JP7489134B2 - Ｄ－プシコース３－エピメラーゼ産生菌株及びその使用 - Google Patents
Ｄ－プシコース３－エピメラーゼ産生菌株及びその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7489134B2 JP7489134B2 JP2022569120A JP2022569120A JP7489134B2 JP 7489134 B2 JP7489134 B2 JP 7489134B2 JP 2022569120 A JP2022569120 A JP 2022569120A JP 2022569120 A JP2022569120 A JP 2022569120A JP 7489134 B2 JP7489134 B2 JP 7489134B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- psicose
- bacillus subtilis
- hag
- promoter
- epimerase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108030002106 D-psicose 3-epimerases Proteins 0.000 title claims description 53
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 107
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 63
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 42
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 28
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 28
- 108010041525 Alanine racemase Proteins 0.000 claims description 20
- BJHIKXHVCXFQLS-PUFIMZNGSA-N D-psicose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C(=O)CO BJHIKXHVCXFQLS-PUFIMZNGSA-N 0.000 claims description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 19
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 15
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 15
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 15
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 15
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 claims description 7
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 6
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 claims description 5
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 claims description 5
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 claims description 5
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 3
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 32
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 31
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 31
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 30
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N D-Fructose Natural products OC[C@H]1OC(O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N 0.000 description 4
- 108090001066 Racemases and epimerases Proteins 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 101100213772 Bacillus subtilis (strain 168) ylbP gene Proteins 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical compound C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- LKDRXBCSQODPBY-JDJSBBGDSA-N D-allulose Chemical compound OCC1(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O LKDRXBCSQODPBY-JDJSBBGDSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000004879 Racemases and epimerases Human genes 0.000 description 2
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 2
- 101710131583 Trypsin-10 Proteins 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 101100162670 Bacillus subtilis (strain 168) amyE gene Proteins 0.000 description 1
- 101100095804 Bacillus subtilis (strain 168) sigX gene Proteins 0.000 description 1
- 241000276408 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N D-fructose group Chemical group OCC(=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N 0.000 description 1
- -1 HpaII Proteins 0.000 description 1
- 101150014040 P43 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 101150009206 aprE gene Proteins 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000385736 bacterium B Species 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- JWEBAGKDUWFYTO-UHFFFAOYSA-L disodium;hydrogen phosphate;decahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O JWEBAGKDUWFYTO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 235000021474 generally recognized As safe (food) Nutrition 0.000 description 1
- 235000021473 generally recognized as safe (food ingredients) Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 101150107068 gsiB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 235000013615 non-nutritive sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 101150112117 nprE gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/02—Monosaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明はＤ－プシコース３－エピメラーゼ産生菌株及びその使用に関し、生物工学の技術分野に属する。
Ｄ－プシコース（Ｄ－ａｌｌｕｌｏｓｅ）はＤ－フルクトースのＣ－３位のエピマーであり、低カロリー甘味料として使用でき、メイラード反応により心地よい味（美味しさ）を生成でき、食品のゲル性を改善することができ、血糖と血中脂質レベルの低下、脂肪蓄積の減少、活性酸素（ＲＯＳ）の除去などの生物調節機能を有する。
２０１４年には、米国食品医薬品局の法規制により、Ｄ－プシコースが一般安全とされ、食品や栄養補助食品、医薬品製剤への添加が認められていた。そのため、Ｄ－プシコースは医薬、食品などの分野で広く応用可能な将来性がある。
Ｄ－プシコースは、自然界に存在する量が極めて少なく、直接抽出することは現実的ではない希少糖である。また、化学合成は副生成物を生成し、分離が困難になり、生産コストを大幅に高め、しかも複雑な反応過程は過度の汚染をもたらす。そのため、現在、Ｄ－プシコースの生産には、主に生物転化法が用いられている。自然抽出法や化学合成法に比べ、生物転化法は反応条件が温和で、特異性が高く、環境に優しいなどの利点がある。生物転化法では、Ｄ－フルクトースをＤ－プシコースに変換することができるＤ－プシコース３－エピメラーゼが重要な役割を果たす。
枯草菌は食品級微生物（ＧＲＡＳ）であり、工業生産に適している。また、それは遺伝背景が明確で、遺伝操作が簡単で成熟しており、規模が拡大しやすく培養しやすいなどの利点があり、Ｄ－プシコース３－エピメラーゼを発酵合成するために好適なプラットフォームである。
本発明の第１目的は目的タンパク質の発現量を向上する発現ベクターであって、ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上のＰ４３プロモーターをｈａｇ、ｙｌｂＰ、ｈａｇＰ４３、ｙｌｂＰｙｌｂＰ、ｈａｇｈａｇのいずれか１つのプロモーターに置換して得られたものであり、
前記プロモーターｈａｇ、ｙｌｂＰ、ｈａｇＰ４３、ｙｌｂＰｙｌｂＰ、ｈａｇｈａｇのヌクレオチド配列がそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６で示される、発現ベクターを提供することである。
