CN110904087B

CN110904087B - L-阿拉伯糖差向异构酶突变体及其应用

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Publication number: CN110904087B
Application number: CN201911383972.2A
Authority: CN
Inventors: 柳志强; 孙晨奕; 贾东旭; 郑裕国; 金利群; 彭晨; 陈德水; 廖承军; 程新平; 李勉; 毛宝兴
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2019-12-28
Filing date: 2019-12-28
Publication date: 2021-05-11
Anticipated expiration: 2039-12-28
Also published as: CN110904087A

Abstract

本发明涉及一种L‑阿拉伯糖差向异构酶突变体，及其在微生物催化D‑半乳糖异构化制备D‑塔格糖中的应用。所述L‑阿拉伯糖差向异构酶突变体，由所示氨基酸经定点突变而得，所述点突变位点为下列中的一个或多个：(1)第97位、(2)第189位、(3)第301位、(4)第409位和(5)第462位。本发明有益效果主要体现在：本发明提供了一种全新的差向异构酶及其突变体，以及其在制备塔格糖(D‑tagatose)中的应用。该突变体具有高最适反应温度80℃，解决了现有酶无法在高温生产D‑tagatose的技术难题。使用本突变体生产D‑tagatose，底物浓度为600g/L时，产物得率最高可达79.7％，优于原始酶和其他突变酶的转化效果，具有较好工业应用前景。

Description

L-阿拉伯糖差向异构酶突变体及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种L-阿拉伯糖差向异构酶突变体，及其在微生物催化D-半乳糖异构化制备D-塔格糖中的应用。

(二)背景技术

D-塔格糖(D-tagatose)是自然界中发现的稀有己酮糖，是D-半乳糖的异构体。它最早被发现存在于一种热带长青植物的树胶中，后来在酸奶、奶酪中也有发现。D-tagatose具有甜度高、热量低、吸收率低、有效降低血糖及抗龋齿、改善肠道菌群等性质与功效。美国食品及药物管理局已通过对D-tagatose的安全认证，准许其用于食品中。D-tagatose的生产方法主要有化学法和生物法。化学法存在成本高、酸碱用量高、污染严重、产物成分复杂、分离纯化难等问题。相比之下，生物法制备D-tagatose更具有优势，近年来逐渐成为研究热点。

生物法制备D-tagatose的工艺是以D-半乳糖为原料，利用L-阿拉伯糖异构酶(L-arabinose isomerase，简称LAI)进行催化反应，一步法生成D-tagatose。其中，原料D-半乳糖廉价易得、整体反应过程温和易控、反应过程符合环保要求，是一种替代化学法的最优制糖方法。研究报道指出，高温和弱酸性的反应条件更有利于D-tagatose的生物转化。当前，生物法催化D-半乳糖制备D-tagatose时底物浓度偏低，均处于100g/L以下，不利于应用到工业化生产中。当前，LAI制备D-tagatose存在的问题是酶源少，催化效率有待提高。

由于异构酶本身作用环境和对象的多样化，通常具备底物谱广泛的优势，可以由一种异构酶催化制备多种糖产品，这为研制针对特定糖的异构酶催化剂提供了新的途径。以核酸、蛋白质等生物大分子数据库为主要对象，辅助计算机对生物信息进行比较分析，获取基因编码、蛋白质结构功能及其相互关系等理性信息，筛选新型异构酶制剂，探索异构酶的底物谱，开发异构酶的新功能，将分子改造获得的高效生物催化剂用于制备高浓度D-psicose，对于满足人民群众日益增长的摄糖需求具有重要意义。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种最适反应温度高且收率高的L-阿拉伯糖异构酶异构体突变体，及其在微生物催化D-半乳糖异构化制备D-塔格糖中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种L-阿拉伯糖差向异构酶突变体，由序列如SEQ ID NO.5所示氨基经定点突变而来，所述突变的位点为下列中的一个或多个：(1)第97位、(2)第189位、(3)第301位、(4)第409位、(5)第462位。

优选的，所述突变体由序列如SEQ ID NO.5所示氨基酸经下列之一或多个位点突变而得：(1)第97位甘氨酸G突变为天冬酰胺N、精氨酸R、赖氨酸K、天冬氨酸D或半胱氨酸C，(2)第189位天冬氨酸N突变为丝氨酸S、谷氨酰胺Q、甘氨酸G或组氨酸H，(3)第301位亮氨酸L突变为异亮氨酸I、蛋氨酸M或谷氨酸E，(4)第409位亮氨酸L突变为苯丙氨酸F、脯氨酸P或丝氨酸S，(5)第462位苏氨酸T突变为丙氨酸A、色氨酸W或酪氨酸Y。

进一步，所述L-阿拉伯糖差向异构酶突变体由序列如SEQ ID NO.5所示氨基酸经下列之一或多个位点突变而得：(1)第97位甘氨酸G突变为赖氨酸K，(2)第189位天冬氨酸N突变为丝氨酸S，(3)第301位亮氨酸L突变为谷氨酸E，(4)第409位亮氨酸L突变为脯氨酸P，(5)第462位苏氨酸T突变为丙氨酸A。

更为优选的，所述L-阿拉伯糖差向异构酶突变体序列如SEQ ID NO.7所示(编码基因如SEQ ID NO.8所示)。

本发明还涉及所述L-阿拉伯糖差向异构酶突变体在催化D-半乳糖异构化制备D-塔格糖中的应用。

具体的，所述应用为：以含L-阿拉伯糖差向异构酶编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经超声破碎后获得的上清液为催化剂，以D-半乳糖为底物，在Mn²⁺存在下，在6.0～7.0的50mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液中，70～85℃温度下反应，反应结束后，反应液分离纯化，获得D-塔格糖。

