CN105637089B - D-阿洛酮糖3-差向异构酶的改进的变体及其用途 - Google Patents

D-阿洛酮糖3-差向异构酶的改进的变体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的改进的变体及其用途。

Description

D-阿洛酮糖3-差向异构酶的改进的变体及其用途
发明领域
本发明涉及用于从果糖制备阿洛酮糖的改进的异构酶，具体地是D-阿洛酮糖3-差向异构酶，及其用途。
发明背景
D-阿洛酮糖，也称为D-阿卢糖，是果糖的罕见糖异构体。它可以发现于自然界中，像在可食用蘑菇或木菠罗中，在小麦和鼠刺属植物中，但是处于非常低的浓度。
与果糖相反，人体中阿洛酮糖的代谢是被部分吸收并且以能量代谢，并且部分地在尿中和在粪便中未改变地被排出。
已经披露了D-阿洛酮糖作为用于预防生活方式相关疾病的材料的特征，包括其无热量性质，对减小升糖反应的正效应，减肥作用，等。此外，D-阿洛酮糖的甜度是蔗糖的甜度的约70％(大岛(Oshima)，等人(2006)不同食物产品中的阿洛酮糖含量及其来源(Psicosecontents in various food products and its origin).食品科学技术研究(Food SciTechnol Res)12:137-143)，但是仅具有0.3％的蔗糖能量，并且被建议为用于食物产品的理想蔗糖代用品。它还可以用作肝脂肪生成酶和肠α-糖苷酶的抑制剂，用于减少体内脂肪累积。它进一步示出重要的生理机能，例如活性氧种类清除活性和神经保护作用。此外，在食品加工期间，它还改进了胶凝特性并且产生良好风味。
D-阿洛酮糖以极小的量存在于商业碳水化合物或农产品中，并且是难以化学合成的。因此，对于作为D-阿洛酮糖生产的有吸引力的方式，通过使用D-塔格糖3-差向异构酶(DTEase)家族酶差向异构化进行D-果糖和D-阿洛酮糖之间的相互转换已经是困惑的。
到目前为止，已经报道了9个类别的DTEase家族酶来源。二十年前，首先由泉森(Izumori)等人表征了DTEase，来自菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)，用D-塔格糖的最佳底物示出己酮糖的C-3差向异构化活性(泉森(Izumori)等人，1993，生物科学、生物技术和生物化学(Biosci.Biotechnol.Biochem.)57，1037-1039)。直至2006年，从根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)鉴定了具有己酮糖的C-3差向异构化活性的第二酶，并且将其命名为D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPEase),这是由于它的针对D-阿洛酮糖的高度底物特异性(金姆(Kim)等人，2006，应用和环境微生物学(Applied and environmentalmicrobiology)72，981-985；US 2010/0190225、WO 2011/040708)。最近，分别从类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)SK011(DTEase)(张(Zhang)等人，2009，生物技术快报(Biotechnology letters)31，857-862)、解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)H10(DPEase)(木(Mu)等人，2011，农业与食品化学杂志(Journal of agricultural and foodchemistry)，59，7785-7792，CN 102373230)、瘤胃球菌属(Ruminococcus sp)5_1_39BFAA(DPEase)(朱(Zhu)等人，2012，生物技术快报(Biotechnology letters)34，1901-1906)、鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)ATCC BAA-613(贾(Jia)等人，2013，应用微生物学和生物技术(Applied Microbiology and Biotechnology)DOI 10.1007/s00253-013-4924-8)、闪烁梭菌(Clostridium scindens)ATCC 35704(张(Zhang)等人，2013，公共科学图书馆杂志(PLoS ONE)8，e62987)、和梭菌属(Clostridium sp)BNL1100(木(Mu)等人，2013，生物技术快报(Biotechnology letters)DOI 10.1007/s10529-013-1230-6)表征了另外六种DTEase家族酶。此外，丸田(Maruta)等人披露了根瘤菌属(Rhizobium)中的产DTEase源(US 2011/0275138)。
只有一篇参考文献报道了通过蛋白质工程技术，对DTEase家族酶进行了酶修饰。使用随机的和定点的诱变技术，崔(Choi)等人(2011，应用和环境微生物学(Applied andenvironmental microbiology)77，7316-7320)构建了根癌土壤杆菌DPEase的I33L S213C双位点变体，并且与野生型酶相比，该变体酶示出最适温度、半衰期、熔化温度、和催化效率方面的增加。它的最适pH仍在8.00保持不变。
然而，对于活性，该酶具有在8.0–9.5的最适pH，并且pH稳定性是在8.0–10.0之间，这并不适合工业应用。
因此，使用阿洛酮糖的主要关注点仍保持在其稀缺性及其生产成本，并且仍存在对改进的工业D-阿洛酮糖生产的需要。
发明概述
为了发展工业D-阿洛酮糖生产并且降低生产成本，优化的DTEase家族酶应是弱酸稳定的并且是热稳定的，并且对于底物D-果糖具有更高催化效率和转换率。
本发明涉及亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶的变体，其中该变体包括与该亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶相比由在对应于SEQ ID No 2中位置211的位置处的丝氨酸残基对甘氨酸残基的取代；并且其中该变体具有D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性。优选地，该亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶具有以下氨基酸序列，该氨基酸序列与选自下组的序列具有60％或更高的同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID No 2和5-10，更优选地，与选自下组的序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％或更高的同一性，该组由以下各项组成：SEQ IDNo 2和5-10。
在一个优选实施例中，该变体具有一个或若干个以下特征：
a.与该亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶相比，具有更低的pH最佳值，优选地是在6至7的范围内；和/或
b.与该亲本-阿洛酮糖3-差向异构酶相比，具有对底物D-果糖的更高催化效率，优选地高至少两倍；和/或
c.与该亲本-阿洛酮糖3-差向异构酶相比，具有在60℃更长的半衰期。
优选地，该变体具有以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID No2具有35％或更高的同一性，优选60％或更高的同一性，更优选至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的同一性。
优选地，该变体具有以下氨基酸序列，该氨基酸序列与选自下组的序列具有60％或更高的同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID No 2和5-10，优选地更优选地，与选自下组的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID No 2和5-10。
