CN113151240B

CN113151240B - 一种葡萄糖异构酶、突变体及其编码基因与应用

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Publication number: CN113151240B
Application number: CN202110559008.1A
Authority: CN
Inventors: 金利群; 金怡婷; 柳志强; 贾东旭; 郑裕国
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2021-05-21
Filing date: 2021-05-21
Publication date: 2022-11-04
Anticipated expiration: 2041-05-21
Also published as: CN113151240A

Abstract

本发明涉及一种葡萄糖异构酶及其突变体，以及其编码基因，以及其在微生物催化D‑葡萄糖异构化制备高果糖浆F‑55中的应用。本发明提供的高效表达耐高温葡萄糖异构酶的重组大肠杆菌，解决了一般的耐高温葡萄糖异构酶生产高果糖浆F‑55反应温度过高的问题；应用该菌种生产葡萄糖异构酶具有产量高、工艺简单、周期短、便于工业化应用等优点，该菌株可直接用于高果糖浆F‑55的生产，而不需要细胞破碎；发酵培养结束后在80℃条件下对D‑葡萄糖的总酶活达到606.8U/g，D‑葡萄糖的转化率达到67.3％，80℃下保温24h残余酶活为75％，反应平衡时间为2.5h，这为高果糖浆F‑55的工业化大规模生产提供了良好的技术支持。

Description

一种葡萄糖异构酶、突变体及其编码基因与应用

(一)技术领域

本发明涉及一种葡萄糖异构酶及其突变体，以及其编码基因，以及其在微生物催化D-葡萄糖异构化制备高果糖浆F-55中的应用。

(二)背景技术

葡萄糖异构酶(Glucose isomerase，GI，EC 5.3.1.5)，又称木糖异构酶(Xyloseisomerase，XI)，在体内可以将D-木糖异构化生成D-木酮糖，可以将腐烂的植物体降解为腐生菌可以吸收的糖类，此外，还可以用于半纤维素的生物转化制备燃料乙醇。在体外葡萄糖异构酶主要用将D-葡萄糖异构化生成D-果糖，是生物酶法制备高果糖浆的关键酶，也是工业上最重要的酶之一。

高果糖浆(HFCS)是D-葡萄糖和D-果糖的混合物，也称果葡糖浆，是一种天然的甜味剂，也是一种新发展起来的淀粉糖产品。HFCS比蔗糖具有更好的稳定性和溶解度、更高的甜度和更低的价格等优势逐渐取代蔗糖，成为主流的甜味剂，已经广泛应用于食品与医药等行业，尤其是在软饮料行业深受消费者喜爱。HFCS根据果糖含量可分为三类：F-42，F-55和F-90。F-90主要是通过F-42分离、浓缩、纯化制得，基本不直接作为添加剂使用，一般用于制备F-55。F-55一般是由F-90与F-42混合制成。自从上世纪六十年代作为一种甜味剂问世以来，高果糖浆的应用领域不断扩大导致其市场需求逐年增加。目前制备高果糖浆的主要方法为化学法和生物酶法。其中葡萄糖异构酶生物转化生产F-42依旧是市场上高果糖浆的主要来源。

葡萄糖异构酶使D-葡萄糖异构化为D-果糖是一个热力学平衡反应。葡萄糖异构酶(第一类GI)一般在高于60℃左右时，催化活性降低，转化率最高达42％-45％，因此只能用来制备F-42。而耐高温葡萄糖异构酶(第二类GI)，可将反应温度提高至80℃以上，促进D-葡萄糖向D-果糖转化，从而将转化率提高提高到55％以上，直接生产F-55。

目前已经有许多的耐高温葡萄糖异构酶报道，例如来自放线菌(Actinomycetechainia sp.NCIM 2960)的葡萄糖异构酶最适反应温度60℃；来自Caldicoprobacteralgeriensis的葡萄糖异构酶最适反应温度为90℃，在100℃的半衰期为6min；来自Thermotoga maritima的葡萄糖异构酶最适反应温度为105-110℃，是目前报道的反应温度最高的葡萄糖异构酶，在120℃半衰期为10min，在80℃半衰期超过24h。目前比较成熟的是60-65℃的HFCS生产工艺，以嗜热菌为催化剂的大规模生产对设备要求高，且它们在高温下的热稳定性和重复使用性较差，因此通过基因工程技术构建酶活性好热稳定性好的基因工程菌在F-55的制备中具有重要意义。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种葡萄糖异构酶及其突变体和编码基因，以及其在催化D-葡萄糖异构化制备高果糖浆F-55型产品中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种葡萄糖异构酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

编码所述葡萄糖异构酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还涉及一种葡萄糖异构酶突变体，由序列如SEQ ID NO.2所示的氨基酸经单突变或双突变获得，所述单突变或双突变的突变位点为：第38位，第130位，第137位，第218位，第229位，第278位，第299位，第316位或第367位氨基酸。

优选的，所述葡萄糖异构酶突变体为下列之一：(1)SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第38位的亮氨酸突变为甲硫氨酸(即突变体TEGI-M-L38M)；(2)SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第130位的亮氨酸突变为甲硫氨酸(即突变体TEGI-M-L130M)；(3)SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第137位的缬氨酸突变为亮氨酸(即突变体TEGI-M-V137L)；(4)SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第218位的谷氨酸突变为天冬氨酸(即突变体TEGI-M-E218D)；(5)SEQ IDNO.2所示氨基酸序列的第229位的亮氨酸突变为苯丙氨酸(即突变体TEGI-M-L229F)；(6)SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第278位的天冬氨酸突变为苏氨酸(即突变体TEGI-M-D278T)；(7)SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第299位的甲硫氨酸突变为谷氨酰胺(即突变体TEGI-M-M299Q)；(8)SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第316位的精氨酸突变为酪氨酸(即突变体TEGI-M-R316Y)；(9)SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第367位的苯丙氨酸突变为亮氨酸(即突变体TEGI-M-F367L)；(10)SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第38位的亮氨酸突变为甲硫氨酸，同时第137位的缬氨酸突变为亮氨酸(即突变体TEGI-M-L38M/V137L)。

