CN107227304A

CN107227304A - 一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的制备及其应用

Info

Publication number: CN107227304A
Application number: CN201710585267.5A
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 宿玲恰; 吴世雄
Original assignee: Hunan Huisheng Biological Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Hunan Jindai Technology Development Co.,Ltd.
Priority date: 2015-04-02
Filing date: 2015-04-02
Publication date: 2017-10-03
Anticipated expiration: 2035-04-02
Also published as: CN107227304B; CN104745562A

Abstract

本发明公开了一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的制备及其应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明是将嗜酸热硫矿硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909麦芽寡糖基海藻糖合成酶表面疏水区域相关的氨基酸残基进行取代。所得突变体实现了麦芽寡糖基海藻糖合成酶可溶性表达量不同程度的提高，突变体M106K、M106H麦芽寡糖基海藻糖合成酶可溶性表达量分别提高了145.32％、92.38％。突变体可溶性表达的提高利于其工业化应用。

Description

一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的制备及其应用

技术领域

本发明涉及一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的制备及其应用，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

海藻糖(Trehalose)是由两个吡喃环葡萄糖以1,1-糖苷键连结而成，是一种稳定的非还原性二糖，它有3种光学异构体，即αα型、αβ型和ββ型。

海藻糖是一种安全的非还原性二糖，广泛存在于自然界中，具有保湿性，抗冻抗干燥性，热酸稳定性等特殊的生物学功能，对生物大分子有着非特异性的保护作用，因此在医学、农业、化妆品、食品等行业应用潜力巨大。自20世纪80年代后，各国相继开展了海藻糖生理生化和分子生物学的研究，该糖现已成为国际上最近开发的主要低聚糖之一。

酶法转化生产海藻糖是上世界90年代逐渐兴起的方法，主要有磷酸化酶法、海藻糖合成酶法和双酶法这三种方法。当前以淀粉为底物经过麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶的共同作用生成海藻糖，即双酶法生产海藻糖，受到广泛关注。以该方法生产海藻糖的转化率高达80％以上，在一定程度上降低了海藻糖的生产成本并极大的推动了海藻糖的工业化生产进程。

麦芽寡糖基海藻糖合成酶是双酶法生产海藻糖的其中一种酶。淀粉经过高温液化后加入支链淀粉酶作用生成麦芽糊精，麦芽寡糖基海藻糖合成酶作用于底物还原性末端的α,α-1,4-糖苷，产生α,α-1,4-糖苷键到α,α-1,1-糖苷键的分子内转糖苷作用，形成中间产物麦芽寡糖基海藻糖，麦芽寡糖基海藻糖水解酶则专一的内切该中间产物中麦芽寡糖基与海藻糖相连的α,α-1,4-糖苷键，使之分解产生海藻糖和减少两个葡萄糖单位的新麦芽寡糖，减少两个葡萄糖单位的新麦芽寡糖作为新底物进行下一轮反应，如此反复交替进行两种酶反应就可以将麦芽寡糖转化成主要为海藻糖，以及少量葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖的产物。

双酶法生产海藻糖以淀粉为底物，转化率高达80％以上，具有低成本的优点，但是麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因在宿主菌中的可溶性表达很低，产生较多的包涵体，酶活力低，不利于其工业化应用。因此，本发明利用基因工程和酶工程手段，在不影响麦芽寡糖基海藻糖合成酶酶学性质和转化率的基础上提高其可溶性表达，从而提高酶活，为其工业化生产创造条件。

发明内容

本发明提供了一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体，该突变体是通过将Sulfolobus acidocaldariusATCC 33909来源的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的蛋白表面疏水区域相关氨基酸残基进行取代后得到的。与其亲代的麦芽寡糖基海藻糖合成酶相比，突变体在宿主菌中的可溶性表达有一定程度的提高，宿主菌胞内麦芽寡糖基海藻糖合成酶酶活提高。

所述Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909来源的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第96位亮氨酸(Leu)突变为苏氨酸(Thr)，突变体命名为L96T。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第96位亮氨酸(Leu)突变为组氨酸(His)，突变体命名为L96H。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第106位甲硫氨酸(Met)突变为赖氨酸(Lys)，突变体命名为M106K。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第106位甲硫氨酸(Met)突变为组氨酸(His)，突变体命名为M106H。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第374位脯氨酸(Pro)突变为谷氨酸(Glu)，突变体命名为P374E。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第374位脯氨酸(Pro)突变为组氨酸(His)，突变体命名为P374H。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第520位异亮氨酸(Ile)突变为组氨酸(His)，突变体命名为I520H。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第520位异亮氨酸(Ile)突变为精氨酸(Arg)，突变体命名为I520R。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第96位亮氨酸(Leu)突变为苏氨酸(Thr)，同时将第106位甲硫氨酸(Met)突变为赖氨酸(Lys)，突变体命名为L96T/M106K。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的制备方法，包括如下步骤：

