CN114350699A - 一株产d-阿洛酮糖3-差向异构酶的菌株及其应用 - Google Patents

一株产d-阿洛酮糖3-差向异构酶的菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株产D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的菌株及其应用，属于生物工程技术领域。本发明提供了一种启动子筛选及其RBS优化提高D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶表达量的方法。使用本发明提供的载体pP43NMK‑hag和pP43NMK‑hag‑RBS4构建的重组枯草芽孢杆菌，使目的基因D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的酶活得到了提高，改造后的酶活分别是原始载体的1.30倍和1.69倍。本发明还提供了一种无抗载体及一株无抗重组枯草芽孢杆菌菌株，采用本发明提供的无抗菌株B.subtilis 1A751‑dal‑/pP43NMK‑hag‑RBS4‑dpe‑dal，其摇瓶最高发酵酶活为24.72U/mL。

Description

一株产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一株产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的菌株及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
D-阿洛酮糖(D-allulose)是D-果糖在C-3位上的差向异构体，可以作为低热量甜味剂，并能通过美拉德反应生成令人愉悦的味道，可改善食物的凝胶性；具有降低血糖与血脂水平、减少脂肪堆积、清除活性氧(ROS)等调节生物功能。
早在2014年，美国食品药品监督管理局的法律法规将D-阿洛酮糖列为一般安全，允许将其添加在食品、膳食补充剂以及医药制剂中。因此D-阿洛酮糖在医药、食品等领域均有广泛的应用前景。
D-阿洛酮糖作为一种稀有糖，在自然界中存在量极少，直接提取并不现实。同时化学合成会生成副产物，造成分离困难，大大提高生产成本，并且复杂的反应过程会产生过度的污染。因此，目前对于D-阿洛酮糖的生产，主要采用的是生物转化法。与自然提取法和化学合成法相比，生物转化法具有反应条件温和、专一性高、对环境友好等优点。在生物转化法中，D-阿洛酮糖3-差向异构酶起着关键性的作用，它可以将D-果糖转化为D-阿洛酮糖。
枯草芽孢杆菌是食品级微生物(GRAS)，适合应用于工业生产。同时，它具有遗传背景清晰、遗传操作简单成熟和易于规模扩大化培养等优点，是发酵合成D-阿洛酮糖3-差向异构酶的优势平台。
发明内容
为了解决现有技术中D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶活低，在重组菌中表达量不高等的技术问题，同时为了得到一种能够在无抗体系中高效表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶的表达体系。本发明第一个目的是提供了一种增强目的蛋白表达量的表达载体，所述表达载体为，将pP43NMK质粒上的P43启动子替换为hag、ylbP、hagP43、ylbPylbP、haghag中的任一个启动子得到的；
所述启动子hag、ylbP、hagP43、ylbPylbP、haghag的核苷酸序列分别为SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。
在本发明的一种实施方式中，所述目的蛋白为D-阿洛酮糖3-差向异构酶或磷酸化糖基差向异构酶；所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示或如SEQ ID NO.21所示，所述磷酸化糖基差向异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示或如SEQ ID NO.23所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供了一种表达载体，所述表达载体为：将pP43NMK质粒上的P43启动子替换为核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的hag启动子，并且，将hag启动子序列上的碱基第129位～137位同时进行突变。
在本发明的一种实施方式中，将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的hag序列上的碱基第129位～137位的agggaggaa序列突变为：gaggaggaa(命名为R2)，或ggggaggag(命名为R4)，或agggaggag(命名为R11)，或agggagggg(命名为R13)，或aaggaggag(命名为R14)，或aaggagggg(命名为R15)。
本发明的第三个目的是提供了一种无抗表达载体，所述表达载体为：
将pP43NMK质粒上的P43启动子替换为核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的hag启动子，并且，将hag启动子序列上的碱基第129位～137位同时突变为：ggggaggag；并用核苷酸序列如SEQ ID NO.19的丙氨酸消旋酶基因dal代替pP43NMK质粒上的抗性基因卡那霉素Kan；
或，将pUB110质粒上的P43启动子替换为核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的hag启动子，并且，将hag启动子序列上的碱基第129位～137位同时突变为：ggggaggag；并用核苷酸序列如SEQ ID NO.19的丙氨酸消旋酶基因dal代替pUB110质粒上的抗性基因卡那霉素Kan和博来霉素Blm。
在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为用丙氨酸消旋酶基因dal代替抗性基因卡那霉素Kan和博来霉素Blm作为筛选标记的可复制质粒pUB-hag-RBS4-dpe-dal和用丙氨酸消旋酶基因dal代替抗性基因卡那霉素Kan作为筛选标记的可复制质粒
pP43NMK-hag-RBS4-dpe-dal。
在本发明的一种实施方式中，丙氨酸消旋酶基因dal的核苷酸序列如SEQ IDNO.19。
本发明的第三个目的是提供了含有上述表达载体的重组细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以细菌或真菌为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以枯草芽孢杆菌WB800或枯草芽孢杆菌1A751为表达宿主。
本发明的第四个目的是提供了一种重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌以上述载体为表达载体，以枯草芽孢杆菌WB800或枯草芽孢杆菌1A751为表达宿主，表达了D-阿洛酮糖3-差向异构酶；
在本发明的一种实施方式中，编码所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第五个目的是提供了一种无抗食品级重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌是按照下述方法制备的：
将上述无抗表达载体转入到敲除了丙氨酸消旋酶基因的枯草芽孢杆菌中。
在本发明的一种实施方式中，以枯草芽孢杆菌1A751、WB600、WB800等为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述表达宿主为：枯草芽孢杆菌1A751，所述敲除了丙氨酸消旋酶基因的枯草芽孢杆菌为：枯草芽孢杆菌1A751Δdal。
在本发明的一种实施方式中，本发明中使用的枯草芽孢杆菌1A751Δdal，即敲除枯草芽孢杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因dal，为实验室前期所构建。(构建方法参考专利：江波，沐万孟，何伟伟，张涛.基于Cre/lox系统的无抗性基因染色体整合的表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法[P]，及公开号为CN104946577A的中国发明专利申请文本中)。
本发明的第六个目的是提供了一种提高D-阿洛酮糖3-差向异构酶表达量的方法，所述方法为采用上述表达载体进行表达。
本发明的第七个目的是提供了一种生产D-阿洛酮糖的方法，所述方法为，将上述重组细胞，或上述重组细胞的发酵液，或上述重组枯草芽孢杆菌，或上述重组枯草芽孢杆菌的发酵液，添加至含有果糖的反应体系中进行反应，得到反应液，从反应液中分离得到D-阿洛酮糖。
在本发明的一种实施方式中，反应体系中，反应条件为：反应的温度为55℃，时间为10min。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，底物的添加量为：800μL。