所述L-阿拉伯糖差向异构酶突变体编码基因序列优选如SEQ ID NO.8所示。

本发明有益效果主要体现在：本发明提供了一种全新的差向异构酶及其突变体，以及其在催化D-半乳糖异构化制备D-塔格糖(D-tagatose)中的应用。该突变体具有高最适反应温度80℃，解决了现有酶无法在高温生产D-tagatose的技术难题。使用本突变体生产D-tagatose，产物得率最高可达79.7％，优于原始酶和其他突变酶的转化效果，具有较好工业应用前景。

(四)附图说明

图1为重组酶的最适温度示意图；

图2为金属离子对重组酶活力的影响示意图；

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：新型酶的筛选

1、酶的来源与重组菌的构建

从NCBI数据库中获得糖异构酶，分别来源于分别来源于Salegentibacteragarivorans(GenBank编号WP_093303409.1)、Massilia glaciei(GenBank编号WP_106758181.1)、Chitinophagaceae bacterium(GenBank编号WP_153799928.1)，并命名为SaLAI、MgLAI和CbLAI。根据氨基酸序列，依据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化，通过基因工程的常规操作以全合成的方法合成了三条选择的核苷酸序列，分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6所示；编码酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5所示。在核酸序列末端加入6×His-tag标签，两端加入酶切位点XbaI和XhoI，将该基因克隆至pET28b(+)对应的XbaI和Xho I位点，获得重组表达质粒pET28b/SaLAI、pET28b/MgLAI和pET28b/CbLAI。

2、重组菌的筛选与诱导

将获得的重组表达质粒pET28b/SaLAI、pET28b/MgLAI和pET28b/CbLAI转化至Escherichia coli BL21(DE3)受体菌中，涂布于含终浓度为100μg/mL卡那霉素的琼脂平板上，37℃下培养过夜，第2天于平板上长出的菌落中随机挑取克隆并抽提质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得含LAI基因的基因工程菌。

LB液体培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH值自然；LB固体培养基在LB液体培养基中添加15g/L琼脂；121℃高压灭菌20min；使用前添加终浓度100μg/mL卡那霉素。

将基因工程菌接种至含终浓度100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃、150r/min培养至OD₆₀₀约0.6～0.8，获得种子液；将种子液以体积浓度2％(v/v)接种量接种至新鲜的含有终浓度100μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃、150r/min培养OD₆₀₀至0.4～-0.6，再向培养液中加入终浓度为1.2mM的IPTG，于28℃下诱导表达12h后，4℃、6000r/min离心10min，弃去上清液，用0.85％的生理盐水清洗两遍湿菌体，并收集湿菌体，备用。

3、底物特异性地研究

各取1g上述重组菌湿菌体，用50mL 50mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄(pH 6.5)缓冲液悬浮，在39W条件下超声破碎，有效时间15min，制备获得超声破碎后的混悬液，离心，收集上清液，取1mL上清液用于反应。反应体系：50mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液(pH 6.5)、0.5mMCoCl₂.6H₂O、0.5mM MnCl₂、0.5mM FeCl₂、0.5mM MgCl₂和50g/L的各种底物(见表1)、50μL上述上清液，共1mL体系。反应条件：于40℃条件下反应10min，沸水煮沸10min终止反应。12000r/min离心10min，取上清液。

对于各个底物的活力测定采用半胱氨酸-咔唑法。取一定浓度的糖溶液，依次加入0.1mL的1.5％(w/v)半胱氨酸盐酸盐溶液、3mL 75％(w/w)浓硫酸溶液、0.1mL的0.12％(w/v)咔唑乙醇溶液，60℃下保温10min，于波长560nm下测定吸光度值，并作空白对照。每min内糖底物异构化生成1μmol糖产物所需酶量定义为一个酶活单位(U)。将SaLAI对L-阿拉伯糖测定的酶活设定为100％。由表1结果可知，CbLAI对D-半乳糖具有较高酶活，说明该酶更具备催化D-半乳糖至D-tagatose的异构化反应能力。

表1：各酶的底物特异性研究

4、重组菌酶活的精准测定

采用超声破碎方法对湿菌体进行超声破碎，取1g制备的湿菌体，用50mL50mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液(pH 6.5)悬浮，在39W条件下超声破碎15min，制备获得超声破碎后的混悬液，离心，收集上清液，取1mL上清液用于反应。反应体系：50mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液(pH 6.5)、1mM MnCl₂和50g/L的D-半乳糖及50μL上述上清液，共1mL体系。反应条件：于40℃条件下反应10min，沸水煮沸10min终止反应，稀释10倍后，使用0.22μm滤膜过膜；采用HPLC检测D-tagatose浓度。分析柱为AminexHPX-87H柱(300×7.8mm，9μm，伯乐生命医学产品有限公司)。Waters 2414示差折光检测器，Waters 1525泵，Waters 717进样器。酶活定义：40℃和pH 6.5下，每分钟将D-半乳糖异构化生成1μmol D-塔格糖所需酶量定义为一个酶活单位(U)。

表2：重组酶的酶活测定

实施例2：CbLAI单位点突变体的构建与筛选

1、突变体构建

根据CbLAI亲本序列(氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示)设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/CbLAI为模板，对第97位引入单突变，引物为：

正向引物97G：CCGGCAAAGATGTGGATCGGTNNNCTAAAAGTAC(下划线为突变碱基)

反向引物97G：GTACTTTTAGNNNACCGATCCACATCTTTGCCGG(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物97G 2μL(5pmol/μL，下同)，反向引物97G 2μL(5pmol/μL，下同)，模板DNA 1μL(20ng/μL，下同)，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，65℃15s，72℃6.5min)30循环；72℃5min。

2、突变体转化表达

取5μL的PCR产物，加入100μL冰浴的E.coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中，冰上静置30min，将转化产物于42℃热击90s，迅速置于冰上冷却5min，向管中加入600μL的LB液体培养基，37℃、150r/min培养60min，取100μL上述菌液涂板，待菌液完全被培养基吸收后，37℃倒置培养12h。

