CN108753747B - 一种热稳定性和海藻糖产量提高的MTSase突变体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种热稳定性和海藻糖产量提高的MTSase突变体，属于酶工程以及蛋白质工程技术领域。本发明的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体是通过将麦芽寡糖基海藻糖合成酶的一个氨基酸位点进行突变，得到了与亲本麦芽寡糖基海藻糖合成酶相比更高的热稳定性、更低的加酶量以及更高的产海藻糖转化率。本发明的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体在50℃的半衰期比野生型增加12h，是野生型的1.3倍。

Description

一种热稳定性和海藻糖产量提高的MTSase突变体

技术领域

本发明涉及一种热稳定性和海藻糖产量提高的MTSase突变体，属于酶工程以及蛋白质工程技术领域。

背景技术

海藻糖(Trehalose)是一种自然界中广泛存在的二糖，由两个葡萄糖通过α,α-1,1-糖苷键连接而成，因为其独特的高保湿性，热酸稳定性和安全性，被广泛应用于食品，农业，医药，化妆品。从20世纪80年代开始，各国相继开展了海藻糖生理生化和分子生物学的研究，该糖现已成为国际上最近开发的主要低聚糖之一。我国卫生部于2005年正式批准海藻糖为新资源食品。

目前，生产海藻糖的方法主要有三种，分别是酸化酶法、海藻糖合酶单酶法、MTSase和MTHase双酶法。其中，MTSase和MTHase双酶法采用液化后的淀粉作为底物，两个酶协同反应，生产海藻糖，该方法生产海藻糖的转化率较高，副产物较少，并用廉价的淀粉作为底物，降低了成本，因而得到了广泛的应用。

在应用MTSase和MTHase双酶法制备海藻糖的过程中，淀粉经过高温液化后加入支链淀粉酶作用生成麦芽糊精；麦芽寡糖基海藻糖合成酶作用于底物还原性末端的α,α-1,4-糖苷，产生α,α-1,1-糖苷键的分子内转糖苷作用，形成中间产物麦芽寡糖基海藻糖；麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)则专一的内切该中间产物中麦芽寡糖基与海藻糖相连的α,α-1,4-糖苷键，使之分解产生海藻糖和减少两个葡萄糖单位的新麦芽寡糖，减少两个葡萄糖单位的新麦芽寡糖作为新底物进行下一轮反应，如此反复交替进行两种酶反应就可以将麦芽寡糖转化成主要为海藻糖，以及少量葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖的产物。

因此，麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)是双酶法生产海藻糖的关键。

麦芽寡糖基海藻糖合成酶有两种类型，高温酶和中温酶，其中，高温酶在宿主中表达差，比活相对中温酶低，但中温酶因为稳定性较差，转化温度不能过高，导致反应中容易染菌，同时，还要在后续补加酶，成本较高，因而，对于中温酶的热稳定和活性改造显得尤为重要。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种热稳定性和海藻糖产量提高的MTSase突变体，其通过将麦芽寡糖基海藻糖合成酶的一个氨基酸位点进行突变，得到了与亲本麦芽寡糖基海藻糖合成酶相比更高的热稳定性、更低的加酶量以及更高的产海藻糖转化率。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种热稳定性和海藻糖产量提高的MTSase突变体，所述酶突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1麦芽寡糖基海藻糖合成酶的第44位氨基酸进行突变得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述酶突变体是通过将麦芽寡糖基海藻糖合成酶的第44位氨基酸由丝氨酸突变成脯氨酸得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的来源为分支节杆菌(Arthrobacter ramosus)。

在本发明的一种实施方式中，所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

本发明提供了上述一种热稳定性和海藻糖产量提高的MTSase突变体的制备方法，包含如下步骤：

步骤1：根据突变位点设计突变引物，以携带麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因的载体为模板进行定点突变，构建含编码突变体的基因的质粒载体；

步骤2：将突变体质粒转化进宿主细胞；

步骤3：挑选阳性克隆进行发酵培养，离心得到菌体并破壁即为麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的粗酶液。

本发明提供了编码上述一种热稳定性和海藻糖产量提高的MTSase突变体的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因的序列为SEQ ID NO.3。

本发明提供了携带上述基因的重组质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒载体为pUC质粒、pET质粒或pGEX质粒。