在本发明的一种实施方式中，所述底物浓度为100g/L，用50mmol/L，pH7.5的Tris/HCl缓冲液配制。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞或重组枯草芽孢杆菌的添加量至少为：200μL。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞或重组枯草芽孢杆菌的发酵液中，D-阿洛酮糖3-差向异构酶的酶活至少为：15.67U/mL。
本发明的第六个目的是提供了上述表达载体，或上述重组细胞，或上述重组枯草芽孢杆菌在制备D-阿洛酮糖或含有D-阿洛酮糖的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品、药品或化妆品。
有益效果
(1)本发明提供了一种启动子筛选及其RBS优化提高D-阿洛酮糖3-差向异构酶表达量的方法。使用本发明提供的载体pP43NMK-hag和pP43NMK-hag-RBS4构建的重组枯草芽孢杆菌，使目的基因D-阿洛酮糖3-差向异构酶的酶活得到了提高，改造后的酶活分别是原始pP43NMK-P43/B.Subtilis WB800的1.30倍和1.69倍，是pP43NMK-HpaII/B.SubtilisWB800的1.77倍和2.29倍。
(2)本发明提供了一株食品级表达D阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌，相较于一般的宿主菌，更安全，更适用于工业生产D-阿洛酮糖。
附图说明
图1：不同启动子重组菌摇瓶的酶活及OD600值。
图2：RBS突变菌株摇瓶的酶活及OD600值。
具体实施方式
下述实施例中涉及的pP43NMK质粒购自淼灵生物；下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α购自通用生物技术有限公司；下述实施例中涉及的枯草芽孢杆菌WB800购自NTCC典型培养物保藏中心。
下述实施例中所涉及的枯草芽孢杆菌1A751Δdal，即敲除枯草芽孢杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因dal，构建方法参考专利：江波，沐万孟，何伟伟，张涛.基于Cre/lox系统的无抗性基因染色体整合的表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法[P]，及公开号为CN104946577A的中国发明专利申请文本中。
下述实施例中所涉及的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，本发明仅仅以核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的D-阿洛酮糖3-差向异构酶做为举例说明本发明的技术效果，其并不能对本发明的实施例进行限定，须知，本发明的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示或如SEQ IDNO.21所示的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，或经过密码子优化，或突变改造之后的序列仍旧可以实现本发明的技术效果。
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，pH自然。
LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉15g/L。
发酵培养基：葡萄糖15g/L、酵母提取物20g/L、氯化钠8g/L、十二水磷酸氢二钠1g/L、七水硫酸镁1g/L，pH7.0。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶活测定方法：1mL的反应体系中，加入800μL的用磷酸盐缓冲液(50mM，pH7.0)溶解的100g/L的D-果糖，200uL的发酵液，55℃保温10min，然后煮沸10min以终止酶反应。
用HPLC检测D-阿洛酮糖的生成量，计算酶活。酶活单位的定义(U)：每分钟催化产生1μmol D-阿洛酮糖所需要的酶量为一个酶活单位。
酶活力(U/mL)＝反应体系中产生的阿洛酮糖的量(mg/mL)×1mL×1000/180/10/0.2。
实施例1：含有不同启动子的重组枯草芽孢杆菌的构建
具体操作步骤如下：
(1)D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因的获得：人工合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
(2)不同启动子基因的获得：所用启动子为hag、ylbP、hagP43、ylbPylbP、haghag、amyE、aprE、gsiB、HpaII、nprE、sigX、P43hag、ylbPhag、hagylbP、ylbPP43、P43ylbP、P43P43；其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.18所示。
在单启动子中，除HpaII以PMA5质粒为模板，进行克隆，其余单启动子均可以B.Subtilis168为模板进行PCR扩增，双启动子可以含有单启动子的载体为模板，进行融合PCR扩增得到。
(3)将D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因与启动子的基因通过融合PCR进行融合，再将融合后的片段与去掉P43启动子基因的线性化pP43NMK质粒用同源重组酶ExnaseⅡ连接，得到连接产物；将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中；将转化后的大肠杆菌DH5α感受态细胞涂布LB固体培养基(含有100μg·mL-1氨苄霉素)，37℃倒置培养12h；挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证，验证正确即获得重组质粒pP43NMK-Promoter-dpe；将获得的重组质粒pP43NMK-Promoter-dpe转入B.Subtilis WB800感受态细胞，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有100μg·mL-1卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12h，得到转化子；将转化子进行PCR验证，验证正确即获得重组枯草芽孢杆菌。
分别制备得到：B.subtilis WB800/pP43NMK-hag-dpe，B.subtilis WB800/pP43NMK-ylbP-dpe，B.subtilis WB800/pP43NMK-hagP43-dpe，B.subtilis WB800/pP43NMK-ylbPylbP-dpe，B.subtilis WB800/pP43NMK-haghag-dpe，B.subtilis WB800/pP43NMK-amyE-dpe，B.subtilis WB800/pP43NMK-aprE-dpe，B.subtilis WB800/pP43NMK-gsiB-dpe，B.subtilis WB800/pP43NMK-HpaII-dpe，B.subtilis WB800/pP43NMK-nprE-dpe，B.subtilis WB800/pP43NMK-sigX-dpe，B.subtilis WB800/pP43NMK-P43hag-dpe，B.subtilis WB800/pP43NMK-ylbPhag-dpe，B.subtilis WB800/pP43NMK-hagylbP-dpe，B.subtilis WB800/pP43NMK-ylbPP43-dpe，B.subtilis WB800/pP43NMK-P43ylbP-dpe，B.subtilis WB800/pP43NMK-P43P43-dpe。
实施例2：含有启动子的重组枯草芽孢杆菌的发酵生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶
具体步骤如下：
(1)分别将实施例1制备得到的重组枯草芽孢杆菌添加至LB液体培养基中，在37℃，200rpm条件下，进行摇床培养12h，制备得到种子液；
(2)将制备得到的种子液按照3％(v/v)的接种量接种至发酵培养基中，在37℃，200rpm条件下，进行摇床培养，制备得到发酵液；
分别检测发酵液中的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的酶活，结果如表1及图1所示。
表1：不同重组枯草芽孢杆菌制备得到D-阿洛酮糖3-差向异构酶的酶活
重组菌 发酵酶活(U/mL)
B.subtilis WB800/pP43NMK-P43-dpe 15.05
B.subtilis WB800/pP43NMK-hag-dpe 19.62
B.subtilis WB800/pP43NMK-ylbP-dpe 16.62