更为优选的，所述葡萄糖异构酶突变体为下列之一：(1)SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第38位的亮氨酸突变为甲硫氨酸(即突变体TEGI-M-L38M，核苷酸序列为SEQ IDNO.3，氨基酸序列为SEQ ID NO.4)；(3)SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第137位的缬氨酸突变为亮氨酸(即突变体TEGI-M-V137L，，核苷酸序列为SEQ ID NO.5，氨基酸序列为SEQ IDNO.6)；(10)SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第38位的亮氨酸突变为甲硫氨酸，同时第137位的缬氨酸突变为亮氨酸(即突变体TEGI-M-L38M/V137L，核苷酸序列为SEQ ID NO.7，氨基酸序列为SEQ ID NO.8)。

由于氨基酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.6，SEQ IDNO.8所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在95％以上，均属于本发明保护范围之列。所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

本发明还涉及编码所述葡萄糖异构酶突变体的基因。

由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.5，SEQ IDNO.7所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有95％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的等位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变编码氨基酸的功能。

本发明还涉及含有权利要求所述编码所述葡萄糖异构酶或其突变体的基因的重组菌。

本发明还涉及所述葡萄糖异构酶及其突变体在微生物催化D-葡萄糖异构化制备高果糖浆F-55中的应用。构建含有所述葡萄糖异构酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，将培养液分离得到含葡萄糖异构酶的菌体细胞，即可作为酶源用于微生物催化D-葡萄糖异构化制备高果糖浆F-55。

具体的，所述应用为：以含葡萄糖异构酶或其突变体基因的重组基因工程菌经发酵诱导培养获得的湿菌体为酶源，以D-葡萄糖为底物，以镁离子和钴离子为助催剂，以超纯水为反应介质，在75～85℃、100～200r/min条件下反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得高果糖浆F-55。

所述反应体系中，湿菌体用量为50～150g/L，镁离子终浓度为5～25mM，钴离子终浓度为0.1～5mM，底物初始浓度为50～500g/L。

所述湿菌体按如下方法制备获得：将含葡萄糖异构酶或其突变体基因的重组基因工程菌接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min培养至OD₆₀₀＝0.8～1.0，获得种子液；种子液以体积浓度1～5％的接种量转入含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、150r/min培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8，添加终浓度0.1mM的IPTG，于28℃、150r/min诱导培养10～12h，获得诱导培养菌悬液，将诱导培养菌悬液离心，收集得到湿菌体。

本发明所述葡萄糖异构酶突变体的筛选、表达及酶活测定方法为(以突变体L38M/V137L为例)：

(1)重组菌的筛选：所述重组表达质粒pET-28b-TEGI-M上带有卡那霉素抗性基因，如果重组质粒已经转化到大肠杆菌中，重组菌株具有卡那霉素抗性，能够在含有50μg/mL卡那霉素的平板上生长；挑取阳性转化子，即为葡萄糖异构酶重组菌Bl21(DE3)/pET-28b-TEGI-M。

(2)葡萄糖异构酶突变体表达菌株的构建

以重组菌Bl21(DE3)/pET-28b-TEGI-M的质粒为模板，连续进行两轮突变PCR，将第38位的亮氨酸突变为甲硫氨酸，将第137位的缬氨酸突变为亮氨酸，突变质粒经Dpn I消化后转入大肠杆菌中，重组菌株具有卡那霉素抗性，能够在含有50μg/mL卡那霉素的平板上生长，挑取阳性转化子测序，序列显示成功突变38位点和137位点，即为葡萄糖异构酶突变体菌Bl21(DE3)/pET-28b-TEGI-L38M/V137L。

(3)重组突变体菌经培养表达葡萄糖异构酶

LB液体培养基(g/L)组成：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，溶剂为超纯水，pH为7.0；LB固体培养基添加20g/L琼脂；高压灭菌；使用前添加终浓度50μg/mL卡那霉素。

将葡萄糖异构酶突变体菌接种至终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，试管，装液量为10mL，培养温度37℃、摇床转速200r/min，培养至OD₆₀₀＝0.8-1.0，获得种子液；种子液以体积浓度1％的接种量转入装有100mL终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基的500mL锥形瓶中，于37℃、150r/min条件下培养2～3h(OD₆₀₀＝0.6～0.8)，添加终浓度0.1mMIPTG，之后于28℃、150r/min诱导培养11h，获得诱导培养菌悬液。

(4)葡萄糖异构酶酶活与转化率测定

取诱导培养液，4℃、8000r/min、离心10min，然后放入冰箱-20℃冰冻备用。将0.5g菌体溶于10mL磷酸钠盐缓冲溶液(pH 6.5)中，加入转子在磁力搅拌器上充分混匀悬浮菌体，加入终浓度1mM Co²⁺、终浓度10mM Mg²⁺和终浓度100g/L的D-葡萄糖，在80℃、150rpm条件下在反应10min和2.5h时取样，冰浴5min终止反应，12000r/min离心1min，取上清稀释10倍；采用HPLC检测D-葡萄糖和D-果糖的浓度。分析柱为AminexR HPX-87H柱(300×7.8mm)，Agilent G7162A示差折光检测器，Agilent G7110B泵，Agilent G7129A进样器。酶活(U)定义为在该条件下每分钟生成1μmol D-果糖所需酶量；比酶活单位为U/g菌体；转化率(％)定义为反应2.5h取样时D-果糖浓度与D-葡萄糖初始投放量的比例。

本发明所述的葡萄糖异构酶和突变体都能够耐受高温80～90℃，且在底物浓度为100g/L、反应温度80℃时，葡萄糖异构酶的酶活达到372.5U/g，转化率达到53.1％；葡萄糖异构酶突变体的酶活达到606.8U/g，转化率达到67.3％。

