CN109880813A - 一种具有低聚半乳糖合成能力的β-葡萄糖苷酶及其表达菌株和应用 - Google Patents
一种具有低聚半乳糖合成能力的β-葡萄糖苷酶及其表达菌株和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有低聚半乳糖合成能力的β‑葡萄糖苷酶及其表达菌株和应用，其中具有低聚半乳糖合成能力的β‑葡萄糖苷酶，名称为BglD1，其原始来源于中国南海西沙群岛海底沉积物，具有如下氨基酸序列之一：(1)序列表中的SEQ ID No：2；(2)序列表中的SEQ ID No：2经取代、缺失或添加一个或几个氨基残基且编码相同功能蛋白质的氨基酸序列。本发明具有低聚半乳糖合成能力的β‑葡萄糖苷酶具有β‑葡萄糖苷酶和β‑半乳糖苷酶活性，可通过转糖苷作用合成低聚半乳糖，产物键型主要为β(1→3)和β(1→4)糖苷键。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有低聚半乳糖合成能力的β-葡萄糖苷酶及其表达菌株和应用，属于生物技术领域。
背景技术
β-葡萄糖苷酶(EC 3.1.2.21，β-glucosidase)属于水解酶类，主要水解糖苷或寡糖中的β-1,4- 糖苷键，同时释放出末端非还原性的葡萄糖或其它糖苷配体。根据氨基酸序列及空间结构的相似性，被归类于糖苷水解酶1家族(GH1)、3家族、5家族、9家族、30家族以及116家族(http://www.cazy.org/)。GH1家族β-葡萄糖苷酶具有宽泛的底物催化特性，可兼具β-半乳糖苷酶、β-木糖酶、β-甘露糖酶等酶活力，因而具有重要的工业应用价值。
低聚半乳糖(galacto-oligosaccharides,GOS)是一种重要的益生元，是具有天然属性的功能性低聚糖，并已被广泛应用于婴幼儿奶粉、发酵乳、糖果、面包等食品中。低聚半乳糖的组成为Gal-(Gal)n-Glc/Gal(n＝0-6)，结构式如下式Ⅰ所示。
目前GOS的生产主要以乳糖为原料，GH2和GH42家族的β-半乳糖苷酶为催化剂，反应过程中，酶将乳糖水解，再将生成的半乳糖基转移到糖基受体上通过转糖苷作用生成GOS。商业用β-半乳糖苷酶催化合成的GOS多为β(1→6)和β(1→4)键型，β(1→3)较少。研究发现，相比β(1→6)及β(1→4)键型GOS，β(1→3)型GOS具有更好的益生元活性。
作为β-半乳糖苷酶的有益补充，具有转糖苷活性的GH1家族β-葡萄糖苷酶在GOS制备方面显示出独特的优势。已有来自Halothermothrixorenii和Thermotoganaphthophila的β-葡萄糖苷酶被用于GOS的合成，除了生成β(1→6)及β(1→4)键型GOS外，β(1→3)键型的GOS亦可有效合成。另外，相比GH2和GH42家族的β-半乳糖苷酶，GH1家族β-葡萄糖苷酶分子量小，更易于重组表达及制备。但是，目前应用于低聚半乳糖合成的GH1家族β- 葡萄糖苷酶较少。
发明内容
本发明是为了避免上述现有技术所存在的不足之处，提供了一种具有低聚半乳糖合成能力的β-葡萄糖苷酶及其表达菌株和应用。
本发明具有低聚半乳糖合成能力的β-葡萄糖苷酶，名称为BglD1，其原始来源于中国南海西沙群岛海底沉积物，具有如下氨基酸序列之一：
(1)序列表中的SEQ ID No：2；
(2)序列表中的SEQ ID No：2经取代、缺失或添加一个或几个氨基残基且编码相同功能蛋白质的氨基酸序列。
本发明所述β-葡萄糖苷酶的编码基因，名称为BglD1，具有如下核苷酸序列之一：
(1)序列表中的SEQ ID No：1；
(2)SEQ ID No：1经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；
(3)编码序列表中SEQ ID No：2蛋白质序列的多核苷酸序列。
本发明具有低聚半乳糖合成能力的β-葡萄糖苷酶的表达菌株，其分类命名为：Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)-BglD1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉. 武汉大学，保藏日期：2019年2月25日，保藏编号：CCTCC NO：M 2019111。
本发明还提供了含有所述β-葡萄糖苷酶的编码基因的重组表达载体，其构建方法包括如下步骤：
步骤1：以含有所述β-葡萄糖苷酶编码基因的Bacillus sp.细菌基因组DNA为模板，以 P1和P2为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，所述引物为：
P1：5′-TTCCATATGGCAATTATACAATTTCCA-3′
P2：5′-CCGCTCGAGATAATACATATCAAAGAAGC-3′