B.subtilis WB800/pP43NMK-hagP43-dpe 15.84
B.subtilis WB800/pP43NMK-ylbPylbP-dpe 17.95
B.subtilis WB800/pP43NMK-haghag-dpe 15.67
B.subtilis WB800/pP43NMK-amyE-dpe 12.71
B.subtilis WB800/pP43NMK-aprE-dpe 7.18
B.subtilis WB800/pP43NMK-gsiB-dpe 7.76
B.subtilis WB800/pP43NMK-HpaII-dpe 11.06
B.subtilis WB800/pP43NMK-nprE-dpe 12.93
B.subtilis WB800/pP43NMK-sigX-dpe 9.16
B.subtilis WB800/pP43NMK-P43hag-dpe 6.78
B.subtilis WB800/pP43NMK-ylbPhag-dpe 11.66
B.subtilis WB800/pP43NMK-hagylbP-dpe 14.79
B.subtilis WB800/pP43NMK-ylbPP43-dpe 11.66
B.subtilis WB800/pP43NMK-P43ylbP-dpe 8.24
B.subtilis WB800/pP43NMK-P43P43-dpe 13.77
结果显示：重组菌B.subtilis WB800/pP43NMK-hag-dpe的效果最好，酶活高达19.62U/mL。
因此，后续实施例选择质粒pP43NMK-hag-dpe为模板，对hag启动子上的RBS序列进行突变，进一步提高D-阿洛酮糖3-差向异构酶的酶活。
实施例3：含有不同RBS的重组枯草芽孢杆菌的构建
具体步骤如下：
以质粒pP43NMK-hag-dpe为模板，以RBS-F/RBS-R为引物，进行one-step PCR，对hag启动子上的RBS序列进行突变，构建含有不同RBS序列的线性化质粒；
其中，引物如下：
RBS-F:tgccttaacaacatattcrrggaggrrcaaaacaatgaagcatggta
RBS-R:taccatgcttcattgttttgyycctccyygaatatgttgttaaggca
将构建得到的线性化质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中；将转化后的大肠杆菌DH5α感受态细胞涂布LB固体培养基(含有100μg·mL-1氨苄霉素)，37℃倒置培养12h；挑取一定数量阳性转化子，提取质粒，测序验证，验证正确即获得重组质粒pP43NMK-hag-RBSn-dpe，分别获得15个不同的RBS突变体，突变序列如下：
ggggaggaa(命名为R1)，gaggaggaa(命名为R2)、ggggaggga(命名为R3)、ggggaggag
(命名为R4)、gaggagggg(命名为R5)、gaggaggga(命名为R6)、ggggagggg(命名为R7)、gaggaggag(命名为R8)、aaggaggaa(命名为R9)、agggaggga(命名为R10)、agggaggag(命名为R11)、aaggaggga(命名为R12)、agggagggg(命名为R13)、aaggaggag(命名为R14)、aaggagggg(命名为R15)；
分别制备得到重组质粒pP43NMK-hag-R1-dpe，pP43NMK-hag-R2-dpe，pP43NMK-hag-R3-dpe，pP43NMK-hag-R4-dpe，pP43NMK-hag-R5-dpe，pP43NMK-hag-R6-dpe，pP43NMK-hag-R7-dpe，pP43NMK-hag-R8-dpe，pP43NMK-hag-R9-dpe，pP43NMK-hag-R10-dpe，pP43NMK-hag-R11-dpe，pP43NMK-hag-R12-dpe，pP43NMK-hag-R13-dpe，pP43NMK-hag-R14-dpe，pP43NMK-hag-R15-dpe；
将未突变前的RBS序列命名为R0，则重组质粒可以表述为：pP43NMK-hag-R0-dpe。
分别将获得的重组质粒pP43NMK-hag-Rn-dpe和pP43NMK-hag-R0-dpe转入B.SubtilisWB800感受态细胞，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有100μg·mL-1卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12h，得到转化子；将转化子进行测序，验证正确即获得重组枯草芽孢杆菌。
即，分别制备得到：
B.subtilis WB800/pP43NMK-hag-R1-dpe，B.subtilis WB800/pP43NMK-hag-R2-dpe，B.subtilis WB800/pP43NMK-hag-R3-dpe，B.subtilis WB800/pP43NMK-hag-R4-dpe，B.subtilis WB800/pP43NMK-hag-R5-dpe，B.subtilis WB800/pP43NMK-hag-R6-dpe，B.subtilis WB800/pP43NMK-hag-R7-dpe，B.subtilis WB800/pP43NMK-hag-R8-dpe，B.subtilis WB800/pP43NMK-hag-R9-dpe，B.subtilis WB800/pP43NMK-hag-R10-dpe，B.subtilis WB800/pP43NMK-hag-R11-dpe，B.subtilis WB800/pP43NMK-hag-R12-dpe，B.subtilis WB800/pP43NMK-hag-R13-dpe，B.subtilis WB800/pP43NMK-hag-R14-dpe，B.subtilis WB800/pP43NMK-hag-R15-dpe，B.subtilis WB800/pP43NMK-hag-R0-dpe。
实施例4：含有不同RBS的重组枯草芽孢杆菌的发酵
具体步骤如下：
(1)分别将实施例3中制备得到的重组枯草芽孢杆菌的转化子在LB固体培养基(含有100μg·mL-1卡那霉素)上划线，于37℃恒温培养箱中倒置培养12h，分别得到单菌落；
()分别挑取单菌落接种至LB液体培养基(含有100μg·mL-1卡那霉素)，于37℃、200r/min培养12h，得到种子液；
(3)将制备得到的种子液以3％(v/v)的接种量转接至发酵培养基中，于37℃、200r/min培养12h以上，得到发酵液。
(4)分别检测上述各个重组枯草芽孢杆菌制备得到的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的酶活，结果如表2及图2所示。
表2：含不同RBS的重组枯草芽孢杆菌制备得到D-阿洛酮糖3-差向异构酶的酶活
Figure BDA0003388228870000081
Figure BDA0003388228870000091
结果显示：重组菌B.subtilis WB800/pP43NMK-hag-R4-dpe的效果最好，D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶活高达25.39U/mL。
并且，重组菌B.subtilis WB800/pP43NMK-hag-R2-dpe发酵制备得到的D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶活为：22.49U/mL；
重组菌B.subtilis WB800/pP43NMK-hag-R11-dpe发酵制备得到的D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶活为：24.46U/mL；
重组菌B.subtilis WB800/pP43NMK-hag-R13-dpe发酵制备得到的D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶活为：23.35U/mL；
重组菌B.subtilis WB800/pP43NMK-hag-R14-dpe发酵制备得到的D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶活为：22.64U/mL；
重组菌B.subtilis WB800/pP43NMK-hag-R15-dpe发酵制备得到的D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶活为：23.35U/mL。
实施例5：制备无抗的重组载体
具体操作步骤如下：
(1)丙氨酸消旋酶基因的获得：人工合成核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示
(2)PUB-hag-RBS4-dpe-dal载体的制备：