本发明的有益效果主要体现在：本发明葡萄糖异构酶高效表达耐高温(80～90℃)，解决了一般的耐高温葡萄糖异构酶生产高果糖浆F-55反应温度过高的问题；构建重组菌生产葡萄糖异构酶具有产量高、工艺简单、周期短、便于工业化应用等优点，重组菌可直接用于高果糖浆F-55的生产，而不需要细胞破碎；发酵培养结束后在80℃条件下对D-葡萄糖的总酶活达到606.8U/g，D-葡萄糖的转化率达到67.3％，这为高果糖浆F-55的工业化大规模生产提供了良好的技术支持。

(四)附图说明

图1为TEGI-M的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。M：DNA Marker；1：定点突变PCR产物。

图2为突变葡萄糖异构酶表达的SDS-PAGE图。M：蛋白分子量Marker；1：TEGI-M；2：TEGI-M-L38M；3：TEGI-M-V137L；4：TEGI-M-L38M/V137L。

图3为TEGI-M及其突变体TEGI-M-L38M/V137L的热稳定性。突变体TEGI-M-L38M/V137L在80℃下保温24h后剩余75％的酶活，为原始的TEGI-M的1.2倍。

图4为TEGI-M及其突变体TEGI-M-L38M/V137L催化D-葡萄糖异构化为D-果糖的反应进程。突变体TEGI-M-L38M/V137L在2.5h内使催化达到平衡，转化率达到67.3％，原始的TEGI-M转化率仅为53％。

(五)具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面将结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，该实施例仅用于解释本发明，并不对本发明的保护范围构成限定。

实施例1：葡萄糖异构酶单位点突变体的构建

将实验室保存的含葡萄糖异构酶TEGI-W139F/V186T(命名为TEGI-M)的菌株从-80℃超低温冰箱中取出，在含有50μg/mL卡那霉素的平板上三区划线，37℃培养14h，挑取单菌落，37℃、150r/min振荡培养过夜，提取质粒，送北京擎科生物有限公司进行测序，葡萄糖异构酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

将提取的质粒pET-28(b)-TEGI-W139F/V186T，以质粒pET-28(b)-TEGI-W139F/V186T作为模板，根据亲本序列设计9对定点突变的突变引物L38M-F：5’-CATCGATGGCAAACCTATGAAAGAACATC-3’和L38M-R：5’-GAGAAACGAAGATGTTCTTTCATAGGTTTGCCAT-3’，L130M-F：5’-TATGATCAAAGATTACATGAAAACATCTAAAA CAAAAGT-3’和L130M-R：5’-TTAGATGTTTTCATGTAATCTTTGATCATAGCAACGA-3’,V137L-F：5’-AAACAAAACTTCTTTTCGGCACAGCTAACCTTTT-3’和V137L-R：5’-CCGAAAAGAAGTTTTGTTTTAGATGTTTTAAGGT-3’，E218D-F：5’-CGTTTCCTTCACAT GGCTGTTGATTACGCTAAAGAA-3’和E218D-R：5’-TCGAAGCCGATTTCTTTAGCGTAA TCAACAGCCATG-3’，L229F-F：5’-AGAAATCGGCTTCGAAGGCCAATT CCTTATCGAAC CT-3’和L229F-R：5’-CTTTAGGTTTAGGTTCGATAAGGAATTGGCCTTCG-3’，D278T-F：5’-ACCATGCTACACTTGCTGGCCATACATTCCAACATGAACT-3’和D278T-R：5’-GCGTAACGAAGTTCATGTTGGAATGTATGGCCAGCAA-3’，M299Q-F：5’-TGGCTCTATCGATGC TAACCAAGGCGATATGCT-3’和M299Q-R：5’-CCAGCCAAGAAGCATATCGCCTTGGTTA GCATCG-3’，R316Y-F：5’-ATCAATTCCCTACAGATATCTACATGACAACACTT-3’和R316Y-R：5’-TTCGTACATAGCAAGTGTTGTCATGTAGATATCTGTAGG-3’，F367L-F：5’-TGGATGCGTTCGCTAAAGGCCTTGAAGTTGCT-3’和F367L-R：5’-AGTTTGTAAGCAACTTCAAGGCCTTTAGCG-3’，(下划线为突变碱基)利用快速PCR技术进行第一轮突变。

PCR反应体系(50μL)为：2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTPs(mix)1μL；模板DNA 1μL；上下游引物各1μL；DNA聚合酶1μL；无菌水20μL。PCR反应程序为95℃预变性5min；30个循环(95℃变性10s，55-60℃退火15s，72℃延伸5.5min)；72℃延伸10min，最后16℃保温，PCR产物以0.9％琼脂糖凝胶电泳验证，结果扩增到与目的载体大小相符的基因片段(鉴定结果见图1)。

PCR产物经过Dpn I 37℃酶切模板3h后，转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，转化方法为：取PCR产物5μL，加入到100μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，充分混匀后，冰浴30min；将装有混合物的Ep管置于42℃水浴90s，然后立即冰浴3min；向管内加入800μLLB液体培养基，置于37℃、200r/min恒温摇床上培养2h，然后涂布于含有50μg/mL卡那霉素的平板上，37℃培养14h。挑单克隆进行菌落PCR验证，验证为阳性克隆的菌株接种于LB培养基(含有50μg/mL卡那霉素)8h后提取质粒，送北京北京擎科生物有限公司进行测序，测序结果正确，构建的单位点突变体葡萄糖异构酶分别命名为TEGI-M-L38M，TEGI-M-L130M，TEGI-M-V137L，TEGI-M-E218D，TEGI-M-L229F，TEGI-M-D278T，TEGI-M-M299Q，TEGI-M-R316Y，TEGI-M-F367L。

