CN106566824B

CN106566824B - 一种葡萄糖异构酶、基因、载体、工程菌及其应用

Info

Publication number: CN106566824B
Application number: CN201610999999.4A
Authority: CN
Inventors: 郑裕国; 贾东旭; 周霖
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2016-11-14
Filing date: 2016-11-14
Publication date: 2019-05-28
Anticipated expiration: 2036-11-14
Also published as: CN106566824A

Abstract

本发明公开了一种葡萄糖异构酶、基因、载体、工程菌及其在催化D‑葡萄糖异构化制备D‑果糖中的应用，所述葡萄糖异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供了一种新的耐高温葡萄糖异构酶。本发明中所述葡萄糖异构酶具有较高酶活(2.42U/mg)和优良热稳定性，于85℃添加20mM锰盐助剂保温48h，仍保持80％以上初始酶活，具备在高温生物催化生产高果糖浆的工业化应用潜力。

Description

一种葡萄糖异构酶、基因、载体、工程菌及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种葡萄糖异构酶、基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，以及在高温下异构化葡萄糖生产高果糖浆的应用。

(二)背景技术

葡萄糖异构酶(glucose isomerase，简称GI，EC 5.3.1.5)，在体外主要用于催化D-葡萄糖异构化生成D-果糖，是工业上利用生物转化法制备高果糖浆的关键酶。根据GI的一级结构，可以将其分为两类，即I类和II类酶。与I类GI相比，II类GI的肽链N端含有多余的40-50个氨基酸残基(Deng H.et al.，Bioprocess and Biosystems Engineering，37：1211-1219，2014)。

高果糖浆(high fructose corn syrup，简称HFCS)是葡萄糖和果糖的混合物，是一种重要的甜味剂。高果糖浆具有溶解度高、化学和热稳定性好、渗透压大、吸潮性和保湿性强、与其它添加剂混合不影响食品风味等优势。根据其果糖含量的不同，高果糖浆主要有3种产品：HFCS-42、HFCS-55和HFCS-90。其中，HFCS-55的甜度优于蔗糖，是市场上的主流产品。但是，目前广泛采用的葡萄糖异构酶生物转化工艺无法一步制得F55型高果糖浆，需要将HFCS-42浓缩再与HFCS-90勾兑才能制得HFCS-55(Moeller S.M.et al.，Journal of theAmerican College of Nutrition,28:619-26，2009)。

GI介入的D-葡萄糖异构化过程是一个热力学平衡反应，随着异构化温度的升高，会促进异构化反应向果糖方向进行。目前，商业上用于生产高果糖浆的GI主要来源于Bacillus coagulans、Streptomyces murinus和Streptomyces rubiginosis等野生菌(Dicosimo R.et al.，Chemical Society Reviews,42：6437-6474，2013)。由于上述这些GI的耐热性一般，只能在60-65℃的异构化温度稳定地进行催化反应，果糖转化率仅42-45％。因此，如果能在高温如85℃或更高的异构化温度下催化，所生成的具有高果糖浓度的高果糖浆将有助于减少后续富集至F90型高果糖浆的成本，对推进高果糖浆的生产技术创新具有重要意义。

目前，已有一些耐热GI的报道，例如Thermotoga maritima和Thermusthermophiles等，其最适温度分别达到105℃和95℃，但是，这些酶并没有制成酶制剂成功投放于市场。鉴于此背景，本发明提出筛选新型耐高温GI基因，并通过基因工程技术构建高表达的基因工程菌用于在高温下生产高果糖浆，对于填补缺乏耐高温酶的市场空白具有重大意义。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种新的耐高温葡萄糖异构酶，编码基因，重组载体，及基因工程菌，以及葡萄糖异构酶基因工程菌在高温下催化D-葡萄糖异构化为D-果糖的应用，此新型耐高温葡萄糖异构酶有效拓展了该酶基因的来源与应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种葡萄糖异构酶，所述葡萄糖异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

任何对SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中氨基酸进行缺失、插入或替换的处理获得的多肽片段或其变体，只要其与该氨基酸具有95％以上的同源性，均属于本发明的保护范围。

本发明还提供一种所述葡萄糖异构酶的编码基因，为实现葡萄糖异构酶在大肠杆菌等原核生物中的可溶性异源表达，通过基因工程常规操作，以全合成的方法获得了对应于所述SEQ ID NO.1氨基酸序列的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示。

任何对SEQ ID NO.2所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入处理获得的核苷酸序列，只要其与SEQ ID NO.2所示核苷酸序列具有90％以上同源性，均属于本发明的保护范围。