步骤2：将步骤1所得PCR扩增产物和pEASY-T3质粒连接，得连接产物；将连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有所述β-葡萄糖苷酶编码基因(BglD1)的pEASY-T3重组质粒；
步骤3：用Nde I和Xho I双酶切步骤2所得的pEASY-T3重组质粒和表达质粒载体，然后用T4DNA连接酶连接，得到连接产物；连接产物转化宿主菌感受态细胞，筛选阳性克隆，得到含有所述β-葡萄糖苷酶的编码基因BglD1的工程表达菌株。
所述表达质粒载体为pCold、pET15、pET22b(+)或pET28等。
所述宿主菌为E.coli BL21(DE3)、E.coli DH5α、E.coli JM109或E.coli Rosetta等。
下面以表达质粒载体pET22b(+)、宿主菌E.coli BL21(DE3)为例，具体介绍含有本发明海洋细菌来源具有低聚半乳糖合成能力的β-葡萄糖苷酶基因的重组表达菌株的构建方法，包括以下步骤：
(1)以包含海洋细菌来源具有低聚半乳糖合成能力的β-葡萄糖苷酶基因的Bacillus sp. 细菌基因组DNA为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述引物为：
P1：5′-TTCCATATGGCAATTATACAATTTCCA-3′
P2：5′-CCGCTCGAGATAATACATATCAAAGAAGC-3′
(2)将步骤(1)所得PCR扩增产物和pEASY-T3质粒连接，得连接产物；将连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有海洋细菌来源具有低聚半乳糖合成能力的β-葡萄糖苷酶基因(BglD1) 的pEASY-T3重组质粒；
(3)用Nde I和Xho I双酶切步骤(2)所得的pEASY-T3重组质粒和pET22b(+)质粒，然后用T4DNA连接酶将酶切后的BglD1与pET22b(+)质粒连接，得到连接产物；连接产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，得到含有本发明基因BglD1的工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET22b(+)-BglD1。
本发明具有低聚半乳糖合成能力的β-葡萄糖苷酶的应用，是通过转糖苷作用合成低聚半乳糖。
具体是以350g/L的乳糖为底物，加入25U/mL BglD1(以pNPGlu为底物测定)，35℃、pH值6.0条件下反应7h，GOS产量最高，达到118g/L。其中β-(1→4)键型的二糖和β-(1→3)键型的三糖分别约为GOS总量的40％。
与现有的海洋细菌β-葡萄糖苷酶相比，本发明具有的优点为：
1、本发明海洋细菌来源具有低聚半乳糖合成能力的β-葡萄糖苷酶具有β-葡萄糖苷酶、β- 半乳糖苷酶等多种活性；
2、本发明的β-葡萄糖苷酶在pH5.5-6.5范围内具有好的稳定性，35℃半衰期为120小时；
3、本发明的β-葡萄糖苷酶具有较高的转糖苷活性，可用于低聚半乳糖的合成，合成的低聚半乳糖具有多种键型，主要为β(1→3)和β(1→4)糖苷键。
附图说明
图1为本发明PCR扩增产物的电泳图谱。M为分子量标准；1为PCR扩增产物。
图2为本发明表达载体pET22b(+)/BglD1质粒的鉴定电泳图谱。中M为分子量标准；1 为经过Nde I/Xho I双酶切的pET22b(+)；2为经过Nde I/Xho I双酶切的pET22b(+)/BglD1。
图3为以pNPGlu为底物时测定的BglD1催化的最适pH和pH稳定性。a为最适pH，b 为pH稳定性。
图4为以pNPGlu为底物时测定的BglD1催化的最适稳定和温度稳定性。a为最适温度， b为温度稳定性，c为45℃下BglD1温度稳定性，d为35℃下BglD1温度稳定性。
具体实施方式
下列实施例中的实施方法，如无特别说明，均为常规方法。
(一)含有本发明海洋细菌来源具有低聚半乳糖合成能力的β-葡萄糖苷酶基因的表达菌株的构建
1、含有本发明海洋细菌来源具有低聚半乳糖合成能力的β-葡萄糖苷酶基因的阳性克隆的筛选及鉴定
从中国南海赵述岛附近浅海区：水温30℃，pH 7.9，水深4-5米(北纬16°58′，东经112°16′) 海底沉积物，分离微生物并提取基因组，取海底沉积物1g，与50mLTYS液体培养基中，30℃， 120rpm，活化2h。取上清稀释不同的倍数涂布于含有0.1％(w/v)七叶苷和0.25％(w/v)柠檬酸铁铵的TYS固体平板上，倒置于16℃、28℃、37℃培养箱培养24h后观察平板上菌落生长情况。产β-葡萄糖苷酶的菌株周围的培养基会变成棕黑色，按照菌落形态的不同和阳性反应圈的大小，选择生长快、棕黑色圈直径与菌落直径之比较大者为初选菌株。用灭菌的牙签挑取阳性克隆于10μL无菌水中，搅拌均匀，用接种环蘸取菌液，于新鲜的培养基上划线纯化。挑取纯化后的单克隆于5mL TYS液体培养基中30℃，200rpm，培养24h。用移液枪吸取 0.1ml稀释液涂布于含有0.1％(w/v)七叶苷和0.25％(w/v)柠檬酸铁铵的TYS固体平板上， 37℃恒温箱中培养1-2天。菌落周围培养基的颜色仍会变成棕黑色的即为β-葡萄糖苷酶复筛阳性克隆。保种：吸取850μL菌液，与150μL灭过菌的甘油(装于1.5mL EP管中)混合均匀，-70℃保存。