3、高通量筛选阳性转化子

反应混合液组成：50mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液(pH 6.5)、1mM MnCl₂和5g/L的D-半乳糖。在96孔聚苯乙烯微孔培养板中每孔加入100μL含有终浓度100μg/mL卡那霉素的LB培养液，接种不同的转化菌落，于37℃、150r/min培养OD₆₀₀至0.4～0.6，再向培养液中加入终浓度为1.2mM的IPTG，于28℃下诱导表达10h后，4℃、6000r/min离心10min，弃去上清液。取50μL上述反应混合液加入含有菌体的的96孔板中，振荡器振荡混匀后在40℃、600r/min反应10min，冰浴10min停止反应。取2.5μL反应液以半胱氨酸-咔唑显色法筛选突变体，反应体包括反应液5μL的1.5％(w/v)半胱氨酸盐酸盐，150μL的70％(w/w)浓硫酸、5μL的0.12％(w/v)咔唑乙醇，60℃下保温10min后观察颜色变化。以重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/CbLAI的反应为对照，取颜色比E.coli BL21(DE3)/pET28b/CbLAI的反应深的突变株进行酶活精准测定。

4、阳性转化子酶活的精准测定

操作同实施例1的“重组菌酶活的精准测定”。

该实施例的结果为：对513株重组转化菌初筛，筛选出5株酶活提高的突变株，再对其进行酶活精准测定，具体结果见表3。经分析确定，其余508株重组菌酶活保持不变或下降的原因是第97位甘氨酸(G)突变为N、R、K、D和C的其他氨基酸。

表3：单点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的CbLAI突变体-G97K记为CbLAI-1，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/CbLAI-1。

实施例3：CbLAI双位点突变体的构建与筛选

根据实施例2构建的单突变体CbLAI-1序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/CbLAI-1为模板，对第189位引入单突变，引物为：

正向引物189N：TTCGGCGACNNNATGAGACAAGTAGCAGTGACAG(下划线为突变碱基)

反向引物189N：CTGTCACTGCTACTTGTCTCATNNNGTCGCCGAA(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物189N 2μL，反向引物189N 2μL，模板DNA 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，62.5℃15s，72℃6.5min)30循环；72℃5min。

PCR产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑单克隆于含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。利用半胱氨酸咔唑法显色法对突变体进行初筛(操作同实施例2的“高通量筛选阳性转化子”)。

采用超声破碎方法对湿菌体进行超声破碎，并进行酶活精准测定(操作同实施例2的“阳性转化子酶活测定”)。

该实施例的结果为：对490株重组转化菌初筛，筛选出4株酶活提高的突变株，再对其进行酶活精准测定，具体结果见表4。经分析确定，其余486株重组菌酶活保持不变或下降的原因是第189位天冬氨酸(N)突变为S、Q、G和H外的其他氨基酸。

表4：双点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的CbLAI突变体-G97K-N189S记为CbLAI-2，获得重组菌E.coliBL21(DE3)/pET28b/CbLAI-2。

实施例4：CbLAI三位点突变体的构建与筛选

根据实施例3构建的突变体CbLAI-2序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/CbLAI-2为模板，对第301位引入单突变，引物为：

正向引物301L：TATTGCCACGCAACGCNNNATGGCAGATGGCTA(下划线为突变碱基)

反向引物301L：TAGCCATCTGCCATNNNGCGTTGCGTGGCAATA(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物301L 2μL，反向引物301L 2μL，模板DNA 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，64℃15s，72℃6.5min)30循环；72℃5min。

该实施例的结果为：对356株重组转化菌初筛，筛选出3株酶活提高的突变株，再对其进行酶活测定，具体结果见表5。经分析确定，其余353株重组菌酶活保持不变或下降的原因是第301位亮氨酸(L)突变为I、M和E外的其他氨基酸。

表5：三点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的CbLAI突变体-G97K-N189S-L301E记为CbLAI-3，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/CbLAI-3。

实施例5：CbLAI四位点突变体的构建与筛选

根据实施例4构建的突变体CbLAI-3序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/CbLAI-3为模板，对第409位引入单突变，引物为：

正向引物409L：CAGATTCAGGNNNTTAGTAAATGAAGTGGAGGCG(下划线为突变碱基)

反向引物409L：CGCCTCCACTTCATTTACTAANNNCCTGAATCTG(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物409L 2μL，反向引物409L 2μL，模板DNA 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，61℃15s，72℃6.5min)30循环；72℃5min。

该实施例的结果为：对586株重组转化菌初筛，筛选出3株酶活提高的突变株，再对其进行酶活测定，具体结果见表6。经分析确定，其余585株重组菌酶活保持不变或下降的原因是第409位亮氨酸(L)突变为F、P和S外的其他氨基酸。

表6：四位点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的CbLAI突变体-G97K-N189S-L301E-L409P记为CbLAI-4，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/CbLAI-4。

实施例6：CbLAI五位点突变体的构建与筛选

根据实施例5构建的突变体CbLAI-4序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/CbLAI-4为模板，对第462位引入单突变，引物为：

正向引物462T：TTCTCAGAACCTTNNNGCGGAACATCTCGAGG(下划线为突变碱基)

反向引物462T：CCTCGAGATGTTCCGCNNNAAGGTTCTGAGAA(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物462T 2μL，反向引物462T 2μL，模板DNA 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，59.5℃15s，72℃6.5min)30循环；72℃5min。

该实施例的结果为：对438株重组转化菌初筛，筛选出3株酶活提高的突变株，再对其进行酶活测定，具体结果见表7。经分析确定，其余435株重组菌酶活保持不变或下降的原因是第462位苏氨酸(T)突变为A、W和Y外的其他氨基酸。

表7：五点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的CbLAI突变体-G97K-N189S-L301E-L409P-T462A记为CbLAI-5，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/CbLAI-5。