本发明提供了携带上述基因或上述重组质粒的宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌或真菌。

本发明提供了上述一种热稳定性和海藻糖产量提高的MTSase突变体或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞在生产海藻糖方面的应用。

有益效果：

(1)本发明构建了一个有意义的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体，实现了麦芽寡糖基海藻糖合成酶热稳定性的提高、加酶量的减少以及产海藻糖转化率的提高；

(2)本发明的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体在50℃的半衰期比野生型增加12h，是野生型的1.3倍，说明本发明的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的稳定性较野生型提高了1.3倍；

(3)利用本发明的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体生产海藻糖，最适加酶量为2.0U/ml，而野生型的最适加酶量为2.5U/ml，二者转化率分别是69.6％，64.0％，说明本发明的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体在稳定性改善的同时，不仅减少了加酶量，海藻糖转化率也得到提高；

附图说明

图1为野生型、本发明突变体突变体S44P、突变体L26F以及突变体T413Y在50℃的热稳定性；

图2为野生型和本发明突变体S44P产海藻糖的转化率。

具体实施方式

本发明的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

酶稳定性检测方法：

将纯化的酶用20mM pH 6.0磷酸盐缓冲液稀释至蛋白含量为0.25mg/mL，且pH为6.0，置于50℃恒温水浴中，每隔6h取样一次，测其残留酶活，比较其稳定性。

残留酶活检测方法：

预热：取1.9mL的0.2％麦芽糊精溶液(DE 9～13pH 6.0磷酸盐缓冲液)于具塞试管中，置于50℃水浴锅中预热10min。

反应：加入0.1mL稀释后的发酵胞内粗酶液，振荡均匀，准确计时10min，加入3mLDNS，振荡均匀，终止反应；煮沸7min，冷却。

测量：向上述反应体系中加入蒸馏水并定容至15mL，混匀；在540nm波长下测定吸光值并计算酶活力。

(酶活定义：每分钟相当于转化一微摩尔葡萄糖变为非还原性糖所需要的酶量。)

海藻糖转化率检测方法：

将反应产物稀释沉淀后用高效液相色谱(HPLC)测定其中海藻糖含量，计算转化率。

计算公式＝海藻糖质量/大米淀粉质量*100/％

HPLC检测条件：流动相(乙腈：水＝80：20)；流速：0.8mL/min，柱温40℃，NH2柱(APS-2HYPERSIL，Thermo Scientific)，示差折光检测器(RID)。

实施例1：野生型麦芽寡糖基海藻糖合成酶的表达

Arthrobacter ramosus基因组为模板，以核苷酸序列为SEQ ID NO.4：CATATGCCAGCTTCTACATAT的正向引物和核苷酸序列为SEQ ID NO.5：ATTACTGGTTGAAACCTAAAAGCTT的反向引物克隆含编码序列的目的基因treY，经过HindIII和NdeI双酶切后与表达载体pET24a连接，转入大肠杆菌BL21(DE3)，得到treY/pET24a/BL21(DE3)，接种treY/pET24a/BL21(DE3)于LB液体培养基(含100mg/L卡那霉素)生长10h，按5％接种量将种子接入TB液体发酵培养基(含100mg/L卡那霉素)，将大肠杆菌工程菌在37℃培养2h后，加入0.01mmol/L终浓度的IPTG(异丙基硫代-β-D半乳糖苷)进行诱导，并在25℃摇床继续培养发酵24h；将一定体积的发酵液于4℃、12000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，菌体沉淀用20mmol/L的pH6.0的磷酸盐缓冲液重新悬浮，混匀；用超声波细胞粉碎机破碎菌体悬浮液的细胞壁(超声细胞破碎机的工作条件：ψ6工作探头，工作时间10min，工作2s停3s，工作功率为20％)，然后12000rpm离心10min，离心后上清即为发酵胞内粗酶液。

实施例2：本发明麦芽寡糖基海藻糖合成酶单突变体的制备及表达

(1)单突变体S44P、L26F、T413Y构建：

定点突变：利用PCR技术，以treY/pET-24a(+)质粒为模板，突变引物为：

S44P：

正向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.6：CCTCTGTTAGAAAGTGAACCAGGTTCTTCAC(下划线为突变位点)