以PUB-P43-dpe-dal质粒(构建方法记载于公开号为CN104894047B的中国发明专利文本中)为模板，通过PCR扩增不含P43基因的线性化载体；以实施例3中构建的pP43NMK-hag-R4-dpe质粒为模板，通过PCR扩增其中的hag-RBS4-dpe基因；将以上的线性化载体和目的基因用高保真聚合酶Phata Max Super-Fidelity DNA Polymerase利用同源臂重组的原理连接。
(3)pP43NMK-hag-RBS4-dpe-dal载体的制备：
以实施例3中构建的pP43NMK-hag-R4-dpe质粒为模板，PCR扩增除抗性基因卡那霉素Kan以外的线性化载体；以实验室前期构建的PUB-P43-dpe-dal质粒为模板，PCR扩增丙氨酸消旋酶基因；将以上的线性化载体和目的基因用高保真聚合酶Phata Max Super-Fidelity DNA Polymerase利用同源臂重组的原理连接。
(4)步骤(2)和步骤(3)连接时的反应体系和反应条件如下：
反应体系：
Figure BDA0003388228870000101
反应条件：
Figure BDA0003388228870000102
变性-退火-终延伸总共进行25-35个循环。
(5)将步骤(2)和步骤(3)中得到的PCR产物(多聚体片段)转入枯草芽孢杆菌1A751Δdal感受态中，得到转化产物；将转化产物涂布在不含抗生素的LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12h，得到转化子；将转化子进行PCR验证，验证正确即获得无抗重组枯草芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌1A751Δdal/PUB-hag-RBS4-dpe-dal，枯草芽孢杆菌1A751Δdal/pP43NMK-hag-RBS4-dpe-dal。
实施例6：无抗重组枯草芽孢杆菌的发酵制备D-阿洛酮糖3-差向异构酶
具体步骤如下：
(1)分别将实施例3中所获得的重组枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌1A751Δdal/PUB-hag-RBS4-dpe-dal，枯草芽孢杆菌1A751Δdal/pP43NMK-hag-RBS4-dpe-dal在无抗LB固体培养基上划线，于37℃恒温培养箱中倒置培养12h，分别得到单菌落；
(2)分别挑取单菌落接种至无抗LB液体培养基，于37℃、200r/min培养12h，得到种子液；
(3)将制备得到的种子液以3％(v/v)的接种量转接至无抗发酵培养基中，于37℃、200r/min培养12h以上，得到发酵液。
(4)分别检测上述各个重组枯草芽孢杆菌制备得到的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的酶活，结果如表3所示。
表3：含不同载体的无抗重组枯草芽孢杆菌制备得到D-阿洛酮糖3-差向异构酶的酶活
重组菌 发酵酶活(U/mL)
B.subtilis 1A751-dal<sup>-</sup>/pP43NMK-hag-RBS4-dpe-dal 24.72
B.subtilis 1A751-dal<sup>-</sup>/PUB-hag-RBS4-dpe-dal 19.13
结果显示：无抗重组菌株B.subtilis 1A751-dal-/pP43NMK-hag-RBS4-dpe-dal的产酶效果最好，最高发酵酶活为24.72U/mL。
因此，本发明可实现在不添加抗生素的培养集中，采用食品级的菌株发酵制备D-阿洛酮糖3-差向异构酶。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一株产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的菌株及其应用
<130> BAA211368A
<160> 23
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 870
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgaagcatg gtatttatta cgcgtactgg gaacaggaat gggcagcaga ttacaagcgg 60
tatgtagaga aggcggcaaa gcttggattc gatatactgg aggttggcgc ggcgccactg 120
ccggactatt ctgcgcagga ggtaaaggaa ctgaaaaaat gcgccgatga taacggtatc 180
cagctgaccg cgggatatgg tcccgccttc aatcataata tgggttcctc agatccgaag 240
atcagggaag aggcgcttca atggtataaa cgcctgttcg aggtgatggc aggccttgat 300
attcatctga ttggcggagc gctttattca tactggccgg tggactttgc cacagccaat 360
aaggaagagg actggaagca cagcgtggag ggaatgcaga ttctggcgcc catcgccagc 420
cagtatggca tcaatctggg aatggaagtc ctgaaccgct ttgagagcca tatcttaaat 480
acttcggaag aaggcgtgaa gttcgtgacg gaagtaggca tggataatgt gaaagtcatg 540
ctggatacgt tccacatgaa catcgaggaa tcgagcattg gcgacgcgat ccgccatgcc 600
gggaaacttc ttggacactt ccacaccggc gagtgcaacc gcatggtacc cggaaagggc 660
cgcaccccat ggagggagat cggggatgcc ttgcgcgaga ttgagtatga cggaaccgtg 720
gttatggagc catttgtacg catgggcgga caggtaggct ctgatatcaa ggtctggaga 780
gacatcagca agggcgcggg agaggaccgg ctggatgagg atgcaaggcg cgcggtagag 840
ttccagagat acatgcttga atggaagtaa 870
<210> 2
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggattttttt atttttgtat taacaaaatc agagacaatc cgatattaat gatgtagccg 60
ggaggaggcg caaaagactc agccagttac aaaataaggg cacaaggacg tgccttaaca 120
acatattcag ggaggaacaa aaca 144
<210> 3
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acttctcaaa gatcccatgt gcttaaaatt aaagtttaaa tatttggatt ttttaaataa 60
agcgtttaca atatatgtag aaacaacaaa gggggagatt tgt 103
<210> 4
<211> 446
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggattttttt atttttgtat taacaaaatc agagacaatc cgatattaat gatgtagccg 60
ggaggaggcg caaaagactc agccagttac aaaataaggg cacaaggacg tgccttaaca 120
acatattcag ggaggaacaa aacaggatcc tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt 180
taaatacagc cattgaacat acggttgatt taataactga caaacatcac cctcttgcta 240
aagcggccaa ggacgctgcc gccggggctg tttgcgtttt tgccgtgatt tcgtgtatca 300
ttggtttact tatttttttg ccaaagctgt aatggctgaa aattcttaca tttattttac 360
atttttagaa atgggcgtga aaaaaagcgc gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcgg 420
taccctcgag aaaaggagga aaaaaa 446
<210> 5
<211> 206
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
acttctcaaa gatcccatgt gcttaaaatt aaagtttaaa tatttggatt ttttaaataa 60