实施例7：重组大肠杆菌发酵产酶与纯化

分别将重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/CbLAI、E.coli BL21(DE3)/pET28b/CbLAI-1、E.coli BL21(DE3)/pET28b/CbLAI-2、E.coli BL21(DE3)/pET28b/CbLAI-3、E.coli BL21(DE3)/pET28b/CbLAI-4、E.coli BL21(DE3)/pET28b/CbLAI-5接种至含终浓度100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃、150r/min培养OD₆₀₀约0.6～0.8，获得种子液；将种子液以2％(v/v)接种量接种至新鲜的含有终浓度100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、150r/min培养OD₆₀₀至0.4～0.6，再向培养液中加入终浓度为1.2mM的IPTG，于28℃下诱导表达12h后，4℃、6000r/min离心10min，弃去上清液，用0.85％的生理盐水清洗两遍湿菌体，并收集湿菌体，备用。采用超声破碎方法对湿菌体进行超声破碎，收集上清液(操作同实施例1的“重组酶酶活的精准测定”)。

使用nickel-NTA琼脂糖凝胶柱进行纯化，用平衡缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 8.0)平衡层析柱，再使用洗脱液(50mM磷酸盐缓冲液，300mMNaCl，500mM咪唑，pH 8.0)进行洗脱，根据紫外检测器的信号响应，收集相应的洗脱液，即为各自纯酶液。

实施例8：纯化CbLAI及其突变体的最适反应温度

将实施例7中的纯酶液作为转化用酶，测定酶的最适反应温度。具体操作如下：50mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液(pH 6.5)中，加入50g/L D-半乳糖、1mM MnCl₂和50μL纯酶液，体系共1mL。分别于不同转化温度：65、70、75、80、85、90、95℃测定重组LAI的活力(方法同实施例1的“重组菌的酶活精准测定”)。将各自(酶)的最高酶活设定为100％。由图2中可知，CbLAI-5在80℃具有最高酶活，比原始酶CbLAI在65℃提高了15℃。

实施例9：金属离子对最优突变体酶活的影响

将实施例7中的纯酶液作为转化用酶，测定金属离子对重组酶酶活的影响，所选单金属离子(阴离子为Cl^-)：Co²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Ba²⁺、Fe²⁺、Ni²⁺、Pb²⁺和Ca²⁺。1mL反应体系包括：50mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液(pH6.5)、50g/L D-半乳糖、50μL纯酶液和1mM不同金属离子。于40℃测定LAI的活力，以不加金属离子作为对照。由图2可知，Mn²⁺对LAI的酶活有极大的促进作用。

实施例10：原始酶与突变酶突变重组菌全细胞制备D-tagatose

按实施例4的方法，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/CbLAI、E.coli BL21(DE3)/pET28b/CbLAI-1、E.coli BL21(DE3)/pET28b/CbLAI-2、E.coli BL21(DE3)/pET28b/CbLAI-3、E.coli BL21(DE3)/pET28b/CbLAI-4、E.coli BL21(DE3)/pET28b/CbLAI-5湿菌体作为生物催化剂，以D-半乳糖为底物，生物转化制备D-tagatose。催化体系包括：不同浓度的D-半乳糖、1mM MnCl₂、10g/L湿菌体，再加入适量50mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄(pH 6.5)缓冲液至总体系100mL。反应体系于65℃、150r/min条件下反应8h。每隔1h取样、离心，用0.22μm膜过滤后进行HPLC检测D-tagatose浓度。由表8可知，E.coli BL21(DE3)/pET28b/CbLAI-5的产物得率最终达到79.7％，高于原始酶E.coli BL21(DE3)/pET28b/CbLAI和其他突变酶的得率。

表8：各重组菌得率的比较

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> L-阿拉伯糖差向异构酶突变体及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 508