按照试剂盒提供的说明抽取产β-葡萄糖苷酶阳性克隆菌株基因组，扩增16S rRNA基因。细菌16S rRNA基因的扩增采用通用引物序列，以阳性菌株基因组为模板。细菌16SrRNA基因通用引物序列：
正向引物(27F)：5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3′
反向引物(1492R)：5′ACGGCTACCTTGTTACGACTT3′
PCR扩增程序如下：第一阶段变性94℃，5min；第二阶段变性94℃，30sec，退火50℃，30sec，延伸72℃，120sec，共进行30个循环；第三阶段延伸72℃，10min。得到的PCR产物用1％琼脂糖电泳检测，在1600bp左右出现条带的初步认为是阳性克隆。将所得PCR扩增产物和pEASY-T3质粒连接，得连接产物；将连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，将转化产物均匀涂于含Amp抗性及IPTG和X-gal的筛选平板上，37℃过夜培养。根据蓝白斑筛选方法，挑白色克隆于5mL含Amp抗性的LB培养基的试管中，37℃培养8h。按照Axygen质粒小量制备试剂盒的说明书抽提菌液质粒，以质粒为模板进行PCR，鉴定是否阳性克隆。阳性重组子质粒送往上海生工测序，得到16S rRNA序列，运用NCBI中的Blast程序与数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中的细菌16S rRNA序列进行相似性比对；根据文献报道，若未知菌株的16S rRNA序列与数据库中的已知序列相似性大于99％，则初步认为该未知菌株与数据库中的已知菌株同属。经序列比对后确定产β-葡萄糖苷酶的阳性菌株与Bacillus sp.Alg07同源性99％，将产β-葡萄糖苷酶的阳性菌株命名为Bacillussp.D1。
2、海洋细菌来源具有低聚半乳糖合成能力的β-葡萄糖苷酶基因的扩增
分析Bacillus sp.Alg07全基因组注释信息，获知WP_072578138.1编码β-葡萄糖苷酶，以此设计PCR扩增引物，以Bacillus sp.D1菌株基因组为模板，PCR扩增获得本发明的β-葡萄糖苷酶全长基因编码序列。
设计一对寡核苷酸引物P1和P2，其序列为：
P1：5′-TTCCATATGGCAATTATACAATTTCCA-3′
P2：5′-CCGCTCGAGATAATACATATCAAAGAAGC-3′
在引物的5′和3′端分别引入Nde I和XhoI酶切位点，以Bacillus sp.D1菌株基因组的DNA 为模板，扩增β-葡萄糖苷酶基因BglD1。PCR反应程序如下：第一阶段变性94℃，5min；第二阶段变性94℃，1min，退火50℃，30sec，延伸72℃，2min，共进行30个循环；第三阶段延伸72℃，10min。得到的PCR产物用1％琼脂糖电泳检测，结果见图1。得到的β-葡萄糖苷酶的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
3、表达载体的构建
将步骤2中得到PCR扩增产物，与质粒载体连接，建立如下酶切体系：25ng pEASY-T3质粒载体，50ngPCR扩增产物，补水至5μl，25℃连接5min。连接产物热激转化大肠杆菌Trans1-T1 感受态细胞，将转化产物均匀涂于含Amp抗性及IPTG和X-gal的筛选平板上，37℃过夜培养。根据蓝白斑筛选方法，挑白色克隆于5mL含Amp抗性的LB培养基的试管中，37℃培养8h。按照质粒小量制备试剂盒的说明书抽提菌液质粒，以质粒为模板进行PCR鉴定获得含有β-葡萄糖苷酶基因(BglD1)的pEASY-T3重组质粒。
用Nde I和Xho I双酶切所得的pEASY-T3重组质粒和pET22b(+)载体，然后用T4DNA连接酶将酶切后的BglD1与表达质粒载体连接，建立如下酶切体系：25ng pET22b(+)载体，50ngBglD1酶切片段，3μl 10×ligation buffer，1μl T4DNA连接酶(TaKaRa)，补水至30μL，16℃连接8h，得到连接产物；连接产物转化宿主菌E.coli BL21(DE3)，得到的转化子测序验证后获得含有本发明基因BglD1的工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET22b(+)-BglD1。