agcgtttaca atatatgtag aaacaacaaa gggggagatt tgtacttctc aaagatccca 120
tgtgcttaaa attaaagttt aaatatttgg attttttaaa taaagcgttt acaatatatg 180
tagaaacaac aaagggggag atttgt 206
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggattttttt atttttgtat taacaaaatc agagacaatc cgatattaat gatgtagccg 60
ggaggaggcg caaaagactc agccagttac aaaataaggg cacaaggacg tgccttaaca 120
acatattcag ggaggaacaa aacaggattt ttttattttt gtattaacaa aatcagagac 180
aatccgatat taatgatgta gccgggagga ggcgcaaaag actcagccag ttacaaaata 240
agggcacaag gacgtgcctt aacaacatat tcagggagga acaaaaca 288
<210> 7
<211> 328
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggcggcgttc tgtttctgct tcggtatgtg attgtgaagc tggcttacag aagagcggta 60
aaagaagaaa taaaaaagaa atcatctttt ttgtttggaa agcgagggaa gcgttcacag 120
tttcgggcag ctttttttat aggaacattg atttgtattc actctgccaa gttgttttga 180
tagagtgatt gtgataattt taaatgtaag cgttaacaaa attctccagt cttcacatcg 240
gtttgaaagg aggaagcgga agaatgaagt aagagggatt tttgactccg aagtaagtct 300
tcaaaaaatc aaataaggag tgtcaaga 328
<210> 8
<211> 625
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
agctgggtaa agcctatgaa ttctccattt tcttctgcta tcaaaataac agactcgtga 60
ttttccaaac gagctttcaa aaaagcctct gccccttgca aatcggatgc ctgtctataa 120
aattcccgat attggttaaa cagcggcgca atggcggccg catctgatgt ctttgcttgg 180
cgaatgttca tcttatttct tcctccctct caataatttt ttcattctat cccttttctg 240
taaagtttat ttttcagaat acttttatca tcatgctttg aaaaaatatc acgataatat 300
ccattgttct cacggaagca cacgcaggtc atttgaacga attttttcga caggaatttg 360
ccgggactca ggagcattta acctaaaaaa gcatgacatt tcagcataat gaacatttac 420
tcatgtctat tttcgttctt ttctgtatga aaatagttat ttcgagtctc tacggaaata 480
gcgagagatg atatacctaa atagagataa aatcatctca aaaaaatggg tctactaaaa 540
tattattcca tctattacaa taaattcaca gaatagtctt ttaagtaagt ctactctgaa 600
tttttttaaa aggagagggt aaaga 625
<210> 9
<211> 128
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cagaaagcag acggacaccg cgatccgcct gcttttttta gtggaaacat acccaatgtg 60
ttttgtttgt ttaaaagaat tgtgagcggg aatacaacaa ccaacaccaa ttaaaggagg 120
aattcaaa 128
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tactacctgt cccttgctga tttttaaacg agcacgagag caaaaccccc ctttgctgag 60
gtggcagagg gcaggttttt ttgtttcttt tttctcgtaa aaaaaagaaa ggtcttaaag 120
gttttatggt tttggtcggc actgccgaca gcctcgcaga gcacacactt tatgaatata 180
aagtatagtg tgttatactt tacttggaag tggttgccgg aaagagcgaa aatgcctcac 240
atttgtgcca cctaaaaagg agcgatttac at 272
<210> 11
<211> 569
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cagcagttct tttccgtcct ctcttaagta agcgctggtg aagtttgttg attgcacctg 60
gtgaataagt tcaacagaca ctcccgccag cagcacaatc cgcaatataa cacccgccaa 120
gaacattgtg cgctgccggt ttattttggg atgatgcacc aaaagatata agcccgccag 180
aacaacaatt gaccattgaa tcagcagggt gctttgtctg cttaatataa aataacgttc 240
gaaatgcaat acataatgac tgaataactc caacacgaac aacaatcctt tacttcttat 300
taaggcctca ttcggttaga cagcggactt ttcaaaaagt ttcaagatga aacaaaaata 360
tctcatcttc cccttgatat gtaaaaaaca taactcttga atgaaccacc acatgacact 420
tgactcatct tgatattatt caacaaaaac aaacacagga caatactatc aattttgtct 480
agttatgtta gtttttgttg agtattccag aatgctagtt taatataaca atataaagtt 540
ttcagtattt tcaaaaaggg ggatttatt 569
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
taaaaatatc gtggaagccc acaacggatc aattactgtg cacagccgaa tagataaagg 60
aacaacattt tctttttata ttccgacaaa acggtaaaat cgagtctgaa tttgccgaag 120
aatcttgttc cataagaaac acccgctgac tgagcgggtg tttttttaat agccaacatt 180
aataaaattt aaggatatgt taatataaat tcccttccaa attccagtta ctcgtaatat 240
agttgtaatg taacttttca agctattcat acgacaaaaa agtgaacgga ggggtttcaa 300
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<211> 446
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ggatcctgat aggtggtatg ttttcgcttg aacttttaaa tacagccatt gaacatacgg 60
ttgatttaat aactgacaaa catcaccctc ttgctaaagc ggccaaggac gctgccgccg 120
gggctgtttg cgtttttgcc gtgatttcgt gtatcattgg tttacttatt tttttgccaa 180
agctgtaatg gctgaaaatt cttacattta ttttacattt ttagaaatgg gcgtgaaaaa 240