前記プロモーターｈａｇ、ｙｌｂＰ、ｈａｇＰ４３、ｙｌｂＰｙｌｂＰ、ｈａｇｈａｇのヌクレオチド配列がそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６で示される、発現ベクターを提供することである。
本発明の一実施形態では、前記目的タンパク質はＤ－プシコース３－エピメラーゼ又はリン酸化グリコシルエピメラーゼであり、前記Ｄ－プシコース３－エピメラーゼのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１で示され、前記リン酸化グリコシルエピメラーゼのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３で示される。
本発明の一実施形態では、前記Ｄ－プシコース３－エピメラーゼをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示される。
本発明の第２目的は、ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位が同時に変異している、発現ベクターを提供することである。
本発明の一実施形態では、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇ配列上の塩基の第１２９位～１３７位のａｇｇｇａｇｇａａ配列が、ｇａｇｇａｇｇａａ（Ｒ２と命名する）、ｇｇｇｇａｇｇａｇ（Ｒ４と命名する）、ａｇｇｇａｇｇａｇ（Ｒ１１と命名する）、ａｇｇｇａｇｇｇｇ（Ｒ１３と命名する）、ａａｇｇａｇｇａｇ（Ｒ１４と命名する）、又はａａｇｇａｇｇｇｇ（Ｒ１５と命名する）に変異している。
本発明の第３目的は、
ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位が、ｇｇｇｇａｇｇａｇに同時に変異しており、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９のアラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌにより、ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上の耐性遺伝子カナマイシンＫａｎが代替された、又は、ｐＵＢ１１０プラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位が、ｇｇｇｇａｇｇａｇに同時に変異しており、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９のアラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌにより、ｐＵＢ１１０プラスミド上の耐性遺伝子カナマイシンＫａｎ及びブレオマイシンＢｌｍが代替されたものである無耐性発現ベクターを提供することである。
ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位が、ｇｇｇｇａｇｇａｇに同時に変異しており、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９のアラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌにより、ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上の耐性遺伝子カナマイシンＫａｎが代替された、又は、ｐＵＢ１１０プラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位が、ｇｇｇｇａｇｇａｇに同時に変異しており、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９のアラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌにより、ｐＵＢ１１０プラスミド上の耐性遺伝子カナマイシンＫａｎ及びブレオマイシンＢｌｍが代替されたものである無耐性発現ベクターを提供することである。
本発明の一実施形態では、前記発現ベクターが、アラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌにより、耐性遺伝子カナマイシンＫａｎ及びブレオマイシンＢｌｍを代替して、スクリーニングマーカーであるコピー可能プラスミドｐＵＢ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌにし、アラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌにより、耐性遺伝子カナマイシンＫａｎを代替して、スクリーニングマーカーであるコピー可能プラスミドｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌにする。
本発明の一実施形態では、アラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９で示される。
本発明の第３目的は、上記発現ベクターを含む組換え細胞を提供することである。
本発明の一実施形態では、前記組換え細胞は細菌又は真菌を発現宿主とする。
本発明の一実施形態では、前記組換え細胞は枯草菌ＷＢ８００又は枯草菌１Ａ７５１を発現宿主とする。
本発明の第４目的は上記ベクターを発現ベクター、枯草菌ＷＢ８００又は枯草菌１Ａ７５１を発現宿主として、Ｄ－プシコース３－エピメラーゼを発現させる組換え枯草菌を提供することである。
本発明の一実施形態では、前記Ｄ－プシコース３－エピメラーゼ遺伝子をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示される。
本発明の第５目的は、組換え枯草菌であって、目的遺伝子を担持した発現ベクターをアラニンラセマーゼ遺伝子ノックアウト枯草菌に導入して得るものであり、前記発現ベクターは、
ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位が、ｇｇｇｇａｇｇａｇに同時に変異している、又は
ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位が、ｇｇｇｇａｇｇａｇに同時に変異しており、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９のアラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌにより、ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上の耐性遺伝子カナマイシンＫａｎが代替された、又は、
ｐＵＢ１１０プラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位が、ｇｇｇｇａｇｇａｇに同時に変異しており、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９のアラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌにより、ｐＵＢ１１０プラスミド上の耐性遺伝子カナマイシンＫａｎ及びブレオマイシンＢｌｍが代替されたものである、組換え枯草菌を提供することである。
ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位が、ｇｇｇｇａｇｇａｇに同時に変異している、又は
ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位が、ｇｇｇｇａｇｇａｇに同時に変異しており、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９のアラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌにより、ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上の耐性遺伝子カナマイシンＫａｎが代替された、又は、
ｐＵＢ１１０プラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位が、ｇｇｇｇａｇｇａｇに同時に変異しており、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９のアラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌにより、ｐＵＢ１１０プラスミド上の耐性遺伝子カナマイシンＫａｎ及びブレオマイシンＢｌｍが代替されたものである、組換え枯草菌を提供することである。
本発明の一実施形態では、前記組換え枯草菌はアラニンラセマーゼ遺伝子ノックアウト枯草菌１Ａ７５１、枯草菌ＷＢ６００又は枯草菌ＷＢ８００を発現宿主とする。
本発明の一実施形態では、前記発現宿主は枯草菌１Ａ７５１であり、前記アラニンラセマーゼ遺伝子ノックアウト枯草菌は枯草菌１Ａ７５１Δｄａｌである。
本発明の一実施形態では、本発明に使用される枯草菌１Ａ７５１Δｄａｌ、すなわち枯草菌１Ａ７５１染色体上のＤ－アラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌをノックアウトしたものは、従来、発明者ら（ラボ前期）で構築されたものである（構築方法は特許：江波、沐万孟、何偉偉、張涛．Ｃｒｅ／ｌｏｘ系統に基づく無耐性遺伝子染色体に組み込むＤ－プシコース３－エピメラーゼ発現組換え枯草菌の構築方法［Ｐ］、及び開示番号ＣＮ１０４９４６５７７Ａの中国発明特許の出願文献を参照）。
本発明の第６目的は、上記発現ベクターを用いて発現させるＤ－プシコース３－エピメラーゼ発現量の向上方法を提供することである。
本発明の第７目的は、Ｄ－プシコース３－エピメラーゼを担持した組換え枯草菌から菌体を得て、菌体からＤ－プシコース３－エピメラーゼを単離するＤ－プシコース３－エピメラーゼ産生方法を提供することである。
本発明の第８目的は、上記製造した組換えＤ－プシコース３－エピメラーゼを、フルクトース含有反応系に添加して反応させ、反応液を得て、反応液からＤ－プシコースを単離する、Ｄ－プシコースの生産方法を提供することである。
本発明の一実施形態では、前記組換え細胞又は組換え枯草菌の発酵液において、組換えＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性が、少なくとも１５．６７Ｕ／ｍＬである。
本発明の第９目的は、上記Ｄ－プシコース３－エピメラーゼを担持した組換え枯草菌の、Ｄ－プシコース又はＤ－プシコースを含有する製品の製造における使用を提供することである。
本発明の一実施形態では、前記製品は食品、医薬品又は化粧品である。
有利な効果
（１）本発明は、プロモータースクリーニング及びそのＲＢＳ最適化によるＤ－プシコース３－エピメラーゼ発現量の向上方法を提供する。本発明によるベクターｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ及びｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ＲＢＳ４で構築された組換え枯草菌は、目的遺伝子Ｄ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性を向上させ、改変後の酵素活性はそれぞれ元のｐＰ４３ＮＭＫ－Ｐ４３／Ｂ． Ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００の１．３０倍及び１．６９倍、ｐＰ４３ＮＭＫ－ＨｐａＩＩ／Ｂ． Ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００の１．７７倍及び２．２９倍である。