上述菌株E.coli BL21(DE3)/pET22b(+)-BglD1已送至中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，CCTCC)保藏，保藏日期：2019年2月25日，保藏编号：CCTCC NO：M 2019111。
(二)含本发明的β-葡萄糖苷酶基因工程菌的表达与蛋白纯化
将(一)中获得的基因的工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET22b(+)-BglD1接种于含有氨苄青霉素的200ml LB液体培养基中，放置于37℃、250rpm条件下培养至OD600达到0.6，加入终浓度为0.2mM的IPTG进行诱导，并于16℃、120rpm条件下继续培养20小时；4℃、8000g离心收集菌体，超声破碎，Ni-NTA柱层析进行纯化。
以pNPGlu为底物，纯化的海洋细菌β-葡萄糖苷酶蛋白BglD1的最适pH为6.0，酶在pH5.5-6.5范围内有较高的稳定性，能够维持原酶活力的50％以上。以pNPGala为底物，海洋细菌β-葡萄糖苷酶BglD1的最适pH为6.5。BglD1在35℃-65℃范围内均能显示催化活性，其最适温度为60℃，35℃时酶的半衰期为120小时。
(三)含本发明海洋细菌β-葡萄糖苷酶比活力的检测
1、以pNPGlu为底物测定酶活力
反应体系为500μL，将缓冲液和50μL 100mM pNPGlu(去离子水配制，终浓度为10mM) 在60℃下预热5min后加入酶液，反应10min后加入500μL 1M Na2CO3终止反应。实验组做 3个平行实验，对照组以缓冲液代替酶液。以对照组调零，测定405nm下的光吸收值。酶活力(U)定义为：每分钟产生1μmol pNP所用的酶量。
2、以多糖为底物测定酶活
反应体系为500μL，将缓冲液和25μL 5mM多糖(缓冲溶液配制，终浓度为5mM)在60℃下预热5min后加入酶液，反应10min后将反应体系放置沸水浴中煮沸5min，使酶充分失活，按照葡萄糖测定试剂盒操作说明进行操作，实验组3个平行，对照组以去离子水代替葡萄糖溶液。以对照组调零，测定505nm下的光吸收值。
表1 BglD1各底物比酶活
(四)海洋细菌来源具有低聚半乳糖合成能力的β-葡萄糖苷酶转糖苷活性
以柠檬酸--磷酸氢二钠缓冲溶液配制350g/L的乳糖溶液，加入25U/mL BglD1(以pNPGlu 为底物测定)，35℃、200rpm反应24h，HPLC检测产物生成。GOS产量在反应7h时最高，达到118g/L。其中β-(1→4)键型的二糖和β-(1→3)键型的三糖分别约为GOS总量的40％。
SEQ ID No:1
ATGGCAATTATACAATTTCCAAAAGATATGAGATGGGGAGCAGCTACGGCTTCTTACCAA ATTGAAGGAGCAGCAAATGAAGATGGAAGAGGCCTTTCCATTTGGGATACCTTTGCCAA AACACCTGGTAAAGTATTAAATGGTGATAACGGTGATGTAGCGTGTGATAGCTATCATCG CTATGAAGAGGATATTGCTTTAATGAAGGAACTAGGTATCGATATTTATCGCTTCTCTATC GCATGGCCACGTATTTTTCCAAACGGTACGGGAGAAATCAATAAAAAAGGAATTCAATT CTATCATGATTTTGTCGATGCCTTACTTGCAAACGGAATCGAACCTATGTGTACACTGTAT CACTGGGATCTGCCACAAGCTCTTCAAGATAAAGGTGGCTGGGAAAACCGTGAAACAG TCGATGCGTTTGCTGATTATGCAGAGCTGATGTTTAAAGAGTTTAACGGTAAAATTAAAA AATGGATTACAATTAATGAACCATGGTGTGTGTCGTATCTATCAAACTACATTGGGTTACA TGCACCAGGATTTCAAAACTTACAAGTAGCAACAACGGTTTCCCATCACCTCTTGCTAG CGCATGGTAAAGCAGTAACTCGCTTGAGAGAAGGAGGATACGAAGGTGAAATAGGGTAT GCTCCTAACACAGAATGGAACGAACCGTTTAGCAACAAGCAAGAAGATATTGACGCTTG TAATCGAGCGACTGGCTGGTTCATTGAGTGGTTCTTCGATCCTGTATTCAAAGGAAGCTA TCCACAATTTATGGTCGAATGGTTCGAGAAAAAAGGTGTAACAGTTCCAATTCAAGAAG GCGACATGGCCATCATCAATCAGGAAATTGATTTTGTTGGCATTAACTATTACACAGGAA