<212> PRT

<213> Salegentibacter agarivorans

<400> 1

Met Ile Asn Ile Glu Ala Lys Glu Ile Trp Phe Val Thr Gly Ser Gln

1 5 10 15

His Leu Tyr Gly Asp Glu Thr Leu Asn Gln Val Ala Ala Asp Ser Lys

20 25 30

Ala Ile Val Asn Gly Leu Asn Glu Ser Lys His Leu Pro Leu Lys Ile

35 40 45

Val Trp Lys Asp Thr Val Lys Thr Ala Asp Glu Ile Thr Asp Ile Cys

50 55 60

Gln Asp Ala Asn Ala Asn Lys Asn Cys Ile Gly Ile Val Ala Trp Met

65 70 75 80

His Thr Phe Ser Pro Ala Lys Met Trp Ile Lys Gly Leu Ser Leu Leu

85 90 95

Lys Lys Pro Leu Cys His Leu His Thr Gln Phe Asn Ala Glu Ile Pro

100 105 110

Trp Gly Lys Ile Asp Met Asp Tyr Met Asn Leu His Gln Ser Ala His

115 120 125

Gly Asp Arg Glu Phe Gly Phe Met Met Ser Arg Met Arg Lys Lys Arg

130 135 140

Lys Val Ile Val Gly His Trp Lys Thr Asp Arg Val Gln Gln Lys Leu

145 150 155 160

Gly Ile Trp Ser Arg Val Val Leu Gly Trp Asp Glu Leu Gln His Leu

165 170 175

Lys Val Ala Arg Ile Gly Asp Asn Met Arg Asn Val Ala Val Thr Glu

180 185 190

Gly Asp Lys Val Ala Ala Glu Met Lys Phe Gly Met Ala Val Asn Gly

195 200 205

Tyr Asp Ser Ser Glu Val Val Ala His Ile Asp Lys Ile Ser Glu Glu

210 215 220

Lys Ile Asn Glu Leu Leu Lys Lys Tyr Glu Ala Asp Tyr Asn Leu Ser

225 230 235 240

Gln Asp Leu Lys Glu Gly Gly Ser Gln Arg Asp Ser Leu Val Asp Ala

245 250 255

Ala Lys Ile Glu Leu Gly Leu Arg Ser Phe Leu Asp Glu Gly Gly Phe

260 265 270

Lys Ala Phe Thr Asp Thr Phe Glu Asn Leu Gly Lys Leu Lys Gln Leu

275 280 285

Pro Gly Ile Ala Val Gln Arg Leu Met Ala Asp Gly Tyr Gly Phe Gly

290 295 300

Ala Glu Gly Asp Trp Lys Thr Ala Ala Leu Leu Arg Ala Met Lys Val

305 310 315 320

Met Ala Val Gly Leu Glu Glu Gly Thr Ser Phe Met Glu Asp Tyr Thr

325 330 335

Tyr His Phe Thr Pro Gln Lys Ser Tyr Val Leu Gly Ser His Met Leu

340 345 350

Glu Ile Cys Pro Ser Ile Ala Asp Ala Lys Pro Thr Cys Glu Val His

355 360 365

Pro Leu Gly Ile Gly Gly Lys Glu Asp Pro Val Arg Leu Val Phe Asn

370 375 380

Ala Pro Lys Gly Asp Ala Leu Asn Ala Ser Leu Ile Asp Met Gly Asn

385 390 395 400

Arg Phe Arg Leu Ile Val Asn Glu Val Glu Ala Val Ala Pro Glu Ala

405 410 415

Asp Leu Pro Asn Leu Pro Val Ala Arg Val Leu Trp Asp Ala Lys Pro

420 425 430

Asn Leu Glu Val Ala Ala Thr Ser Trp Ile Leu Ala Gly Gly Ala His

435 440 445

His Thr Val Tyr Thr Gln Ala Leu Thr Thr Glu Phe Leu Glu Asp Phe

450 455 460

Ala Asp Ile Ala Gly Ile Glu Leu Leu Val Ile Asp Asp Lys Thr Ser

465 470 475 480

Ile Arg Glu Phe Lys Asp Lys Ile Asn Ala Asn Glu Ala Tyr Tyr His

485 490 495

Met Phe Gln His Gly Met His His His His His His

500 505

<210> 2

<211> 1524

<212> DNA

<213> Salegentibacter agarivorans

<400> 2

atgattaata tcgaagctaa agagatatgg tttgttactg gttctcaaca tttatatggc 60

gatgaaacct tgaaccaggt cgccgcagac tccaaggcga ttgtaaatgg acttaacgag 120

tcaaaacacc tccctctaaa gatcgtgtgg aaagatacag ttaagacggc tgacgaaata 180

actgatattt gtcaagacgc caatgcaaac aaaaattgca tcgggatagt cgcgtggatg 240

cataccttct cgcccgctaa gatgtggatt aaaggtctga gtttattgaa gaaaccactt 300

tgtcacctcc atacacagtt taacgccgag atcccgtggg gcaagataga tatggactac 360

atgaatctac accaaagcgc acatggagat cgtgaattcg ggtttatgat gtctcgcatg 420

cgaaaaaagc ggaaagtaat tgtgggtcac tggaagacgg acagagttca gcaaaaactg 480

ggcatctggt ccagggtcgt attaggatgg gatgagttgc agcatcttaa ggtggcgcgt 540

ataggggaca acatgcgcaa tgttgctgtc actgaaggtg ataaagtagc cgcagagatg 600

aagttcggca tggcggtgaa cggatatgac tcatcggaag ttgtcgctca cattgataaa 660

atcagtgagg aaaagataaa tgagctccta aaaaagtacg aagccgacta taacctgagc 720

caagatttaa aagagggggg ttctcagcga gactccttgg tagatgcagc gaagattgaa 780

cttggcctcc ggtcatttct agacgaggga gggttcaaag cttttaccga tacattcgaa 840

aatctgggta agttaaaaca attgcctggc atcgccgtgc agagacttat ggcagacgga 900

tacgggtttg gtgcggaggg cgattggaag acggctgccc tcctaagggc aatgaaagtt 960

atggcggtcg gactggaaga ggggacttcg ttcatggaag actataccta ccattttaca 1020

ccccaaaaga gttatgtatt aggtagccac atgttggaga tatgcccatc tattgctgat 1080

gccaaaccga cgtgtgaagt gcatcctctt ggcatcggag ggaaggagga ccccgttcgt 1140

ctcgtcttca acgcaccaaa aggtgatgcg ctaaatgctt ccctgataga catgggcaac 1200

cgctttcgat taattgtaaa tgaagtggag gccgttgcac cggaagcgga tttgcctaac 1260

cttcccgtcg ctcgggtact ctgggacgcc aagccaaatc tagaggtggc agcgacttca 1320

tggatcctgg ctggaggggc ccaccatacc gtttacacac aggcattaac gactgaattc 1380

ttggaggatt ttgcggacat agctggtatt gaacttctcg tcatcgatga caaaacctcg 1440

ataagagagt tcaaggataa aattaacgcc aatgaagcat attaccacat gtttcaacat 1500

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<210> 3

<211> 506

<212> PRT

<213> Massilia glaciei

<400> 3

Met Lys Thr Tyr Gly Glu Lys Glu Val Trp Leu Val Thr Gly Ser Gln

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His Leu Tyr Gly Pro Gly Val Leu Gln Gln Val Ala Ala Asn Ser Ala

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His Ile Ala Glu Gln Leu Thr Gly Ser Pro Asn Ile Pro Ile Arg Ile