反向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.7：GTGAAGAACCTGGTTCACTTTCTAACAGAGG(下划线为突变位点)

L26F：

正向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.8：CAGCCCGTATTGTTCCATATTTTCATCGTTTAGGC(下划线为突变位点)

反向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.9：GCCTAAACGATGAAAATATGGAACAATACGGGCTG(下划线为突变位点)

T413Y：

正向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.10：CGCTTTCAGCAGTACTCAGGTATGATCATGGCC(下划线为突变位点)

反向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.11：GGCCATGATCATACCTGAGTACTGCTGAAAGCG(下划线为突变位点)

PCR体系为：20μM正向引物和反向引物各0.5μL，dNTPMix 4μL，5×PS Buffer 10μL，2.5U/μL的PrimeStar聚合酶0.5uL，模板0.5μL，加双蒸水补齐50μL。

PCR条件为：94℃预变性4min；随后进行25个循环(94℃10s，55℃5s，72℃7min40s)72℃延伸10min；最后4℃保温。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

将上述验证正确的PCR产物进行Dpn1消化，转入大肠杆菌JM109感受态细胞，转化产物涂布于含100mg/L卡那青霉素的LB平板上，经37℃过夜培养，平板上挑取2个单菌落，接入LB液体培养基，8h后提取质粒并测序，结果正确，然后转入大肠杆菌BL21(DE3)。

(2)突变体的表达

接种(1)所得的treY/pET24a/BL21(DE3)于LB液体培养基(含100mg/L卡那霉素)生长10h，按5％接种量将种子接入TB液体发酵培养基(含100mg/L卡那霉素)，将大肠杆菌工程菌在37℃培养2h后，加入0.01mmol/L终浓度的IPTG(异丙基硫代-β-D半乳糖苷)进行诱导，并在25℃摇床继续培养发酵24h；将一定体积的发酵液于4℃、12000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，菌体沉淀用20mmol/L的pH6.0的磷酸盐缓冲液重新悬浮，混匀；用超声波细胞粉碎机破碎菌体悬浮液的细胞壁(超声细胞破碎机的工作条件：ψ6工作探头，工作时间10min，工作2s停3s，工作功率为20％)，然后12000rpm离心10min，离心后上清即为发酵胞内粗酶液。

实施例3：本发明麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的热稳定性分析

将将实施例1和实施例2所得的发酵胞内粗酶液进行纯化，将纯化的酶进行稳定性检测。

检测结果如图1所示，可知，突变体S44P、L26F、T413Y和野生型半衰期分别是55h、40h、15h和43h，突变体S44P比野生型增加12h，是野生型的1.3倍，突变体L26F、T413Y半衰期比野生型减少，分别减少3h、28h。

实施例4：本发明麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的加酶量以及海藻糖转化率分析

以150g/L大米淀粉为底物，经过α-淀粉酶高温液化成DE值为16，调节初始pH为6.0，加入5U/g淀粉的普鲁兰酶(来源于Bacillus deramificans)，2U/mL的环糊精葡萄糖基转移酶(来源于Paenibacillus macerans)，0.5U/mL 4-α糖基转移酶(来源于Thermusaquaticus)，再分别加入入5.0U/mL的MTHase和梯度浓度为1.5U/mL、2.0U/mL、2.5U/mL、3.0U/mL的野生型MTSase或本发明的MTSase突变体S44P。反应条件为50℃，150r/min，反应36h后煮沸样品终止反应得到反应产物。

结果如图2，可知，野生型和突变体加酶量分别是1.5，2.0，2.5，3.0U/mL，得到野生型最适加酶量2.5U/mL，突变体最适加酶量2.0U/mL，即本发明的突变体的加酶量有所降低。

将上述反应产物进行海藻糖转化率分析。

检测结果为，在最适加酶量时，野生型的转化率为64.0％，突变体的转化率为69.6％，说明突变体使得转化率有所提高。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种热稳定性和海藻糖产量提高的MTSase突变体

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 757

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Pro Ala Ser Thr Tyr Arg Leu Gln Ile Ser Ala Glu Phe Thr Leu