(1)根据确定的突变位点，设计定点突变的突变引物，以携带麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含编码突变体的基因的质粒载体；

(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；

(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，离心收集细胞，细胞破壁上清即为麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的粗酶液。

所述质粒载体为pUC系列，pET系列，或pGEX中的任意一种。

所述宿主细胞为细菌或真菌细胞。

所述的细菌为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。

本发明提供了一系列在宿主菌中可溶性表达强度提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体。在适当的培养条件下，突变体L96T、L96H、M106K、M106H、I520H、I520R、L96T/M106K麦芽寡糖基海藻糖合成酶的酶活分别为野生酶的2.69倍、1.16倍、2.45倍、1.92倍、1.07倍、1.09倍、3.04倍。

附图说明

图1野生型麦芽寡糖基海藻糖合成酶和突变体(L96T、L96H、M106K、M106H、I520H、I520R、L96T/M106K)重组菌摇瓶酶活力测定

具体实施方式

实施例1野生麦芽寡糖基海藻糖合成酶的制备

(1)麦芽寡糖基海藻糖合成酶重组菌的构建

根据NCBI上的treY氨基酸序列(NCBI编号：WP_015385613.1)，将NCBI上的treY基因序列(NCBI编号：NC_020247.1)进行密码子优化，采用化学全合成方法合成麦芽寡糖基海藻糖合成酶的基因序列treY。用于构建大肠杆菌表达载体的质粒是pET24a(+)。将pET24a(+)质粒和带有treY基因的质粒分别进行NdeⅠ和HindⅢ双酶切，酶切产物经胶回收后，用T4连接酶连接过夜，连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，转化产物涂布于含100mg/L卡那霉素的LB平板，经37℃培养过夜，平板上挑取3个单菌落，接入LB液体培养基，8h后抽提质粒验证，结果正确，得到富集的treY/pET24a质粒。将质粒treY/pET24a转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取转化子在LB液体培养基(含100mg/L卡那霉素)中37℃培养过夜，保存甘油管，命名为treY/pET24a/BL21(DE3)。

(2)麦芽寡糖基海藻糖合成酶的表达

从甘油管接种treY/pET24a/BL21(DE3)于LB液体培养基(含100mg/L卡那霉素)生长8h，按5％接种量将种子接入TB液体发酵培养基(含100mg/L卡那霉素)。大肠杆菌在37℃培养2h后，加入0.01mM终浓度的IPTG(异丙基硫代-β-D半乳糖苷)进行诱导，并在25℃摇床继续培养发酵24h后，将一定体积发酵液于4℃、12000r·min^-1离心10min去上清液，收集菌体，菌体沉淀用50mmol·L^-1pH 8.5Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液重新悬浮，混匀。用超声波细胞粉碎机破碎菌体悬浮液的细胞壁(超声细胞破碎机的工作条件：工作探头，工作时间5min，工作3s停3s，工作功率为20％)，然后12000r·min^-1离心10min，离心后上清即为发酵胞内粗酶液。

实施例2麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的制备及表达

(1)突变体的制备

来源于Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的八种突变体酶L96T、L96H、M106K、M106H、P374E、P374H、I520H、I520R：根据Sulfolobusacidocaldarius ATCC 33909麦芽寡糖基海藻糖合成酶的基因序列，分别设计并合成引入L96T、L96H、M106K、M106H、P374E、P374H、I520H、I520R突变的引物，对麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因进行定点突变，测定DNA编码序列，分别鉴别出第96位的Leu密码子变成Thr密码子和His密码子，第106位的Met密码子变成Lys密码子和His密码子，第374位的Pro密码子变成Glu密码子和His密码子，第520位的Ile密码子变成His密码子和Arg密码子。将突变体基因置于适当的表达载体并导入大肠杆菌中进行表达，得到单突变麦芽寡糖基海藻糖合成酶。单突变L96T、L96H、M106K、M106H、P374E、P374H、I520H、I520R的定点突变：利用快速PCR技术，以表达载体treY/pET24a(+)为模板。