（２）本発明は、一般な宿主菌よりも安全でＤ－プシコースの工業的生産に適している食品等級のＤプシコース３－エピメラーゼを発現させた組換え枯草菌を提供する。
（１）本発明は、プロモータースクリーニング及びそのＲＢＳ最適化によるＤ－プシコース３－エピメラーゼ発現量の向上方法を提供する。本発明によるベクターｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ及びｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ＲＢＳ４で構築された組換え枯草菌は、目的遺伝子Ｄ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性を向上させ、改変後の酵素活性はそれぞれ元のｐＰ４３ＮＭＫ－Ｐ４３／Ｂ． Ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００の１．３０倍及び１．６９倍、ｐＰ４３ＮＭＫ－ＨｐａＩＩ／Ｂ． Ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００の１．７７倍及び２．２９倍である。
（２）本発明は、一般な宿主菌よりも安全でＤ－プシコースの工業的生産に適している食品等級のＤプシコース３－エピメラーゼを発現させた組換え枯草菌を提供する。
以下の実施例に係るｐＰ４３ＮＭＫプラスミドは、武漢▲みゃお▼霊生物社（Wuhan miaolingbio bioscience & technology co.,ltd）より購入したものであり、下記の実施例に係る大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５αは、通用生物技術有限公司（Generalbiol）より購入したものであり、下記の実施例に係る枯草菌ＷＢ８００は、ＮＴＣＣ典型培養物寄託センターより購入したものである。
下記の実施例に係る枯草菌１Ａ７５１Δｄａｌ、即ち枯草菌１Ａ７５１の染色体上のＤ－アラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌをノックアウトしたものの構築方法は特許：江波、沐万孟、何偉偉、張涛．Ｃｒｅ／ｌｏｘ系統に基づく無耐性遺伝子染色体に組み込むＤ－プシコース３－エピメラーゼ発現組換え枯草菌の構築方法［Ｐ］、及び開示番号ＣＮ１０４９４６５７７Ａの中国発明特許の出願文献を参照する。
下記実施例に係るＤ－プシコース３－エピメラーゼについては、本発明では、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示されるＤ－プシコース３－エピメラーゼを例として本発明の技術的効果を説明するが、本発明の実施例はこれらに制限されるものではなく、なお、本発明のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１で示されるＤ－プシコース３－エピメラーゼ、又はコドン最適化若しくは突然変異改変を受けた配列も本発明の技術的効果を奏しうる。
下記実施例に係る培地は以下のとおりである。
ＬＢ液体培地：トリプシン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、ｐＨ自然。
ＬＢ固体培地：トリプシン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、寒天粉１５ｇ／Ｌ。
発酵培地：ブドウ糖１５ｇ／Ｌ、酵母抽出物２０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム８ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム・十ニ水和物１ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム7水和物１ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０。
ＬＢ液体培地：トリプシン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、ｐＨ自然。
ＬＢ固体培地：トリプシン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、寒天粉１５ｇ／Ｌ。
発酵培地：ブドウ糖１５ｇ／Ｌ、酵母抽出物２０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム８ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム・十ニ水和物１ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム7水和物１ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０。
下記実施例に係る検出方法は以下のとおりである。
Ｄ－プシコース３－エピメラーゼ酵素活性の測定方法：反応系１ｍＬにリン酸塩緩衝液（５０ ｍＭ、ｐＨ７．０）で溶解した１００ｇ／ＬのＤ－フルクトース８００μＬ、発酵液２００μＬを加え、５５℃で１０ｍｉｎ保温した後、１０ｍｉｎ沸騰させて酵素反応を停止する。
ＨＰＬＣによってＤ－プシコースの生成量を検出し、酵素活性を算出する。酵素活性単位の定義（Ｕ）：１分あたり１μｍｏｌのＤ－プシコースを触媒により産生するのに必要な酵素量は１酵素活性単位とする。
酵素活性（Ｕ／ｍＬ）＝反応系中に産生されたプシコース量（ｍｇ／ｍＬ）＊１ｍＬ＊１０００／１８０／１０／０．２。
Ｄ－プシコース３－エピメラーゼ酵素活性の測定方法：反応系１ｍＬにリン酸塩緩衝液（５０ ｍＭ、ｐＨ７．０）で溶解した１００ｇ／ＬのＤ－フルクトース８００μＬ、発酵液２００μＬを加え、５５℃で１０ｍｉｎ保温した後、１０ｍｉｎ沸騰させて酵素反応を停止する。
ＨＰＬＣによってＤ－プシコースの生成量を検出し、酵素活性を算出する。酵素活性単位の定義（Ｕ）：１分あたり１μｍｏｌのＤ－プシコースを触媒により産生するのに必要な酵素量は１酵素活性単位とする。
酵素活性（Ｕ／ｍＬ）＝反応系中に産生されたプシコース量（ｍｇ／ｍＬ）＊１ｍＬ＊１０００／１８０／１０／０．２。
実施例１：各プロモーターを含有する組換え枯草菌の構築
具体的な操作ステップ：
（１）Ｄ－プシコース３－エピメラーゼ遺伝子の取得：人工合成ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示される。
（２）各プロモーター遺伝子の取得：使用されるプロモーターはｈａｇ、ｙｌｂＰ、ｈａｇＰ４３、ｙｌｂＰｙｌｂＰ、ｈａｇｈａｇ、ａｍｙＥ、ａｐｒＥ、ｇｓｉＢ、ＨｐａＩＩ、ｎｐｒＥ、ｓｉｇＸ、Ｐ４３ｈａｇ、ｙｌｂＰｈａｇ、ｈａｇｙｌｂＰ、ｙｌｂＰＰ４３、Ｐ４３ｙｌｂＰ、Ｐ４３Ｐ４３であり、そのヌクレオチド配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８で示される。
シングルプロモーターでは、ＨｐａＩＩがＰＭＡ５プラスミドをテンプレートとしてクローニングされたことを除き、残りのシングルプロモーターは全てＢ． Ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８をテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行い、デュアルプロモーターはシングルプロモーターのベクターをテンプレートとして、融合ＰＣＲ（Fusion PCR）による増幅を行うことにより得ることができる。
（３）Ｄ－プシコース３－エピメラーゼの遺伝子とプロモーターの遺伝子を融合ＰＣＲにより融合した後、融合後の断片とＰ４３プロモーター遺伝子を除去した線状化ｐＰ４３ＮＭＫプラスミドとを相同組換え酵素Ｅｘｎａｓｅ IIで連結し、連結産物（ライゲーション産物）を得た。連結産物を大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。形質転換した大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞をＬＢ固体培地（１００μｇ・ｍＬ－１アンピシリン含有）に塗布し、３７℃で１２ｈ倒置培養した。陽性形質転換体を選択してプラスミドを抽出し、シーケンシングにより検証して正しい場合、組換えプラスミドｐＰ４３ＮＭＫ－Ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ｄｐｅを取得した。取得した組換えプラスミドｐＰ４３ＮＭＫ－Ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ｄｐｅをＢ． Ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００コンピテント細胞に導入し、形質転換産物を得た。形質転換産物をＬＢ固体培地（１００μｇ・ｍＬ－１カナマイシン含有）に塗布し、３７℃の恒温インキュベータにて１２ｈ倒置培養し、形質転換体を得た。形質転換体についてＰＣＲ検証を行った結果、正しい場合、組換え枯草菌を取得した。
B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-ylbP -dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hagP43-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-ylbPylbP-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-haghag-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-amyE-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-aprE-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-gsiB-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-HpaII-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-nprE-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-sigX-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-P43hag-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-ylbPhag-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hagylbP-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-ylbPP43-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-P43ylbP-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-P43P43-dpeがそれぞれ調製された。
具体的な操作ステップ：
（１）Ｄ－プシコース３－エピメラーゼ遺伝子の取得：人工合成ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示される。
（２）各プロモーター遺伝子の取得：使用されるプロモーターはｈａｇ、ｙｌｂＰ、ｈａｇＰ４３、ｙｌｂＰｙｌｂＰ、ｈａｇｈａｇ、ａｍｙＥ、ａｐｒＥ、ｇｓｉＢ、ＨｐａＩＩ、ｎｐｒＥ、ｓｉｇＸ、Ｐ４３ｈａｇ、ｙｌｂＰｈａｇ、ｈａｇｙｌｂＰ、ｙｌｂＰＰ４３、Ｐ４３ｙｌｂＰ、Ｐ４３Ｐ４３であり、そのヌクレオチド配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８で示される。