实施例2：葡萄糖异构酶双位点突变体的构建

将实施例1中提取的质粒pET-28(b)-TEGI-W139F/V186T，以质粒pET-28(b)-TEGI-W139F/V186T作为模板，根据亲本序列设计点突变的突变引物L38M-F：5’-CATCGATGGCAAACCTATGAAAGAACATC-3’和L38M-R：5’-GAGAAACGAAGATGTTCTTTCATAGGTTTGCCAT-3’，(下划线为突变碱基)利用快速PCR技术进行第一轮突变。再以引入L38M突变点为模板进行第二轮突变，引物为V137L-F：5’-AAACAAAACTTCTTTTCGGCACAGCTAACCTTTT-3’和V137L-R：5’-CCGAAAAGAAGTTTTGTTTTAGATGTTTTA AGGT-3’。PCR反应体系(50μL)为：2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTPs(mix)1μL；模板DNA 1μL；上下游引物各1μL；DNA聚合酶1μL；无菌水20μL。PCR反应程序为95℃预变性5min；30个循环(95℃变性10s，55-60℃退火15s，72℃延伸5.5min)；72℃延伸10min，最后16℃保温，PCR产物以0.9％琼脂糖凝胶电泳验证，结果扩增到与目的载体大小相符的基因片段(鉴定结果见图1)。

PCR产物经过Dpn I 37℃酶切模板3h后，转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，转化方法为：取连接产物5μL，加入到100μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，充分混匀后，冰浴30min；将装有混合物的Ep管置于42℃水浴90s，然后立即冰浴3min；向管内加入800μLLB液体培养基，置于37℃、200r/min恒温摇床上培养2h，然后涂布于含有50μg/mL卡那霉素的平板上，37℃培养14h。挑单克隆进行菌落PCR验证，验证为阳性克隆的菌株接种于LB培养基(含有50μg/mL卡那霉素)8h后提取质粒，送北京北京擎科生物有限公司进行测序，测序结果正确，构建的双位点突变体葡萄糖异构酶命名为TEGI-M-L38M/V137L。

实施例3：重组大肠杆菌的表达

将实施例1中的葡萄糖异构酶TEGI-M菌株接种至10mL LB液体培养基中(含终浓度50μg/mL卡那霉素)，37℃、200r/min培养至OD₆₀₀＝0.8-1.0，获得种子液；种子液以体积浓度1％的接种量转入新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素的100mL LB液体培养基中，于37℃、150r/min培养至菌体浓度OD₆₀₀＝0.6-0.8，添加终浓度0.1mM IPTG，之后于28℃、150r/min诱导培养11h。

诱导培养11h后，将0.5g菌体沉淀悬浮于10mL磷酸钠盐缓冲液(pH 6.5)中，超声破碎(超声1s，暂停2s，30min)，离心后经镍柱纯化蛋白，纯化后在磷酸钠盐缓冲液(pH 6.5)中过夜透析，取10μL透析液，加10μL SDS缓冲液混合，沸水浴加热5min，取5μL进行SDS-PAGE电泳分析，以TEGI-M为对照，得到一条分子量约52kDa的蛋白条带。

实施例4：葡萄糖异构酶及其突变体的酶活测定

将实施例1单位点突变体葡萄糖异构酶TEGI-M-L38M，TEGI-M-L130M，TEGI-M-V137L，TEGI-M-E218D，TEGI-M-L229F，TEGI-M-D278T，TEGI-M-M299Q，TEGI-M-R316Y，TEGI-M-F367L，实施例2中的双位点突变体葡萄糖异构酶TEGI-M-L38M/V137L分别按照实施例3中的方法进行诱导表达，同时测定该重组菌及突变体菌对D-葡萄糖的酶活。

酶活测定方法为：取诱导培养液，4℃、8000r/min离心10min，将0.5g菌体沉淀悬浮于10mL磷酸钠盐缓冲液(pH 6.5)中，加入终浓度1mM Co²⁺、终浓度10mM Mg²⁺和终浓度100g/L的D-葡萄糖，在80℃条件下反应10min，冰浴5min终止反应，取1mL反应液12000r/min离心1min，取上清，稀释10倍后，0.22μm水膜过滤后用HPLC液相色谱仪检测D-葡萄糖和D-果糖的浓度。分析柱为AminexR HPX-87H柱(300×7.8mm)，Agilent G7162A示差折光检测器，Agilent G7110B泵，Agilent G7129A进样器。

酶活单位定义：在80℃，pH 6.5条件下，1min内催化D-葡萄糖异构化为1μmol D-果糖所需要的酶量定义为1U。葡萄糖异构酶的比酶活以每g湿菌体所含有的酶活力单位表示(U/g)，结果见表1。葡萄糖异构酶双位点突变体TEGI-M-L38M/V137L活力是葡萄糖异构酶的2.0倍，达到606.8U/g。

表1：葡萄糖异构酶及其突变体酶活力

酶的名称	比酶活(U/g)	倍数
			TEGI-M	353.4	1.0
TEGI-M-L38M	565.4	1.6
			TEGI-M-L130M	282.7	0.8
TEGI-M-V137L	583.1	1.6
			TEGI-M-E218D	282.6	0.8
TEGI-M-L229F	247.4	0.7
			TEGI-M-D278T	176.7	0.5
TEGI-M-M299Q	246.3	0.7
			TEGI-M-R316Y	248.2	0.7
TEGI-M-F367L	212.1	0.6
			TEGI-M-L38M/V137L	606.8	1.7