在一个优选实施例中，该亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶是选自：来自菊苣假单胞菌的D-塔格糖3-差向异构酶、来自根癌土壤杆菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶、来自梭菌属的D-阿洛酮糖3-差向异构酶、来自闪烁梭菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶、来自鲍氏梭菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶、来自瘤胃球菌属的D-阿洛酮糖3-差向异构酶、和来自解纤维梭菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶。更优选地，该亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶是来自解纤维梭菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶。
在一个最优选实施例中，该变体包括SEQ ID No 4的氨基酸序列或由其组成，或包括以下氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列与SEQ ID No 4具有90％或95％或更高的同一性，并且在位置211处具有残基丝氨酸。
在一个替代性优选实施例中，该变体包括以下项或由其组成：
-具有G211S取代的SEQ ID No 5的氨基酸序列，或以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID No 5具有90％或95％或更高的同一性并且在位置211处具有残基Ser；或者
-具有G210S取代的SEQ ID No 6的氨基酸序列，或以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID No 6具有90％或95％或更高的同一性并且在位置210处具有残基Ser；或者
-具有G211S取代的SEQ ID No 7的氨基酸序列，或以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID No 7具有90％或95％或更高的同一性并且在位置211处具有残基Ser；或者
-具有G213S取代的SEQ ID No 8的氨基酸序列，或以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID No 8具有90％或95％或更高的同一性并且在位置213处具有残基Ser；或者
-具有G223S取代的SEQ ID No 9的氨基酸序列，或以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID No 7具有90％或95％或更高的同一性并且在位置223处具有残基Ser；或者
-具有G213S取代的SEQ ID No 10的氨基酸序列或以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID No 10具有90％或95％或更高的同一性并且在位置213处具有残基Ser。
本发明的另一个目标是编码根据本发明的变体的分离的核酸。本发明进一步涉及包括编码根据本发明的变体的核酸的表达盒或重组表达载体。它还涉及包含根据本发明的核酸、根据本发明的表达盒或根据本发明的重组表达载体的重组宿主细胞。优选地，将编码根据本发明的变体的核酸整合进该宿主细胞的染色体中。在一个具体实施例中，该宿主细胞是GRAS菌株(公认安全)，优选地是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。在一些实施例中，该重组宿主细胞是枯草芽孢杆菌菌株，其中编码杆菌肽酶F的基因是失活的。
本发明涉及用于生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体的方法，该方法包括培养根据本发明的重组宿主细胞，并且任选地从所得培养物回收或纯化产生的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体。换言之，它涉及根据本发明所述的重组宿主细胞用于产生根据本发明的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体的用途。
本发明还涉及用于产生D-阿洛酮糖的方法，包括在适合D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性的条件下，使根据本发明的变体与D-果糖接触，并且任选地回收产生的D-阿洛酮糖。任选地，D-果糖是由葡糖异构酶从D-葡萄糖预先地或同时地产生的。然后，本发明涉及根据本发明的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体或根据本发明的重组宿主细胞用于产生D-阿洛酮糖的用途。
本发明的一个目标是一种酶组合物，该酶组合物包括根据本发明的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体和另外的酶，该另外的酶特别是葡糖异构酶。
最后，本发明涉及根据本发明的GRAS宿主细胞用于制备食物产品的用途，并且涉及包括这样一种GRAS宿主细胞的食物产品。
发明详细说明
本发明涉及D-阿洛酮糖3-差向异构酶的改进的变体。
定义
在本文件中，术语“DPEase”和“DTEase”分别可以用于代替“D-阿洛酮糖3-差向异构酶”和“D-塔格糖3-差向异构酶”。并且“DPEase”和“DTEase”分别意指具有为D-阿洛酮糖和D-塔格糖的最佳底物的酮醣3-差向异构酶。
术语“亲本”意指对其进行改变以产生本发明的变体的酶。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其片段的变体。在一个优选实施例中，该亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶是在SEQ ID No 2和5-10中示出的那些之间选择的一个D-阿洛酮糖3-差向异构酶。
此外，术语“DPEase变体”还可以是指如在本发明中传授的D-塔格糖3-差向异构酶的变体。同一性百分比：通过比较窗口，通过比较以最佳方式比对的两个序列，来确定两个氨基酸序列(A)和(B)之间的“百分比同一性”。可以通过熟知的方法，例如使用用于尼德尔曼(Needleman)-翁施(Wunsch)的总体比对的算法，来进行序列的所述比对。蛋白分析软件使用分配为不同取代、缺失和其他修饰(包括保守性氨基酸取代)的相似性的量度，来匹配类似的序列。一旦获得了总体比对，则可以通过用比对的相同氨基酸残基的全部数目除以包含在序列(A)和(B)之间的最长序列中的残基的全部数目，来获得同一性的百分比。典型地使用序列分析软件来确定序列同一性。为了比较两个氨基酸序列，技术人员可以使用例如由EMBL-EBI提供并且在以下网址可得的用于蛋白的成对序列比对的工具“凸出针(Emboss needle)”：www.ebi.ac.uk/Tools/services/web/toolform.ebi？tool＝emboss_ needle&con text＝protein，使用默认设置：(I)矩阵：BLOSUM62，(ii)缺口开放：10，(iii)缺口延伸：0.5，(iv)输出格式：对，(v)末端缺口罚分：假，(vi)末端缺口开放：10，(vii)末端缺口延伸：0.5。
“约”是指值加减该值的10％。优选地，它是指值加减该值的5％。例如，“约100”意指在90和110之间、优选地在95和105之间。
“D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性”是指酶将D-果糖修饰为D-阿洛酮糖的能力。可以通过测量从D-果糖形成的D-阿洛酮糖的量来测定这一活性。具体地，可以像在实例部分中详述的那样，或如在木(Mu)等人(2011，农业与食品化学杂志(Journal of agriculturaland food chemistry)59，7785-7792；在“酶测定”部分，7787页)中所披露，进行测量。