シングルプロモーターでは、ＨｐａＩＩがＰＭＡ５プラスミドをテンプレートとしてクローニングされたことを除き、残りのシングルプロモーターは全てＢ． Ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８をテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行い、デュアルプロモーターはシングルプロモーターのベクターをテンプレートとして、融合ＰＣＲ（Fusion PCR）による増幅を行うことにより得ることができる。
（３）Ｄ－プシコース３－エピメラーゼの遺伝子とプロモーターの遺伝子を融合ＰＣＲにより融合した後、融合後の断片とＰ４３プロモーター遺伝子を除去した線状化ｐＰ４３ＮＭＫプラスミドとを相同組換え酵素Ｅｘｎａｓｅ IIで連結し、連結産物（ライゲーション産物）を得た。連結産物を大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。形質転換した大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞をＬＢ固体培地（１００μｇ・ｍＬ－１アンピシリン含有）に塗布し、３７℃で１２ｈ倒置培養した。陽性形質転換体を選択してプラスミドを抽出し、シーケンシングにより検証して正しい場合、組換えプラスミドｐＰ４３ＮＭＫ－Ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ｄｐｅを取得した。取得した組換えプラスミドｐＰ４３ＮＭＫ－Ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ｄｐｅをＢ． Ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００コンピテント細胞に導入し、形質転換産物を得た。形質転換産物をＬＢ固体培地（１００μｇ・ｍＬ－１カナマイシン含有）に塗布し、３７℃の恒温インキュベータにて１２ｈ倒置培養し、形質転換体を得た。形質転換体についてＰＣＲ検証を行った結果、正しい場合、組換え枯草菌を取得した。
B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-ylbP -dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hagP43-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-ylbPylbP-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-haghag-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-amyE-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-aprE-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-gsiB-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-HpaII-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-nprE-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-sigX-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-P43hag-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-ylbPhag-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hagylbP-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-ylbPP43-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-P43ylbP-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-P43P43-dpeがそれぞれ調製された。
実施例２：プロモーターを含有する組換え枯草菌の発酵によるＤ－プシコース３－エピメラーゼの産生
具体的なステップは以下のとおりである。
（１）実施例１で調製された組換え枯草菌をＬＢ液体培地にそれぞれ添加し、３７℃、２００ｒｐｍの条件下で、１２ｈ振とう培養し、シード液を製造した。
（２）製造されたシード液を３％（ｖ／ｖ）の播種量で発酵培地に播種し、３７℃、２００ｒｐｍの条件下で、振とう培養を行い、酵素含有菌体細胞を単離した。
発酵液菌体細胞中のＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性をそれぞれ検出し、結果を表１及び図１に示す。
その結果、組換え菌Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ｄｐｅは効果が最も高く、酵素活性が１９．６２Ｕ／ｍＬと高い。
よって、後の実施例では、プラスミドｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ｄｐｅをテンプレートとして、ｈａｇプロモーター上のＲＢＳ配列を変異することによって、Ｄ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性をさらに向上させる。
具体的なステップは以下のとおりである。
（１）実施例１で調製された組換え枯草菌をＬＢ液体培地にそれぞれ添加し、３７℃、２００ｒｐｍの条件下で、１２ｈ振とう培養し、シード液を製造した。
（２）製造されたシード液を３％（ｖ／ｖ）の播種量で発酵培地に播種し、３７℃、２００ｒｐｍの条件下で、振とう培養を行い、酵素含有菌体細胞を単離した。
発酵液菌体細胞中のＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性をそれぞれ検出し、結果を表１及び図１に示す。
よって、後の実施例では、プラスミドｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ｄｐｅをテンプレートとして、ｈａｇプロモーター上のＲＢＳ配列を変異することによって、Ｄ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性をさらに向上させる。
実施例３：各ＲＢＳを含有する組換え枯草菌の構築
具体的なステップは以下のとおりである。
プラスミドｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ｄｐｅをテンプレート、ＲＢＳ－Ｆ／ＲＢＳ－Ｒをプライマーとして、ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ＰＣＲを行い、ｈａｇプロモーター上のＲＢＳ配列を変異させ、各ＲＢＳ配列を含有する線状化プラスミドを構築した。
プライマー：
RBS-F: tgccttaacaacatattcrrggaggrrcaaaacaatgaagcatggta
RBS-R: taccatgcttcattgttttgyycctccyygaatatgttgttaaggca
構築した線状化プラスミドを大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。形質転換後の大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞をＬＢ固体培地（１００μｇ・ｍＬ－１アンピシリン含有）に塗布し、３７℃で１２ｈ倒置培養した。所定量の陽性形質転換体を選択して、プラスミドを抽出し、シーケンシングにより検証して正しい場合、組換えプラスミドｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ＲＢＳｎ－ｄｐｅを取得し、１５個の異なるＲＢＳ変異体をそれぞれ取得した。変異配列は以下のとおりである。
ｇｇｇｇａｇｇａａ（Ｒ１と命名する）、ｇａｇｇａｇｇａａ（Ｒ２と命名する）、ｇｇｇｇａｇｇｇａ（Ｒ３と命名する）、ｇｇｇｇａｇｇａｇ（Ｒ４と命名する）、ｇａｇｇａｇｇｇｇ（Ｒ５と命名する）、ｇａｇｇａｇｇｇａ（Ｒ６と命名する）、ｇｇｇｇａｇｇｇｇ（Ｒ７と命名する）、ｇａｇｇａｇｇａｇ（Ｒ８と命名する）、ａａｇｇａｇｇａａ（Ｒ９と命名する）、ａｇｇｇａｇｇｇａ（Ｒ１０と命名する）、ａｇｇｇａｇｇａｇ（Ｒ１１と命名する）、ａａｇｇａｇｇｇａ（Ｒ１２と命名する）、ａｇｇｇａｇｇｇｇ（Ｒ１３と命名する）、ａａｇｇａｇｇａｇ（Ｒ１４と命名する）、ａａｇｇａｇｇｇｇ（Ｒ１５と命名する）
組換えプラスミドpP43NMK-hag-R1-dpe、pP43NMK-hag-R2-dpe、pP43NMK-hag-R3-dpe、pP43NMK-hag-R4-dpe、pP43NMK-hag-R5-dpe、pP43NMK-hag-R6-dpe、pP43NMK-hag-R7-dpe、pP43NMK-hag-R8-dpe、pP43NMK-hag-R9-dpe、pP43NMK-hag-R10-dpe、pP43NMK-hag-R11-dpe、pP43NMK-hag-R12-dpe、pP43NMK-hag-R13-dpe、pP43NMK-hag-R14-dpe、pP43NMK-hag-R15-dpeがそれぞれ調製された。
変異前のＲＢＳ配列をＲ０と命名すると、組換えプラスミドはｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ０－ｄｐｅとして表現される。
取得した組換えプラスミドｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒｎ－ｄｐｅ及びｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ０－ｄｐｅをそれぞれＢ． Ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００コンピテント細胞に導入し、形質転換産物を得た。形質転換産物をＬＢ固体培地（１００μｇ・ｍＬ－１カナマイシン含有）に塗布し、３７℃の恒温インキュベータで１２ｈ倒置培養し、形質転換体を得た。形質転換体をシーケンシングして正しい場合、組換え枯草菌を取得した。
即ち、
B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R1-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R2-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R3-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R4-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R5-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R6-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R7-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R8-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R9-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R10-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R11-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R12-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R13-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R14-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R15-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R0-dpeがそれぞれ調製された。