GTGTTACTAGATATAAAGAGAATGAAGGCTTACTAGATGGTGAAAAAGTAGATATTGGCT ATGAAAAAACAGACTTTGATTGGAATATCTACCCTGAAGGCTTTTATAAAGTGTTAACAA AAATCAATGAACAATACGGCTCAGTACCAATCTATATTACGGAAAATGGCGCATGTTATAA TGATGGCGTAGAAAATGGTAGAGTCAAGGATGTAAGACGTATCGAGTATTTGAAACAGC ACTTAACATCATTACAACGTGCAATCGATAGTGGAGTGAATATAAAGGGTTACCTTACTT GGTCGCTATTAGATAACTTTGAATGGGCAGAAGGCTACGATAAGAGATTTGGTATCATCC ATGTTGATTTCCACACATTAGAAAGAACGAAGAAGGATAGTTACTATTGGTATAAGCAAA CGATTAAAAACGGCTTCTTTGATATGTATTAT
SEQ ID No:2
MAIIQFPKDMRWGAATASYQIEGAANEDGRGLSIWDTFAKTPGKVLNGDNGDVACDSYHR YEEDIALMKELGIDIYRFSIAWPRIFPNGTGEINKKGIQFYHDFVDALLANGIEPMCTLYHWD LPQALQDKGGWENRETVDAFADYAELMFKEFNGKIKKWITINEPWCVSYLSNYIGLHAPG FQNLQVATTVSHHLLLAHGKAVTRLREGGYEGEIGYAPNTEWNEPFSNKQEDIDACNRATG WFIEWFFDPVFKGSYPQFMVEWFEKKGVTVPIQEGDMAIINQEIDFVGINYYTGSVTRYKE NEGLLDGEKVDIGYEKTDFDWNIYPEGFYKVLTKINEQYGSVPIYITENGACYNDGVENGRVKDVRRIEYLKQHLTSLQRAIDSGVNIKGYLTWSLLDNFEWAEGYDKRFGIIHVDFHTLERTKKDSYYWYKQTIKNGFFDMYY。
SEQUENCE LISTING
<110> 安徽大学
<120> 一种具有低聚半乳糖合成能力的β-葡萄糖苷酶及其表达菌株和应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 1347
<212> DNA
<213> Bacillus sp.D1
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1347)
<223>
<400> 1
atg gca att ata caa ttt cca aaa gat atg aga tgg gga gca gct acg 48
Met Ala Ile Ile Gln Phe Pro Lys Asp Met Arg Trp Gly Ala Ala Thr
1 5 10 15
gct tct tac caa att gaa gga gca gca aat gaa gat gga aga ggc ctt 96
Ala Ser Tyr Gln Ile Glu Gly Ala Ala Asn Glu Asp Gly Arg Gly Leu
20 25 30
tcc att tgg gat acc ttt gcc aaa aca cct ggt aaa gta tta aat ggt 144
Ser Ile Trp Asp Thr Phe Ala Lys Thr Pro Gly Lys Val Leu Asn Gly
35 40 45
gat aac ggt gat gta gcg tgt gat agc tat cat cgc tat gaa gag gat 192
Asp Asn Gly Asp Val Ala Cys Asp Ser Tyr His Arg Tyr Glu Glu Asp
50 55 60
att gct tta atg aag gaa cta ggt atc gat att tat cgc ttc tct atc 240
Ile Ala Leu Met Lys Glu Leu Gly Ile Asp Ile Tyr Arg Phe Ser Ile
65 70 75 80
gca tgg cca cgt att ttt cca aac ggt acg gga gaa atc aat aaa aaa 288
Ala Trp Pro Arg Ile Phe Pro Asn Gly Thr Gly Glu Ile Asn Lys Lys
85 90 95
gga att caa ttc tat cat gat ttt gtc gat gcc tta ctt gca aac gga 336
