CN114703170B - 一种d-阿洛酮糖3-差向异构酶的热稳定性突变体及其高通量筛选方法 - Google Patents

一种d-阿洛酮糖3-差向异构酶的热稳定性突变体及其高通量筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的热稳定性突变体及其高通量筛选方法，属于酶工程领域。该高通量筛选方法经过两轮叠加筛选获得的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶三点突变体热稳定性明显提高。该突变体与野生型相比，5min热处理的半失活温度从58.9℃升高至66.0℃，60℃热处理温度下半衰期从2.06min增加至19.52min，同时三点突变体的比酶活从野生型的214.6U/mg增加至338.5U/mg。

Description

一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶的热稳定性突变体及其高通量 筛选方法
技术领域
本发明涉及一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶热稳定性提高的突变体及筛选热稳定性突变体的高通量筛选方法，属于酶工程领域。
背景技术
稀少糖D-阿洛酮糖(又称D-核糖-2-己酮糖)是D-果糖C3位置的差向异构体，是一种能量密度很小的单糖，其热量约为0.2kcal/g，而其甜度相当于蔗糖的70％左右。D-阿洛酮糖已被美国食品和药品管理局(FDA)确认为安全(GRAS)食品，通常用作食品工业中甜味剂或膳食补充剂。D-阿洛酮糖还具有抗氧化、控制血糖、改善胰岛素抵抗等多种生理功能，在食品工业领域具有广阔的应用前景。
D-阿洛酮糖仅存在于自然界的少数水果中，且难以通过化学合成法生产。目前主要的生产方式是酶催化法。
D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-allulose 3-epimerase，简称DAE，EC5.1.3.30)，能催化D-果糖异构化生成D-阿洛酮糖。通过比较不同来源的酶学性质，我们发现DAE普遍存在热稳定性较差的问题。
目前，分子改造技术已成功应用于改善DAE催化性能。通过合理的设计策略，包括计算机辅助△△G的计算、二硫键的设计、B因子分析、多序列比对以及亚基间作用力的分析计算，已经对来自不同来源的DAE进行了理性设计，并且在热稳定性提高效果方面取得了一定成果。
为克服在理性设计过程中改造效率较低的问题，快速高效提高DAE的稳定性，本发明利用偶联葡萄糖异构酶催化，根据检测体系酮糖与间苯二酚在酸性加热条件下得到显色的分光光度法成功构建了适合于热稳定性改造的高通量筛选方法。
Mu等对来源于Clostridium cellulolyticum H10的DAE在大肠杆菌中进行了异源表达(J.Agric.Food Chem.2011,59,14,7785–7792)。本发明以此为基础，经过两轮高通量叠加筛选，获得一个热稳定性显著提高且催化活性也更高的突变体。
发明内容
本发明内容的目的是提供一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体、编码基因、重组载体、重组菌以及用于D-阿洛酮糖3-差向异构酶催化活性改造的高通量筛选方法。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体，所述突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第56位组氨酸和第277位谷氨酰胺以及293位丝氨酸突变为精氨酸(H56R/Q277R/S293R)。
所述突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还涉及一种编码上述D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体的基因。
本发明还涉及一种携带上述D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体基因的重组载体。
本发明还涉及一种由上述重组载体转化制备的重组菌。
本发明还涉及一种基于与葡萄糖异构酶相偶联的用于D-阿洛酮糖3-差向异构酶稳定性改造的高通量筛选方法，具体步骤为：
步骤一，以DAE编码基因为模板，在0.08mM Mn2+下进行易错PCR，构建DAE的突变体文库，然后将重组菌单菌落挑取至96深孔板中诱导表达，获得含DAE的重组大肠杆菌。
步骤二，离心，菌体用缓冲液重悬，60℃热处理10min后在60℃催化1g/L D-果糖异构化生成D-阿洛酮糖，反应20min后，沸水浴终止反应；将体系温度调至80℃，加入葡萄糖异构酶继续反应30min至平衡，催化残余D-果糖生成D-葡萄糖。
步骤三，结束反应后离心取上清，等体积加入新鲜配置的间苯二酚显色液，沸水浴10min后冷却至室温，480nm处测量吸光值，并从中挑取吸光值增加最多的突变体进行复筛。
作为本发明的优选方案，步骤2)所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶催化质量百分比为10％-30％的D-果糖异构化生成D-阿洛酮糖，葡萄糖异构酶催化剩余D-果糖异构化生成D-葡萄糖至反应平衡的80％以上。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