具体的なステップは以下のとおりである。
プラスミドｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ｄｐｅをテンプレート、ＲＢＳ－Ｆ／ＲＢＳ－Ｒをプライマーとして、ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ＰＣＲを行い、ｈａｇプロモーター上のＲＢＳ配列を変異させ、各ＲＢＳ配列を含有する線状化プラスミドを構築した。
プライマー：
RBS-F: tgccttaacaacatattcrrggaggrrcaaaacaatgaagcatggta
RBS-R: taccatgcttcattgttttgyycctccyygaatatgttgttaaggca
構築した線状化プラスミドを大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。形質転換後の大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞をＬＢ固体培地（１００μｇ・ｍＬ－１アンピシリン含有）に塗布し、３７℃で１２ｈ倒置培養した。所定量の陽性形質転換体を選択して、プラスミドを抽出し、シーケンシングにより検証して正しい場合、組換えプラスミドｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ＲＢＳｎ－ｄｐｅを取得し、１５個の異なるＲＢＳ変異体をそれぞれ取得した。変異配列は以下のとおりである。
ｇｇｇｇａｇｇａａ（Ｒ１と命名する）、ｇａｇｇａｇｇａａ（Ｒ２と命名する）、ｇｇｇｇａｇｇｇａ（Ｒ３と命名する）、ｇｇｇｇａｇｇａｇ（Ｒ４と命名する）、ｇａｇｇａｇｇｇｇ（Ｒ５と命名する）、ｇａｇｇａｇｇｇａ（Ｒ６と命名する）、ｇｇｇｇａｇｇｇｇ（Ｒ７と命名する）、ｇａｇｇａｇｇａｇ（Ｒ８と命名する）、ａａｇｇａｇｇａａ（Ｒ９と命名する）、ａｇｇｇａｇｇｇａ（Ｒ１０と命名する）、ａｇｇｇａｇｇａｇ（Ｒ１１と命名する）、ａａｇｇａｇｇｇａ（Ｒ１２と命名する）、ａｇｇｇａｇｇｇｇ（Ｒ１３と命名する）、ａａｇｇａｇｇａｇ（Ｒ１４と命名する）、ａａｇｇａｇｇｇｇ（Ｒ１５と命名する）
組換えプラスミドpP43NMK-hag-R1-dpe、pP43NMK-hag-R2-dpe、pP43NMK-hag-R3-dpe、pP43NMK-hag-R4-dpe、pP43NMK-hag-R5-dpe、pP43NMK-hag-R6-dpe、pP43NMK-hag-R7-dpe、pP43NMK-hag-R8-dpe、pP43NMK-hag-R9-dpe、pP43NMK-hag-R10-dpe、pP43NMK-hag-R11-dpe、pP43NMK-hag-R12-dpe、pP43NMK-hag-R13-dpe、pP43NMK-hag-R14-dpe、pP43NMK-hag-R15-dpeがそれぞれ調製された。
変異前のＲＢＳ配列をＲ０と命名すると、組換えプラスミドはｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ０－ｄｐｅとして表現される。
取得した組換えプラスミドｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒｎ－ｄｐｅ及びｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ０－ｄｐｅをそれぞれＢ． Ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００コンピテント細胞に導入し、形質転換産物を得た。形質転換産物をＬＢ固体培地（１００μｇ・ｍＬ－１カナマイシン含有）に塗布し、３７℃の恒温インキュベータで１２ｈ倒置培養し、形質転換体を得た。形質転換体をシーケンシングして正しい場合、組換え枯草菌を取得した。
即ち、
B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R1-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R2-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R3-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R4-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R5-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R6-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R7-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R8-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R9-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R10-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R11-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R12-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R13-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R14-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R15-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R0-dpeがそれぞれ調製された。
実施例４：各ＲＢＳを含有する組換え枯草菌の発酵
具体的なステップは以下のとおりである。
（１）実施例３で製造された組換え枯草菌の形質転換体をそれぞれ用いてＬＢ固体培地（１００μｇ・ｍＬ－１カナマイシン含有）でストリークし、３７℃の恒温インキュベータで１２ｈ倒置培養し、単一コロニーをそれぞれ得た。
（２）単一コロニーをそれぞれピックアップしてＬＢ液体培地（１００μｇ・ｍＬ－１カナマイシン含有）に播種し、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで１２ｈ培養し、シード液を得た。
（３）製造されたシード液を３％（ｖ／ｖ）の播種量で発酵培地に移し、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで１２ｈ以上培養し、発酵液を得た。
（４）上記発酵液中の各組換え枯草菌で製造されたＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性をそれぞれ検出し、結果を表２及び図２に示す。
その結果、組換え菌Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ４－ｄｐｅは効果が最も高く、Ｄ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性が２５．３９Ｕ／ｍＬと高い。
さらに、組換え菌Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ２－ｄｐｅの発酵により製造されたＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性が、２２．４９Ｕ／ｍＬである。
組換え菌Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ１１－ｄｐｅの発酵により製造されたＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性が、２４．４６Ｕ／ｍＬである。
組換え菌Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ１３－ｄｐｅの発酵により製造されたＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性が、２３．３５Ｕ／ｍＬである。
組換え菌Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ１４－ｄｐｅの発酵により製造されたＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性が、２２．６４Ｕ／ｍＬである。
組換え菌Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ１５－ｄｐｅの発酵により製造されたＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性が２３．３５Ｕ／ｍＬである。
具体的なステップは以下のとおりである。
（１）実施例３で製造された組換え枯草菌の形質転換体をそれぞれ用いてＬＢ固体培地（１００μｇ・ｍＬ－１カナマイシン含有）でストリークし、３７℃の恒温インキュベータで１２ｈ倒置培養し、単一コロニーをそれぞれ得た。
（２）単一コロニーをそれぞれピックアップしてＬＢ液体培地（１００μｇ・ｍＬ－１カナマイシン含有）に播種し、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで１２ｈ培養し、シード液を得た。
（３）製造されたシード液を３％（ｖ／ｖ）の播種量で発酵培地に移し、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで１２ｈ以上培養し、発酵液を得た。
（４）上記発酵液中の各組換え枯草菌で製造されたＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性をそれぞれ検出し、結果を表２及び図２に示す。
さらに、組換え菌Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ２－ｄｐｅの発酵により製造されたＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性が、２２．４９Ｕ／ｍＬである。
組換え菌Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ１１－ｄｐｅの発酵により製造されたＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性が、２４．４６Ｕ／ｍＬである。
組換え菌Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ１３－ｄｐｅの発酵により製造されたＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性が、２３．３５Ｕ／ｍＬである。