引入L96T突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-GGTTAACAGCACGAATTGGCGC-3’(下划线为突变碱基)

反向引物：5’-GCGCCAATTCGTGCTGTTAACC-3’(下划线为突变碱基)

引入L96H突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-GGTTAACAGCCACAATTGGCGC-3’(下划线为突变碱基)

反向引物：5’-GCGCCAATTGTGGCTGTTAACC-3’(下划线为突变碱基)

引入M106K突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-ATGTTCTGAAGAAGGGTAAGAA-3’(下划线为突变碱基)

反向引物：5’-TTCTTACCCTTCTTCAGAACAT-3’(下划线为突变碱基)

引入M106H突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-ATGTTCTGAAGCACGGTAAGAA-3’(下划线为突变碱基)

反向引物：5’-TTCTTACCGTGCTTCAGAACAT-3’(下划线为突变碱基)

引入P374E突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-CCAAACGTAATGAGGAAGCGTA-3’(下划线为突变碱基)

反向引物：5’-TACGCTTCCTCATTACGTTTGG-3’(下划线为突变碱基)

引入P374H突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-CCAAACGTAATCACGAAGCGTA-3’(下划线为突变碱基)

反向引物：5’-TACGCTTCGTGATTACGTTTGG-3’(下划线为突变碱基)

引入I520H突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-TGAAGCGAAACACAATACGAGC-3’(下划线为突变碱基)

反向引物：5’-GCTCGTATTCTTTGAGGCTTCA-3’(下划线为突变碱基)

引入I520R突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-TGAAGCGAAACGGAATACGAGC-3’(下划线为突变碱基)

反向引物：5’-GCTCGTATTCCGTTTCGCTTCA-3’(下划线为突变碱基)

PCR反应体系均为：5×PS buffer 10μL，dNTPs Mix(2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA 1μL，PrimerStar HS(5U/μL)0.5μL，加入双蒸水至50μL。

PCR扩增条件为：94℃预变性4min；随后30个循环(98℃10s，55℃5s，72℃7min30s)；72℃继续延伸10min。

PCR产物经DpnⅠ消化，转化大肠杆菌JM109感受态，感受态细胞在LB固体培养基(含100mg/L氨苄青霉素)培养过夜后，挑克隆于LB液体培养基(含100mg/L氨苄青霉素)中培养后提取质粒，将突变质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，所有突变质粒均测序正确。

(2)突变体酶的表达

突变体表达过程如实施例1所述。

实施例3麦芽寡糖基海藻糖合成酶酶活力分析

(1)酶活单位定义

采用3，5-二硝基水扬酸法(DNS法)测定麦芽寡糖基海藻糖合成酶酶活时，每分钟转化1μmol麦芽五糖为麦芽三糖基海藻糖所需的酶量作为一个活力单位。

(2)酶活力测定步骤

预热：取0.5mL的1％麦芽五糖溶液(50mM pH5.5磷酸盐缓冲液)于试管中，置于60℃水浴锅中预热10min。

反应：加入0.05mL发酵胞内粗酶液，振荡均匀，准确计时10min，沸水浴煮沸10min终止反应，冷却。加入1mLDNS振荡均匀，沸水浴煮沸7min，冷却。

测量：向上述反应体系中加入蒸馏水并定容至10mL，混匀。在540nm波长下测定吸光值并计算酶活力。

野生型麦芽寡糖基海藻糖合成酶和突变体酶的摇瓶培养24h OD_600nm及酶活力列于表1，其中L96T和M106K效果最显著，酶活分别为野生酶的2.69倍和2.45倍。此外，酶学定性实验结果表明，各突变体的酶学性质均与野生酶相似。

表1野生型麦芽寡糖基海藻糖合成酶和突变体酶的摇瓶OD_600nm及酶活

实施例4麦芽寡糖基海藻糖合成酶双突变体的制备

由实施例3发现，在众多突变体中突变体L96T和突变体M106K可溶性表达显著提高，由此将麦芽寡糖基海藻糖合成酶Leu96位点和Met106位点进行双突变，设计突变体L96T/M106K。

双突变L96T/M106K的定点突变：利用快速PCR技术，以表达载体L96T/pET24a(+)为模板。

引入M106K突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-ATGTTCTGAAGAAGGGTAAGAA-3’(下划线为突变碱基)

反向引物：5’-TTCTTACCCTTCTTCAGAACAT-3’(下划线为突变碱基)