D-阿洛酮糖3-差向异构酶的变体
本发明涉及亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶的变体，其中该变体包括与该亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶相比由在对应于SEQ ID No 2中位置211的位置处的丝氨酸残基对甘氨酸残基的取代；并且其中该变体具有D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性。
优选地，该亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶具有以下氨基酸序列，该氨基酸序列与选自下组的序列具有60％或更高的同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID No 2和5-10。具体地，该亲本可以具有以下氨基酸序列，该氨基酸序列与选自下组的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID No 2和5-10。
本发明的诸位发明人令人惊讶地将来自解纤维梭菌的DPEase的G211S变体鉴定为改进的变体。确实，这一变体呈现了以下优点(参见表1和表2)：
-具有更低的pH最佳值，即6.5，代替了野生型DPEase的8.0；
-具有在60℃更高的半衰期，即7.2小时，代替了6.8；以及
-对于D-果糖而言更高的kcat/Km，即150.6，代替了62.7。
根据本发明的诸位发明人的知识，第一次报道了DPEase具有低于7.0的pH最佳值。此外，pH最佳值的下降伴随改进的稳定性和催化效率的强烈增加。
相应地，该DPEase变体具有一个或若干个以下特征：
a.与该亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶相比，具有更低的pH最佳值，优选地是在6至7的范围内；和/或
b.与该亲本-阿洛酮糖3-差向异构酶相比，具有对底物D-果糖的更高催化效率，优选地高至少50％、75％、100％、120％，更优选地高至少两倍；和/或
c.具有在60℃更长的半衰期，优选地该半衰期长至少5、10、15或20分钟。
在一个第一实施例中，该DPEase变体满足项目a)和b)、项目a)和c)、项目b)和c)、或项目a)、b)和c)的要求。优选地，与该亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶相比，该DPEase变体具有更低的pH最佳值，优选地是在6至7的范围内。因此，该DPEase变体满足项目a)和b)、项目a)和c)、或项目a)、b)和c)的要求。
此外，该变体具有以下氨基酸序列，该氨基酸序列与选自下组的亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列具有60％或更高的同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID No 2和5-10。具体地，该变体具有一以下氨基酸序列，该氨基酸序列与选自下组的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID No 2和5-10。
在一个具体实施例中，该变体包括在对应于该亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶的SEQ ID No 2中的位置211的位置处由丝氨酸残基对甘氨酸残基的取代，该变体具有D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性，并且与选自下组的序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID No 2和5-10。此外，该变体可以满足如以上披露的项目a)和b)、项目a)和c)、项目b)和c)、或项目a)、b)和c)的要求。
本发明的诸位发明人进一步注意到，尽管在来自菊苣假单胞菌的D-塔格糖3-差向异构酶、来自根癌土壤杆菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶、和来自解纤维梭菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶之间存在相当低的氨基酸(aa)序列同一性(即菊苣假单胞菌的DTEase与解纤维梭菌的DPEase具有41％的aa同一性；根癌土壤杆菌的DPEase与解纤维梭菌的DPEase具有60％的aa同一性)，但是解纤维梭菌的DPEase的残基G211是保守的。此外，如在图1中所示，在八种酶中的七种中G211是保守的(参见图1)。
然后，本发明涉及DPEase变体，该DPEase变体具有以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID No 2具有35％或更高的同一性，优选地60％或更高的同一性，更优选地，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的同一性。显然地应理解，本发明的所有DPEase变体呈现了在对应于SEQ ID No 2中的残基211的位置处由Ser取代Gly。
更具体地，该亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶是选自：来自菊苣假单胞菌的D-塔格糖3-差向异构酶、来自根癌土壤杆菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶、来自梭菌属的D-阿洛酮糖3-差向异构酶、来自闪烁梭菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶、来自鲍氏梭菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶、来自瘤胃球菌属的D-阿洛酮糖3-差向异构酶、和来自解纤维梭菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶。在一个优选实施例中，该亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶是来自解纤维梭菌、更具体地是解纤维梭菌菌株H10(ATCC 35319)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶。
因此，本发明涉及DPEase变体，该变体具有或包括具有G211S取代的SEQ ID No 2的氨基酸序列(即SEQ ID No 4)的氨基酸序列)，或以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQID No 4具有90％或95％或更高的同一性并且在位置211处具有残基Ser。
可替代地，它还涉及DPEase变体，该变体具有或包括具有G211S取代的SEQ ID No5的氨基酸序列，或以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID No 5具有90％或95％或更高的同一性并且在位置211处具有残基Ser。
此外，它还涉及DPEase变体，该变体具有或包括具有G210S取代的SEQ ID No 6的氨基酸序列，或以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID No 6具有90％或95％或更高的同一性并且在位置210处具有残基Ser。
可替代地，它还涉及DPEase变体，该变体具有或包括具有G211S取代的SEQ ID No7的氨基酸序列，或以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID No 7具有90％或95％或更高的同一性并且在位置211处具有残基Ser。