1 5 10 15

Phe Asp Ala Ala Arg Ile Val Pro Tyr Leu His Arg Leu Gly Ala Asp

20 25 30

Trp Leu Tyr Leu Ser Pro Leu Leu Glu Ser Glu Ser Gly Ser Ser His

35 40 45

Gly Tyr Asp Val Val Asp His Ser Arg Val Asp Ala Ala Arg Gly Gly

50 55 60

Pro Glu Gly Leu Ala Glu Leu Ser Arg Ala Ala His Glu Arg Gly Met

65 70 75 80

Gly Val Val Val Asp Ile Val Pro Asn His Val Gly Val Ala Thr Pro

85 90 95

Lys Ala Asn Arg Trp Trp Trp Asp Val Leu Ala Arg Gly Gln Arg Ser

100 105 110

Glu Tyr Ala Asp Tyr Phe Asp Ile Asp Trp Glu Phe Gly Gly Gly Arg

115 120 125

Leu Arg Leu Pro Val Leu Gly Asp Gly Pro Asp Glu Leu Asp Ala Leu

130 135 140

Arg Val Asp Gly Asp Glu Leu Val Tyr Tyr Glu His Arg Phe Pro Ile

145 150 155 160

Ala Glu Gly Thr Gly Gly Gly Thr Pro Arg Glu Val His Asp Arg Gln

165 170 175

His Tyr Glu Leu Met Ser Trp Arg Arg Ala Asp His Asp Leu Asn Tyr

180 185 190

Arg Arg Phe Phe Ala Val Asn Thr Leu Ala Ala Val Arg Val Glu Asp

195 200 205

Pro Arg Val Phe Asp Asp Thr His Arg Glu Ile Gly Arg Trp Ile Ala

210 215 220

Glu Gly Leu Val Asp Gly Leu Arg Val Asp His Pro Asp Gly Leu Arg

225 230 235 240

Ala Pro Gly Asp Tyr Leu Arg Arg Leu Ala Glu Leu Ala Gln Gly Arg

245 250 255

Pro Ile Trp Val Glu Lys Ile Ile Glu Gly Asp Glu Arg Met Pro Pro

260 265 270

Gln Trp Pro Ile Ala Gly Thr Thr Gly Tyr Asp Ala Leu Ala Gly Ile

275 280 285

Asp Arg Val Leu Val Asp Pro Ala Gly Glu His Pro Leu Thr Gln Ile

290 295 300

Val Asp Glu Ala Ala Gly Ser Pro Arg Arg Trp Ala Glu Leu Val Pro

305 310 315 320

Glu Arg Lys Arg Ala Val Ala Arg Gly Ile Leu Asn Ser Glu Ile Arg

325 330 335

Arg Val Ala Arg Glu Leu Gly Glu Val Ala Gly Asp Val Glu Asp Ala

340 345 350

Leu Val Glu Ile Ala Ala Ala Leu Ser Val Tyr Arg Ser Tyr Leu Pro

355 360 365

Phe Gly Arg Glu His Leu Asp Glu Ala Val Ala Ala Ala Gln Ala Ala

370 375 380

Ala Pro Gln Leu Glu Ala Asp Leu Ala Ala Val Gly Ala Ala Leu Ala

385 390 395 400