PCR反应体系、反应条件及突变基因的测序方法同单突变体的方法。

实施例5麦芽寡糖基海藻糖合成酶双突变体L96T/M106K酶活力分析

酶活测定方法如实施例3所述。

野生型麦芽寡糖基海藻糖合成酶和双突变体酶的摇瓶培养24h OD_600nm及酶活力列于表2，酶学定性实验结果表明，双突变体的酶学性质与野生酶相似。

表2野生型麦芽寡糖基海藻糖合成酶和双突变体酶的摇瓶OD_600nm及酶活

突变体L96T、L96H、M106K、M106H、I520H、I520R、L96T/M106K麦芽寡糖基海藻糖合成酶的酶活力分别为野生酶的2.69倍、1.16倍、2.45倍、1.92倍、1.07倍、1.09倍、3.04倍。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南汇升生物科技有限公司

<120> 一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的制备及其应用

<160> 19

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 720

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Ile Ser Ala Thr Tyr Arg Leu Gln Leu Asn Lys Asn Phe Asn Phe

1 5 10 15

Gly Asp Val Ile Asp Asn Leu Trp Tyr Phe Lys Asp Leu Gly Val Ser

20 25 30

His Leu Tyr Leu Ser Pro Val Leu Met Ala Ser Pro Gly Ser Asn His

35 40 45

Gly Tyr Asp Val Ile Asp His Ser Arg Ile Asn Asp Glu Leu Gly Gly

50 55 60

Glu Lys Glu Tyr Arg Arg Leu Ile Glu Thr Ala His Thr Ile Gly Leu

65 70 75 80

Gly Ile Ile Gln Asp Ile Val Pro Asn His Met Ala Val Asn Ser Leu

85 90 95

Asn Trp Arg Leu Met Asp Val Leu Lys Met Gly Lys Lys Ser Lys Tyr

100 105 110

Tyr Thr Tyr Phe Asp Phe Phe Pro Glu Asp Asp Lys Ile Arg Leu Pro

115 120 125

Ile Leu Gly Glu Asp Leu Asp Thr Val Ile Ser Lys Gly Leu Leu Lys

130 135 140

Ile Val Lys Asp Gly Asp Glu Tyr Phe Leu Glu Tyr Phe Lys Trp Lys

145 150 155 160

Leu Pro Leu Thr Glu Val Gly Asn Asp Ile Tyr Asp Thr Leu Gln Lys

165 170 175

Gln Asn Tyr Thr Leu Met Ser Trp Lys Asn Pro Pro Ser Tyr Arg Arg

180 185 190

Phe Phe Asp Val Asn Thr Leu Ile Gly Val Asn Val Glu Lys Asp His

195 200 205

Val Phe Gln Glu Ser His Ser Lys Ile Leu Asp Leu Asp Val Asp Gly

210 215 220

Tyr Arg Ile Asp His Ile Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Glu Lys Tyr Ile