此外，它还涉及DPEase变体，该变体具有或包括具有G213S取代的SEQ ID No 8的氨基酸序列，或以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID No 8具有90％或95％或更高的同一性并且在位置213处具有残基Ser。
可替代地，它还涉及DPEase变体，该变体具有或包括具有G223S取代的SEQ ID No9的氨基酸序列，或以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID No 7具有90％或95％或更高的同一性并且在位置223处具有残基Ser。
最后，它还涉及DTEase变体，该变体具有或包括具有G213S取代的SEQ ID No 10的氨基酸序列，或以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID No 10具有90％或95％或更高的同一性并且在位置213处具有残基Ser。
任选地，该变体具有在不多于11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸处的改变，例如可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的取代、插入、和/或缺失。
本发明还涉及进一步包括标签的根据本发明的DPEase变体。例如，它可以包括适合于促进DPEase变体纯化或固定的标签，例如His标签(His6)、FLAG标签、HA标签(源自流感蛋白血球凝集素的表位)、MYC标签(源自人类原癌蛋白MYC的表位)或GST标签(小谷胱甘肽-S-转移酶)。
最后，本发明涉及固定在固相支持体或载体上的根据本发明的DPEase变体。DPEase可以被固定在任何适合的支持体或载体上，例如藻酸盐、安伯来特树脂、交联葡萄糖树脂或离子交换树脂，例如珠粒。固定手段是本领域技术人员熟知的。例如，参见崔(Choi)等人，同上；利姆(Lim)等人(2009，过程生物化学(Porcess Biochemistry)44，822-828)和WO 2011/040708，将它们的披露内容通过引用结合在此。
核酸、载体和宿主细胞
本发明涉及编码根据本发明的DPEase变体的核酸，或包括编码根据本发明的DPEase变体的序列的核酸。本发明还涉及根据本发明的核酸的表达盒。它进一步涉及包括根据本发明的核酸或表达盒的载体。优选地，载体是表达载体。优选地，载体是质粒载体。此外，本发明涉及宿主细胞，该宿主细胞包含根据本发明的核酸、根据本发明的核酸的表达盒或包括根据本发明的核酸或表达盒的载体。编码根据本发明的DPEase变体的核酸可以作为游离基因序列存在于宿主细胞中，或可以被并入其染色体中。编码根据本发明的DPEase变体的核酸可以按一个拷贝或按若干个拷贝存在于宿主细胞中。
核酸可以是DNA(cDNA或gDNA)、RNA、或这二者的混合物。它可以处于单链的形式或处于双链体的形式或是这二者的混合物。它可以包括修饰的核苷酸，例如包括修饰的键、修饰的嘌呤或嘧啶碱基、或修饰的糖。它可以通过本领域技术人员已知的任何方法，包括化学合成、重组、诱变等来制备。
表达盒包括用于表达根据本发明的DPEase变体所需的所有元件，具体地是在宿主细胞中，具体地是在考虑的宿主细胞中转录和翻译所需的元件。
宿主细胞可以是原核的或真核的，优选地是原核的或低等真核的，更优选地是原核的。具体地，表达盒包括启动子和终止子，任选地增强子。启动子可以是原核的或真核的，取决于选择的宿主细胞。优选的真核启动子的实例包括：Lacl、LacZ、pLacT、ptac、pARA、pBAD，噬菌体T3或T7的RNA聚合酶启动子，多角体蛋白启动子，λ噬菌体的PR或PL启动子。一般，为了选择适合的启动子，本领域技术人员可以有利地查阅萨姆布鲁克(Sambrook)等人的工作(1989)，或由富勒(Fuller)等人(1996；分子生物学当前实验方案中的免疫学(Immunology in Current Protocols in Molecular Biology))所描述的技术。在一个优选实施例中，将强启动子操作地连接至DPEase变体的编码序列。
本发明涉及包含编码根据本发明的DPEase变体的核酸或表达盒的载体。优选地，载体是表达载体，也就是说，它包括在宿主细胞中表达该变体所需的元件。载体是可自我复制型载体。宿主细胞可以是原核细胞，例如大肠杆菌(E.coli)，或真核细胞。真核细胞可以是低等真核细胞，例如酵母(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))或真菌(例如来自曲霉属(Aspergillus)或放线菌属(Actinomyces))或高等真核细胞，例如昆虫的、哺乳动物的或植物的细胞。细胞可以是哺乳动物细胞，例如COS、CHO(US 4,889,803；US 5,047,335)。在一个具体是实施例中，细胞是非人类的并且是非胚胎的。
载体可以是质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、病毒、YAC、BAC、来自土壤杆菌属的pTi质粒、等。优选地，载体可以包括选自下组的一个或多个元件，该组由以下各项组成：复制起点、多克隆位点和选择基因。在一个优选实施例中，载体是质粒。载体是可自我复制型载体。原核载体的实例包括但不限于以下项：pER322、pQE70、pMA5、pUC18、pQE60、pUB110、pQE-9(Qiagen公司)、pbs、pTZ4、pC194、pD10、pHV14、Yep7、phagescript、psiX174、pbluescriptSK、pbsks、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A(Stratagene公司)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pBR322、和pRIT5(Pharmacia公司)、pET(Novagen公司)。真核载体的实例包括但不限于以下项：pWLNEO、pSV2CAT、pPICZ、pcDNA3.1(+)Hyg(英杰公司(Invitrogen))、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene公司)；pSVK3、pBPV、pCI-neo(Stratagene公司)、pMSG、pSVL(Pharmacia公司)；和pQE-30(QLAexpress公司)。优选地，表达载体是质粒载体。
更具体地，为了在大肠杆菌中表达，优选地，可以使用pBR322、pUC18、pBluescriptII SK(+)、λgt.λC和λgt.λB。同时，为了在枯草芽孢杆菌中表达，优选地，可以使用pUB110、pTZ4、pC194、ρ11、Φ1和Φ105。在两个或更多个类别的宿主中复制重组核酸的情况下，质粒、pHV14、TRp7、YEp7和pBS7是有用的。为了将编码核酸序列插入这些载体中，可以使用本领域的常规方法。
在一个具体实施例中，载体是适合于将编码根据本发明的DPEase变体的序列并入宿主细胞的染色体中的整合载体。可商购的整合载体的非穷尽的实例是来自芽孢杆菌属基因储存中心(Bacillus Genetic Stock Center)的用于枯草芽孢杆菌的pMUTIN4。
相应地，在一个优选的方面，本发明涉及具有被整合进其染色体中的编码根据本发明的DPEase变体的核酸的宿主细胞。宿主细胞的染色体可以包括编码DPEase变体的核酸的一个或若干个拷贝(例如2、3、4或5个拷贝)。可以通过本领域已知的方法，例如通过同源重组或随机整合，来引入所述核酸。在一个优选实施例中，通过Cre-loxP方法(参见严(Yan)等人，应用和环境微生物学(Appl.Environm.Microbiol.)，2008，74，5556-5562)或任何类似方法(例如基于mazF的系统)，来引入编码DPEase变体的核酸。在一个优选实施例中，宿主细胞并不包括任何异源选择基因，例如抗生素抗性基因。例如，首先可以连同异源选择基因一起，将编码DPEase变体的核酸引入宿主细胞的染色体中，并且然后从宿主细胞的染色体中缺失异源选择基因。
