）是所谓的pUT-衍生物，其基于R6K复制起点(Herrero等人,1990,J.Bacteriol.,172:6557-67)。仅当存在对于复制必不可少的编码π-蛋白的pir-基因时，这些载体才复制。一种这样的菌株是大肠杆菌（E.coli）S17-1λpir(Herrero et al.,1990,J.Bacteriol.,172:6557-67)，它被用于构建各种启动子取代质粒。在同源重组后介导smuA的精准缺失的一个示例性最终的缺失构建体(pUT-GntR-P3C1-DSmuA)显示于图1中。
所得的smuA-缺失质粒向红色精朊杆菌（P.rubrum）3C1的转移优选通过大肠杆菌（E.colil）S17-1λpir和红色精朊杆菌（P.rubrum）之间的基因间接合来实现。所用的pUT-质粒具有RP4质粒的“转移起点”（oriT），并且可以通过染色体整合在大肠杆菌（E.colil）S17-1λpir中的RP4质粒而移动至红色精朊杆菌（P.rubrum）(Herrero et al.,1990,J.Bacteriol.,172:6557-67)。
如下述优化基因间接合的条件：潜在的红色精朊杆菌（P.rubrum）3C1转接合子的选择需要一个在红色精朊杆菌（P.Rubrum）中可选择的质粒标记物（例如aphII，卡那霉素抗性），和可以选择性地抑制大肠杆菌（E.colil）供体。通过在含利福霉素的培养基（100μg/ml）上铺板（Ausplattieren），自发产生抗利福霉素的红色精朊杆菌（P.rubrum）3C1菌群(红色精朊杆菌（P.rubrum）3C1Rif)，除此以外，其与野生型没有区别。所述接合如下进行：
将具有smuA-取代质粒的大肠杆菌（E.colil）S17-pir供体菌株在5mldYT培养基（每升：16g细菌用胰蛋白胨、10g细菌用酵母萃取物和5g NaCl）中，在加入卡那霉素（50μg/ml）的条件下在37℃过夜培养。类似地，将受体红色精朊杆菌（P.rubrum）3C1在加入利福霉素(100μg/ml)的5ml dYT中，在30℃过夜培养。将各1ml过夜培养物接种到含100ml dYT培养基（添加物见上）的锥形瓶中，并在30℃（红色精朊杆菌（P.rubrum）3C1）或37℃（大肠杆菌（E.colil))和250转/分钟孵育，直至0.4至0.8的OD（600nm）。将供体和受体以1:4的比例混合，离心，用1ml dYT洗涤并最后容纳在100μldYT-培养基中。将该悬浮液移液至位于dYT板上的硝基纤维素过滤器（孔径0.45μm）上，并在30℃孵育过夜。随后，将细胞用1ml dYT由过滤器洗下，稀释，平铺到选择板（dYT+卡那霉素50μg/ml和利福霉素100μg/ml）上并在30℃孵育过夜。
通过卡那霉素的选择，得到这样的红色精朊杆菌（P.rubrum）3C1转接合子，质粒在其中优选经两个同源区域之一被整合在染色体中（图1）。在无卡那霉素的培养基上的孵育允许选择这样的smuA缺失菌株，其中整合的质粒经第二次交换而被从染色体去整合。
为证明去整合成功，可以使用存在于取代质粒上的彩色标记物基因xylE。xylE基因编码儿茶酚-2,3双加氧酶，其将儿茶酚转化为2-羟基己二烯二酸半醛，其可通过显著的黄色而显性识别。之前整合的取代质粒的去整合是少见的事情（1000个菌落里有一个）并且可以借助于此标记物通过加入儿茶酚（喷雾剂：0.2ml 0.5mol/l的水溶液）之后在希望的克隆中黄色消失来检测。因为交换质粒的去整合也可以导致野生型的重构，所有生成的smuA-缺失菌株均可以通过PCR实验、Southern印迹分析和基因组测序来核实并验证。smuA-缺失菌株被称作红色精朊杆菌（P.rubrum）3C1DSmuA（图2）。
1.2序列变体的制备及其在红色精朊杆菌（P.rubrum）3C1DSmuA中的整合
编码前述根据本发明的通过氨基酸取代而修饰的SmuA的氨基酸序列的多核苷酸分子可以通过各种本领域技术人员已知的方法（例如基因合成、无连接酶克隆或重叠延伸PCR）生成。示例性地描述了两个序列变体D302Y和双突变体D302Y/S303P的制备和测试（参比序列是SEQ-ID No:1）。SEQ-ID-No.3描述了编码SmuA氨基酸取代变体D302Y的全长基因的核苷酸序列，和SEQ-ID-No.4描述了编码SmuA双突变体D302Y/S303P的全长基因的核苷酸序列。