aagcgcgcga ttatgtaaaa tataaagtga tagcggtacc ctcgagaaaa ggaggaaaaa 300
aaggattttt ttatttttgt attaacaaaa tcagagacaa tccgatatta atgatgtagc 360
cgggaggagg cgcaaaagac tcagccagtt acaaaataag ggcacaagga cgtgccttaa 420
caacatattc agggaggaac aaaaca 446
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acttctcaaa gatcccatgt gcttaaaatt aaagtttaaa tatttggatt ttttaaataa 60
agcgtttaca atatatgtag aaacaacaaa gggggagatt tgtggatttt tttatttttg 120
tattaacaaa atcagagaca atccgatatt aatgatgtag ccgggaggag gcgcaaaaga 180
ctcagccagt tacaaaataa gggcacaagg acgtgcctta acaacatatt cagggaggaa 240
caaaaca 247
<210> 15
<211> 247
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ggattttttt atttttgtat taacaaaatc agagacaatc cgatattaat gatgtagccg 60
ggaggaggcg caaaagactc agccagttac aaaataaggg cacaaggacg tgccttaaca 120
acatattcag ggaggaacaa aacaacttct caaagatccc atgtgcttaa aattaaagtt 180
taaatatttg gattttttaa ataaagcgtt tacaatatat gtagaaacaa caaaggggga 240
gatttgt 247
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
acttctcaaa gatcccatgt gcttaaaatt aaagtttaaa tatttggatt ttttaaataa 60
agcgtttaca atatatgtag aaacaacaaa gggggagatt tgtggatcct gataggtggt 120
atgttttcgc ttgaactttt aaatacagcc attgaacata cggttgattt aataactgac 180
aaacatcacc ctcttgctaa agcggccaag gacgctgccg ccggggctgt ttgcgttttt 240
gccgtgattt cgtgtatcat tggtttactt atttttttgc caaagctgta atggctgaaa 300
attcttacat ttattttaca tttttagaaa tgggcgtgaa aaaaagcgcg cgattatgta 360
aaatataaag tgatagcggt accctcgaga aaaggaggaa aaaaa 405
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ggatcctgat aggtggtatg ttttcgcttg aacttttaaa tacagccatt gaacatacgg 60
ttgatttaat aactgacaaa catcaccctc ttgctaaagc ggccaaggac gctgccgccg 120
gggctgtttg cgtttttgcc gtgatttcgt gtatcattgg tttacttatt tttttgccaa 180
agctgtaatg gctgaaaatt cttacattta ttttacattt ttagaaatgg gcgtgaaaaa 240
aagcgcgcga ttatgtaaaa tataaagtga tagcggtacc ctcgagaaaa ggaggaaaaa 300
aaacttctca aagatcccat gtgcttaaaa ttaaagttta aatatttgga ttttttaaat 360
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ggatcctgat aggtggtatg ttttcgcttg aacttttaaa tacagccatt gaacatacgg 60
ttgatttaat aactgacaaa catcaccctc ttgctaaagc ggccaaggac gctgccgccg 120
gggctgtttg cgtttttgcc gtgatttcgt gtatcattgg tttacttatt tttttgccaa 180
agctgtaatg gctgaaaatt cttacattta ttttacattt ttagaaatgg gcgtgaaaaa 240
aagcgcgcga ttatgtaaaa tataaagtga tagcggtacc ctcgagaaaa ggaggaaaaa 300
aaggatcctg ataggtggta tgttttcgct tgaactttta aatacagcca ttgaacatac 360
ggttgattta ataactgaca aacatcaccc tcttgctaaa gcggccaagg acgctgccgc 420
cggggctgtt tgcgtttttg ccgtgatttc gtgtatcatt ggtttactta tttttttgcc 480
aaagctgtaa tggctgaaaa ttcttacatt tattttacat ttttagaaat gggcgtgaaa 540
aaaagcgcgc gattatgtaa aatataaagt gatagcggta ccctcgagaa aaggaggaaa 600
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atgagcacaa aaccttttta cagagatacg tgggcggaaa ttgacttgtc cgcgataaag 60
gaaaatgtca gcaatatgaa aaaacatatc ggtgaacatg tccacttgat ggcagttgtg 120
aaagcaaacg cctacgggca tggtgatgca gaaacagcaa aggctgctct tgacgcaggt 180
gcttcatgct tggccgtggc cattttggat gaagcgattt cactgcgcaa aaagggattg 240
aaggcgccta tattggtgct tggcgcggtt cccccggagt atgtggcaat cgctgctgag 300
tatgacgtga ccttaacagg ttattctgtt gaatggcttc aggaggcagc ccgccacacg 360
aaaaaaggtt ctcttcattt tcatctgaag gtcgatacgg ggatgaacag acttggtgta 420
aaaacagagg aagaagttca gaacgtgatg gcaattcttg accgcaaccc tcgtttaaag 480
tgcaaagggg tatttaccca ttttgcgaca gcggatgaaa aagaaagagg ctatttctta 540
atgcagtttg agcgctttaa agagctgatt gctccgctgc cgttaaagaa tctaatggtc 600
cactgcgcga acagcgccgc tggactccgg ctgaaaaaag gcttttttaa tgcagtcaga 660
ttcggcatcg gcatgtatgg ccttcgcccg tctgctgaca tgtcggacga gataccgttt 720
cagctgcgtc cggcatttac cctgcattcg acactgtcac atgtcaaact gatcagaaaa 780
ggcgagagcg tcagctacgg agccgagtac acagcggaaa aagacacatg gatcgggacg 840
gtgcctgtag gctatgcgga cggctggctc cgaaaattga aagggaccga catccttgtg 900
aagggaaaac gcctgaaaat tgccggccga atttgcatgg accaatttat ggtggagctg 960
gatcaggaat atccgccggg cacaaaagtc acattaatag gccggcaggg ggatgaatat 1020