Asp Pro Gly Asn Pro Ala Ala Leu Arg Phe Gln Gln Thr Ser Gly Met

405 410 415

Ile Met Ala Lys Gly Val Glu Asp Asn Ala Phe Tyr Arg Tyr Pro Arg

420 425 430

Leu Thr Ser Leu Thr Glu Val Gly Gly Asp Pro Ser Leu Phe Ala Ile

435 440 445

Asp Ala Ala Ala Phe His Ala Ala Gln Arg Asp Arg Ala Ala Arg Leu

450 455 460

Pro Glu Ser Met Thr Thr Leu Thr Thr His Asp Thr Lys Arg Ser Glu

465 470 475 480

Asp Thr Arg Ala Arg Ile Thr Ala Leu Ala Glu Ala Pro Glu Arg Trp

485 490 495

Arg Arg Phe Leu Thr Glu Val Gly Gly Leu Ile Gly Thr Gly Asp Arg

500 505 510

Val Leu Glu Asn Leu Ile Trp Gln Ala Ile Val Gly Ala Trp Pro Ala

515 520 525

Ser Arg Glu Arg Leu Glu Ala Tyr Ala Leu Lys Ala Ala Arg Glu Ala

530 535 540

Gly Glu Ser Thr Asp Trp Ile Asp Gly Asp Pro Ala Phe Glu Glu Arg

545 550 555 560

Leu Thr Arg Leu Val Thr Val Ala Val Glu Glu Pro Leu Val His Glu

565 570 575

Leu Leu Glu Arg Leu Val Asp Glu Leu Thr Ala Ala Gly Tyr Ser Asn

580 585 590

Gly Leu Ala Ala Lys Leu Leu Gln Leu Leu Ala Pro Gly Thr Pro Asp

595 600 605

Val Tyr Gln Gly Thr Glu Arg Trp Asp Arg Ser Leu Val Asp Pro Asp

610 615 620

Asn Arg Arg Pro Val Asp Phe Ala Ala Ala Ser Glu Leu Leu Asp Arg

625 630 635 640

Leu Asp Gly Gly Trp Arg Pro Pro Val Asp Glu Thr Gly Ala Val Lys

645 650 655

Thr Leu Val Val Ser Arg Ala Leu Arg Leu Arg Arg Asp Arg Pro Glu

660 665 670

Leu Phe Thr Ala Tyr His Pro Val Thr Ala Arg Gly Ala Gln Ala Glu

675 680 685

His Leu Ile Gly Phe Asp Arg Gly Gly Ala Ile Ala Leu Ala Thr Arg

690 695 700

Leu Pro Leu Gly Leu Ala Ala Ala Gly Gly Trp Gly Asp Thr Val Val

705 710 715 720

Asp Val Gly Glu Arg Ser Leu Arg Asp Glu Leu Thr Gly Arg Glu Ala

725 730 735

Arg Gly Ala Ala Arg Val Ala Glu Leu Phe Ala Asp Tyr Pro Val Ala

740 745 750

Leu Leu Val Glu Thr

755

<210> 2

<211> 757

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Pro Ala Ser Thr Tyr Arg Leu Gln Ile Ser Ala Glu Phe Thr Leu