优选地，可以在下组中选择宿主细胞，该组由以下各项组成：大肠杆菌、和GRAS菌株。优选地，GRAS菌株选自下组，该组由以下各项组成：无害细菌，尤其是无害的棒杆菌属(Corynebacterium sp)，例如谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)，和无害的芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，例如枯草芽孢杆菌。在一个非常具体的实施例中，宿主细胞是大肠杆菌或枯草芽孢杆菌，优选地是枯草芽孢杆菌。
在一些实施例中，宿主细胞可以是GRAS菌株，其中一个或若干个基因被失活或激活，以便增加所述菌株的活性DPEase的产生。
确实，本发明的诸位发明人示出，杆菌肽酶F，即由枯草芽孢杆菌菌株天然地产生的蛋白酶之一，可以展现出针对DPEase的水解活性，这会限制宿主细胞的活性DPEase的产率。因此，在一个具体实施例中，宿主细胞是GRAS菌株，其中编码易于水解DPEase的蛋白酶的基因中的至少一个被减弱或失活。如在此使用的，展现出“减弱的基因”的菌株是指如与对应的野生型菌株相比，展现降低了所述基因的表达或降低了由所述基因编码的蛋白质的活性的突变菌株。用于减弱或失活基因的方法是技术人员熟知的。可以例如通过以下方式获得基因的减弱：
-将一个或若干个突变引入该基因，以便降低该基因的表达水平，或以便改变编码蛋白的生物活性，这些突变例如是插入、缺失、或随机的或定向的突变，例如移码突变、点突变或插入终止密码子。例如，在本发明的背景下，突变会导致产生具有针对DPEase的非常低的水解活性的蛋白酶。
-用源自更低的蛋白生产的低强度启动子替换基因的天然启动子，
-使用扰动对应的信使RNA或蛋白的元件，
-缺失该基因或其一部分，特别是敲除。
在一些实施例中，宿主细胞是GRAS菌株，其中减弱的基因是编码易于水解DPEase的丝氨酸内肽酶的基因。
在一些另外的实施例中，宿主细胞是芽孢杆菌属菌株，优选地是枯草芽孢杆菌菌株，其中编码杆菌肽酶F的基因被减弱或失活。在一些另外的实施例中，宿主细胞是枯草芽孢杆菌菌株，其中编码杆菌肽酶F的基因被敲除。可以通过缺失所述菌株的基因组中的对应的基因组DNA来获得此类敲除。为了说明，在斯洛马(Sloma)等人(1990，细菌学杂志(J.Bacteriol.,)，172，1470-1477)中描述了枯草芽孢杆菌中的杆菌肽酶F基因(brp)的基因ID。
本发明涉及使用如以上披露的用于产生根据本发明的DPEase变体的核酸、表达盒、表达载体或宿主细胞。
它还涉及用于产生根据本发明的DPEase变体的方法，该方法包括培养根据本发明的重组宿主细胞，并且任选地从所得培养物回收和/或纯化产生的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体。在一个优选实施例中，宿主细胞选自大肠杆菌和GRAS菌株，尤其是枯草芽孢杆菌。
任选地，宿主细胞进一步产生葡糖异构酶。
在一个具体实施例中，本发明涉及根据本发明的产生并且分泌本发明的DPEase变体的固定化宿主细胞。
D-阿洛酮糖的产生
本发明涉及根据本发明的DPEase变体用于产生D-阿洛酮糖的用途，并且涉及用于通过使用根据本发明的DPEase变体产生D-阿洛酮糖的方法。
在一个第一实施例中，在适合于D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性的条件下，使DPEase变体与D-果糖接触。可以作为高果糖浆，并且具体地是高果糖玉米糖浆，来提供D-果糖。此类高果糖玉米糖浆是在
Figure BDA0000933195260000171
参考下，从法国罗盖特公司(RoquetteFreres)可商购的。
在另一个具体实施例中，使D-葡萄糖与包括根据本发明的DPEase变体和葡糖异构酶的酶混合物接触。葡糖异构酶也称为木糖异构酶并且对应于EC.5.3.1.5。优选地，作为葡萄糖浆，具体地是玉米糖浆，来提供葡萄糖。
在另一个替代方案中，起始材料可以是淀粉，代替葡萄糖或果糖，并且酶混合物进一步包括α-淀粉酶和/或葡糖淀粉酶。
本发明涉及包括根据本发明的DPEase变体和另外的酶的酶混合物。优选地，该酶混合物包括根据本发明的DPEase变体和葡糖异构酶。任选地，酶混合物可以进一步包括α-淀粉酶和/或葡糖淀粉酶。
可以由本领域技术人员来限定适合的产生D-阿洛酮糖的条件。优选地，它们包括以下特征：
-温度：在50℃和60℃之间，优选地约55℃；和/或
-pH：在5.5和7.5之间，优选地在6和7之间，更优选地约6.5；和/或
-存在二价金属离子，优选地选自下组，该组由以下各项组成：Co2+、Mn2+、Fe2+、Ni2+和Mg2+，更优选地选自Co2+、Mn2+、Fe2+、和Ni2+，仍优选地选自Co2+和Mn2+，并且最优选地是Co2 +；和/或
-当使用固定化TDEase时，存在硼酸盐，例如40-80mM的硼酸盐，优选地约60mM。
在一个具体实施例中，有待用于该方法的酶被固定化。更具体地，本发明的DPEase变体被固定化。任选地，葡糖异构酶和本发明的DPEase变体这二者可以被固定化或仅DPEase变体被固定化。在另一个替代方案中，代替固定酶，产生这些酶的微生物被固定化。例如，可以将这一种或多种酶或微生物固定在任何适合的支持体上，例如藻酸盐、安伯来特树脂、交联葡萄糖树脂或离子交换树脂，例如珠粒。
可以将这一种或多种固定化的酶或微生物填充进适合的柱中，并且将葡萄糖或果糖的液体或糖浆连续地引入该柱。
用于将DPEase固定在支持体上并且用来生产D-阿洛酮糖的方法是本领域技术人员熟知的，例如在WO 2011/040708中。
所得产物可以是D-果糖和D-阿洛酮糖的混合物，并且甚至可以是D-葡萄糖、D-果糖和D-阿洛酮糖的混合物。
本发明的一个方面涉及根据本发明的GRAS宿主细胞用于制备食物产品的用途，并且涉及包括这种GRAS宿主细胞的食物产品。食物产品被用于人类或用于动物饲料。例如，食物可以是健康食品、患者食品、食品材料、健康食品材料、患者食品材料、食品添加剂、健康食品添加剂、患者食品添加剂、饮料、健康饮料、患者饮料、饮用水、健康饮用水、患者饮用水、药物、药物原料、饲料、以及患病家畜和/或患病动物的饲料。当用作食品材料或食品添加剂时，它可以用于减轻异常碳水化合物代谢和/或异常脂质代谢。它可以处于固体制剂的形式，例如片剂、胶囊、或有待溶于饮料中的粉末或颗粒、等；半固体制剂，例如果冻状物；液体，例如饮用水；要在使用前稀释的高浓度溶液；等。
附图简要说明
图1.DTEase家族酶及其同系物的多重序列比对。氨基酸序列是来自解纤维梭菌DPEase(Clce-DPEase；基因库登录号：ACL75304)，梭菌属(Clsp-DPEase；YP_005149214.1)，闪烁梭菌DPEase(Clsc-DPEase；EDS06411.1)，根癌土壤杆菌DPEase(Agtu-DPEase；AAL45544)，鲍氏梭菌DPEase(Clbo-DPEase；EDP19602)，瘤胃球菌属DPEase(Rusp-DPEase；ZP_04858451)，菊苣假单胞菌DTEase(Psci-DTEase；BAA24429)，和类球红细菌DTEase(Rhsp-DTEase；ACO59490)。使用ClustalW2程序(www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)进行比对。用星号(*)标记在所有展示的序列中相同的氨基酸残基，分别用冒号(:)或点(.)指示强保守的或弱保守的残基。
图2.解纤维梭菌DPEase的野生型和G211S突变体之间的pH曲线的比较。
图3.用考马斯蓝染色的纯化的G211S DTEase变体和蛋白标记物的SDS-PAGE分析。泳道1，枯草芽孢杆菌产生的DPEase；泳道2，蛋白标记物。
图4示出根据实例2中描述的方法1(Cre/Lox重组系统)，用于将DPEase基因插入枯草芽孢杆菌菌株中的质粒pDGI-7S6-DPE的构建。
图5示出实例2中描述的方法1的主要步骤，用来产生表达DPEase的枯草芽孢杆菌菌株。
图6根据实例2中描述的方法2(基于mazF的系统)，用于将DPEase基因插入枯草芽孢杆菌菌株中的质粒pDGI-DP的构建。