Gly Ile Gln Phe Tyr His Asp Phe Val Asp Ala Leu Leu Ala Asn Gly
100 105 110
atc gaa cct atg tgt aca ctg tat cac tgg gat ctg cca caa gct ctt 384
Ile Glu Pro Met Cys Thr Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Ala Leu
115 120 125
caa gat aaa ggt ggc tgg gaa aac cgt gaa aca gtc gat gcg ttt gct 432
Gln Asp Lys Gly Gly Trp Glu Asn Arg Glu Thr Val Asp Ala Phe Ala
130 135 140
gat tat gca gag ctg atg ttt aaa gag ttt aac ggt aaa att aaa aaa 480
Asp Tyr Ala Glu Leu Met Phe Lys Glu Phe Asn Gly Lys Ile Lys Lys
145 150 155 160
tgg att aca att aat gaa cca tgg tgt gtg tcg tat cta tca aac tac 528
Trp Ile Thr Ile Asn Glu Pro Trp Cys Val Ser Tyr Leu Ser Asn Tyr
165 170 175
att ggg tta cat gca cca gga ttt caa aac tta caa gta gca aca acg 576
Ile Gly Leu His Ala Pro Gly Phe Gln Asn Leu Gln Val Ala Thr Thr
180 185 190
gtt tcc cat cac ctc ttg cta gcg cat ggt aaa gca gta act cgc ttg 624
Val Ser His His Leu Leu Leu Ala His Gly Lys Ala Val Thr Arg Leu
195 200 205
aga gaa gga gga tac gaa ggt gaa ata ggg tat gct cct aac aca gaa 672
Arg Glu Gly Gly Tyr Glu Gly Glu Ile Gly Tyr Ala Pro Asn Thr Glu
210 215 220
tgg aac gaa ccg ttt agc aac aag caa gaa gat att gac gct tgt aat 720
Trp Asn Glu Pro Phe Ser Asn Lys Gln Glu Asp Ile Asp Ala Cys Asn
225 230 235 240
cga gcg act ggc tgg ttc att gag tgg ttc ttc gat cct gta ttc aaa 768
Arg Ala Thr Gly Trp Phe Ile Glu Trp Phe Phe Asp Pro Val Phe Lys
245 250 255
gga agc tat cca caa ttt atg gtc gaa tgg ttc gag aaa aaa ggt gta 816
Gly Ser Tyr Pro Gln Phe Met Val Glu Trp Phe Glu Lys Lys Gly Val
260 265 270
aca gtt cca att caa gaa ggc gac atg gcc atc atc aat cag gaa att 864
Thr Val Pro Ile Gln Glu Gly Asp Met Ala Ile Ile Asn Gln Glu Ile
275 280 285
gat ttt gtt ggc att aac tat tac aca gga agt gtt act aga tat aaa 912
Asp Phe Val Gly Ile Asn Tyr Tyr Thr Gly Ser Val Thr Arg Tyr Lys
290 295 300
gag aat gaa ggc tta cta gat ggt gaa aaa gta gat att ggc tat gaa 960
Glu Asn Glu Gly Leu Leu Asp Gly Glu Lys Val Asp Ile Gly Tyr Glu
305 310 315 320
aaa aca gac ttt gat tgg aat atc tac cct gaa ggc ttt tat aaa gtg 1008
Lys Thr Asp Phe Asp Trp Asn Ile Tyr Pro Glu Gly Phe Tyr Lys Val
325 330 335