本发明成功建立了一种用于D-阿洛酮糖3-差向异构酶热稳定性改造的高通量筛选方法，通过该筛选方法，筛选得到一个热稳定性提高的DAE突变体，该突变体与野生型相比，5min热处理的半失活温度从58.9℃提高至66.0℃，60℃热处理温度下半衰期从2.06min增加至19.52min，同时突变体比酶活从野生型的214.6U/mg增加至338.5U/mg。
附图说明
图1：酮糖与显色液反应的标准曲线；
图2：高通量测定方法过程示意图；
图3：DAE与对照组的显色差异图；
图4：D-阿洛酮糖的高效液相色谱标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行描述，但对本发明的保护范围并非仅限于此：
实施例1：D-阿洛酮糖3-差向异构酶重组菌的构建
选取Clostridium cellulolyticum H10来源的DAE(SEQ ID NO.1)，编码基因经过密码子优化后由生物生工基因全合成整合至pUC57载体，利用PCR技术，以生物生工基因合成的pUC57-DAE质粒为模板。DAE-F：5‘-AGCAAATGGGT CGCggatccATGAAACACGGCATCTACTATGC-3‘(SEQ ID NO.3)和DAE-R：5‘-GGAATGCCACAAACACAGCTAAaagcttGCGGCCGCACTCGA-3‘(SEQ ID NO.4)为引物，对DAE基因进行扩增。PCR反应体系(50μL)为：2×PrimerSTAR MaxPremix 25μL，模板DNA(质粒DNA浓度：20ng/ul)1μL，上下游引物各1μL，无菌水22ul。PCR反应条件为：98℃ 5min；98℃ 10s，55℃ 10s，72℃ 5s，循环30次；72℃ 5min。以1％琼脂糖凝胶电泳验证PCR扩增产物，当目的条带大小符合编码SEQ ID NO.1大小时。用PCR产物回收试剂和进行产物回收。Vector-F：5‘-aagcttGCGGCCGCACTCGA-3‘(SEQ ID NO.5)和vector-R：5‘-ggatccGCGACCCATTTGCTGT-3’(SEQ ID NO.6)为引物，对pET28a(+)质粒骨架进行扩增。PCR反应体系(50μL)为：2×PrimerSTAR Max Premix 25μL，模板DNA(质粒DNA浓度：20ng/ul)1μL，上下游引物各1μL，无菌水22ul。PCR反应条件为：98℃ 5min；98℃ 10s，60℃ 5s，72℃ 30s，循环30次；72℃ 5min。以1％琼脂糖凝胶电泳验证PCR扩增产物，当目的条带大小符合编码SEQ ID NO.1大小时。用PCR产物回收试剂和进行产物回收。将纯化后的DAE基因插入片段与质粒pET-28a(+)骨架片段按照2：1(目的基因：质粒)进行无缝克隆重组。接着，通过热激法将重组产物转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-DAE.
实施例2：D-阿洛酮糖3-差向异构酶热稳定性改造高通量筛选方法的建立。
己酮糖在浓盐酸的作用下共热脱水形成羟甲基化合物，间苯二酚与羟甲基糖醛加热条件下结合生成鲜红色化合物，相同条件下己醛糖如葡萄糖则不发生显色反应。因此将该显色法作为高通量筛选的检测方法。为确保筛选过程的灵敏性以及准确性，配制了D-果糖与D-阿洛酮糖1：1的混合酮糖溶液，稀释混糖溶液，控制总酮糖浓度范围从0.2g/L到1.0g/L，与显色液1：1(v/v)混匀，沸水浴10min后冷却至室温，用纯水与显色液的反应液进行基线校零，在480nm处检测吸光度，测定标准曲线。酮糖与显色液反应的标准曲线见图1。
D-果糖与D-阿洛酮糖属于己酮糖，无法直接用间苯二酚显色法进行区分。结束DAE的催化反应后，反应体系中引入葡萄糖异构酶(XI)催化残余D-果糖可逆生成D-葡萄糖。以野生型DAE为例对该高通量筛选方法的过程说明如图2。从D-果糖到D-阿洛酮糖的转化首先由DAE进行可逆催化，对于野生型DAE，D-果糖和D-阿洛酮糖之间的平衡比为68:32左右。完成DAE催化反应后剩余的果糖含量约为68％，而在添加有等量灭活DAE的对照组中未观察到D-果糖含量的变化。将两组反应沸水浴10分钟彻底灭活DAE，添加等量XI到两组反应液中，将剩余的D-果糖转化为D-葡萄糖。反应在80℃下水浴反应足够时间，直至D-葡萄糖和D-果糖之间的平衡达到55:45的平衡状态。与添加了非活性DAE的对照组相比，活性DAE组中残留的果糖量较少，产生的D-葡萄糖量也较少。DAE催化至反应平衡，体系中再加入XI反应至平衡后，DAE体系中的酮糖与对照反应中的酮糖之比理论上约为63:45，在加入XI后开始反应的不同时间点取样进行检测，活性DAE组的OD480比对照组高约16％，并在20分钟后达到稳定状态，DAE组与对照组加入XI后反应一定时间的显色差异见图3。表明DAE/XI双酶系统可有效检测DAE的活性。最终确定反应体系为：100μL的预混液含有50mMPBS(pH8.0)、0.15mMCoCl2、0.2mMMnCl2和1.5g/LD-果糖，加入50μL经过60℃热处理10min的细胞重悬液，60℃反应20min，催化约20％D-果糖为D-阿洛酮糖，沸水浴10min终止反应。体系温度调至80℃，加入50μLXI酶液，继续在80℃反应30min。结束反应后，5000rpm离心5min，取100μL上清液，与100μL间苯二酚显色液混匀，沸水浴10min，冷却至室温，于480nm测吸光值。
间苯二酚的酚羟基容易被氧化，因此显色液需要在使用前新鲜配制。显色液的组成为5M盐酸和2g/L间苯二酚溶液。