图7示出实例2中描述的方法2的主要步骤，用来产生表达DPEase的枯草芽孢杆菌菌株。
实例1
诸位发明人用定点诱变，通过用密码子AGC、GCC、GAC、CGC、TGG和CTC替换在位置211(SEQ ID No 1)中编码Gly的密码子GGC(分别编码取代G211S、G211A、G211D、G211T、G211W和G211L)来制备解纤维梭菌的DPEase变体。
已经在枯草芽孢杆菌中表达了DPEase变体，进行了表达和纯化(图3)。
已经确定了用于底物D-阿洛酮糖的来自解纤维梭菌的DPEase的野生型和变体的酶特性和动力学参数，并且在表1中给出了结果。
与野生型DPEase(表1)，而且还与其他已知酶(表2)相比，G211S变体示出了改进的特征。具体地，它是在范围从6至8的pH下具有多于80％活性的弱酸稳定的酶(图2)，在55℃具有大约150.6的催化效率和至少10小时的半衰期，和/或在60℃具有至少6.5小时的半衰期。此外，宿主是食品级微生物。在具有更有效的生产循环和更低的生产成本的食品级D-阿洛酮糖的生物生产方面，这些属性是重要的。
材料和方法
化学品和试剂
Taq DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸(dNTP)、用于PCR的化学品、T4DNA连接酶和质粒小型制备试剂盒获得自宝生物工程有限公司(Takara)(大连，中国)。用于蛋白纯化的树脂，螯合琼脂糖快流获得自GE公司(乌普萨拉市(Uppsala)，瑞典)。电泳试剂购买自Bio-Rad公司。异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)和用于酶测定和表征的所有化学品都至少是分析级的，获得自西格玛公司(圣路易斯，密苏里州，美国)和国药集团化学试剂有限公司(Sinopharm Chemical Reagent)(上海，中国)。由生工生物工程股份有限公司(SangonBiological Engineering Technology and Services)(上海，中国)合成寡核苷酸。
质粒，细菌菌株，和培养条件
质粒pET-22b(+)获得自Novagen公司(达姆施塔特，德国)。大肠杆菌DH5α和大肠杆菌BL21(DE3)获得自天根生物技术有限公司(Tiangen Biotechnology)(北京，中国)。枯草芽孢杆菌WB600和质粒pMA5获得自英杰公司(Invitrogen)(卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)。在37℃，在旋转振荡器(200rpm)中，在卢里亚-贝尔塔尼(Luria-Bertani)培养基中，使细菌菌株生长。
大肠杆菌中解纤维梭菌的DPEase变体的制备
(1)用于蛋白修饰的引物设计如下：
正向诱变引物：
G211S正向引物1：CATTTACACACTAGCGAATGTAATCGT(SEQ ID No 12)
G211A正向引物2：CATTTACACACTGCCGAATGTAATCGT(SEQ ID No 13)
G211D正向引物3：CATTTACACACTGACGAATGTAATCGT(SEQ ID No 14)
G211R正向引物4：CATTTACACACTCGCGAATGTAATCGT(SEQ ID No 15)
G211W正向引物5：CATTTACACACTTGGGAATGTAATCGT(SEQ ID No 16)
G211L正向引物6：CATTTACACACTCTCGAATGTAATCGT(SEQ ID No 17)
反向引物：5’-AGTGTGTAAATGTCCCAAGTAAGAGCCCGC-3’(SEQ ID No 18)
(2)通过PCR技术，使用上述引物，扩增质粒。
模板：pET-Cc-dpe
DNA聚合酶：Pfu
PCR程序：用PfuDNA聚合酶进行20个循环的PCR扩增，每个循环由以下组成：94℃持续30s，60℃持续30s，和72℃持续5min，之后是在72℃ 10min的延伸步骤。
(3)PCR后，将1ul DpnI限制性内切酶(10U/μl)添加进200μl PCR产物中，并且在37℃孵育4h，以消化并且消除模板DNA。
(4)用凝胶提取试剂盒纯化DNA。
(5)在16℃，在一起进行突变片段的5’-磷酸化和连接反应，持续12h，并且反应系统如下：
Figure BDA0000933195260000221
(6)将DNA转化进大肠杆菌DH5α。在37℃，在包含100μg/mL氨苄西林的LB琼脂平板上选择转化子。
(7)提取质粒并且通过核苷酸测序来进行鉴定。
(8)将重构质粒转化进大肠杆菌BL21
在37℃，在包含100μg/mL氨苄西林的LB琼脂平板上选择转化子。
枯草芽孢杆菌中解纤维梭菌的DPEase变体的制备
(1)PCR
关于将不同变体基因亚克隆至枯草芽孢杆菌表达质粒中，设计正向引物(5’-CGCCATATGAAACATGGTATATACTACGC-3’–SEQ ID No 19)和反向引物(5’-CGCGGATCCTTGTTAGCCGGATCTC-3’–SEQ ID No 20)，来引入NdeI和BamHI限制酶切位点。使用容纳不同DPEase变体基因的重构的pET-22b(+)质粒，单独地用Taq Plus DNA聚合酶进行PCR扩增，持续35个循环，每个循环由以下组成：94℃持续1min，60℃持续1min，和72℃持续1min，之后是在72℃ 10min的最终延伸步骤。
(2)单独地使用凝胶提取试剂盒纯化PCR产物。
(3)用限制性内切酶NdeI和BamHI消化纯化的PCR产物和枯草芽孢杆菌表达质粒pMA5
(4)用T4DNA连接酶连接DNA片段和pMA5，并且然后将混合物转化进大肠杆菌DH5α中。
(5)在37℃，在包含100μg/mL氨苄西林的LB琼脂平板上选择转化子。
(6)提取重构质粒并且通过限制性内切酶消化和核苷酸测序来进行鉴定。
(7)通过电穿孔，单独地将容纳野生型或变体DPEase基因的重构pMA5质粒转化进枯草芽孢杆菌WB600中。在37℃，在包含100μg/mL氨苄西林的LB琼脂平板上选择转化子。
解纤维梭菌的DPEase变体的纯化
为了纯化重组DPEase变体，将离心的细胞沉淀再悬浮于裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH 7.5)中，并且通过使用Vibra-Cell 72405声发生器，在4℃声处理6min来使其破裂(3s的脉冲，放大90)，并且通过离心(20000g，20min，4℃)来去除细胞碎片。将无细胞提取物施加至螯合琼脂糖快流树脂柱(1.0cm x 10.0cm)上，该柱预先螯合Ni2+，并且用结合缓冲液(50mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH 7.5)进行平衡。用洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl，500mM NaCl，50mM咪唑，pH 7.5)从该柱洗脱未结合蛋白。然后，用洗脱缓冲液(50mMTris-HCl，500mM NaCl，500mM咪唑，pH 7.5)从该柱洗脱DPEase变体。收集活性部分，并且在4℃，针对包含10mM乙二胺四乙酸(EDTA)的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)透析过夜，持续48h。随后，针对50mM无EDTA的Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)透析酶。
DPEase测定
通过确定从D-果糖产生的D-阿洛酮糖的量，来测量活性。1mL的反应混合物包含D-果糖(50g/L)、Tris-HCl缓冲液(50mM，pH 8.0)、0.1mM Co2+、和0.5μM酶。在55℃孵育反应混合物2min，并且在10min后通过煮沸来停止反应。通过HPLC方法来确定产生的D-阿洛酮糖。一个单位的酶活性被定义为在pH 8.0和55℃，每分钟催化形成1μmol的D-阿洛酮糖的酶的量。
温度和pH的作用