实施例5：葡萄糖异构酶及其突变体的动力学常数测定

将实施例1单位点突变体葡萄糖异构酶TEGI-M-L38M，TEGI-M-V137L，实施例2中的双位点突变体葡萄糖异构酶TEGI-M-L38M/V137L分别按照实施例3中的方法进行诱导表达。诱导培养11h后，8000r/min，10min离心收集菌体，弃上清，用磷酸钠盐缓冲液(pH 6.5)润洗一遍菌体后，同样条件收集菌体。取一定量菌体，按50g菌体/L磷酸钠盐缓冲液(pH 6.5)比例悬浮菌体，磁力搅拌器搅拌均匀后，超声破碎，8000r/min，10min离心，取上清，上清液为粗酶液，经过镍柱纯化，收集得到的纯酶液用于催化底物D-葡萄糖测定动力学常数，纯酶鉴定结果见图2。反应体系如下：D-葡萄糖初始底物浓度为20-400mM，以镁离子(10mM)和钴离子(1mM)为助催剂，以磷酸钠盐缓冲液(pH 6.5)为反应介质，在80℃、150r/min条件下反应10min后，将反应液分离纯化，通过D-果糖的生成量拟合计算出动力学常数。结果见表2。结果显示双位点突变TEGI-M-L38M/V137L对底物亲和力有所提高，催化效率为原始的1.46倍。

表2：葡萄糖异构酶及其突变体酶动力学常数

Mutant	K<sub>m</sub>(mM)	V<sub>max</sub>[μmol·(min·mg)<sup>-1</sup>]
			TEG-M	234.2±4.4	29.2±0.5
TEGI-M-L38M	199.9±1.7	39.8±0.2
			TEGI-M-V137L	112.2±2.8	32.5±0.8
TEGI-M-L38M/V137L	85.9±3.9	42.7±0.7

实施例6：葡萄糖异构酶及其突变体的热稳定性测定

将实施例1中的葡萄糖异构酶TEGI-M，实施例2中的双位点突变体葡萄糖异构酶TEGI-M-L38M/V137L分别按照实施例3中的方法进行诱导表达。诱导培养11h后，8000r/min，10min离心收集菌体，弃上清，用磷酸钠盐缓冲液(pH 6.5)润洗一遍菌体后，同样条件收集菌体。收集湿菌体作为转化用酶，以D-葡萄糖为底物，进行异构化反应制备D-果糖。具体操作如下：在50mL反应瓶中依次加入10mL磷酸钠盐缓冲液(pH 6.5)，0.5g 80℃下不同保温时间(0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、9h、24h)湿菌体、终浓度为100g/L的D-葡萄糖、终浓度10mMMg²⁺和终浓度1mM Co²⁺，在80℃、150r/min条件下反应10min，取1mL反应液12000r/min离心，稀释10倍后，0.22μm水膜过滤后用HPLC液相色谱仪检测D-葡萄糖和D-果糖的浓度并计算残余酶活，结果见图3。分析柱为AminexR HPX-87H柱(300×7.8mm)，Agilent G7162A示差折光检测器，Agilent G7110B泵，Agilent G7129A进样器。酶活单位定义：在80℃，pH 6.5条件下，1min内催化D-葡萄糖异构化为1μmol D-果糖所需要的酶量定义为1U。由图可知，表达的葡萄糖异构酶突变体在80℃的高温条件下保温24h后残余酶活为75％，是原始葡萄糖异构酶的1.2倍。

实施例7：二价金属离子对葡萄糖异构酶及其突变体的影响

将实施例1中的葡萄糖异构酶TEGI-M，实施例3中的双位点突变体葡萄糖异构酶TEGI-M-L38M/V137L分别按照实施例3中的方法进行诱导表达。诱导培养11h后，8000r/min，10min离心收集菌体，弃上清，用磷酸钠盐缓冲液(pH 6.5)润洗一遍菌体后，同样条件收集菌体。收集湿菌体作为转化用酶，以D-葡萄糖为底物，进行异构化反应制备D-果糖。具体操作如下：在50mL反应瓶中依次加入10mL磷酸钠盐缓冲液(pH 6.5)，0.5g湿菌体、终浓度为100g/L的D-葡萄糖、终浓度10mM的各种二价金属离子(Mg²⁺，Co²⁺，Mn²⁺，Zn²⁺，Ni²⁺，Cu²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺和Fe²⁺)，在80℃、150r/min条件下反应10min，取1mL反应液12000r/min离心，稀释10倍后，0.22μm水膜过滤后用HPLC液相色谱仪检测D-葡萄糖和D-果糖的浓度并计算残余酶活，结果见图。分析柱为AminexR HPX-87H柱(300×7.8mm)，Agilent G7162A示差折光检测器，Agilent G7110B泵，Agilent G7129A进样器。酶活单位定义：在80℃，pH 6.5条件下，1min内催化D-葡萄糖异构化为1μmol D-果糖所需要的酶量定义为1U。由表可知，Mg²⁺，Co²⁺对葡萄糖异构酶及其突变体的酶活影响较大，其中，突变体对Ca²⁺的耐受性要大于原始葡萄糖异构酶。

表3：不同二价金属离子对葡萄糖异构酶及其突变体的影响

实施例8：葡萄糖异构酶及其突变体催化D-葡萄糖制备HFCS-55

将实施例1中的葡萄糖异构酶TEGI-M，实施例2中的双位点突变体葡萄糖异构酶TEGI-M-L38M/V137L分别按照实施例3中的方法进行诱导表达。诱导培养11h后，8000r/min，10min离心收集菌体，弃上清，用磷酸钠盐缓冲液(pH 6.5)润洗一遍菌体后，同样条件收集菌体。收集湿菌体作为转化用酶，以D-葡萄糖为底物，进行异构化反应制备D-果糖。具体操作如下：在50mL反应瓶中依次加入10mL磷酸钠盐缓冲液(pH 6.5)，0.5g湿菌体、终浓度为100g/L的D-葡萄糖、终浓度10mM Mg²⁺和终浓度1mM Co²⁺，在80℃、150r/min条件下反应10min，取1mL反应液12000r/min离心，稀释10倍后，0.22μm水膜过滤后用HPLC液相色谱仪检测D-葡萄糖和D-果糖的浓度并计算残余酶活，结果见图。分析柱为AminexR HPX-87H柱(300×7.8mm)，Agilent G7162A示差折光检测器，Agilent G7110B泵，Agilent G7129A进样器。由图4可知，葡萄糖异构酶突变体TEGI-M-L38M/V137L在2.5h内可使催化反应达到平衡，转化率高达67.3％。