实施例3：突变体文库的构建与高通量筛选
以野生型DAE编码基因为模板，在0.04mM、0.06mM、0.08mM、0.1mM Mn2+下进行易错PCR建库，分别随机挑取10个单菌落进行测序，发现当Mn2+浓度为0.08mM时，碱基突变率满足易错PCR建库要求(表1)。用高通量筛选方法对该突变体库初筛，获得13个OD480比对照组至少高0.2的突变体。对这13个突变体进行复筛，最终获得2个热稳定性比野生型DAE明显提高的突变体(H56R和Q277R)。
表1 PCR体系中Mn2+浓度与突变率的关系
实施例4：DAE的两点突变
以突变体(H56R)中提取的质粒pET-28a(+)-DAE-H56R为模板，以Q277R-F：5‘-TGGATCGTGAAGCGCgGGCGGCGCTGGATTTCTCTC-3‘(SEQ ID NO.7)和5’-CGCGCTTCACGATCCAGCATTTTTTC-3‘(SEQ ID NO.8)为引物，进行全质粒PCR扩增(98℃ 5min；98℃ 10s，60℃ 5s，72℃ 40s，循环30次；72℃ 5min)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证后用限制酶DpnⅠ对模板进行消化，再通过热激法将消化后的产物转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，获得稳定性与酶活具正向叠加效果的两点突变的重组菌。
实施例5：DAE两点突变的迭代高通量筛选
以DAE两点突变体的编码基因为模板，在0.08mM Mn2+下再次进行易错PCR建库，用高通量筛选方法对该突变体库初筛，获得1个比DAE两点突变体对照组至少高0.2的突变体，对该突变体进行复筛，最终获得1个稳定性进一步提高的三点突变体(H56R/Q277R/S293R)。三点突变体H56R/Q277R/S293R的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
实施例6：野生型DAE和突变体的诱导表达
将DAE野生型重组菌和突变体重组菌分别加入到5mL含50ug/mL卡那霉素的LB培养基(1％蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母提取物，pH 7.0)中，37℃、220rpm培养12h。再按照2％的接种量，转接1mL至50mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中。待菌体浓度(OD600)达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，30℃、220rpm培养12h。4℃、6000×g离心10min收集菌体，用50mM pH8.0的PBS缓冲液离心重悬3次后，使OD600浓缩为10。接着，将重选的菌体置于冰水浴中超声破胞。
取破胞液上清上样至Ni-NTA亲和柱(购于上海生工生物工程技术服务有限公司)，用裂解液平衡柱成分，用洗杂液(50mM PBS，500mMNaCl，60mM咪唑，pH8.0)洗去杂质，用洗脱液(50mM PBS，500mMNaCl，260mM咪唑，pH8.0)洗脱目的蛋白，获得纯酶液。
实施例7：野生型DAE和突变体的比酶活测定
酶活的测定方法：总体积为1mL的反应体系中含有50mMPBS(pH8.0)、300mMD-果糖、0.1mMCo2+和0.5μM纯酶液，60℃水浴反应5min，沸水浴10min的方式终止酶反应。4℃、13000rpm离心10min后，用高效液相色谱法测定上清液D-阿洛酮糖浓度。1个单位酶活(1U)被定义为每分钟转化生成1μmol D-阿洛酮糖的酶量。
高效液相色谱法：采用Aminex HPX-87C Column(300×7.8mm,Bio-Rad)色谱柱，以纯水为流动相，流动相流速为0.6ml/min，柱温72℃，进样量20μL，采用Shimadzu RID-10A折光示差检测器。D-阿洛酮糖的标准曲线如图4。
用PierceTM BCA Protein Assay Kit测量蛋白质浓度后，计算野生型DAE和突变体的比酶活，结果见表2。
表2野生型DAE和突变体的比酶活
由表2可见，三点突变体H56R/Q277R/S293R比酶活相比野生型DAE显著提高。
实施例8：野生型DAE和突变体的动力学参数测定
野生型DAE和突变体的动力学参数测定方法：从50mM至800mM不同浓度的D-果糖作为反应底物，通过测定0.1mMCo2+的50mMPBS(pH8.0)体系中D-阿洛酮糖在DAE催化作用下的产生速率。所有数据均通过对Michaelis-Menten方程的非线性回归进行拟合，以确定野生型和变体的Km和kcat。野生型DAE和突变体的动力学参数见表3。
表3野生型DAE和突变体的动力学参数
实施例9：野生型DAE和突变体的半失活温度测定
DAE的热稳定性通过测定其半失活温度T50 5来进行评价。将野生型DAE和突变体的纯酶溶液分别在50℃、55℃、60℃、65℃、70℃和75℃的水浴条件下孵育5min后，冰浴2min，然后室温恢复10min，测定酶活，与热处理前初始酶活相比即为残余酶活，当酶活降低到初始酶活的一半，即经过5min热处理后残余酶活为50％所对应的温度为DAE的半失活温度T50 5。野生型DAE和突变体的T50 5结果见表4。
表4野生型DAE和突变体的T50 5
由表格可见，三点突变体H56R/Q277R/S293R半失活温度T50 5相比野生型DAE显著提高。