通过经在35℃-70℃的范围上持续2min，来测定酶样品，从而测量酶活性的最佳温度。使用两个缓冲液系统，磷酸钠(50mM，pH 6.0-7.0)和Tris-HCl((50mM，pH 7.5-9.0)来测量酶活性的最佳pH 值。通过在不同温度，在Tris-HCl缓冲液(50mM，pH 8.0)中孵育酶，来研究酶的热稳定性。按给定时间间隔，取出样品并且在标准测定条件下测量残余活性。为了确定pH稳定性，在4℃，在pH 6.0-9.0持续高达2h来孵育酶，并且在标准测定条件下，按时间间隔测量剩余酶活性。
动力学参数的确定
在用于在55℃反应的包含0.1mM Co2+和5-200mM底物的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，确定DPEase变体的动力学参数。在10min后通过煮沸来停止酶反应，并且通过HPLC测定来确定D-阿洛酮糖的量。使用莱恩威佛-伯克(Lineweaver-Burk)方程和酶浓度的定量，获得动力学参数，例如底物的米氏常数(Michaelis-Menten constant)(Km)和转换数(kcat)值。
分析方法
通过配备有反射指数检测器和Ca2+-碳水化合物柱(Waters Sugar-Pak1，沃特世公司(Waters Corp.)，米尔福德，马萨诸塞州)的HPLC来分析D-果糖和D-阿洛酮糖的浓度，该柱是在85℃以0.4mL/min用水进行洗脱。使用牛血清白蛋白作为标准品，根据布拉德福(Bradford)方法确定蛋白浓度。根据利姆里(Laemmli)的方法，进行SDS-PAGE。用考马斯亮兰来染色凝胶(12％w/v聚丙烯酰胺)，并且用10％(v/v)甲醇/10％(v/v)乙酸的水性混合物脱色。
表1：对于底物D-阿洛酮糖，来自解纤维梭菌的DPEase的野生型和突变体酶的酶特性和动力学参数
Figure BDA0000933195260000251
a NR，并未报道。
表2：用于D-阿洛酮糖产生的DTEase家族酶的酶特性和动力学参数
Figure BDA0000933195260000261
a NR，并未报道。
b半衰期值是从以min为单位的原始参考值转化。
a该值是从以mM-1s-1为单位的原始参考值转化。
实例2：生产D-阿洛酮糖差向异构酶的微生物菌株的染色体整合和生产
诸位发明人构建了具有D-阿洛酮糖差向异构酶的染色体整合的五个菌株。为了避免抗生素添加和菌株内的抗生素抗性基因(ARG)，通过染色体整合经两种方法即Cre/Lox和基于mazF的系统构建这些菌株，而不用插入ARG。Cre/Lox系统用来构建具有与ARG进行的染色体整合的菌株，并且用Cre重组酶(方法1)将该ARG敲除。另一系统被用来构建具有与mazF基因进行的染色体整合的菌株，并且用p43-DPE基因(方法2)将该mazF基因敲除。将枯草芽孢杆菌的三个菌株用作宿主菌株，即1A751、WB600、和WB800。
方法1.在枯草芽孢杆菌中，基于Cre/Lox系统的基因组工程
1.1引入
Cre/Lox重组系统是目前被认为是强有力的DNA重组工具的简单二组分系统。Cre/Lox系统之后的一般原理依赖于Cre重组酶识别、结合并且重组两个loxP位点之间的DNA的能力；这些34bp靶DNA序列中的每一个都由在8bp中央定向核心侧翼的两个13bp反向重复序列组成。通过使用Cre/Lox重组系统，敲除了抗生素抗性基因(ARG)。
1.2方法
基于Cre/Lox重组系统，构建具有不含ARG的染色体整合的菌株，包含如下若干步骤(还参见图4)：
a.通过重叠延伸PCR，具有启动子p43的DPEase编码基因的剪接
通过重叠延伸PCR来剪接启动子p43和DPEase编码基因。然后将PCR产生的p43-DPE盒克隆进pMD19-T，以产生pP43DPE。
b.将p43-DPE基因(p43-DPE)和大观霉素抗性基因(lox71-spc-lox66)插入穿梭质粒载体pDGIEF中，以构建重组质粒pDGI-7S6-DPE。
质粒pDGI-7S6-DPE构建如下。将包含lox71-spc-lox66盒的且侧翼为SalI-和XmaI的片段从p7S6转移至pDGIEF的对应位点，给出pDGI-7S6；然后将NheI/SalI消化的pP43DPE克隆进pDGI-7S6的对应位点，以产生pDGI-7S6-DPE(图4)。
c.将重构质粒转化进枯草芽孢杆菌用于染色体整合。
通过化学转化，将pDGI-7S6-DPE质粒通过XhoI线性化并且转化进枯草芽孢杆菌菌株(1A751、WB600、和WB800)中[基思(Keith)等人，应用微生物学和生物技术(ApplMicrobiol Biotechnol)，2013，97:6803–6811(宿主1A751)；张(Zhang)等人，生物资源技术(Bioresource Technology)，2013，146:543–548(宿主WB600)；纽伦(Nguyen)等人.微生物细胞工厂(Microbial Cell Factories)2013，12:79(宿主WB800)]。将枯草芽孢杆菌淀粉酶基因同源臂用于整合载体和染色体DNA之间的同源重组。通过染色体整合，将p43-DPE盒和lox71-spc-lox66盒插入染色体DNA中。
d.用大观霉素筛选整合的枯草芽孢杆菌
在具有100ug/mL大观霉素的LB平板上筛选重组菌株。
e.将pTSC质粒转化进枯草芽孢杆菌(7S6-DPE)中，并且然后用红霉素进行筛选。
将容纳Cre重组酶基因的pTSC质粒转化进枯草芽孢杆菌(pDGI-7S6-DPE)感受态细胞中。在具有200ug/mL红霉素的LB平板上筛选枯草芽孢杆菌(7S6-DPE，pTSC)菌株。
f.用红霉素和大观霉素筛选枯草芽孢杆菌(lox-DPE，pTSC)菌株。
如果大观霉素抗性基因被敲除，则菌株不可以在具有200ug/mL红霉素和100ug/mL大观霉素的LB平板上生长，但是可以在具有200ug/mL红霉素的LB平板上生长。基于这一点，筛选并且选择枯草芽孢杆菌(lox-DPE，pTSC)菌株。
g.用红霉素筛选枯草芽孢杆菌(lox-DPE)菌株。
当在42℃孵育平板时，pTSC是不能复制的温度敏感型质粒。如果在枯草芽孢杆菌菌株中丧失了pTSC质粒，则这些菌株不可以在具有200ug/mL红霉素的LB平板上生长。在42℃孵育两天后，在LB平板和具有200ug/mL红毒素的LB平板上筛选和选择枯草芽孢杆菌(lox-DPE)菌株。
h.验证抗生素抗性基因的敲除
使用以下两种测试方法来验证抗生素抗性基因的敲除：PCR和在抗生素平板上筛选。使用枯草芽孢杆菌淀粉酶同源臂基因的引物来进行PCR扩增。对DNA片段进行测序并且将其与抗生素抗性基因序列进行比对，以确定抗生素抗性基因被敲除。同时，还使用抗生素抗性基因的引物。如果PCR扩增失败，则在构建的菌株中并不存在抗生素抗性基因。在抗生素平板上筛选其他测试方法。如果菌株不能在抗生素平板上生长，则抗生素抗性基因被敲除。
方法2.在枯草芽孢杆菌中，基于mazF的基因组工程
2.1引入
mazF是大肠杆菌毒素基因，它可以用作新颖的计数器选择性标记，用于在枯草芽孢杆菌中进行未标记的染色体操纵。将mazF置于木糖诱导型表达系统的控制下。容纳mazF盒的枯草芽孢杆菌菌株不能在含木糖培养基上生长。如果用p43-DPE盒替换了mazF盒，则这些菌株能在含木糖培养基上生长。
2.2方法
基于这一点，枯草芽孢杆菌中未标记的染色体整合包含如下若干步骤(还参见图7)：
a.将p43-DPE基因(p43-DPE)插入穿梭质粒载体pDGIEF中，以构建重组质粒pDGI-DPE。
质粒pDGI-DPE构建如下。将包含p43-DPE盒的、且侧翼为Xma I-和Sal I的片段从pP43DPE转移至pDGIEF的对应位点，给出pDGI-DPE。(图6)
b.将重构质粒pDGREF转化进枯草芽孢杆菌中用于染色体整合。
用Cla I将pDGREF质粒线性化，并且通过化学转化将其转化进枯草芽孢杆菌菌株(1A751、WB600、WB800)中。将枯草芽孢杆菌淀粉酶基因同源臂用于整合载体和染色体DNA之间的同源重组。通过染色体整合，将mazF盒插入染色体DNA中。
c.用大观霉素和木糖筛选整合的枯草芽孢杆菌。
在具有100μg/mL大观霉素的LB平板上筛选重组菌株。然后分别在含大观霉素(100μg/mL)-木糖(2％)的LB平板和含大观霉素(100ug/mL)的LB平板上划线阳性克隆。将不能在含木糖平板上生长的阳性克隆用于下一步骤。