35 40 45

Val Ala Lys Asp Val Val Lys Ser Pro Gly Glu Ile Leu Ser Val Cys

50 55 60

Gln Ala Ala Asn Ser Asp Ala Asn Cys Val Gly Leu Ile Leu Trp Met

65 70 75 80

His Thr Phe Ser Pro Ala Lys Met Trp Ile Ala Gly Leu Ser Val Leu

85 90 95

Ser Lys Pro Tyr Met His Leu His Thr Gln Phe Asn Ala Glu Leu Pro

100 105 110

Phe Ala Asp Ile Asp Met His Phe Met Asn Leu Asn Gln Ser Ala His

115 120 125

Gly Asp Arg Glu Phe Gly His Val Ser Thr Arg Leu Lys Gln Glu Arg

130 135 140

Lys Val Val Val Gly His Trp Ala Ala Pro Ala Val Gln Leu Glu Ile

145 150 155 160

Asp Ser Trp Cys Arg Val Ala Met Gly Trp His Glu Ser Arg Asn Leu

165 170 175

Arg Val Ala Arg Phe Gly Asp Asn Met Arg Gln Val Ala Val Thr Asp

180 185 190

Gly Asp Lys Val Ala Ala Gln Ile Gln Phe Gly Tyr Glu Val His Ala

195 200 205

Tyr Gly Leu Gly Asp Leu Gln Lys Val Val Asp Ala Val Thr Asp Glu

210 215 220

Gln Val Ala Arg Gln Ile Ala Val Tyr Gln Glu Ala Tyr Glu Ile Ala

225 230 235 240

Pro Ser Met Leu Gly Asp Ala His Gln Met Glu Met Ile Glu Asn Glu

245 250 255

Ala Arg Leu Glu Leu Gly Met Leu Ala Phe Leu Gln Asp Gly Gly Phe

260 265 270

Gly Ala Phe Thr Asn Cys Phe Glu Asn Leu Thr Gly Leu Thr Asn Leu

275 280 285

Pro Gly Leu Ala Thr Gln Arg Leu Met Ala Gln Gly Tyr Gly Tyr Gly

290 295 300

Gly Glu Gly Asp Trp Lys Thr Ala Ala Met Val Arg Ile Ala Lys Val

305 310 315 320

Met Ser Lys Gly Arg Pro Gly Gly Ser Ser Phe Met Glu Asp Tyr Thr

325 330 335

Tyr His Phe Gly Val Val Asp Gln Val Leu Gly Ala His Met Leu Glu

340 345 350

Val Cys Pro Ser Ile Ala Ala Ala Arg Pro Lys Leu Glu Val His Leu

355 360 365

His Thr Ile Gly Cys Arg Asn Asp Ile Ala Arg Leu Leu Phe Thr Gly

370 375 380

Lys Ala Gly Pro Ala Leu Cys Ile Ser Leu Ile Asp Leu Gly Asn Arg

385 390 395 400

Phe Arg Met Ile Ile Ser Glu Val Asp Thr Val Thr Pro Glu His Glu

405 410 415

Leu Pro Lys Leu Pro Val Ala Lys Ala Leu Trp Gln Pro Arg Pro Asn

420 425 430

Leu Gln Val Ala Ala Ala Ala Trp Ile His Ala Gly Gly Ala His His

435 440 445

Ser Thr Tyr Thr Gln Gly Ile Thr Ala Glu Glu Ala Gln Asp Phe Ala

450 455 460

Asp Ile Ala Gly Ile Glu Ala Val Val Ile Gly Ala Gly Thr Ser Val

465 470 475 480

Arg Gly Met Lys Thr Asp Leu Arg His Asn Ala Ala Tyr Tyr His Leu

485 490 495

Lys Asp Gly Val His His His His His His

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<210> 4

<211> 1518

<212> DNA

<213> Massilia glaciei

<400> 4

atgaaaactt atggtgaaaa ggaggtttgg ttagtcaccg gctctcaaca tttgtacgga 60

cctggggtac ttcagcaagt ggctgccaat tccgcacaca ttgcggaaca gctcacaggt 120

tcacccaaca tcccaatacg tattgttgct aaagatgtcg taaagtcgcc gggcgagatc 180

ctaagtgtgt gtcaagccgc aaatagcgac gcgaactgcg ttggactgat attatggatg 240

catacgtttt ctcctgctaa aatgtggatt gccgggttgt ccgtcctttc aaagccctat 300

atgcacctcc atactcagtt caatgcagaa ctaccatttg cggatatcga catgcacttc 360

atgaacctga atcaatcggc tcatggtgat cgcgagtttg gccacgtaag tacccgatta 420

aaacaggaac ggaaggtggt tgtcggacat tgggccgcac cggcggtaca attggagata 480

gacagctggt gtagagtggc tatggggtgg cacgaatcta ggaaccttcg tgttgcccgc 540

ttcggtgata atatgcgaca ggtcgcagta acagacggcg ataaagtggc ggctcaaatt 600

cagtttggat acgaggttca tgcctatggg ctcggtgacc tacaaaaggt cgtagatgca 660

gtgacggacg aacaggttgc gcggcaaatc gctgtctacc aggaggccta tgaaatagca 720

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ttgggaatgc ttgccttcct ccaggacggg ggttttggcg cattcactaa ttgctttgag 840

aacctaaccg gactgacaaa tttacccggg ttggcgacgc aaaggcttat ggctcagggt 900

tacggctatg gaggggaagg tgattggaaa actgccgcaa tggtacgtat cgcgaaggtg 960

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cttttcacgg ggaaagccgg tcccgcactc tgtatatctc taattgatct gggcaatagg 1200

tttcgtatga tcatatccga agtcgacact gtaaccccag agcatgaatt accgaagttg 1260

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caagatttcg ccgacatagc aggcattgag gcggtcgtaa tcggagctgg gacctcggtg 1440

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catcaccatc accatcac 1518

<210> 5

<211> 507

<212> PRT

<213> Chitinophagaceae bacterium

<400> 5

Met Lys His Ile Ile Thr Ser Ala Gly Ala Ala Leu Glu Val Trp Phe

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Val Thr Gly Ser Gln His Leu Tyr Gly Glu Glu Thr Leu Lys Gln Val

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Ala Glu His Ser Arg Gln Ile Ala Ala Ser Leu His Glu Ala Ala Ala

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Ile Pro Val Asn Val Val Phe Lys Pro Thr Val Lys Thr Pro Asp Glu