实施例10：野生型DAE和突变体的半衰期分析
DAE的热稳定性也通过其在55℃与60℃下的半衰期来进行评价。将野生型DAE和突变体的纯酶液在55℃或60℃的温度下孵育，间隔一定时间后取样，冰浴2min，然后室温恢复10min，测定酶活。残余酶活为50％所用的时间为DAE在该温度下的半衰期。野生型DAE和突变体的半衰期结果见表5。
表5野生型DAE和突变体的半衰期
由表格可见，三点突变体H56R/Q277R/S293R比半衰期比野生型DAE显著增加。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶的热稳定性突变体及其高通量筛选方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 293
<212> PRT
<213> 解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)
<400> 1
Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ala Tyr Trp Glu Gln Glu Trp Glu Ala
1 5 10 15
Asp Tyr Lys Tyr Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile
20 25 30
Leu Glu Ile Ala Ala Ser Pro Leu Pro Phe Tyr Ser Asp Ile Gln Ile
35 40 45
Asn Glu Leu Lys Ala Cys Ala His Gly Asn Gly Ile Thr Leu Thr Val
50 55 60
Gly His Gly Pro Ser Ala Glu Gln Asn Leu Ser Ser Pro Asp Pro Asp
65 70 75 80
Ile Arg Lys Asn Ala Lys Ala Phe Tyr Thr Asp Leu Leu Lys Arg Leu
85 90 95
Tyr Lys Leu Asp Val His Leu Ile Gly Gly Ala Leu Tyr Ser Tyr Trp
100 105 110
Pro Ile Asp Tyr Thr Lys Thr Ile Asp Lys Lys Gly Asp Trp Glu Arg
115 120 125
Ser Val Glu Ser Val Arg Glu Val Ala Lys Val Ala Glu Ala Cys Gly
130 135 140
Val Asp Phe Cys Leu Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn Tyr Leu Ile
145 150 155 160
Asn Thr Ala Gln Glu Gly Val Asp Phe Val Lys Gln Val Asp His Asn
165 170 175
Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp
180 185 190
Ser Ile Gly Gly Ala Ile Arg Thr Ala Gly Ser Tyr Leu Gly His Leu
195 200 205
His Thr Gly Glu Cys Asn Arg Lys Val Pro Gly Arg Gly Arg Ile Pro
210 215 220
Trp Val Glu Ile Gly Glu Ala Leu Ala Asp Ile Gly Tyr Asn Gly Ser
225 230 235 240
Val Val Met Glu Pro Phe Val Arg Met Gly Gly Thr Val Gly Ser Asn
245 250 255
Ile Lys Val Trp Arg Asp Ile Ser Asn Gly Ala Asp Glu Lys Met Leu
260 265 270
Asp Arg Glu Ala Gln Ala Ala Leu Asp Phe Ser Arg Tyr Val Leu Glu
275 280 285
Cys His Lys His Ser
290
<210> 2
<211> 293
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ala Tyr Trp Glu Gln Glu Trp Glu Ala
1 5 10 15
Asp Tyr Lys Tyr Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile
20 25 30
Leu Glu Ile Ala Ala Ser Pro Leu Pro Phe Tyr Ser Asp Ile Gln Ile
35 40 45
Asn Glu Leu Lys Ala Cys Ala Arg Gly Asn Gly Ile Thr Leu Thr Val
50 55 60
Gly His Gly Pro Ser Ala Glu Gln Asn Leu Ser Ser Pro Asp Pro Asp
65 70 75 80
Ile Arg Lys Asn Ala Lys Ala Phe Tyr Thr Asp Leu Leu Lys Arg Leu
85 90 95
Tyr Lys Leu Asp Val His Leu Ile Gly Gly Ala Leu Tyr Ser Tyr Trp