编码根据本发明的SmuA的氨基酸取代物(SmuA*)的修饰的smuA基因序列变体(smuA*)可以转移到实施例1.1所述的SmuA缺失菌株中用于表达。为此，将相应的smuA*-变体基因通过本领域技术人员已知的方法例如无连接酶克隆（见上）精准克隆在非复制的pUT衍生物中。如图3所示，这样的质粒如pUT-GntR-P3C1-SmuA*，除了smuA-变体基因smuA*之外还在smuA*上游具有一个1267bp的区域，其与smuA缺失菌株红色精朊杆菌（P.rubrum）3C1DsmuA的染色体同源。经由此区域，可以将质粒通过同源重组整合入红色精朊杆菌（P.rubrum）3C1DSmuA的染色体中(图3)。该转移可通过基因间接合（见实施例1.1）进行。通过卡那霉素选择得到这样的转移结合子，质粒在其中经由smuA*上游的同源区域整合进染色体中。
通过PCR实验证明正确的整合。验证过的转移结合子带有smuA*-变体基因，其通过强3C1启动子组成型地表达。随后，分析在这些菌株中产生的根据本发明通过氨基酸取代而修饰的SmuA-序列变体在全细胞生物转化中的产品谱。
实施例2：根据本发明的SmuA-变体菌株在红色精朊杆菌（P.rubrum）
3C1/Z12A中的产品谱
2.1借助于HPLC分析碳水化合物组成
通过具有下列部件的HPLC进行分离的碳水化合物的确定：HPLC泵；进样器；RI（折射率）检测器；预柱：10mm×4.6mm，氨基相（例如Zorbax-NH2）；分离柱：250mm×4.6mm，氨基相（例如Zorbax-NH2）；用于测量数据采集和分析的界面、电脑和软件。
在以下色谱条件下进行测量：注射体积：10μl；流速：1.0至1.8ml/min。用于最佳分离所设置的流速取决于分离柱的类型和状态以及洗脱液的组成。其它的分析参数见表1。
表1：
2.2在振动瓶中的全细胞生物转化
根据本发明的菌种和野生型对照菌种的培养在30ml LB-培养基（起始OD600为0.05）中进行。培养物分别在30°C、200rmp下在水平振动器中孵育。在首先发酵24小时后，取出5×OD细胞，离心并且用1ml醋酸钙缓冲液（0.01mol/l，pH 5.5）洗涤。将细胞沉淀物（相当于5×OD细胞）分别重悬带有用0.584mol/l(200g/l)的蔗糖溶液的1.25ml醋酸钙缓冲液（0.01mol/l，pH 5.5）中。将该制剂在深孔板中在轻柔振动下在室温孵育90分钟，以进行生物转化。反应通过加热处理（5分钟，98℃）来终止。
表2显示了蔗糖培养下发酵后上清液的HPLC分析结果。
表2：
Claims (26)
1.具有以下氨基酸序列的蔗糖变位酶，所述氨基酸序列选自由相对于SEQ ID NO:1所示的序列，具有一个或多个氨基酸取代的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸取代选自：S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q。
2.根据前述权利要求的蔗糖变位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO:1所示的序列具有氨基酸取代S303P。
3.根据前述权利要求之一的蔗糖变位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO:1所示的序列至少具有氨基酸取代D302Y。
4.根据前述权利要求之一的蔗糖变位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO:1所示的序列至少具有氨基酸取代S303P和D302Y。
5.根据前述权利要求之一的蔗糖变位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO:1所示的序列至少具有氨基酸取代K180P。