tta aca aaa atc aat gaa caa tac ggc tca gta cca atc tat att acg 1056
Leu Thr Lys Ile Asn Glu Gln Tyr Gly Ser Val Pro Ile Tyr Ile Thr
340 345 350
gaa aat ggc gca tgt tat aat gat ggc gta gaa aat ggt aga gtc aag 1104
Glu Asn Gly Ala Cys Tyr Asn Asp Gly Val Glu Asn Gly Arg Val Lys
355 360 365
gat gta aga cgt atc gag tat ttg aaa cag cac tta aca tca tta caa 1152
Asp Val Arg Arg Ile Glu Tyr Leu Lys Gln His Leu Thr Ser Leu Gln
370 375 380
cgt gca atc gat agt gga gtg aat ata aag ggt tac ctt act tgg tcg 1200
Arg Ala Ile Asp Ser Gly Val Asn Ile Lys Gly Tyr Leu Thr Trp Ser
385 390 395 400
cta tta gat aac ttt gaa tgg gca gaa ggc tac gat aag aga ttt ggt 1248
Leu Leu Asp Asn Phe Glu Trp Ala Glu Gly Tyr Asp Lys Arg Phe Gly
405 410 415
atc atc cat gtt gat ttc cac aca tta gaa aga acg aag aag gat agt 1296
Ile Ile His Val Asp Phe His Thr Leu Glu Arg Thr Lys Lys Asp Ser
420 425 430
tac tat tgg tat aag caa acg att aaa aac ggc ttc ttt gat atg tat 1344
Tyr Tyr Trp Tyr Lys Gln Thr Ile Lys Asn Gly Phe Phe Asp Met Tyr
435 440 445
tat 1347
Tyr
<210> 2
<211> 449
<212> PRT
<213> Bacillus sp.D1
<400> 2
Met Ala Ile Ile Gln Phe Pro Lys Asp Met Arg Trp Gly Ala Ala Thr
1 5 10 15
Ala Ser Tyr Gln Ile Glu Gly Ala Ala Asn Glu Asp Gly Arg Gly Leu
20 25 30
Ser Ile Trp Asp Thr Phe Ala Lys Thr Pro Gly Lys Val Leu Asn Gly
35 40 45
Asp Asn Gly Asp Val Ala Cys Asp Ser Tyr His Arg Tyr Glu Glu Asp
50 55 60
Ile Ala Leu Met Lys Glu Leu Gly Ile Asp Ile Tyr Arg Phe Ser Ile
65 70 75 80
Ala Trp Pro Arg Ile Phe Pro Asn Gly Thr Gly Glu Ile Asn Lys Lys
85 90 95
Gly Ile Gln Phe Tyr His Asp Phe Val Asp Ala Leu Leu Ala Asn Gly
100 105 110
Ile Glu Pro Met Cys Thr Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Ala Leu
115 120 125
Gln Asp Lys Gly Gly Trp Glu Asn Arg Glu Thr Val Asp Ala Phe Ala
130 135 140
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145 150 155 160
Trp Ile Thr Ile Asn Glu Pro Trp Cys Val Ser Tyr Leu Ser Asn Tyr
165 170 175
Ile Gly Leu His Ala Pro Gly Phe Gln Asn Leu Gln Val Ala Thr Thr
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
Gly Ser Tyr Pro Gln Phe Met Val Glu Trp Phe Glu Lys Lys Gly Val