100 105 110
Pro Ile Asp Tyr Thr Lys Thr Ile Asp Lys Lys Gly Asp Trp Glu Arg
115 120 125
Ser Val Glu Ser Val Arg Glu Val Ala Lys Val Ala Glu Ala Cys Gly
130 135 140
Val Asp Phe Cys Leu Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn Tyr Leu Ile
145 150 155 160
Asn Thr Ala Gln Glu Gly Val Asp Phe Val Lys Gln Val Asp His Asn
165 170 175
Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp
180 185 190
Ser Ile Gly Gly Ala Ile Arg Thr Ala Gly Ser Tyr Leu Gly His Leu
195 200 205
His Thr Gly Glu Cys Asn Arg Lys Val Pro Gly Arg Gly Arg Ile Pro
210 215 220
Trp Val Glu Ile Gly Glu Ala Leu Ala Asp Ile Gly Tyr Asn Gly Ser
225 230 235 240
Val Val Met Glu Pro Phe Val Arg Met Gly Gly Thr Val Gly Ser Asn
245 250 255
Ile Lys Val Trp Arg Asp Ile Ser Asn Gly Ala Asp Glu Lys Met Leu
260 265 270
Asp Arg Glu Ala Arg Ala Ala Leu Asp Phe Ser Arg Tyr Val Leu Glu
275 280 285
Cys His Lys His Arg
290
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agcaaatggg tcgcggatcc atgaaacacg gcatctacta tgc 43
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggaatgccac aaacacagct aaaagcttgc ggccgcactc ga 42
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aagcttgcgg ccgcactcga 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggatccgcga cccatttgct gt 22
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tggatcgtga agcgcgggcg gcgctggatt tctctc 36
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgcgcttcac gatccagcat tttttc 26

Claims (6)

1.一种热稳定性提高的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体，其特征在于，所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体是将如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第56位组氨酸、第277位谷氨酰胺和第293位丝氨酸都突变为精氨酸。
2.一种编码如权利要求1所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体的基因。
3.一种如权利要求2所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体的编码基因构建的重组载体。
4.一种如权利要求3所述重组载体转化制备的重组菌。
5.一种基于与葡萄糖异构酶相偶联用于D-阿洛酮糖3-差向异构酶热稳定性改造的高通量筛选方法，其特征在于，包括如下步骤为：
1）以D-阿洛酮糖3-差向异构酶（DAE）编码基因为模板进行易错PCR，构建DAE的突变体文库；然后重组菌单菌落挑取至96深孔板中诱导表达，获得含DAE的重组大肠杆菌；
2）离心，菌体用缓冲液重悬，60℃热处理后用以催化D-果糖生成D-阿洛酮糖，催化反应一段时间后，沸水浴终止反应；将体系温度调到80℃，加入葡萄糖异构酶催化剩余D-果糖异构化生成D-葡萄糖；
3）反应至达到平衡后，加入间苯二酚显色液，沸水浴显色，冷却至室温，480 nm处测定吸光值，并从中挑取吸光值增量最多的突变体进行复筛。
6.如权利要求5所述的高通量筛选方法，其特征在于，步骤2）所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶催化质量百分比为10%-30%的D-果糖异构化生成D-阿洛酮糖，葡萄糖异构酶催化剩余D-果糖异构化生成D-葡萄糖至平衡的80%以上。
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