組換え菌Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ１４－ｄｐｅの発酵により製造されたＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性が、２２．６４Ｕ／ｍＬである。
組換え菌Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ１５－ｄｐｅの発酵により製造されたＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性が２３．３５Ｕ／ｍＬである。
実施例５：無耐性組換えベクターの調製
具体的な操作ステップは以下のとおりである。
（１）アラニンラセマーゼ遺伝子の取得：人工合成ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９で示される。
（２）ＰＵＢ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌベクターの製造：
ＰＵＢ－Ｐ４３－ｄｐｅ－ｄａｌプラスミド（構築方法は公開番号ＣＮ１０４８９４０４７Ｂの中国発明特許文献に記載されている）をテンプレートとして、ＰＣＲによってＰ４３遺伝子を含まない線状化ベクターを増幅した。実施例３で構築されたｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ４－ｄｐｅプラスミドをテンプレートとして、ＰＣＲによってそのｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ遺伝子を増幅した。以上の線状化ベクターと目的遺伝子を高忠実度ポリメラーゼＰｈａｔａ Ｍａｘ Ｓｕｐｅｒ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで相同アーム組換えの原理により連結した。
（３）ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌベクターの調製：
実施例３で構築したｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ４－ｄｐｅプラスミドをテンプレートとして、ＰＣＲによって耐性遺伝子カナマイシンＫａｎ以外の線状化ベクターを増幅した。以前発明者らで構築したＰＵＢ－Ｐ４３－ｄｐｅ－ｄａｌプラスミドをテンプレートとして、ＰＣＲによってアラニンラセマーゼ遺伝子を増幅した。以上の線状化ベクターと目的遺伝子を高忠実度ポリメラーゼＰｈａｔａ Ｍａｘ Ｓｕｐｅｒ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで相同アーム組換え原理により連結した。
（４）ステップ（２）及びステップ（３）の連結時の反応系及び反応条件：
変性－アニール－最終伸長は合計２５～３５サイクル行った。
（５）ステップ（２）及びステップ（３）で得たＰＣＲ産物（多量体断片）を１Ａ７５１Δｄａｌコンピテント枯草菌に導入し、形質転換産物を得て、形質転換産物を、抗生物質を含まないＬＢ固体培地に塗布し、３７℃の恒温インキュベータで１２ｈ倒置培養し、形質転換体を得て、形質転換体をＰＣＲで検証して正しい場合、無耐性組換え枯草菌：枯草菌１Ａ７５１Δｄａｌ／ＰＵＢ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌ、枯草菌１Ａ７５１Δｄａｌ／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌを得た。
具体的な操作ステップは以下のとおりである。
（１）アラニンラセマーゼ遺伝子の取得：人工合成ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９で示される。
（２）ＰＵＢ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌベクターの製造：
ＰＵＢ－Ｐ４３－ｄｐｅ－ｄａｌプラスミド（構築方法は公開番号ＣＮ１０４８９４０４７Ｂの中国発明特許文献に記載されている）をテンプレートとして、ＰＣＲによってＰ４３遺伝子を含まない線状化ベクターを増幅した。実施例３で構築されたｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ４－ｄｐｅプラスミドをテンプレートとして、ＰＣＲによってそのｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ遺伝子を増幅した。以上の線状化ベクターと目的遺伝子を高忠実度ポリメラーゼＰｈａｔａ Ｍａｘ Ｓｕｐｅｒ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで相同アーム組換えの原理により連結した。
（３）ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌベクターの調製：
実施例３で構築したｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ４－ｄｐｅプラスミドをテンプレートとして、ＰＣＲによって耐性遺伝子カナマイシンＫａｎ以外の線状化ベクターを増幅した。以前発明者らで構築したＰＵＢ－Ｐ４３－ｄｐｅ－ｄａｌプラスミドをテンプレートとして、ＰＣＲによってアラニンラセマーゼ遺伝子を増幅した。以上の線状化ベクターと目的遺伝子を高忠実度ポリメラーゼＰｈａｔａ Ｍａｘ Ｓｕｐｅｒ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで相同アーム組換え原理により連結した。
（４）ステップ（２）及びステップ（３）の連結時の反応系及び反応条件：
（５）ステップ（２）及びステップ（３）で得たＰＣＲ産物（多量体断片）を１Ａ７５１Δｄａｌコンピテント枯草菌に導入し、形質転換産物を得て、形質転換産物を、抗生物質を含まないＬＢ固体培地に塗布し、３７℃の恒温インキュベータで１２ｈ倒置培養し、形質転換体を得て、形質転換体をＰＣＲで検証して正しい場合、無耐性組換え枯草菌：枯草菌１Ａ７５１Δｄａｌ／ＰＵＢ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌ、枯草菌１Ａ７５１Δｄａｌ／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌを得た。
実施例６：無耐性組換え枯草菌の発酵によるＤ－プシコース３－エピメラーゼの製造
具体的なステップは以下のとおりである。
（１）実施例３で取得した組換え枯草菌である枯草菌１Ａ７５１Δｄａｌ／ＰＵＢ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌ、枯草菌１Ａ７５１Δｄａｌ／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌを用いてそれぞれ無耐性ＬＢ固体培地でストリークし、３７℃の恒温インキュベータで１２ｈ倒置培養し、単一コロニーをそれぞれ得た。
（２）単一コロニーをそれぞれピックアップして、無耐性ＬＢ液体培地に播種し、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで１２ｈ培養し、シード液を得た。
（３）製造されたシード液を３％（ｖ／ｖ）の播種量で無耐性発酵培地に移し、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで１２ｈ以上培養し、発酵液を得た。
（４）上記各組換え枯草菌で製造されたＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性をそれぞれ検出し、結果を表３に示す。
その結果、無耐性組換え菌株Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ １Ａ７５１－ｄａｌ－／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌは酵素産生効果が最も高く、最高発酵酵素活性が２４．７２Ｕ／ｍＬである。
よって、本発明は抗生物質を添加していない培地において食品等級の菌株発酵を用いてＤ－プシコース３－エピメラーゼを製造することができる。
具体的なステップは以下のとおりである。
（１）実施例３で取得した組換え枯草菌である枯草菌１Ａ７５１Δｄａｌ／ＰＵＢ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌ、枯草菌１Ａ７５１Δｄａｌ／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌを用いてそれぞれ無耐性ＬＢ固体培地でストリークし、３７℃の恒温インキュベータで１２ｈ倒置培養し、単一コロニーをそれぞれ得た。
（２）単一コロニーをそれぞれピックアップして、無耐性ＬＢ液体培地に播種し、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで１２ｈ培養し、シード液を得た。
（３）製造されたシード液を３％（ｖ／ｖ）の播種量で無耐性発酵培地に移し、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで１２ｈ以上培養し、発酵液を得た。
（４）上記各組換え枯草菌で製造されたＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性をそれぞれ検出し、結果を表３に示す。
よって、本発明は抗生物質を添加していない培地において食品等級の菌株発酵を用いてＤ－プシコース３－エピメラーゼを製造することができる。
実施例７：Ｄ－プシコース３－エピメラーゼの発酵による製造
（１）プレートにおける無耐性組換え菌株Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ １Ａ７５１－ｄａｌ－／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌ単一コロニーをピックアップして、５０ｍＬ（液体仕込み量１０％）のＬＢ液体培地に播種し、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで１２ｈ振とう培養し、シード液を得た。
（２）発酵培地を３Ｌ発酵タンク（ファーメンター）に入れて、ステップ（１）で得たシード液を３％（ｖ／ｖ）の播種量で発酵培地に播種し、発酵培養し、発酵において通気量と撹拌速度を絶えず調整し、ＤＯ値を３０％、発酵温度を３７℃に制御した。
（３）溶存酸素が回復し始めたら、補充し、補充培地にはブドウ糖２００ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム7水和物５ｇ／Ｌが含まれており、補充速度を４０ｍＬ／ｈに設定した。
（４）補充過程では、酵素活性を常に検出し、酵素活性が低下し始めるまで補充した。この時に、発酵を停止し、検出したところ、得られたＤ－プシコース３－エピメラーゼの発酵酵素活性は、７１４．８Ｕ／ｍＬである。
（５）発酵菌体を遠心分離し、検出したところ、得られたＤ－プシコース３－エピメラーゼを含む湿菌体の酵素活性は、１３６１２．５Ｕ／ｇである。
（１）プレートにおける無耐性組換え菌株Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ １Ａ７５１－ｄａｌ－／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌ単一コロニーをピックアップして、５０ｍＬ（液体仕込み量１０％）のＬＢ液体培地に播種し、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで１２ｈ振とう培養し、シード液を得た。