由上述实验结果可知，将本发明葡萄糖异构酶突变体TEGI-M-L38M/V137L基因转入大肠杆菌得到的重组大肠杆菌具有较强的产葡萄糖异构酶能力，可直接以含酶的菌体细胞为酶源进行异构化反应，以葡萄糖异构酶突变体作为转化酶源，以D-葡萄糖为底物，可以在高温(80℃)下进行异构化反应生成D-果糖，其转化率达到67.3％，这将有利于HFCS-55的工业化生产。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种葡萄糖异构酶、突变体及其编码基因与应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1343

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

atggtagaat acttcaaaaa cgttcctcaa atcaaatacg aaggccctaa atctaacaac 60

ccttacgctt tcaaattcta caaccctgat gaaatcatcg atggcaaacc tcttaaagaa 120

catcttcgtt tctctgttgc ttactggcat acattcacag ctaacggcac agatcctttc 180

ggcgctccta caatgcaacg tccttgggat catttcacag atcctatgga tatcgctaaa 240

gctcgtgttg aagctgcttt cgaacttttc gaaaaacttg atgttccttt cttctgcttc 300

catgatcgtg atatcgctcc tgaaggcgaa acacttcgtg aaacaaacaa aaaccttgat 360

acaatcgttg ctatgatcaa agattacctt aaaacatcta aaacaaaagt tcttttcggc 420

acagctaacc ttttctctaa ccctcgtttc gttcatggcg ctgctcatct tgcaacgctg 480

atgttttcgc ttacgctgct gctcaagtta aaaaagctct tgaaatcaca aaagaacttg 540

gcggccaaaa ctacactttc tggggcggcc gtgaaggcta cgaaacactt cttaacacag 600

atatggaact tgaacttgat aaccttgctc gtttccttca catggctgtt gaatacgcta 660

aagaaatcgg cttcgaaggc caacttctta tcgaacctaa acctaaagaa cctacaaaac 720

atcaatacga tttcgatgct gctaacgttt acgctttcct taaaaaatac gatcttgata 780

aatacttcaa acttaacatc gaagctaacc atgctacact tgctggccat gatttccaac 840

atgaacttcg ttacgctcgt atcaacaaca tgcttggctc tatcgatgct aacatgggcg 900

atatgcttct tggctgggat acagatcaat tccctacaga tatccgtatg acaacacttg 960

ctatgtacga agttatcaaa atgggcggct tcgataaagg cggccttaac ttcgatgcta 1020

aagttcgtcg tgcttctttc gaacctgaag atcttttcct tggccatata gctggcatgg 1080

atgcgttcgc taaaggcttt gaagttgctt acaaacttgt taaagatggc gttttcgatc 1140

gtttcatcga agaacgttac aaatcttacc gtgaaggcat cggcgctgaa atcgtttctg 1200

gcaaagctaa cttcaaaaca cttgaagaat acgctcttaa caaccctaaa atcgaaaaca 1260

aatctggcaa acaagaactt cttgaatcta tccttaacca ataccttttc tctgaactcg 1320

agcaccacca ccaccaccac tga 1343

<210> 2

<211> 447

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

Met Val Glu Tyr Phe Lys Asn Val Pro Gln Ile Lys Tyr Glu Gly Pro

1 5 10 15

Lys Ser Asn Asn Pro Tyr Ala Phe Lys Phe Tyr Asn Pro Asp Glu Ile

20 25 30

Ile Asp Gly Lys Pro Leu Lys Glu His Leu Arg Phe Ser Val Ala Tyr

35 40 45

Trp His Thr Phe Thr Ala Asn Gly Thr Asp Pro Phe Gly Ala Pro Thr

50 55 60

Met Gln Arg Pro Trp Asp His Phe Thr Asp Pro Met Asp Ile Ala Lys

65 70 75 80

Ala Arg Val Glu Ala Ala Phe Glu Leu Phe Glu Lys Leu Asp Val Pro

85 90 95

Phe Phe Cys Phe His Asp Arg Asp Ile Ala Pro Glu Gly Glu Thr Leu

100 105 110

Arg Glu Thr Asn Lys Asn Leu Asp Thr Ile Val Ala Met Ile Lys Asp

115 120 125

Tyr Leu Lys Thr Ser Lys Thr Lys Val Leu Phe Gly Thr Ala Asn Leu

130 135 140

Phe Ser Asn Pro Arg Phe Val His Gly Ala Ala Thr Ser Cys Asn Ala

145 150 155 160

Asp Val Phe Ala Tyr Ala Ala Ala Gln Val Lys Lys Ala Leu Glu Ile

165 170 175

Thr Lys Glu Leu Gly Gly Gln Asn Tyr Thr Phe Trp Gly Gly Arg Glu

180 185 190

Gly Tyr Glu Thr Leu Leu Asn Thr Asp Met Glu Leu Glu Leu Asp Asn

195 200 205

Leu Ala Arg Phe Leu His Met Ala Val Glu Tyr Ala Lys Glu Ile Gly

210 215 220

Phe Glu Gly Gln Leu Leu Ile Glu Pro Lys Pro Lys Glu Pro Thr Lys

225 230 235 240

His Gln Tyr Asp Phe Asp Ala Ala Asn Val Tyr Ala Phe Leu Lys Lys

245 250 255

Tyr Asp Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Leu Asn Ile Glu Ala Asn His Ala

260 265 270

Thr Leu Ala Gly His Asp Phe Gln His Glu Leu Arg Tyr Ala Arg Ile

275 280 285

Asn Asn Met Leu Gly Ser Ile Asp Ala Asn Met Gly Asp Met Leu Leu

290 295 300

Gly Trp Asp Thr Asp Gln Phe Pro Thr Asp Ile Arg Met Thr Thr Leu

305 310 315 320

Ala Met Tyr Glu Val Ile Lys Met Gly Gly Phe Asp Lys Gly Gly Leu

325 330 335

Asn Phe Asp Ala Lys Val Arg Arg Ala Ser Phe Glu Pro Glu Asp Leu

340 345 350

Phe Leu Gly His Ile Ala Gly Met Asp Ala Phe Ala Lys Gly Phe Glu

355 360 365

Val Ala Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Val Phe Asp Arg Phe Ile Glu