本发明还涉及一种由所述葡萄糖异构酶编码基因构建的重组载体，以及由所述重组载体转化获得的重组基因工程菌。

本发明还涉及一种所述葡萄糖异构酶编码基因在制备葡萄糖异构酶中的应用，所述应用为构建含有所述葡萄糖异构酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导表达，取培养液分离得到含葡萄糖异构酶基因的菌体细胞。具体为：将含葡萄糖异构酶基因的基因工程菌接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃、150r/min培养10h，获得种子液；将种子液以体积浓度2％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃、150r/min培养OD₆₀₀至0.6-0.8，再向培养液中加入终浓度为0.1mM的IPTG，于28℃诱导10h，8000r/min离心10min，弃去上清液，收集湿菌体，即为含葡萄糖异构酶基因的菌体细胞；所述LB培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH值自然。

本发明还涉及一种葡萄糖异构酶在催化D-葡萄糖异构化制备D-果糖中的应用，所述应用为：以含葡萄糖异构酶基因的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为酶源，以D-葡萄糖为底物，以锰盐为助剂，以50mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄(pH 8.0)缓冲液为反应介质构成反应体系，在50-100℃(优选85℃)，150r/min条件下反应，待反应结束，将反应液分离纯化，获得D-果糖；所述反应体系中，底物初始浓度为50-500g/L(优选400g/L)，湿菌体的用量为10-50g/L(优选25g/L)，所述锰盐终浓度为5-25mM(优选20mM)。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明提供了一种新的耐高温葡萄糖异构酶。本发明中所述葡萄糖异构酶具有较高酶活(2.42U/mg)和优良热稳定性，于85℃添加20mM锰盐助剂保温48h，仍保持80％以上初始酶活，具备在高温生物催化生产高果糖浆的工业化应用潜力。

(四)附图说明

图1为葡萄糖异构酶的SDS-PAGE图谱；

图2为金属离子对重组酶酶活的影响示意图；

图3为重组酶的最适温度和热稳定性示意图；

图4为重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b/ToGI生产D-果糖的应用示意图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：葡萄糖异构酶的基因合成

利用蛋白质PDB数据库和NCBI数据库数据对葡萄糖异构酶基因序列进行筛选，得到来源于Thermus oshimai的葡萄糖异构酶基因(GenBank accession no.WP_016329521.1)。根据该葡萄糖异构酶的氨基酸序列，并依据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化，通过基因工程的常规操作以全合成的方法合成了该段葡萄糖异构酶核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示；编码酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。在核酸序列末端加入6×his-tag标签，两端加入酶切位点Xba I和Xho I，将该基因克隆至pET28b(+)对应的Xba I和Xho I位点，获得重组表达质粒pET28b/ToGI。

实施例2：重组质粒的转化与重组菌的筛选

将实施例1获得的重组表达质粒pET28b/ToGI转化至Escherichia coli BL21(DE3)受体菌中，涂布于含终浓度为50μg/mL卡那霉素的琼脂平板上，37℃下培养过夜，第2天于平板上长出的菌落中随机挑取克隆并抽提质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得含葡萄糖异构酶基因的基因工程菌。

实施例3：重组工程菌的诱导表达

LB液体培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH值自然；LB固体培养基在LB液体培养基中添加20g/L琼脂；121℃高压灭菌20min；使用前添加终浓度50μg/mL卡那霉素。

将实施例2获得的含葡萄糖异构酶基因的基因工程菌接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃、150r/min培养OD₆₀₀约0.6-0.8，获得种子液；将种子液以体积浓度2％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃、150r/min培养OD₆₀₀至0.6-0.8，再向培养液中加入终浓度为0.1mM的IPTG，于28℃下诱导表达10h后，4℃、8000r/min离心10min，弃去上清液，用0.85％的生理盐水清洗两遍湿菌体，并收集湿菌体，备用。

实施例4：重组工程菌的酶活的测定

采用超声破碎方法对湿菌体进行超声破碎，取1g实施例3制备的湿菌体，用20mLTris-HCl(pH 7.0)缓冲液悬浮，在39W条件下超声破碎20min，制备获得无细胞抽提液(即超声破碎后的混悬液)，离心，收集上清液，取1mL上清液用于反应。反应体系：Tris-HCl(pH7.0)缓冲液、1mM Co²⁺和10mM Mg²⁺、200mM D-葡萄糖，共5mL体系。反应条件：于85℃、150r/min条件下反应20min，冰浴10min终止反应，8000r/min离心10min，取上清液；采用HPLC检测D-葡萄糖和D-果糖的浓度。分析柱为Hypersil NH₂柱(250×4.6mm，5μm)(依利特分析仪器有限公司，大连，中国)。Waters 2414示差折光检测器，Waters 1525泵，Waters 717进样器。酶活定义：85℃和pH 7.0下，每分钟将D-葡萄糖异构化生成1μmol D-果糖所需酶量定义为一个酶活单位(U)。