1 5 10 15

Phe Asp Ala Ala Arg Ile Val Pro Tyr Leu His Arg Leu Gly Ala Asp

20 25 30

Trp Leu Tyr Leu Ser Pro Leu Leu Glu Ser Glu Pro Gly Ser Ser His

35 40 45

Gly Tyr Asp Val Val Asp His Ser Arg Val Asp Ala Ala Arg Gly Gly

50 55 60

Pro Glu Gly Leu Ala Glu Leu Ser Arg Ala Ala His Glu Arg Gly Met

65 70 75 80

Gly Val Val Val Asp Ile Val Pro Asn His Val Gly Val Ala Thr Pro

85 90 95

Lys Ala Asn Arg Trp Trp Trp Asp Val Leu Ala Arg Gly Gln Arg Ser

100 105 110

Glu Tyr Ala Asp Tyr Phe Asp Ile Asp Trp Glu Phe Gly Gly Gly Arg

115 120 125

Leu Arg Leu Pro Val Leu Gly Asp Gly Pro Asp Glu Leu Asp Ala Leu

130 135 140

Arg Val Asp Gly Asp Glu Leu Val Tyr Tyr Glu His Arg Phe Pro Ile

145 150 155 160

Ala Glu Gly Thr Gly Gly Gly Thr Pro Arg Glu Val His Asp Arg Gln

165 170 175

His Tyr Glu Leu Met Ser Trp Arg Arg Ala Asp His Asp Leu Asn Tyr

180 185 190

Arg Arg Phe Phe Ala Val Asn Thr Leu Ala Ala Val Arg Val Glu Asp

195 200 205

Pro Arg Val Phe Asp Asp Thr His Arg Glu Ile Gly Arg Trp Ile Ala

210 215 220

Glu Gly Leu Val Asp Gly Leu Arg Val Asp His Pro Asp Gly Leu Arg

225 230 235 240

Ala Pro Gly Asp Tyr Leu Arg Arg Leu Ala Glu Leu Ala Gln Gly Arg

245 250 255

Pro Ile Trp Val Glu Lys Ile Ile Glu Gly Asp Glu Arg Met Pro Pro

260 265 270

Gln Trp Pro Ile Ala Gly Thr Thr Gly Tyr Asp Ala Leu Ala Gly Ile

275 280 285

Asp Arg Val Leu Val Asp Pro Ala Gly Glu His Pro Leu Thr Gln Ile

290 295 300

Val Asp Glu Ala Ala Gly Ser Pro Arg Arg Trp Ala Glu Leu Val Pro

305 310 315 320

Glu Arg Lys Arg Ala Val Ala Arg Gly Ile Leu Asn Ser Glu Ile Arg

325 330 335

Arg Val Ala Arg Glu Leu Gly Glu Val Ala Gly Asp Val Glu Asp Ala

340 345 350

Leu Val Glu Ile Ala Ala Ala Leu Ser Val Tyr Arg Ser Tyr Leu Pro

355 360 365

Phe Gly Arg Glu His Leu Asp Glu Ala Val Ala Ala Ala Gln Ala Ala

370 375 380

Ala Pro Gln Leu Glu Ala Asp Leu Ala Ala Val Gly Ala Ala Leu Ala

385 390 395 400

Asp Pro Gly Asn Pro Ala Ala Leu Arg Phe Gln Gln Thr Ser Gly Met

405 410 415

Ile Met Ala Lys Gly Val Glu Asp Asn Ala Phe Tyr Arg Tyr Pro Arg

420 425 430

Leu Thr Ser Leu Thr Glu Val Gly Gly Asp Pro Ser Leu Phe Ala Ile

435 440 445

Asp Ala Ala Ala Phe His Ala Ala Gln Arg Asp Arg Ala Ala Arg Leu

450 455 460

Pro Glu Ser Met Thr Thr Leu Thr Thr His Asp Thr Lys Arg Ser Glu

465 470 475 480

Asp Thr Arg Ala Arg Ile Thr Ala Leu Ala Glu Ala Pro Glu Arg Trp

485 490 495

Arg Arg Phe Leu Thr Glu Val Gly Gly Leu Ile Gly Thr Gly Asp Arg

500 505 510

Val Leu Glu Asn Leu Ile Trp Gln Ala Ile Val Gly Ala Trp Pro Ala

515 520 525

Ser Arg Glu Arg Leu Glu Ala Tyr Ala Leu Lys Ala Ala Arg Glu Ala

530 535 540

Gly Glu Ser Thr Asp Trp Ile Asp Gly Asp Pro Ala Phe Glu Glu Arg

545 550 555 560

Leu Thr Arg Leu Val Thr Val Ala Val Glu Glu Pro Leu Val His Glu

565 570 575

Leu Leu Glu Arg Leu Val Asp Glu Leu Thr Ala Ala Gly Tyr Ser Asn

580 585 590

Gly Leu Ala Ala Lys Leu Leu Gln Leu Leu Ala Pro Gly Thr Pro Asp

595 600 605

Val Tyr Gln Gly Thr Glu Arg Trp Asp Arg Ser Leu Val Asp Pro Asp

610 615 620

Asn Arg Arg Pro Val Asp Phe Ala Ala Ala Ser Glu Leu Leu Asp Arg

625 630 635 640

Leu Asp Gly Gly Trp Arg Pro Pro Val Asp Glu Thr Gly Ala Val Lys

645 650 655

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Leu Phe Thr Ala Tyr His Pro Val Thr Ala Arg Gly Ala Gln Ala Glu

675 680 685

His Leu Ile Gly Phe Asp Arg Gly Gly Ala Ile Ala Leu Ala Thr Arg

690 695 700

Leu Pro Leu Gly Leu Ala Ala Ala Gly Gly Trp Gly Asp Thr Val Val

705 710 715 720

Asp Val Gly Glu Arg Ser Leu Arg Asp Glu Leu Thr Gly Arg Glu Ala

725 730 735

Arg Gly Ala Ala Arg Val Ala Glu Leu Phe Ala Asp Tyr Pro Val Ala

740 745 750

Leu Leu Val Glu Thr

755

<210> 3

<211> 2274

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgccagctt ctacatatcg tttacagatt tcagccgagt tcaccttatt tgatgcagcc 60