atttccatgg atgagattgc aggaaggctc gaaaccatta actatgaggt ggcctgtaca 1080
ataagttccc gtgttccccg tatgtttttg gaaaatggga gtataatgga agtaagaaat 1140
cctttattgc aggtaaatat aagcaat 1167
<210> 20
<211> 289
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 20
Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ala Tyr Trp Glu Gln Glu Trp Ala Ala
1 5 10 15
Asp Tyr Lys Arg Tyr Val Glu Lys Ala Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile
20 25 30
Leu Glu Val Gly Ala Ala Pro Leu Pro Asp Tyr Ser Ala Gln Glu Val
35 40 45
Lys Glu Leu Lys Lys Cys Ala Asp Asp Asn Gly Ile Gln Leu Thr Ala
50 55 60
Gly Tyr Gly Pro Ala Phe Asn His Asn Met Gly Ser Ser Asp Pro Lys
65 70 75 80
Ile Arg Glu Glu Ala Leu Gln Trp Tyr Lys Arg Leu Phe Glu Val Met
85 90 95
Ala Gly Leu Asp Ile His Leu Ile Gly Gly Ala Leu Tyr Ser Tyr Trp
100 105 110
Pro Val Asp Phe Ala Thr Ala Asn Lys Glu Glu Asp Trp Lys His Ser
115 120 125
Val Glu Gly Met Gln Ile Leu Ala Pro Ile Ala Ser Gln Tyr Gly Ile
130 135 140
Asn Leu Gly Met Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Ser His Ile Leu Asn
145 150 155 160
Thr Ser Glu Glu Gly Val Lys Phe Val Thr Glu Val Gly Met Asp Asn
165 170 175
Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Ser Ser
180 185 190
Ile Gly Asp Ala Ile Arg His Ala Gly Lys Leu Leu Gly His Phe His
195 200 205
Thr Gly Glu Cys Asn Arg Met Val Pro Gly Lys Gly Arg Thr Pro Trp
210 215 220
Arg Glu Ile Gly Asp Ala Leu Arg Glu Ile Glu Tyr Asp Gly Thr Val
225 230 235 240
Val Met Glu Pro Phe Val Arg Met Gly Gly Gln Val Gly Ser Asp Ile
245 250 255
Lys Val Trp Arg Asp Ile Ser Lys Gly Ala Gly Glu Asp Arg Leu Asp
260 265 270
Glu Asp Ala Arg Arg Ala Val Glu Phe Gln Arg Tyr Met Leu Glu Trp
275 280 285
Lys
<210> 21
<211> 289
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 21
Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ser Tyr Trp Glu His Glu Trp Ser Ala
1 5 10 15
Lys Phe Gly Thr Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile
20 25 30
Ile Glu Val Ala Ala His His Ile Asn Glu Tyr Ser Asp Ala Glu Leu
35 40 45
Ala Val Ile Arg Gln Ser Ala Lys Asp Asn Gly Ile Ile Leu Thr Ala
50 55 60
Gly Ile Gly Pro Ser Lys Thr Lys Asn Leu Ser Ser Glu Asp Ala Ala
65 70 75 80
Val Arg Ala Ala Gly Lys Ala Phe Phe Glu Arg Thr Leu Thr Asn Val
85 90 95
Ala Lys Leu Asp Ile His Thr Ile Gly Gly Ala Leu His Ser Tyr Trp
100 105 110
Pro Ile Asp Tyr Ser Gln Pro Val Asp Lys Ala Gly Asp Tyr Ala Arg
115 120 125
Gly Val Glu Gly Ile His Gly Ile Ala Asp Phe Ala Asn Asp Leu Gly
130 135 140
Ile Asn Leu Cys Ile Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn His Val Leu
145 150 155 160
Asn Thr Ala Ala Glu Gly Val Ala Phe Val Lys Asp Val Gly Lys Asn
165 170 175
Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp
180 185 190
Ser Phe Gly Glu Ala Ile Arg Thr Ala Gly Pro Leu Leu Gly His Phe
195 200 205
His Thr Gly Glu Ser Asn Arg Arg Val Pro Gly Lys Gly Arg Met Pro
210 215 220
Trp His Glu Ile Gly Leu Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Thr Gly Ala
225 230 235 240
Val Val Met Glu Pro Phe Val Lys Thr Gly Gly Thr Ile Gly Ser Asp
245 250 255
Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly Ala Asp Leu Ala Lys Met
260 265 270
Asp Glu Asp Ala Arg Asn Ala Leu Ala Phe Ser Arg Phe Val Leu Gly
275 280 285
Ser
<210> 22
<211> 288
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 22
Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ala Tyr Trp Glu Lys Glu Trp Arg Gly
1 5 10 15
Asp Tyr Leu Tyr Tyr Ile Glu Lys Ala Ala Arg Leu Gly Phe Asp Ile
20 25 30
Leu Glu Leu Ala Ala Ser Pro Phe Pro Glu Tyr Ser Lys Glu Glu Ile
35 40 45
Arg Ala Leu Arg Asp Cys Ala Lys Ser Asn Gly Ile Ile Leu Thr Ala
50 55 60
Gly His Gly Pro Ser Ala Asp Cys Asn Ile Ala Ser Ala Asp Pro Ala
65 70 75 80
Val Lys Ala Asn Ala Leu Glu Phe Tyr Lys Lys Ile Phe Asp Val Met
85 90 95
Glu Gln Leu Asp Ile His Thr Ile Gly Gly Gly Ile Tyr Ser Tyr Trp
100 105 110
Pro Val Asp Tyr Thr Lys Pro Ile Asp Ile Ala Gly Asp Trp Lys Arg
115 120 125
Ser Val Glu Gly Val Arg Glu Met Ala Asp Ile Ala Lys Asp His Gly