（２）発酵培地を３Ｌ発酵タンク（ファーメンター）に入れて、ステップ（１）で得たシード液を３％（ｖ／ｖ）の播種量で発酵培地に播種し、発酵培養し、発酵において通気量と撹拌速度を絶えず調整し、ＤＯ値を３０％、発酵温度を３７℃に制御した。
（３）溶存酸素が回復し始めたら、補充し、補充培地にはブドウ糖２００ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム7水和物５ｇ／Ｌが含まれており、補充速度を４０ｍＬ／ｈに設定した。
（４）補充過程では、酵素活性を常に検出し、酵素活性が低下し始めるまで補充した。この時に、発酵を停止し、検出したところ、得られたＤ－プシコース３－エピメラーゼの発酵酵素活性は、７１４．８Ｕ／ｍＬである。
（５）発酵菌体を遠心分離し、検出したところ、得られたＤ－プシコース３－エピメラーゼを含む湿菌体の酵素活性は、１３６１２．５Ｕ／ｇである。
実施例８：Ｄ－プシコースの製造
１０００ｍＬジャケット酵素反応器に濃度４５％の基質であるＤ－フルクトース溶液を加え、反応温度を５５℃に保持し、ｐＨを７．０に調整し、３０Ｕ／ｇフルクトースで実施例７で製造されたＤ－プシコース３－エピメラーゼを含む菌体を加え、回転数１００ｒ／ｍｉｎで撹拌して反応させた。
反応中にサンプリングして、沸騰させて酵素を不活性化し、遠心分離して上澄み液を得て、ＨＰＬＣ分析によってＤ－プシコースの含有量を検出した。
８ｈ反応後、反応全体が平衡の状態になり、Ｄ－プシコースの転化率は２８．５％である。
１０００ｍＬジャケット酵素反応器に濃度４５％の基質であるＤ－フルクトース溶液を加え、反応温度を５５℃に保持し、ｐＨを７．０に調整し、３０Ｕ／ｇフルクトースで実施例７で製造されたＤ－プシコース３－エピメラーゼを含む菌体を加え、回転数１００ｒ／ｍｉｎで撹拌して反応させた。
反応中にサンプリングして、沸騰させて酵素を不活性化し、遠心分離して上澄み液を得て、ＨＰＬＣ分析によってＤ－プシコースの含有量を検出した。
８ｈ反応後、反応全体が平衡の状態になり、Ｄ－プシコースの転化率は２８．５％である。
本発明は好適な実施例を以上で開示しているが、これらは本発明を限定するものではなく、当業者であれば、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく様々な修正や変更が可能であり、このため、本発明の特許範囲は特許請求の範囲により定められるものに準じる。
Claims (12)
- 組換え枯草菌であって、目的遺伝子Ｄ－プシコース３－エピメラーゼを担持した発現ベクターをアラニンラセマーゼ遺伝子ノックアウト枯草菌に導入して得られるものであり、前記発現ベクターは、
Ｄ－プシコース３－エピメラーゼ遺伝子を担持したｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位がｇｇｇｇａｇｇａｇに同時に変異しており、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９のアラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌにより、ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上の耐性遺伝子カナマイシンＫａｎが代替されたもの、又は、
Ｄ－プシコース３－エピメラーゼ遺伝子を担持したｐＵＢ１１０プラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位がｇｇｇｇａｇｇａｇに同時に変異しており、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９のアラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌにより、ｐＵＢ１１０プラスミド上の耐性遺伝子カナマイシンＫａｎ及びブレオマイシンＢｌｍが代替されたものであることを特徴とする、組換え枯草菌。 - アラニンラセマーゼ遺伝子ノックアウト枯草菌１Ａ７５１を発現宿主とすることを特徴とする、請求項１に記載の組換え枯草菌。
- アラニンラセマーゼ遺伝子ノックアウト枯草菌ＷＢ６００を発現宿主とすることを特徴とする、請求項１に記載の組換え枯草菌。
- アラニンラセマーゼ遺伝子ノックアウト枯草菌ＷＢ８００を発現宿主とすることを特徴とする、請求項１に記載の組換え枯草菌。
- 枯草菌ＷＢ８００又は枯草菌１Ａ７５１を発現宿主として、Ｄ－プシコース３－エピメラーゼを発現させており、Ｄ－プシコース３－エピメラーゼの発現ベクターは、
ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位がｇｇｇｇａｇｇａｇに同時に変異したものであることを特徴とする、組換え枯草菌。 - ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位が同時に変異したものであり、
ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位が、ｇａｇｇａｇｇａａ、ｇｇｇｇａｇｇａｇ、ａｇｇｇａｇｇａｇ、ａｇｇｇａｇｇｇｇ、ａａｇｇａｇｇａｇ、又はａａｇｇａｇｇｇｇに同時に変異していることを特徴とする、発現ベクター。 - ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位が、ｇｇｇｇａｇｇａｇに同時に突然変異しており、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９のアラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌにより、ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上の耐性遺伝子カナマイシンＫａｎが代替されたものであり、又は、
ｐＵＢ１１０プラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位が、ｇｇｇｇａｇｇａｇに同時に突然変異しており、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９のアラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌにより、ｐＵＢ１１０プラスミド上の耐性遺伝子カナマイシンＫａｎ及びブレオマイシンＢｌｍが代替されたものであることを特徴とする無耐性発現ベクター。 - 請求項６又は７に記載の発現ベクターを含有する、組換え細胞。
- 枯草菌ＷＢ８００又は枯草菌１Ａ７５１を発現宿主とすることを特徴とする、請求項８に記載の組換え細胞。
- Ｄ－プシコース３－エピメラーゼを担持した請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え枯草菌から菌体を得て、菌体からＤ－プシコース３－エピメラーゼを単離することを特徴とする、Ｄ－プシコース３－エピメラーゼ産生方法。
- Ｄ－プシコース３－エピメラーゼを担持した請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え枯草菌をフルクトース含有反応系に添加して反応させ、反応液を得て、反応液からＤ－プシコースを単離することを特徴とする、Ｄ－プシコースの生産方法。
- 請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え枯草菌の、Ｄ－プシコース又はＤ－プシコースを含有する製品の製造における、使用。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111457416.2 | 2021-12-02 | ||
| CN202111457416.2A CN114350699B (zh) | 2021-12-02 | 2021-12-02 | 一株产d-阿洛酮糖3-差向异构酶的菌株及其应用 |
| PCT/CN2022/092360 WO2023097975A1 (zh) | 2021-12-02 | 2022-05-12 | 一株产d-阿洛酮糖3-差向异构酶的菌株及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2023551624A JP2023551624A (ja) | 2023-12-12 |
| JP7489134B2 true JP7489134B2 (ja) | 2024-05-23 |
Family
ID=81096542
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022569120A Active JP7489134B2 (ja) | 2021-12-02 | 2022-05-12 | Ｄ－プシコース３－エピメラーゼ産生菌株及びその使用 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11970723B2 (ja) |
| JP (1) | JP7489134B2 (ja) |
| CN (1) | CN114350699B (ja) |
| WO (1) | WO2023097975A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114350699B (zh) * | 2021-12-02 | 2024-03-26 | 江南大学 | 一株产d-阿洛酮糖3-差向异构酶的菌株及其应用 |
| CN115074350B (zh) * | 2022-08-12 | 2022-12-13 | 保龄宝生物股份有限公司 | 一种降低d-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液酶活力损失的方法 |
Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013066446A (ja) | 2011-09-26 | 2013-04-18 | Kao Corp | σＤ因子抑制解除株及びそれを用いたタンパク質の製造方法 |
| CN104894047A (zh) | 2015-06-02 | 2015-09-09 | 江南大学 | 基于d-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法 |
| JP2016528925A (ja) | 2013-09-03 | 2016-09-23 | ロケット フレールＲｏｑｕｅｔｔｅ Ｆｒｅｒｅｓ | Ｄ−プシコース ３−エピメラーゼの改良された変異体およびその使用 |
| CN106222190A (zh) | 2016-08-25 | 2016-12-14 | 江南大学 | 一种枯草芽孢杆菌对数期表达系统 |
| WO2019144944A1 (zh) | 2018-01-25 | 2019-08-01 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种生产阿洛酮糖及其衍生物的工程菌株及其构建方法和应用 |
| US20200032237A1 (en) | 2018-07-24 | 2020-01-30 | Jiangnan University | Recombinant strain of bacillus subtilis |
| CN110904088A (zh) | 2019-12-28 | 2020-03-24 | 浙江工业大学 | 耐高温d-阿洛酮糖3-差向异构酶、突变体及其应用 |
| CN110862979B (zh) | 2020-01-20 | 2020-04-24 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 碱性蛋白酶的突变体及其应用 |