d.将pDGI-DPE质粒转化进枯草芽孢杆菌(REF)中，并且然后用木糖进行筛选。
将容纳p43-DPE基因的pDGI-DPE质粒用Xho I线性化，并且转化进枯草芽孢杆菌(REF)感受态细胞中。在具有2％木糖的LB平板上筛选枯草芽孢杆菌(DPE)菌株。
·结果
通过这两个方法选择五种菌株。在选择枯草芽孢杆菌菌株后，在实验室培养基中发酵这些菌株。如在实例1中所述的确定酶活性，以确保将DPEase编码基因插入染色体DNA中。针对所有选择的菌株确定酶活性。对于1A751菌株，检测到最高酶活性。酶活性达到03.45U/mL，这接近对于质粒依赖性枯草芽孢杆菌检测到的初始活性。
Figure BDA0000933195260000311
序列表
SEQ ID No 说明
1 来自解纤维梭菌的亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶的核酸序列
2 来自解纤维梭菌的亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列
3 源自解纤维梭菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体的核酸序列
4 源自解纤维梭菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体的氨基酸序列
5 梭菌属DPEase的氨基酸序列
6 闪烁梭菌DPEase的氨基酸序列
7 根癌土壤杆菌DPEase的氨基酸序列
8 瘤胃球菌属DPEase的氨基酸序列
9 鲍氏梭菌DPEase的氨基酸序列
10 菊苣假单胞菌DTEase的氨基酸序列
11 类球红细菌DTEase的氨基酸序列
12-20 引物
Figure IDA0000933195320000011
Figure IDA0000933195320000021
Figure IDA0000933195320000031
Figure IDA0000933195320000041
Figure IDA0000933195320000051
Figure IDA0000933195320000061
Figure IDA0000933195320000071
Figure IDA0000933195320000081
Figure IDA0000933195320000091
Figure IDA0000933195320000101
Figure IDA0000933195320000111
Figure IDA0000933195320000121
Figure IDA0000933195320000131
Figure IDA0000933195320000141

Claims (20)

1.一种亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶的变体，其中该变体以下列序列表征：
-SEQ ID No 4的氨基酸序列；或
-具有G211S取代的SEQ ID No 5的氨基酸序列；或
-具有G210S取代的SEQ ID No 6的氨基酸序列；或
-具有G211S取代的SEQ ID No 7的氨基酸序列；或
-具有G213S取代的SEQ ID No 8的氨基酸序列；或
-具有G223S取代的SEQ ID No 9的氨基酸序列；或
-具有G213S取代的SEQ ID No 10的氨基酸序列，
并且其中所述变体具有D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性。
2.根据权利要求1所述的变体，其中该变体具有一个或若干个以下特征：
a.与该亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶相比，具有更低的pH最佳值；和/或
b.与该亲本-阿洛酮糖3-差向异构酶相比，具有对底物D-果糖的更高催化效率；和/或
c.与该亲本-阿洛酮糖3-差向异构酶相比，在60℃具有更长的半衰期。
3.根据权利要求2所述的变体，其中所述更低的pH最佳值在6至7的范围内。
4.根据权利要求2所述的变体，其中与该亲本-阿洛酮糖3-差向异构酶相比，对底物D-果糖的催化效率高至少两倍。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的变体，其中该亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶是选自：来自菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)的D-塔格糖3-差向异构酶、来自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶、来自梭菌属(Clostridium sp)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶、来自闪烁梭菌(Clostridium scindens)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶、来自鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶、来自瘤胃球菌属(Ruminococcus sp)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶、和来自解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶。
6.根据权利要求5所述的变体，其中该亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶是来自解纤维梭菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶。
7.一种编码根据权利要求1-6中任一项所述的变体的分离的核酸。
8.一种包含根据权利要求7所述的核酸的重组表达载体。
9.一种包含根据权利要求7所述的核酸或根据权利要求8所述的重组表达载体的重组宿主细胞。
10.根据权利要求9所述的重组宿主细胞，其中将编码所述变体的核酸整合进该宿主细胞的染色体中。
11.根据权利要求9-10中任一项所述的重组宿主细胞，其中该宿主细胞是GRAS菌株。
12.根据权利要求11所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
13.根据权利要求12所述的重组宿主细胞，其中该宿主细胞是枯草芽孢杆菌菌株，其中编码杆菌肽酶F的基因是失活的。
14.一种用于产生D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体的方法，该方法包括培养根据权利要求9-13中任一项所述的重组宿主细胞，并且任选地从所得培养物回收产生的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体。
15.一种用于产生D-阿洛酮糖的方法，该方法包括在适合于D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性的条件下，使根据权利要求1至6中任一项所述的变体与D-果糖接触，并且任选地回收产生的D-阿洛酮糖。
16.如权利要求15所述的方法，其中该D-果糖是由葡糖异构酶从D-葡萄糖预先地或同时地产生的。
17.一种酶组合物，其包括根据权利要求1至6中任一项所述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体，和选自葡糖异构酶、α-淀粉酶和/或葡糖淀粉酶的另外的酶。
18.根据权利要求1至6中任一项所述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体或根据权利要求9至13中任一项所述的宿主细胞用于产生D-阿洛酮糖的用途。
19.根据权利要求12或13所述的宿主细胞用于制备食物产品的用途。
20.一种包含根据权利要求12或13所述的宿主细胞的食物产品。
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