370 375 380

Glu Arg Tyr Lys Ser Tyr Arg Glu Gly Ile Gly Ala Glu Ile Val Ser

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Gly Lys Ala Asn Phe Lys Thr Leu Glu Glu Tyr Ala Leu Asn Asn Pro

405 410 415

Lys Ile Glu Asn Lys Ser Gly Lys Gln Glu Leu Leu Glu Ser Ile Leu

420 425 430

Asn Gln Tyr Leu Phe Ser Glu Leu Glu His His His His His His

435 440 445

<210> 3

<211> 1343

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

atggtagaat acttcaaaaa cgttcctcaa atcaaatacg aaggccctaa atctaacaac 60

ccttacgctt tcaaattcta caaccctgat gaaatcatcg atggcaaacc tcttaaagaa 120

catcttcgtt tctctgttgc ttactggcat acattcacag ctaacggcac agatcctttc 180

ggcgctccta caatgcaacg tccttgggat catttcacag atcctatgga tatcgctaaa 240

gctcgtgttg aagctgcttt cgaacttttc gaaaaacttg atgttccttt cttctgcttc 300

catgatcgtg atatcgctcc tgaaggcgaa acacttcgtg aaacaaacaa aaaccttgat 360

acaatcgttg ctatgatcaa agattacctt aaaacatcta aaacaaaagt tcttttcggc 420

acagctaacc ttttctctaa ccctcgtttc gttcatggcg ctgctcatct tgcaacgctg 480

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<210> 4

<211> 447

<212> PRT

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65 70 75 80

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Phe Ser Asn Pro Arg Phe Val His Gly Ala Ala Thr Ser Cys Asn Ala

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Asp Val Phe Ala Tyr Ala Ala Ala Gln Val Lys Lys Ala Leu Glu Ile

165 170 175

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Asn Phe Asp Ala Lys Val Arg Arg Ala Ser Phe Glu Pro Glu Asp Leu

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Phe Leu Gly His Ile Ala Gly Met Asp Ala Phe Ala Lys Gly Phe Glu

355 360 365

Val Ala Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Val Phe Asp Arg Phe Ile Glu

370 375 380

Glu Arg Tyr Lys Ser Tyr Arg Glu Gly Ile Gly Ala Glu Ile Val Ser

385 390 395 400

Gly Lys Ala Asn Phe Lys Thr Leu Glu Glu Tyr Ala Leu Asn Asn Pro

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Lys Ile Glu Asn Lys Ser Gly Lys Gln Glu Leu Leu Glu Ser Ile Leu

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Asn Gln Tyr Leu Phe Ser Glu Leu Glu His His His His His His

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<210> 6

<211> 1343

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

atggtagaat acttcaaaaa cgttcctcaa atcaaatacg aaggccctaa atctaacaac 60

ccttacgctt tcaaattcta caaccctgat gaaatcatcg atggcaaacc tcttaaagaa 120

catcttcgtt tctctgttgc ttactggcat acattcacag ctaacggcac agatcctttc 180

ggcgctccta caatgcaacg tccttgggat catttcacag atcctatgga tatcgctaaa 240

gctcgtgttg aagctgcttt cgaacttttc gaaaaacttg atgttccttt cttctgcttc 300

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aagttcgtcg tgcttctttc gaacctgaag atcttttcct tggccatata gctggcatgg 1080

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gcaaagctaa cttcaaaaca cttgaagaat acgctcttaa caaccctaaa atcgaaaaca 1260

aatctggcaa acaagaactt cttgaatcta tccttaacca ataccttttc tctgaactcg 1320

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<210> 5

<211> 447

<212> PRT

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<400> 5

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1 5 10 15

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245 250 255

Tyr Asp Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Leu Asn Ile Glu Ala Asn His Ala

260 265 270

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275 280 285

Asn Asn Met Leu Gly Ser Ile Asp Ala Asn Met Gly Asp Met Leu Leu

290 295 300

Gly Trp Asp Thr Asp Gln Phe Pro Thr Asp Ile Arg Met Thr Thr Leu

305 310 315 320

Ala Met Tyr Glu Val Ile Lys Met Gly Gly Phe Asp Lys Gly Gly Leu

325 330 335

Asn Phe Asp Ala Lys Val Arg Arg Ala Ser Phe Glu Pro Glu Asp Leu

340 345 350

Phe Leu Gly His Ile Ala Gly Met Asp Ala Phe Ala Lys Gly Phe Glu

355 360 365

Val Ala Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Val Phe Asp Arg Phe Ile Glu

370 375 380

Glu Arg Tyr Lys Ser Tyr Arg Glu Gly Ile Gly Ala Glu Ile Val Ser

385 390 395 400

Gly Lys Ala Asn Phe Lys Thr Leu Glu Glu Tyr Ala Leu Asn Asn Pro

405 410 415

Lys Ile Glu Asn Lys Ser Gly Lys Gln Glu Leu Leu Glu Ser Ile Leu

420 425 430

Asn Gln Tyr Leu Phe Ser Glu Leu Glu His His His His His His

435 440 445

<210> 12

<211> 447

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 12

Met Val Glu Tyr Phe Lys Asn Val Pro Gln Ile Lys Tyr Glu Gly Pro

1 5 10 15

Lys Ser Asn Asn Pro Tyr Ala Phe Lys Phe Tyr Asn Pro Asp Glu Ile

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35 40 45

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50 55 60

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100 105 110

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130 135 140

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145 150 155 160

Asp Val Phe Ala Tyr Ala Ala Ala Gln Val Lys Lys Ala Leu Glu Ile

165 170 175

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210 215 220

Phe Glu Gly Gln Leu Leu Ile Glu Pro Lys Pro Lys Glu Pro Thr Lys

225 230 235 240

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245 250 255

Tyr Asp Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Leu Asn Ile Glu Ala Asn His Ala