表1重组葡萄糖异构酶的酶活测定

实施例5：纯化重组酶

收集实施例4制备的超声破碎后的上清液，取5μL上清液进行SDS-PAGE电泳分析，结果见图1所示。上清液在75℃热处理15min，然后在4℃、8000r/min离心10min，弃去沉淀，收集上清液。接着使用nickel-NTA琼脂糖凝胶柱进行纯化，用平衡缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 8.0)平衡层析柱，再使用洗脱液(50mM磷酸盐缓冲液，300mMNaCl，500mM咪唑，pH 8.0)进行洗脱，收集纯酶液，经酶活测定和SDS-PAGE分析，确定为在实施例6和7中使用的酶蛋白。

实施例6：金属离子对重组酶酶活的影响

将实施例5中的纯酶液作为转化用酶，测定金属离子对重组酶酶活的影响，具体操作如下：(1)所选单金属离子：Co²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Ba²⁺、Fe²⁺、Ni²⁺和Ca²⁺。5mL反应体系包括：50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)、200mM D-葡萄糖、1mL酶液和10mM不同金属离子。于85℃测定葡萄糖异构酶的活力，以不加金属离子作为对照。(2)设置三组组合金属，分别为：10mM Mg²⁺和5mM Co²⁺，10mM Mg²⁺和5mM Mn²⁺，10mM Mn²⁺和5mM Co²⁺替代单金属离子进行酶反应，测定酶活，以不加金属离子作为对照。由图2可知，Mn²⁺对葡萄糖异构酶的酶活有极大的促进作用，并且比组合金属的效果更为明显。

实施例7：纯化酶的最适温度和热稳定性

将实施例5中的纯酶液作为转化用酶，测定酶的最适反应温度。具体操作如下：50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)中，加入200mM D-葡萄糖、1mM Co²⁺、10mM Mg²⁺和1mL酶液，体系共5mL。分别于不同转化温度：65、70、75、80、85、90、95和100℃测定葡萄糖异构酶的活力。由图3中A可知，ToGI在95℃具有最高酶活。

将实施例5中的纯酶液作为转化用酶，测定纯化酶的热稳定性。具体操作如下：将酶液中加入20mM Mn²⁺，于85℃保温，并在0、1、2、3、4、6、8、20、24、28、48h取1mL酶液样品，测定残余酶活，将初始酶活力定义为100％。由图3中B可知，48h后活力仍能保持在80％左右。

实施例8：重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b/ToGI全细胞制备D-果糖。

以实施例3中获得的含有表达重组酶的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/ToGI湿菌体作为生物催化剂，以D-葡萄糖为底物，生物转化制备D-果糖。100mL催化体系包括：50mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄(pH8.0)缓冲液，400g/L D-葡萄糖、20mM Mn²⁺、25g/L湿菌体。于85℃、150r/min，反应8h。每隔1h取1mL反应液，离心，0.22μm膜过滤后用HPLC检测D-果糖的浓度。由图4可知，葡萄糖异构酶在5h底物转化率达52.16％。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江工业大学

<120> 一种葡萄糖异构酶、基因、载体、工程菌及其应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 393