225 230 235 240

Asn Asp Leu Arg Ser Ile Ile Lys Asn Lys Ile Ile Ile Val Glu Lys

245 250 255

Ile Leu Gly Phe Gln Glu Glu Leu Lys Leu Asn Ser Asp Gly Thr Thr

260 265 270

Gly Tyr Asp Phe Leu Asn Tyr Ser Asn Leu Leu Phe Asn Phe Asn Gln

275 280 285

Glu Ile Met Asp Ser Ile Tyr Glu Asn Phe Thr Ala Glu Lys Ile Ser

290 295 300

Ile Ser Glu Ser Ile Lys Lys Ile Lys Ala Gln Ile Ile Asp Glu Leu

305 310 315 320

Phe Ser Tyr Glu Val Lys Arg Leu Ala Ser Gln Leu Gly Ile Ser Tyr

325 330 335

Asp Ile Leu Arg Asp Tyr Leu Ser Cys Ile Asp Val Tyr Arg Thr Tyr

340 345 350

Ala Asn Gln Ile Val Lys Glu Cys Asp Lys Thr Asn Glu Ile Glu Glu

355 360 365

Ala Thr Lys Arg Asn Pro Glu Ala Tyr Thr Lys Leu Gln Gln Tyr Met

370 375 380

Pro Ala Val Tyr Ala Lys Ala Tyr Glu Asp Thr Phe Leu Phe Arg Tyr

385 390 395 400

Asn Arg Leu Ile Ser Ile Asn Glu Val Gly Ser Asp Leu Arg Tyr Tyr

405 410 415

Lys Ile Ser Pro Asp Gln Phe His Val Phe Asn Gln Lys Arg Arg Gly

420 425 430

Lys Ile Thr Leu Asn Ala Thr Ser Thr His Asp Thr Lys Phe Ser Glu

435 440 445

Asp Val Arg Met Lys Ile Ser Val Leu Ser Glu Phe Pro Glu Glu Trp

450 455 460

Lys Asn Lys Val Glu Glu Trp His Ser Ile Ile Asn Pro Lys Val Ser

465 470 475 480

Arg Asn Asp Glu Tyr Arg Tyr Tyr Gln Val Leu Val Gly Ser Phe Tyr

485 490 495

Glu Gly Phe Ser Asn Asp Phe Lys Glu Arg Ile Lys Gln His Met Ile

500 505 510

Lys Ser Val Arg Glu Ala Lys Ile Asn Thr Ser Trp Arg Asn Gln Asn

515 520 525

Lys Glu Tyr Glu Asn Arg Val Met Glu Leu Val Glu Glu Thr Phe Thr

530 535 540

Asn Lys Asp Phe Ile Lys Ser Phe Met Lys Phe Glu Ser Lys Ile Arg

545 550 555 560

Arg Ile Gly Met Ile Lys Ser Leu Ser Leu Val Ala Leu Lys Ile Met

565 570 575

Ser Ala Gly Ile Pro Asp Phe Tyr Gln Gly Thr Glu Ile Trp Arg Tyr

580 585 590

Leu Leu Thr Asp Pro Asp Asn Arg Val Pro Val Asp Phe Lys Lys Leu

595 600 605

His Glu Ile Leu Glu Lys Ser Lys Lys Phe Glu Lys Asn Met Leu Glu

610 615 620

Ser Met Asp Asp Gly Arg Ile Lys Met Tyr Leu Thr Tyr Lys Leu Leu

625 630 635 640

Ser Leu Arg Lys Gln Leu Ala Glu Asp Phe Leu Lys Gly Glu Tyr Lys

645 650 655

Gly Leu Asp Leu Glu Glu Gly Leu Cys Gly Phe Ile Arg Phe Asn Lys

660 665 670

Ile Leu Val Ile Ile Lys Thr Lys Gly Ser Val Asn Tyr Lys Leu Lys

675 680 685

Leu Glu Glu Gly Ala Ile Tyr Thr Asp Val Leu Thr Gly Glu Glu Ile

690 695 700

Lys Lys Glu Val Gln Ile Asn Glu Leu Pro Arg Ile Leu Val Arg Met

705 710 715 720

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ggttaacagc ctgaattggc gc 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gcgccaattc aggctgttaa cc 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ggttaacagc acgaattggc gc 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gcgccaattc gtgctgttaa cc 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ggttaacagc cacaattggc gc 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gcgccaattg tggctgttaa cc 22

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

atgttctgaa gaagggtaag aa 22

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<212> DNA

<213> 人工合成

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ttcttaccct tcttcagaac at 22

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

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atgttctgaa gcacggtaag aa 22

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<212> DNA

<213> 人工合成

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ttcttaccgt gcttcagaac at 22

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<212> DNA

<213> 人工合成

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ccaaacgtaa tgaggaagcg ta 22

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<212> DNA

<213> 人工合成

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tacgcttcct cattacgttt gg 22

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

ccaaacgtaa tcacgaagcg ta 22

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

tacgcttcgt gattacgttt gg 22

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

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tgaagcgaaa cacaatacga gc 22

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<212> DNA

<213> 人工合成

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gctcgtattc tttgaggctt ca 22

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<212> DNA

<213> 人工合成

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tgaagcgaaa cggaatacga gc 22

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

gctcgtattc cgtttcgctt ca 22

Claims

1.一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体，其特征在于，通过将麦芽寡糖基海藻糖合成酶的蛋白表面疏水区域相关氨基酸残基进行取代后得到；所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述取代是将第106位甲硫氨酸突变为赖氨酸或组氨酸。

2.一种制备权利要求1所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述质粒载体为pUC系列，pET系列，或pGEX中的任意一种。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为细菌或真菌细胞。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的细菌为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。

6.编码权利要求1所述突变体的基因。

7.携带权利要求6所述基因的载体或重组细胞。

8.权利要求1所述突变体在制备海藻糖中的应用。