260 265 270

Thr Leu Ala Gly His Asp Phe Gln His Glu Leu Arg Tyr Ala Arg Ile

275 280 285

Asn Asn Met Leu Gly Ser Ile Asp Ala Asn Met Gly Asp Met Leu Leu

290 295 300

Gly Trp Asp Thr Asp Gln Phe Pro Thr Asp Ile Arg Met Thr Thr Leu

305 310 315 320

Ala Met Tyr Glu Val Ile Lys Met Gly Gly Phe Asp Lys Gly Gly Leu

325 330 335

Asn Phe Asp Ala Lys Val Arg Arg Ala Ser Phe Glu Pro Glu Asp Leu

340 345 350

Phe Leu Gly His Ile Ala Gly Met Asp Ala Phe Ala Lys Gly Phe Glu

355 360 365

Val Ala Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Val Phe Asp Arg Phe Ile Glu

370 375 380

Glu Arg Tyr Lys Ser Tyr Arg Glu Gly Ile Gly Ala Glu Ile Val Ser

385 390 395 400

Gly Lys Ala Asn Phe Lys Thr Leu Glu Glu Tyr Ala Leu Asn Asn Pro

405 410 415

Lys Ile Glu Asn Lys Ser Gly Lys Gln Glu Leu Leu Glu Ser Ile Leu

420 425 430

Asn Gln Tyr Leu Phe Ser Glu Leu Glu His His His His His His

435 440 445

<210> 13

<211> 1343

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 13

atggtagaat acttcaaaaa cgttcctcaa atcaaatacg aaggccctaa atctaacaac 60

ccttacgctt tcaaattcta caaccctgat gaaatcatcg atggcaaacc tatgaaagaa 120

catcttcgtt tctctgttgc ttactggcat acattcacag ctaacggcac agatcctttc 180

ggcgctccta caatgcaacg tccttgggat catttcacag atcctatgga tatcgctaaa 240

gctcgtgttg aagctgcttt cgaacttttc gaaaaacttg atgttccttt cttctgcttc 300

catgatcgtg atatcgctcc tgaaggcgaa acacttcgtg aaacaaacaa aaaccttgat 360

acaatcgttg ctatgatcaa agattacctt aaaacatcta aaacaaaact tcttttcggc 420

acagctaacc ttttctctaa ccctcgtttc gttcatggcg ctgctcatct tgcaacgctg 480

atgttttcgc ttacgctgct gctcaagtta aaaaagctct tgaaatcaca aaagaacttg 540

gcggccaaaa ctacactttc tggggcggcc gtgaaggcta cgaaacactt cttaacacag 600

atatggaact tgaacttgat aaccttgctc gtttccttca catggctgtt gaatacgcta 660

aagaaatcgg cttcgaaggc caacttctta tcgaacctaa acctaaagaa cctacaaaac 720

atcaatacga tttcgatgct gctaacgttt acgctttcct taaaaaatac gatcttgata 780

aatacttcaa acttaacatc gaagctaacc atgctacact tgctggccat gatttccaac 840

atgaacttcg ttacgctcgt atcaacaaca tgcttggctc tatcgatgct aacatgggcg 900

atatgcttct tggctgggat acagatcaat tccctacaga tatccgtatg acaacacttg 960

ctatgtacga agttatcaaa atgggcggct tcgataaagg cggccttaac ttcgatgcta 1020

aagttcgtcg tgcttctttc gaacctgaag atcttttcct tggccatata gctggcatgg 1080

atgcgttcgc taaaggcttt gaagttgctt acaaacttgt taaagatggc gttttcgatc 1140

gtttcatcga agaacgttac aaatcttacc gtgaaggcat cggcgctgaa atcgtttctg 1200

gcaaagctaa cttcaaaaca cttgaagaat acgctcttaa caaccctaaa atcgaaaaca 1260

aatctggcaa acaagaactt cttgaatcta tccttaacca ataccttttc tctgaactcg 1320

agcaccacca ccaccaccac tga 1343

Claims

1.一种葡萄糖异构酶突变体，其特征在所述葡萄糖异构酶突变体为下列之一：（1）SEQID NO.2所示氨基酸序列的第38位的亮氨酸突变为甲硫氨酸；（2）SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第137位的缬氨酸突变为亮氨酸；（3）SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第38位的亮氨酸突变为甲硫氨酸，同时第137位的缬氨酸突变为亮氨酸。

2.编码权利要求1所述葡萄糖异构酶突变体的基因。

3.含有权利要求2所述编码基因的重组菌。

4.权利要求1所述葡萄糖异构酶突变体在微生物催化D-葡萄糖异构化制备高果糖浆F-55中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用为：以含葡萄糖异构酶或其突变体基因的重组基因工程菌经发酵诱导培养获得的湿菌体为酶源，以D-葡萄糖为底物，以镁离子和钴离子为助催剂，以超纯水为反应介质，在75~85℃、100~200 r/min条件下反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得高果糖浆F-55。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于反应体系中，湿菌体用量为50~150g/L，镁离子终浓度为5~25mM，钴离子终浓度为0.1~5mM，底物初始浓度为50~500g/L。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备获得：将含葡萄糖异构酶或其突变体基因的重组基因工程菌接种至含终浓度50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min培养至OD₆₀₀=0.8~1.0，获得种子液；种子液以体积浓度1~5%的接种量转入含终浓度50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37 ℃、150 r/min培养至OD₆₀₀=0.6~0.8，添加终浓度0.1 mM的IPTG，于28 ℃、150 r/min诱导培养10~12 h，获得诱导培养菌悬液，将诱导培养菌悬液离心，收集得到湿菌体。