6.根据前述权利要求之一的蔗糖变位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO:1所示的序列至少具有氨基酸取代M199I。
7.根据前述权利要求之一的蔗糖变位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO:1所示的序列至少具有氨基酸取代Q276A。
8.根据前述权利要求之一的蔗糖变位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO:1所示的序列至少具有氨基酸取代A198D。
9.根据前述权利要求之一的蔗糖变位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO:1所示的序列至少具有氨基酸取代Y219F。
10.根据前述权利要求之一的蔗糖变位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO:1所示的序列至少具有氨基酸取代V324T。
11.根据前述权利要求之一的蔗糖变位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO:1所示的序列至少具有氨基酸取代T369L。
12.根据前述权利要求之一的蔗糖变位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO:1所示的序列至少具有氨基酸取代A346Q。
13.根据前述权利要求之一的蔗糖变位酶，其中所述酶作为分离的聚氨基酸分子存在。
14.生物催化剂，其包含固定在支持物上的如前述权利要求之一的蔗糖变位酶。
15.多核苷酸分子，其编码前述权利要求之一的蔗糖变位酶。
16.载体，其包含一个或多个权利要求15的多核苷酸分子。
17.细胞，其包含权利要求16的多核苷酸分子。
18.根据权利要求17的细胞，其在所述细胞的染色体中包含权利要求15的多核苷酸分子。
19.根据权利要求17的细胞，其在染色体外（游离地）包含权利要求15的多核苷酸分子。
20.根据权利要求17-19之一的细胞，其选自由下列属的微生物组成的组：埃希菌属（Escherichia）、沙门氏菌属（Salmonella）、沙雷菌属（Serratia）、欧文菌属（Erwinia）、肠杆菌属（Enterobacter）、克雷伯菌属（Klebsiella）、拉乌尔菌属（Rauoltella）、果胶杆菌属（Pectobacterium）、假单胞菌属（Pseudomonas）、固氮菌属（Azotobacter）、泛菌属（Pantoea）、银合欢属（Leucanea）以及精朊杆菌属（Protaminobacter）。
21.根据权利要求20的细胞，其选自红色精朊杆菌（Protaminobacterrubrum）的生物。
22.用于制备权利要求17-21之一所述的细胞的方法，其包括下列步骤：
-提供细胞，和
-使所述菌种与权利要求15的多核苷酸分子和/或权利要求16的载体接触。
23.由含蔗糖的底物生物技术制备异麦芽酮糖或异麦芽酮糖组合物的方法，其包括下列步骤：在有利于所述底物转化成异麦芽酮糖或异麦芽酮糖组合物的条件下，使所述含蔗糖的底物与权利要求1-13之一的蔗糖变位酶或权利要求14的生物催化剂接触。
24.由含蔗糖的底物生物技术制备异麦芽酮糖或异麦芽酮糖组合物的方法，其包括下列步骤：在有利于所述底物转化成异麦芽酮糖或异麦芽酮糖组合物的条件下，在含所述底物的培养基中培养权利要求17-21之一的细胞或可按照权利要求22的方法制备的细胞。
25.根据权利要求24的方法，其中所述细胞固定在基质中以用于转化。
26.根据权利要求24或25的方法，其进一步包含下列步骤：从培养基和/或细胞中分离所述异麦芽酮糖或异麦芽酮糖组合物。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C05 | Deemed withdrawal (patent law before 1993) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120926 |