50 55 60

Ile Tyr Gln Val Cys Val Asp Ala Asn Thr Thr Lys Asn Cys Ile Gly

65 70 75 80

Val Ile Thr Trp Met His Thr Phe Ser Pro Ala Lys Met Trp Ile Gly

85 90 95

Gly Leu Lys Val Leu Gln Lys Pro Leu Cys His Leu His Thr Gln Phe

100 105 110

Asn Arg Asp Ile Pro Trp Gly Asp Ile Asp Met Asp Phe Met Asn Leu

115 120 125

Asn Gln Ser Ala His Gly Asp Arg Glu Tyr Gly Phe Ile Met Ser Arg

130 135 140

Met Arg Leu Arg Arg Lys Val Val Val Gly His Trp Gln Asp Glu Gln

145 150 155 160

Val Val Ala Gly Ile Ala Ser Trp Val Arg Ala Ala Ala Gly Trp Asn

165 170 175

Asp Trp Gln Gly Ala Arg Phe Val Arg Phe Gly Asp Asn Met Arg Gln

180 185 190

Val Ala Val Thr Glu Gly Asp Lys Val Glu Ala Glu Leu Gln Phe Gly

195 200 205

Tyr Ser Val Asn Thr His Gly Ile Gly Asp Leu Val Lys Val Ile Asn

210 215 220

Glu Val Thr Asp Ala Asp Val Asp Lys Leu Cys Ala Asn Tyr Asp Glu

225 230 235 240

Gln Tyr Lys Leu Val Ala Ser Leu Lys Lys Gly Gly Asp Gln His Glu

245 250 255

Ser Leu Lys Asp Ala Ala Arg Ile Glu Leu Gly Leu Arg Tyr Phe Leu

260 265 270

Glu Gln Gly Asn Phe Lys Gly Phe Thr Asp Thr Phe Glu Asp Leu His

275 280 285

Gly Met Lys Gln Leu Pro Gly Ile Ala Thr Gln Arg Leu Met Ala Asp

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Gly Tyr Gly Phe Gly Gly Glu Gly Asp Trp Lys Thr Ser Ala Leu Val

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Arg Ala Met Lys Val Met Gly Ser Gly Leu Gln Gly Gly Asn Ser Phe

325 330 335

Met Glu Asp Tyr Thr Tyr His Phe Glu Pro Gly Asn Asn Leu Val Leu

340 345 350

Gly Ser His Met Leu Glu Ile Cys Pro Ser Ile Ala Asp Gly Lys Pro

355 360 365

Ser Cys Glu Ile His Pro Leu Gly Ile Gly Gly Lys Ala Asp Pro Val

370 375 380

Arg Leu Val Phe Asn Val Ala Ala Gly Pro Ala Ile Asn Ala Ser Val

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Ile Asp Met Gly Asn Arg Phe Arg Leu Leu Val Asn Glu Val Glu Ala

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Val Ala Pro Leu His Asp Leu Pro Arg Leu Pro Val Ala Arg Val Leu

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Trp Lys Pro Leu Pro Asp Met Gln Thr Ala Leu Ala Ala Trp Ile Leu

435 440 445

Ala Gly Gly Ala His His Thr Gly Tyr Ser Gln Asn Leu Thr Ala Glu

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His Leu Glu Asp Phe Ala Asp Ile Ala Lys Ile Glu Phe Val Leu Ile

465 470 475 480

Gly Lys Asn Thr Asn Leu Tyr Gln Leu Lys Asn Glu Leu Arg Trp Ser

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Glu Ile Ala Tyr Lys His His His His His His

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<211> 1521

<212> DNA

<213> Chitinophagaceae bacterium

<400> 6

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caacacttgt atggagagga aacacttaag caggtagcgg agcattcacg tcaaatagct 120

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gcggctagga tagaactagg tctgcgttat ttcttagagc aaggcaactt taaaggattc 840

accgatacat ttgaagactt gcacgggatg aagcagcttc caggtattgc cacgcaacgc 900

ctcatggcag atggctacgg attcgggggt gagggcgact ggaaaactag cgcgctagtg 960

cgagctatga aggttatggg atctgggctg cagggtggca attcctttat ggaagattat 1020

acctaccatt tcgagccggg aaacaattta gtcttggggt cacacatgct tgaaatctgt 1080

ccttcgatag ccgacggtaa acccagttgc gagattcatc cactcggcat cggagggaag 1140

gcagatccgg tacggctagt gtttaacgtt gcggctggtc ctgccataaa tgcaagcgtc 1200

attgacatgg gcaacagatt caggctgtta gtaaatgaag tggaggcggt tgctcccttg 1260

cacgatcttc cacgtctccc ggtcgcccgc gtactatgga aacctctgcc cgacatgcaa 1320

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<212> PRT

<213> 人工序列(Unknown)

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Ala Glu His Ser Arg Gln Ile Ala Ala Ser Leu His Glu Ala Ala Ala

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Ile Pro Val Asn Val Val Phe Lys Pro Thr Val Lys Thr Pro Asp Glu

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Ile Tyr Gln Val Cys Val Asp Ala Asn Thr Thr Lys Asn Cys Ile Gly

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Val Ile Thr Trp Met His Thr Phe Ser Pro Ala Lys Met Trp Ile Gly

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Lys Leu Lys Val Leu Gln Lys Pro Leu Cys His Leu His Thr Gln Phe

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Asn Arg Asp Ile Pro Trp Gly Asp Ile Asp Met Asp Phe Met Asn Leu

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Asn Gln Ser Ala His Gly Asp Arg Glu Tyr Gly Phe Ile Met Ser Arg