130 135 140
Ile Thr Leu Cys Leu Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Gly Tyr Leu Leu
145 150 155 160
Asn Thr Ser Glu Glu Gly Thr Arg Phe Val Lys Glu Val Asp Lys Glu
165 170 175
Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Thr
180 185 190
Ser Ile Gly Asp Ala Ile Arg Thr Ala Gly Lys Tyr Leu Gly His Phe
195 200 205
His Thr Gly Glu Cys Asn Arg Leu Cys Pro Gly Lys Gly Arg Thr Pro
210 215 220
Trp Arg Glu Ile His Asp Ala Leu His Asp Ile Gly Tyr Asp Arg Ala
225 230 235 240
Val Val Met Glu Pro Phe Val Gln Thr Gly Gly Thr Val Gly Ser Asp
245 250 255
Ile Lys Val Trp Arg Glu Met Val Pro Asp Leu Ser Glu Ala Lys Leu
260 265 270
Asp Ala Asp Ala Lys Asp Ala Leu Ile Phe Gln Arg Tyr Met Leu Asp
275 280 285
<210> 23
<211> 289
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 23
Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ser Tyr Trp Glu His Glu Trp Ser Ala
1 5 10 15
Lys Phe Gly Pro Tyr Val Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Val
20 25 30
Ile Glu Val Ala Ala His His Ile Asn Glu Tyr Ser Asp Ala Glu Leu
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Arg Thr Ala Lys Asp Asn Asn Ile Ile Leu Thr Ala
50 55 60
Gly Ile Gly Pro Ser Lys Thr Lys Asn Leu Ser Ser Pro Asp Ile Ala
65 70 75 80
Val Arg Gln Ala Gly Lys Ala Phe Phe Glu Gln Thr Leu Thr Asn Val
85 90 95
Ala Lys Leu Asp Ile Lys Thr Ile Gly Gly Ala Leu His Ser Tyr Trp
100 105 110
Pro Val Asp Tyr Ser Lys Pro Val Asp Lys Glu Gly Asp Arg Ala Arg
115 120 125
Gly Val Glu Gly Ile His Gly Ile Ala Asp Phe Ala Gly Asn Leu Gly
130 135 140
Ile Asn Leu Cys Ile Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn His Val Leu
145 150 155 160
Asn Thr Ala Ala Glu Gly Val Ala Phe Val Lys Asp Val Gly Lys Pro
165 170 175
Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp
180 185 190
Ser Phe Gly Glu Ala Ile Arg Thr Ala Gly Pro Leu Leu Gly His Phe
195 200 205
His Thr Gly Glu Ser Asn Arg Arg Val Pro Gly Lys Gly Arg Met Pro
210 215 220
Trp His Glu Ile Gly Leu Ala Leu Arg Asp Ile Ser Tyr Ala Gly Ala
225 230 235 240
Val Val Met Glu Pro Phe Val Lys Thr Gly Gly Thr Ile Gly Ser Asp
245 250 255
Ile Arg Val Trp Arg Asp Leu Thr Asp Gly Ala Asp Glu Thr Lys Met
260 265 270
Asp Glu Asp Ala Arg Asn Ala Leu Ala Phe Ser Arg Phe Val Leu Gly
275 280 285
Gly

Claims (10)

1.一种增强目的蛋白表达量的表达载体，其特征在于，所述表达载体为，将pP43NMK质粒上的P43启动子替换为hag、ylbP、hagP43、ylbPylbP、haghag中的任一个启动子得到的；
所述启动子hag、ylbP、hagP43、ylbPylbP、haghag的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。
2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述目的蛋白为D-阿洛酮糖3-差向异构酶或磷酸化糖基差向异构酶；所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示或如SEQ ID NO.21所示，所述磷酸化糖基差向异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示或如SEQ ID NO.23所示。
3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体为：将pP43NMK质粒上的P43启动子替换为核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的hag启动子，并且，将hag启动子序列上的碱基第129位～137位同时进行突变。
4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，将hag启动子序列上的碱基第129位～137位同时进行突变为：gaggaggaa，或ggggaggag，或agggaggag，或agggagggg，或aaggaggag，或aaggagggg。
5.一种无抗表达载体，其特征在于，所述表达载体为：
将pP43NMK质粒上的P43启动子替换为核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的hag启动子，并且，将hag启动子序列上的碱基第129位～137位同时突变为：ggggaggag；并用核苷酸序列如SEQ ID NO.19的丙氨酸消旋酶基因dal代替pP43NMK质粒上的抗性基因卡那霉素Kan；
或，将pUB110质粒上的P43启动子替换为核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的hag启动子，并且，将hag启动子序列上的碱基第129位～137位同时突变为：ggggaggag；并用核苷酸序列如SEQ ID NO.19的丙氨酸消旋酶基因dal代替pUB110质粒上的抗性基因卡那霉素Kan和博来霉素Blm。
6.含有权利要求1～5任一所述的表达载体的重组细胞。
7.一种无抗食品级重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，将权利要求5所述的表达载体转入到敲除了丙氨酸消旋酶基因的枯草芽孢杆菌中，制备得到的。
8.如权利要求7所述的无抗食品级重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以枯草芽孢杆菌1A751、WB600、WB800为表达宿主。
9.一种生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，将权利要求6所述的重组细胞，或权利要求6所述的重组细胞的发酵液，或权利要求7或8所述的重组枯草芽孢杆菌，或权利要求7或8所述的重组枯草芽孢杆菌的发酵液，添加至含有果糖的反应体系中进行反应，得到反应液，从反应液中分离得到D-阿洛酮糖。
10.权利要求1～5任一所述的表达载体，或权利要求6所述的重组细胞，或权利要求7或8所述的重组枯草芽孢杆菌在制备D-阿洛酮糖或含有D-阿洛酮糖的产品中的应用。
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