260 265 270
Thr Val Pro Ile Gln Glu Gly Asp Met Ala Ile Ile Asn Gln Glu Ile
275 280 285
Asp Phe Val Gly Ile Asn Tyr Tyr Thr Gly Ser Val Thr Arg Tyr Lys
290 295 300
Glu Asn Glu Gly Leu Leu Asp Gly Glu Lys Val Asp Ile Gly Tyr Glu
305 310 315 320
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325 330 335
Leu Thr Lys Ile Asn Glu Gln Tyr Gly Ser Val Pro Ile Tyr Ile Thr
340 345 350
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355 360 365
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<212> PRT
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Tyr Tyr Trp Tyr Lys Gln Thr Ile Lys Asn Gly Phe Phe Asp Met Tyr
435 440 445
Tyr
Claims (8)
1.一种具有低聚半乳糖合成能力的β-葡萄糖苷酶，名称为BglD1，其特征在于：具有如下氨基酸序列之一：
(1)序列表中的SEQ ID No：2；
(2)序列表中的SEQ ID No：2经取代、缺失或添加一个或几个氨基残基且编码相同功能蛋白质的氨基酸序列。
2.权利要求1所述β-葡萄糖苷酶的编码基因，名称为BglD1，其特征在于：具有如下核苷酸序列之一：
(1)序列表中的SEQ ID No：1；
(2)SEQ ID No：1经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；
(3)编码序列表中SEQ ID No：2蛋白质序列的多核苷酸序列。
3.权利要求1所述β-葡萄糖苷酶的表达菌株，其特征在于：
所述菌株的分类命名为：Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)-BglD1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2019年2月25日，保藏编号：CCTCC NO：M 2019111。
4.含有权利要求2所述β-葡萄糖苷酶的编码基因的重组表达载体，其特征在于其构建方法包括如下步骤：
步骤1：以含有所述β-葡萄糖苷酶编码基因的Bacillus sp.细菌基因组DNA为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，所述引物为：
P1：5′-TTCCATATGGCAATTATACAATTTCCA-3′
P2：5′-CCGCTCGAGATAATACATATCAAAGAAGC-3′
步骤2：将步骤1所得PCR扩增产物和pEASY-T3质粒连接，得连接产物；将连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有所述β-葡萄糖苷酶编码基因BglD1的pEASY-T3重组质粒；
步骤3：用Nde I和Xho I双酶切步骤2所得的pEASY-T3重组质粒和表达质粒载体，然后用T4DNA连接酶连接，得到连接产物；连接产物转化宿主菌感受态细胞，筛选阳性克隆，得到含有所述β-葡萄糖苷酶的编码基因BglD1的工程表达菌株。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：
所述表达质粒载体为pCold、pET15、pET22b(+)或pET28。
6.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：
所述宿主菌为E.coli BL21(DE3)、E.coli DH5α、E.coli JM109或E.coli Rosetta。
7.权利要求1所述β-葡萄糖苷酶的应用，其特征在于：
所述β-葡萄糖苷酶具有β-葡萄糖苷酶和β-半乳糖苷酶活性，可通过转糖苷作用合成低聚半乳糖。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：
通过转糖苷作用合成低聚半乳糖过程中，乳糖溶液浓度为350g/L，体系pH值为6.0，体系温度为35℃，反应7h，GOS达到最高产量。
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