<212> PRT

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

Met Tyr Glu Pro Lys Pro Glu His Lys Phe Thr Phe Gly Leu Trp Thr

1 5 10 15

Val Gly Asn Val Gly Arg Asp Pro Phe Gly Asp Ala Val Arg Glu Lys

20 25 30

Leu Asp Pro Val Tyr Val Val His Lys Leu Ala Glu Leu Gly Val Tyr

35 40 45

Gly Ile Asn Leu His Asp Glu Asp Leu Ile Pro Arg Gly Thr Pro Pro

50 55 60

Ala Glu Arg Asp Arg Ile Val Arg Arg Phe Arg Lys Ala Leu Glu Glu

65 70 75 80

Thr Gly Leu Lys Val Pro Met Val Thr Ala Asn Leu Phe Ser Asp Pro

85 90 95

Ala Phe Lys Asp Gly Ala Phe Thr Ser Pro Asp Pro Trp Val Arg Ala

100 105 110

Tyr Ala Leu Arg Lys Ser Leu Glu Thr Met Asp Leu Gly Ala Glu Leu

115 120 125

Gly Ala Glu Ile Tyr Val Val Trp Pro Gly Arg Glu Gly Ala Glu Val

130 135 140

Glu Ala Thr Gly Lys Ser Arg Arg Val Trp Gly Trp Val Arg Glu Ala

145 150 155 160

Leu Asn Phe Met Ala Ala Tyr Ala Glu Asp Gln Gly Tyr Gly Tyr Arg

165 170 175

Phe Ala Leu Glu Pro Lys Pro Asn Glu Pro Arg Gly Asp Ile Tyr Phe

180 185 190

Ala Thr Val Gly Ser Phe Leu Ala Phe Ile Tyr Thr Leu Asp Gln Pro

195 200 205

Glu Arg Phe Gly Leu Asn Pro Glu Phe Ala His Glu Thr Met Ala Gly

210 215 220

Leu Asn Phe Val His Ala Val Ala Gln Val Leu Asp Ala Gly Lys Leu

225 230 235 240

Phe His Ile Asp Leu Asn Asp Gln Arg Met Ser Arg Phe Asp Gln Asp

245 250 255

Leu Arg Phe Gly Ser Glu Asn Leu Lys Ala Ala Phe Phe Leu Val Asp

260 265 270

Leu Leu Glu Ser Ser Gly Tyr Gln Gly Pro Arg His Phe Asp Ala His

275 280 285

Ala Leu Arg Thr Glu Asp Glu Glu Gly Val Trp Ala Phe Ala Arg Gly

290 295 300

Cys Met Arg Thr Tyr Leu Ile Phe Lys Glu Lys Ala Gln Ala Phe Arg

305 310 315 320

Glu Asp Pro Glu Val Arg Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Tyr Gly Glu Asp

325 330 335

Pro Gln Ala Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ser Arg Glu Arg Ala Thr

340 345 350

Ala Leu Lys Glu Val Ala Leu Pro Leu Glu Ala Lys Arg Arg Arg Gly

355 360 365

Tyr Ala Leu Glu Arg Leu Asp Gln Leu Val Val Glu His Leu Leu Gly

370 375 380

Val Arg Gly His His His His His His

385 390

<210> 2

<211> 1179

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

atgtacgaac cgaaaccgga acacaaattc accttcggtc tgtggaccgt tggtaacgtt 60

ggtcgtgacc cgttcggtga cgctgttcgt gaaaaactgg acccggttta cgttgttcac 120

aaactggctg aactgggtgt ttacggtatc aacctgcacg acgaagacct gatcccgcgt 180

ggtaccccgc cggctgaacg tgaccgtata gttcgtaggt tccgtaaagc tctcgaagaa 240

accggtctga aagttccgat ggttaccgct aacctgttct ctgacccggc gttcaaagac 300

ggtgcgttca cctctccgga cccgtgggtt cgtgcttacg ctctgcgtaa atctctggaa 360

accatggacc tgggtgctga actgggtgct gaaatctacg ttgtttggcc gggtcgtgaa 420

ggtgctgaag ttgaagctac cggtaaatct cgtcgtgttt ggggttgggt tcgtgaagct 480

ctgaacttca tggctgctta cgctgaagac cagggttacg gttaccgttt cgctctggaa 540

ccgaaaccga acgaaccgcg tggtgacatc tacttcgcta ccgttggttc tttcctggct 600

ttcatctaca ccctcgacca gccagaaagg ttcggtctga acccagaatt cgctcacgaa 660

accatggctg gtctgaactt cgttcacgct gttgctcagg ttctggacgc tggtaaactg 720

ttccacatcg acctgaacga ccagcgtatg tctcgtttcg accaggacct gcgtttcggt 780

tctgaaaacc tgaaagctgc tttcttcctg gttgacctgc tggaatcttc tggttaccag 840

ggtccgcgtc acttcgacgc tcacgctctg cgtaccgaag acgaagaagg tgtttgggct 900

ttcgctcgtg gttgcatgcg tacctacctg atcttcaaag aaaaggcgca ggcgttccgt 960

gaagacccag aagttcgttc tctgctggaa gaatactacg gtgaagaccc gcaggctctg 1020

ggtctgctgg gtccgtactc tcgtgaacgt gctaccgctc tgaaagaagt tgctctgccg 1080

ctggaagcta aacgtcgtcg tggttacgct ctggaacgtc tggaccagct ggttgttgaa 1140

cacctgctgg gtgttcgtgg tcaccaccac caccaccac 1179

Claims

1.一种葡萄糖异构酶在催化D-葡萄糖异构化制备D-果糖中的应用，其特征在于所述的应用以含葡萄糖异构酶基因的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为酶源，以D-葡萄糖为底物，以锰盐为助剂，以pH 8.0、50mM的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液为反应介质构成反应体系，在50-100℃、150r/min条件下反应，待反应结束，将反应液分离纯化，获得D-果糖；所述葡萄糖异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述反应体系中，底物初始浓度为400g/L，湿菌体的用量为25g/L，所述锰盐终浓度为20mM。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述葡萄糖异构酶的编码基因核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述酶源制备方法为：将含葡萄糖异构酶基因的基因工程菌接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃、150r/min培养10h，获得种子液；将种子液以体积浓度2％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、150r/min培养OD₆₀₀至0.6-0.8，再向培养液中加入终浓度为0.1mM的IPTG，于28℃诱导10h，8000r/min离心10min，弃去上清液，收集湿菌体，即为酶源；所述LB液体培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH值自然。