130 135 140

Met Arg Leu Arg Arg Lys Val Val Val Gly His Trp Gln Asp Glu Gln

145 150 155 160

Val Val Ala Gly Ile Ala Ser Trp Val Arg Ala Ala Ala Gly Trp Asn

165 170 175

Asp Trp Gln Gly Ala Arg Phe Val Arg Phe Gly Asp Ser Met Arg Gln

180 185 190

Val Ala Val Thr Glu Gly Asp Lys Val Glu Ala Glu Leu Gln Phe Gly

195 200 205

Tyr Ser Val Asn Thr His Gly Ile Gly Asp Leu Val Lys Val Ile Asn

210 215 220

Glu Val Thr Asp Ala Asp Val Asp Lys Leu Cys Ala Asn Tyr Asp Glu

225 230 235 240

Gln Tyr Lys Leu Val Ala Ser Leu Lys Lys Gly Gly Asp Gln His Glu

245 250 255

Ser Leu Lys Asp Ala Ala Arg Ile Glu Leu Gly Leu Arg Tyr Phe Leu

260 265 270

Glu Gln Gly Asn Phe Lys Gly Phe Thr Asp Thr Phe Glu Asp Leu His

275 280 285

Gly Met Lys Gln Leu Pro Gly Ile Ala Thr Gln Arg Glu Met Ala Asp

290 295 300

Gly Tyr Gly Phe Gly Gly Glu Gly Asp Trp Lys Thr Ser Ala Leu Val

305 310 315 320

Arg Ala Met Lys Val Met Gly Ser Gly Leu Gln Gly Gly Asn Ser Phe

325 330 335

Met Glu Asp Tyr Thr Tyr His Phe Glu Pro Gly Asn Asn Leu Val Leu

340 345 350

Gly Ser His Met Leu Glu Ile Cys Pro Ser Ile Ala Asp Gly Lys Pro

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Ser Cys Glu Ile His Pro Leu Gly Ile Gly Gly Lys Ala Asp Pro Val

370 375 380

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385 390 395 400

Ile Asp Met Gly Asn Arg Phe Arg Pro Leu Val Asn Glu Val Glu Ala

405 410 415

Val Ala Pro Leu His Asp Leu Pro Arg Leu Pro Val Ala Arg Val Leu

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Trp Lys Pro Leu Pro Asp Met Gln Thr Ala Leu Ala Ala Trp Ile Leu

435 440 445

Ala Gly Gly Ala His His Thr Gly Tyr Ser Gln Asn Leu Ala Ala Glu

450 455 460

His Leu Glu Asp Phe Ala Asp Ile Ala Lys Ile Glu Phe Val Leu Ile

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<212> DNA

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accccggatg aaatttatca ggtgtgcgtg gatgcgaaca ccaccaaaaa ctgcattggc 240

gtgattacct ggatgcatac ctttagcccg gcgaaaatgt ggattggcaa actgaaagtg 300

ctgcagaaac cgctgtgcca tctgcatacc cagtttaacc gtgatattcc gtggggcgat 360

attgatatgg attttatgaa cctgaaccag agcgcgcatg gcgatcgtga atatggcttt 420

attatgagcc gtatgcgtct gcgtcgtaaa gtggtggtgg gccattggca ggatgaacag 480

gtggtggcgg gcattgcgag ctgggtgcgt gcggcggcgg gctggaacga ttggcagggc 540

gcgcgttttg tgcgttttgg cgatagcatg cgtcaggtgg cggtgaccga aggcgataaa 600

gtggaagcgg aactgcagtt tggctatagc gtgaacaccc atggcattgg cgatctggtg 660

aaagtgatta acgaagtgac cgatgcggat gtggataaac tgtgcgcgaa ctatgatgaa 720

cagtataaac tggtggcgag cctgaaaaaa ggcggcgatc agcatgaaag cctgaaagat 780

gcggcgcgta ttgaactggg cctgcgttat tttctggaac agggcaactt taaaggcttt 840

accgatacct ttgaagatct gcatggcatg aaacagctgc cgggcattgc gacccagcgt 900

gaaatggcgg atggctatgg ctttggcggc gaaggcgatt ggaaaaccag cgcgctggtg 960

cgtgcgatga aagtgatggg cagcggcctg cagggcggca acagctttat ggaagattat 1020

acctatcatt ttgaaccggg caacaacctg gtgctgggca gccatatgct ggaaatttgc 1080

ccgagcattg cggatggcaa accgagctgc gaaattcatc cgctgggcat tggcggcaaa 1140

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catgatctgc cgcgtctgcc ggtggcgcgt gtgctgtgga aaccgctgcc ggatatgcag 1320

accgcgctgg cggcgtggat tctggcgggc ggcgcgcatc ataccggcta tagccagaac 1380

ctggcggcgg aacatctgga agattttgcg gatattgcga aaattgaatt tgtgctgatt 1440

ggcaaaaaca ccaacctgta tcagctgaaa aacgaactgc gttggagcga aattgcgtat 1500

aaacatcatc atcatcatca t 1521

Claims

1.一种L-阿拉伯糖差向异构酶突变体，由序列如SEQ ID NO.5所示氨基酸经定点突变而来，所述突变的位点为下列之一：

（1）第97位甘氨酸G突变为赖氨酸K；

（2）第97位甘氨酸G突变为赖氨酸K+第189位天冬氨酸N突变为丝氨酸S；

（3）第97位甘氨酸G突变为赖氨酸K+第189位天冬氨酸N突变为丝氨酸S+第301位亮氨酸L突变为谷氨酸E；

（4）第97位甘氨酸G突变为赖氨酸K+第189位天冬氨酸N突变为丝氨酸S+第301位亮氨酸L突变为谷氨酸E+第409位亮氨酸L突变为脯氨酸P；

（5）第97位甘氨酸G突变为赖氨酸K+第189位天冬氨酸N突变为丝氨酸S+第301位亮氨酸L突变为谷氨酸E+第409位亮氨酸L突变为脯氨酸P+第462位苏氨酸T突变为丙氨酸A。

2.如权利要求1所述的L-阿拉伯糖差向异构酶突变体，其特征在于所述L-阿拉伯糖差向异构酶突变体序列如SEQ ID NO. 7所示。

3.权利要求1或2所述L-阿拉伯糖差向异构酶突变体在催化D-半乳糖异构化制备D-塔格糖中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用为：以含L-阿拉伯糖差向异构酶编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经超声破碎后获得的上清液作为催化剂，以D-半乳糖为底物，在Mn²⁺存在下，在6.0~7.0 的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液中，70~85℃温度下反应，反应结束后，反应液分离纯化，获得D-塔格糖。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述L-阿拉伯糖差向异构酶突变体编码基因序列如SEQ ID NO. 8所示。