cgtattgttc catatctgca tcgtttaggc gccgattggt tatatctgag tcctctgtta 120

gaaagtgaac caggttcttc acatggctat gatgttgtgg atcattcgag ggtggatgca 180

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gaaaaaatca tcgaagggga tgaacgtatg ccacctcagt ggccaattgc gggtacaacc 840

ggctatgatg ccctggcagg catcgatcgt gttctggttg atccagcggg cgaacatcct 900

ctgacacaga ttgtggatga agctgccggc tctccacgtc gctgggcaga actggttcca 960

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ggtgtggaag ataatgcctt ttatcgctat cctcgcctga cctcactgac ggaagtgggc 1320

ggtgaccctt cactgtttgc aatcgatgct gctgcctttc atgcggcaca gcgcgatcgt 1380

gcggcccgtc tgccagaaag tatgacaacc ctgacaaccc atgataccaa acgctcagaa 1440

gatactaggg cccgcatcac cgccttagca gaagctccgg aacgttggcg tcgctttctg 1500

acggaagtgg gcggtctgat tggtactggg gatcgcgttt tagaaaacct catctggcag 1560

gccattgtgg gtgcttggcc agcgagtcgc gaacgcctgg aagcgtacgc cttaaaagcc 1620

gctagagaag caggtgaaag taccgattgg attgatggag atccggcctt tgaagaacgc 1680

ctgacccgcc tggttacggt tgctgtggaa gaaccattag ttcatgaatt attagaacgc 1740

ttagttgatg aactgaccgc cgcaggctat agtaatggct tagccgccaa actgttacag 1800

ttactggcac cgggtacacc agatgtgtat cagggtacgg aacgctggga tcgtagttta 1860

gttgatccag ataatcgtcg tccggttgat tttgcggcgg ccagtgaact gttagatcgc 1920

ttagatggcg gttggcgtcc accagtggat gaaacaggtg cagttaaaac actggttgtg 1980

tctcgcgcac tgcgcttacg tcgcgatcgt ccagaattat tcaccgcata tcatccagtg 2040

acggcacgcg gtgctcaggc tgaacatctt atcggctttg atcgcggcgg tgcaattgcc 2100

ctggcaaccc gtttaccatt aggcttagcc gcagcgggcg gctggggaga taccgttgtt 2160

gatgtgggtg aacgtagtct gcgcgatgaa ctgacgggtc gtgaagcccg cggcgcagcg 2220

cgggttgccg aactgtttgc agattatcca gttgcattac tggttgaaac ctaa 2274

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

catatgccag cttctacata t 21

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

attactggtt gaaacctaaa agctt 25

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cctctgttag aaagtgaacc aggttcttca c 31

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtgaagaacc tggttcactt tctaacagag g 31

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cagcccgtat tgttccatat tttcatcgtt taggc 35

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gcctaaacga tgaaaatatg gaacaatacg ggctg 35

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cgctttcagc agtactcagg tatgatcatg gcc 33

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggccatgatc atacctgagt actgctgaaa gcg 33

Claims (9)

1.一种热稳定性和海藻糖产量提高的MTSase突变体，其特征在于，所述MTSase突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1麦芽寡糖基海藻糖合成酶的第44位氨基酸由丝氨酸突变成脯氨酸得到的。

2.如权利要求1所述的一种热稳定性和海藻糖产量提高的MTSase突变体，其特征在于，所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的来源为分支节杆菌(Arthrobacter ramosus)。

3.如权利要求1或2所述的一种热稳定性和海藻糖产量提高的MTSase突变体，其特征在于，所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

4.编码权利要求1-3任一所述的一种热稳定性和海藻糖产量提高的MTSase突变体的基因。

5.如权利要求4所述的基因，其特征在于，所述基因的序列为SEQ ID NO.3。

6.携带权利要求4或5所述基因的重组质粒。

7.如权利要求6所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒载体为pUC质粒、pET质粒或pGEX质粒。

8.携带权利要求4或5所述基因或权利要求6所述重组质粒的宿主细胞。

9.权利要求1-3任一所述的一种热稳定性和海藻糖产量提高的MTSase突变体或权利要求4或5所述的基因或权利要求6所述的重组质粒或权利要求8所述的宿主细胞在生产海藻糖方面的应用。

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