| JP2020535801A (ja) | 2017-09-13 | 2020-12-10 | ジーバイオティクス カンパニー | プロバイオティック微生物の遺伝子発現系 |
| CN112695006A (zh) | 2021-02-05 | 2021-04-23 | 江南大学 | 一种表达d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌 |
| CN113025605A (zh) | 2021-03-11 | 2021-06-25 | 江南大学 | 一种固定d-葡萄糖异构酶与d-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法 |
| CN113249287A (zh) | 2021-07-07 | 2021-08-13 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一株表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的枯草芽孢杆菌工程菌株及其应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6563013B2 (ja) * | 2014-10-30 | 2019-08-21 | サムヤン コーポレイション | プシコースエピメラーゼの発現システムおよびこれを用いたプシコースの生産 |
| CN104946577A (zh) * | 2015-06-02 | 2015-09-30 | 江南大学 | 基于Cre/lox系统的无抗性基因染色体整合的表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法 |
| CN106967659A (zh) * | 2017-03-28 | 2017-07-21 | 江南大学 | 一种表达谷氨酸脱羧酶的无抗生素抗性重组枯草芽孢杆菌的构建及发酵方法 |
| CN110157749B (zh) * | 2019-06-06 | 2020-10-09 | 江南大学 | 应用枯草芽孢杆菌群体响应调控系统合成mk-7的方法 |
| CN114350699B (zh) * | 2021-12-02 | 2024-03-26 | 江南大学 | 一株产d-阿洛酮糖3-差向异构酶的菌株及其应用 |
-
2021
- 2021-12-02 CN CN202111457416.2A patent/CN114350699B/zh active Active
-
2022
- 2022-05-12 WO PCT/CN2022/092360 patent/WO2023097975A1/zh active Application Filing
- 2022-05-12 JP JP2022569120A patent/JP7489134B2/ja active Active
-
2023
- 2023-03-22 US US18/187,984 patent/US11970723B2/en active Active
Patent Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013066446A (ja) | 2011-09-26 | 2013-04-18 | Kao Corp | σＤ因子抑制解除株及びそれを用いたタンパク質の製造方法 |
| JP2016528925A (ja) | 2013-09-03 | 2016-09-23 | ロケット フレールＲｏｑｕｅｔｔｅ Ｆｒｅｒｅｓ | Ｄ−プシコース ３−エピメラーゼの改良された変異体およびその使用 |
| CN104894047A (zh) | 2015-06-02 | 2015-09-09 | 江南大学 | 基于d-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法 |
| CN106222190A (zh) | 2016-08-25 | 2016-12-14 | 江南大学 | 一种枯草芽孢杆菌对数期表达系统 |
| JP2020535801A (ja) | 2017-09-13 | 2020-12-10 | ジーバイオティクス カンパニー | プロバイオティック微生物の遺伝子発現系 |
| WO2019144944A1 (zh) | 2018-01-25 | 2019-08-01 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种生产阿洛酮糖及其衍生物的工程菌株及其构建方法和应用 |
| US20200032237A1 (en) | 2018-07-24 | 2020-01-30 | Jiangnan University | Recombinant strain of bacillus subtilis |
| CN110904088A (zh) | 2019-12-28 | 2020-03-24 | 浙江工业大学 | 耐高温d-阿洛酮糖3-差向异构酶、突变体及其应用 |
| CN110862979B (zh) | 2020-01-20 | 2020-04-24 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 碱性蛋白酶的突变体及其应用 |
| CN112695006A (zh) | 2021-02-05 | 2021-04-23 | 江南大学 | 一种表达d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌 |
| CN113025605A (zh) | 2021-03-11 | 2021-06-25 | 江南大学 | 一种固定d-葡萄糖异构酶与d-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法 |
| CN113249287A (zh) | 2021-07-07 | 2021-08-13 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一株表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的枯草芽孢杆菌工程菌株及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Appl. Environ. Microbiol.，2005年，Vol.71, No.7，pp.4101-4103 |
| Biosci. Biotechnol. Biochem.，2018年，Vol.82, No.11，pp.1942-1954 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2023097975A1 (zh) | 2023-06-08 |
| US11970723B2 (en) | 2024-04-30 |
| CN114350699B (zh) | 2024-03-26 |
| US20230265411A1 (en) | 2023-08-24 |
| JP2023551624A (ja) | 2023-12-12 |
| CN114350699A (zh) | 2022-04-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7489134B2 (ja) | Ｄ－プシコース３－エピメラーゼ産生菌株及びその使用 | |
| CN110157654B (zh) | 一种纳豆芽孢杆菌重组菌及其构建方法与应用 | |
| CN111393515B (zh) | 核糖核苷酸还原酶转录抑制因子突变体、突变基因及其在制备维生素b2中的应用 | |
| US20050181490A1 (en) | Fermentation process for preparing coenzyme Q10 by the recombinant Agrobacterium tumefaciens | |
| US11773383B2 (en) | Methods for promoting extracellular expression of proteins in Bacillus subtilis using a cutinase | |
| CN113073074B (zh) | 一种高效合成核黄素的基因工程菌及其应用 | |
| CN112210519A (zh) | 一种以食用菌分泌乙醛脱氢酶的基因工程菌 | |
| CN112795582A (zh) | 一种适合在微生物中高效合成nad衍生物的酶基因 | |
| CN114317384A (zh) | 生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用 | |
| KR102473375B1 (ko) | 재조합 미생물, 그 제조방법 및 보효소 q10의 생산에 있어서 그의 사용 | |
| CN114181288B (zh) | 制备l-缬氨酸的方法及其所用的基因与该基因编码的蛋白质 | |
| CN110591996A (zh) | 一种高产l-赖氨酸枯草芽孢杆工程菌的构建方法及应用 | |
| CN114410561B (zh) | 一种生产胸苷的基因工程菌株及其构建方法与应用 | |
| CN113462628B (zh) | 一株产血红素的基因工程菌及其构建方法和应用 | |
| TWI789734B (zh) | 新穎啟動子及使用其生產麩胱甘肽的方法 | |
| CN111393514B (zh) | 过氧化物转录抑制因子突变体、突变基因及其在制备维生素b2中的应用 | |
| CN108795832B (zh) | 一种内源l-门冬酰胺酶ii基因敲除的宿主菌、其制备方法及其应用 | |
| CN114990088B (zh) | 烟酰胺核糖激酶突变体及其重组菌与nmn的制备方法 | |
| CN110331121B (zh) | 一种高产脂肽的重组菌及其应用 | |
| TWI786573B (zh) | 麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體及使用其生產麩胱甘肽的方法 | |
| CN113736761B (zh) | Rna解旋酶突变体、突变基因及其在制备维生素b2中的应用 | |
| CN117946984B (zh) | 泛酸合成酶突变体及其制备方法、构建体及其构建方法、泛酸生产菌株和应用及泛酸的制备方法 | |
| CN115125179B (zh) | 产雷帕霉素的基因工程菌及其应用 | |
| US20240060056A1 (en) | Modified beta-1,3-n-acetylglucosaminyltransferase polypeptides | |
| CN118755686A (zh) | β-1,3-N-乙酰葡萄糖胺转移酶突变体及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230323 |
|
| A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20230323 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20231219 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20240319 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20240409 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20240502 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7489134 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |