CN113774073B

CN113774073B - 一种深海宏基因组来源β-半乳糖苷酶、编码基因和应用

Info

Publication number: CN113774073B
Application number: CN202111239822.1A
Authority: CN
Inventors: 孙晶晶; 郝建华; 王伟
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2021-10-25
Filing date: 2021-10-25
Publication date: 2023-03-17
Anticipated expiration: 2041-10-25
Also published as: CN113774073A

Abstract

本发明涉及一种深海宏基因组来源β‑半乳糖苷酶、编码基因和应用，属于生物技术领域。所述的β‑半乳糖苷酶基因来源于深海海水样品的宏基因组测序分析，核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，氨基酸序列如SEQ ID No:2所示，所述β‑半乳糖苷酶基因编码的蛋白能水解乳糖底物和化学合成糖苷底物，具有耐盐特性和转糖基活性，在益生元低聚半乳糖生产领域具有广阔的应用前景。

Description

一种深海宏基因组来源β-半乳糖苷酶、编码基因和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种深海宏基因组来源β-半乳糖苷酶、编码基因及其表达和应用。

背景技术

β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)又称乳糖酶，能水解乳糖，生成半乳糖和葡萄糖。β-半乳糖苷酶还具有转糖基活性，能以乳糖为底物合成低聚半乳糖。低聚半乳糖(Galactooligosaccharides，GOS)是一种具有天然属性的功能性低聚糖，是哺乳动物乳汁的成分，其分子结构一般是在半乳糖或葡萄糖分子上连接1-7个半乳糖基。低聚半乳糖作为一种人体重要的益生元，具有促进肠道双歧杆菌和乳酸菌等益生菌增殖的作用，作为食品添加剂广泛用于婴儿配方奶粉、保健食品、乳制品、糕点等食品加工领域。

β-半乳糖苷酶主要来源于糖苷水解酶GH1、GH2、GH35、GH42等家族，其中文献报道的微生物来源的β-半乳糖苷酶大多归属于GH2和GH42家族。近年来，随着高通量测序技术的日益发展，宏基因组测序技术被广泛应用。宏基因组(Metagenome)是指环境中全部微小生物遗传物质的总和，包括了环境中的可培养微生物和不可培养微生物。生活在极端环境(例如高温、高压、低温等)中的微生物难以实现实验室培养，宏基因组测序不需要微生物具有可培养性，通过高通量测序获得环境微生物的基因序列，结合基因注释，预测基因的功能。

发明内容

本发明在于提供一种深海宏基因组来源β-半乳糖苷酶的编码基因和应用，该β-半乳糖苷酶具有耐盐特性和转糖基活性，能应用于低聚半乳糖的生产中。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种编码β-半乳糖苷酶的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。

一种上述核苷酸序列编码的β-半乳糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。

一种重组表达载体，它包含了SEQ ID No:1所示核苷酸序列，载体为pET-bga。

一种重组表达菌，它包含了SEQ ID No:1所示核苷酸序列，菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。

利用上述β-半乳糖苷酶的核苷酸序列制备重组β-半乳糖苷酶的方法，步骤如下：

(1)将β-半乳糖苷酶的基因序列SEQ ID No:1克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中，构建重组表达载体pET-bga，将表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，用卡那霉素抗性筛选出含β-半乳糖苷酶重组菌株；

(2)将步骤(1)筛选出的菌株接种于LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜，获得种子液；将种子液以体积比1％-2％的量接种于LB液体培养基中，待生长到OD₆₀₀为0.8-1时，加入终浓度0.2mmol/L的IPTG诱导，诱导温度为16℃，诱导时间为20小时；

(3)收集步骤(2)诱导后获得的菌体，加入菌液体积十分之一的磷酸盐缓冲液，超声破碎后，离心去除沉淀，获得粗酶液；粗酶液通过镍亲和层析柱进行纯化，获得电泳纯的重组β-半乳糖苷酶。

本发明还提供上述重组β-半乳糖苷酶在生产低聚半乳糖中的应用。

上述重组β-半乳糖苷酶具有如下酶学性质:

(1)以化学底物oNPG作为底物时，重组β-半乳糖苷酶的最适温度为40℃，在温度范围35-45℃时能保持80％酶活力，反应温度超过55℃时，酶活力迅速下降；以乳糖作为底物时，最适反应温度为50℃，在反应温度超过60℃时，酶的活力迅速下降。

(2)以oNPG为底物时，重组β-半乳糖苷酶的最适pH为6.5；以乳糖作为底物时，重组β-半乳糖苷酶的最适pH为7，在pH5-9范围内，酶活力保持在70％以上，pH对酶活力的影响很小。

(3)重组β-半乳糖苷酶在4到30℃温度范围保持高稳定性；温度40℃和50℃作用1小时，重组β-半乳糖苷酶的活力分别下降至最初酶活的60％和40％，在随后的孵育中，酶活力保持不变。

(4)重组β-半乳糖苷酶在pH范围6到9之间保持高稳定性。

(5)还原剂巯基乙醇对重组β-半乳糖苷酶有一定的激活作用；金属离子K⁺、Li⁺、Mg² ⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Ba²⁺、Co²⁺、Al³⁺对重组β-半乳糖苷酶的酶活有弱抑制作用；Zn²⁺、Cu²⁺对重组β-半乳糖苷酶有强抑制作用；金属螯合剂EDTA对重组β-半乳糖苷酶有一定的抑制作用，说明重组β-半乳糖苷酶可能依赖金属离子。

(6)重组β-半乳糖苷酶具有耐盐特性；反应体系中加入终浓度1-3mol/L NaCl，酶活与不加NaCl的体系相比有所提高；当NaCl含量超过3mol/L时，酶活开始下降。

(7)重组β-半乳糖苷酶具有乙醇耐受性；反应体系中10％的乙醇存在，酶活有所提高。

(8)重组β-半乳糖苷酶对底物oNPG的Km值为1.1mmol/L，最大反应速率为21.6U/mg，对底物乳糖的Km值为3mmol/L，最大反应速率为1.8U/mg。

(9)重组β-半乳糖苷酶专一性水解β型半乳糖苷底物，对α型糖苷底物无活性，对葡萄糖苷、木糖苷、纤维二糖苷底物无活性。

本发明所述所述重组β-半乳糖苷酶在低聚半乳糖生产中的应用是指：

重组β-半乳糖苷酶以乳糖为底物，生成低聚半乳糖产物；在反应体系中分别额外加入葡萄糖、半乳糖、果糖等单糖时，低聚糖产物增加。说明重组β-半乳糖苷酶具有转糖基活性。

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明提供了一种深海宏基因组来源β-半乳糖苷酶的基因序列，利用所述基因表达的重组β-半乳糖苷酶与已知的酶相比优势在于耐盐特性和转糖基活性，在低聚半乳糖的生产中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1、重组β-半乳糖苷酶SDS-PAGE电泳图；泳道M，蛋白Marker；泳道1，镍柱纯化后的重组β-半乳糖苷酶；

图2、不同温度下重组β-半乳糖苷酶水解oNPG和乳糖的相对活性；

图3、不同pH下重组β-半乳糖苷酶水解oNPG和乳糖的相对活性；

图4、重组β-半乳糖苷酶的在不同温度下的热稳定性；

图5、不同pH下重组β-半乳糖苷酶的稳定性；

图6、NaCl对重组β-半乳糖苷酶的影响；

图7、乙醇对重组β-半乳糖苷酶的影响；

图8、重组β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖薄层色谱检测结果。

具体实施方式

下面通过实施例来对本发明的技术方案作进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

实施例1β-半乳糖苷酶基因表达载体的构建

本实施例所述的β-半乳糖苷酶基因来源于深海海水样品的宏基因组测序分析，共有2136个碱基，编码711个氨基酸。理论相对分子质量为78KDa，理论等电点为7.2。在NCBI数据库上比对发现，与之氨基酸序列相似度最高的β-半乳糖苷酶基因，来源于海洋宏基因组(GenBank:MBR9790212.1)，相似度为90.86％，该序列编码的蛋白无酶学性质相关报道。根据氨基酸序列保守性分析，本实施例所述的β-半乳糖苷酶归属于糖基水解酶GH42家族。以深海海水滤膜样品中的宏基因组DNA为模板，加入引物1(5'-ggaattccatatgccttcattttca-3')和引物2(5'-CCGCTCGAGTCAGGCCTCCTGATTG-3')进行PCR(划线部分为限制性酶切位点Nde I和Xho I)，获得β-半乳糖苷酶基因。

PCR体系(LA Taq酶购于TaKaRa公司)

10*LA Taq buffer 5μL

引物1(10μM) 1μL

引物2(10μM) 1μL

dNTP(2.5mM) 4μL

宏基因组DNA 1μL

LA Taq 0.5μL

ddH₂O 37.5μL

总体积 50μL

PCR条件

1.94℃，5min

2.94℃，1min

55℃，30s

72℃，2min 10s

循环25次

3.72℃，5min

将PCR产物和质粒pET-28a分别用Nde I和Xho I进行酶切，通过T4连接酶进行连接，连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，涂布到含有50μg/mL的卡那霉素平板上，筛选出阳性克隆，挑取单菌落进行测序分析，获得含有β-半乳糖苷酶基因的重组表达载体pET-bga。

实施例2重组β-半乳糖苷酶的制备方法

将实例1所述重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得β-半乳糖苷酶的基因工程菌株。将菌株分别接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm过夜培养。取1％-2％培养液接种，培养至OD₆₀₀值0.8-1，加入IPTG至终浓度0.2mM，20℃诱导16小时。4℃、8000rpm离心5min收集菌体，菌体用50mM磷酸盐缓冲液(pH 7)重悬。超声破碎，细胞破碎液在4℃，12000rpm离心10min，收集上清液，获得粗酶液。粗酶液经过0.22μm滤膜过滤后进入柱子，随后用平衡缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液,500mM NaCl,pH 7)冲洗5个柱体积，含有25mM咪唑的平衡液冲洗5个柱体积去除非特异性吸附。用含25-250mM咪唑的平衡液进行梯度洗脱，获得纯的重组β-半乳糖苷酶。通过超滤离心将纯化后的酶置换到磷酸盐缓冲液(50mM，pH7)中储存。SDS-PAGE检测结果如图1所示,纯化后的重组β-半乳糖苷酶为单一条带，与理论分子量相符。

实施例3重组β-半乳糖苷酶的酶学性质

重组β-半乳糖苷酶的最适反应温度是在温度范围4-60℃内测定的，温度与酶活的关系如图2所示，对底物2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(oNPG)，最适反应温度为40℃，对底物乳糖的最适反应温度为50℃。测定了重组β-半乳糖苷酶在pH范围5-9的Britton–Robinson缓冲液中的酶活，实验结果如图3所示，重组β-半乳糖苷酶对底物oNPG的最适pH为6.5，对底物乳糖的最适pH为7。重组β-半乳糖苷酶的热稳定性在温度范围4-50℃内作用6小时，每1小时取样测定其残余酶活，重组β-半乳糖苷酶的热稳定性实验结果如图4所示，重组β-半乳糖苷酶在0-30℃时，表现出良好的稳定性。重组β-半乳糖苷酶pH稳定性实验是通过将酶置于pH范围5-10的Britton–Robinson缓冲液中分别作用3小时、6小时后，测定其残余酶活来实现的，实验结果如图5所示。重组β-半乳糖苷酶在pH范围6-9的缓冲体系中，表现出良好的稳定性。

在酶活测定体系中加入终浓度为5mM的金属离子(K⁺、Li⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Ba² ⁺、Cu²⁺、Co²⁺或Al³⁺)，金属螯合剂EDTA及还原剂DTT和巯基乙醇，测定残余酶活，实验结果如表1所示。还原剂巯基乙醇对重组β-半乳糖苷酶的酶活有增强作用；金属离子K⁺、Li⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Ba²⁺、Co²⁺、Al³⁺、还原剂DTT对重组β-半乳糖苷酶的酶活有弱抑制作用；Zn²⁺，Cu²⁺对重组β-半乳糖苷酶有强抑制作用；金属螯合剂EDTA对重组β-半乳糖苷酶有一定的抑制作用。

表1化学试剂对重组β-半乳糖苷酶活性的影响

重组β-半乳糖苷酶对盐的耐受性是通过在测活体系中加入0-6mol/L的NaCl，测定其酶活来实现的，其结果如图6所示，重组β-半乳糖苷酶具有较强的耐盐特性，在1-3mol/LNaCl中保持酶活不下降。

重组β-半乳糖苷酶对乙醇的耐受性通过在测活体系中加入0-40％(v/v)的乙醇，测定其酶活来实现的，其结果如图7所示。在20％的乙醇存在下，重组β-半乳糖苷酶能保持80％以上的活力。

重组β-半乳糖苷酶对不同底物的水解特性如表2所示。重组β-半乳糖苷酶专一性水解β型半乳糖苷底物，对α型糖苷底物无活性，对葡萄糖苷、木糖苷、纤维二糖苷底物无活性。

表2重组β-半乳糖苷酶的底物特异性

重组β-半乳糖苷酶动力学测定缓冲液为50mM的磷酸盐缓冲液(pH 7)，其中oNPG浓度范围为0-40mM，乳糖浓度范围为0-40mM，温度分别为40℃、50℃。通过双倒数作图法计算K_m，V_max，k_cat和k_cat/K_m等动力学参数。重组β-半乳糖苷酶对化学底物oNPG和天然底物乳糖的动力学参数如表3所示。

表3重组β-半乳糖苷酶的动力学参数

实施例5重组β-半乳糖苷酶在低聚半乳糖生产中的应用

反应体系为终浓度为5％乳糖、0.8mg/mL重组β-半乳糖苷酶以及50mM磷酸盐缓冲液(pH 7)。为了进一步验证重组β-半乳糖苷酶的转糖基活性，在反应体系中分别加入终浓度为20％半乳糖、20％葡萄糖或20％果糖。在40℃，转速200rpm的恒温摇床中反应48小时，分别在4小时、24小时、48小时取出反应液，通过薄层色谱法分析反应产物。实验结果如图8所示，重组β-半乳糖苷酶与乳糖作用4小时后，有少量的水解产物和转糖基产物，额外加入单糖的反应体系中寡糖产物增加；反应进行24小时后，反应体系中转糖基产物和水解产物均有所增加；反应进行48小时后，重组β-半乳糖苷酶对乳糖的反应产物主要是水解产物，加入半乳糖和葡萄糖的反应体系，主要产物为转糖基产物，其中，加入半乳糖的反应体系低聚半乳糖产率最高，加入果糖的反应体系与其他反应体系相比，出现了新的低聚糖斑点，说明重组β-半乳糖苷酶对果糖有转糖基作用。重组β-半乳糖苷酶对乳糖底物具有转糖基活性，生成低聚半乳糖产物，具有较高的应用前景。

序列表

<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120> 一种深海宏基因组来源β-半乳糖苷酶、编码基因和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2136

<212> DNA

<213> β-半乳糖苷酶( β-galactosidase )

<400> 1

atgccttcat tttcacgacg cgatctattt tgtctggccg gtaaaagtgc tgtgttaggc 60

gctttcatgg cgcctttatc gcacaatgca ctggcggctg ctgcggctgt ttcgcgcccg 120

tataaaatca acaagctcat tcatggtgtg gcgtactacc cagagttatg gccggatgct 180

gatgtggatg ccgacattgc cgaaatgcaa tcgttaggca tcaatctggt acgcatggcc 240

gagtttgcct ggtcgaccat ggaaaccacg cccggcgatt atgactttag gttatttaaa 300

acggtgatgg ataaaatgca tgccgccggg attgatgtgc tgctctgtac accaaccgca 360

acacctcccg catggctgac tcacaatcat cccgagcgat gccatagaaa cgccaagggg 420

acagtcatga gtcatggcgc gcgtcagcac gccagctatg agcacccggc ggtccgggaa 480

gcctgcttta gtatcattcg ccgcatgtcc catgaactcg gccgccaccc ggcgctgatt 540

ggctggcaat tagataacga aatgaaagcc catgtggcag aagatttcag tgatgccgct 600

attgccaact ggcgtaagtg gttgcaacag cgattcggta ccattgaggc acttaacgaa 660

gcctggggca cccatatctg gagtcagcat tacaataatt ttgaccaggt gcccgcgccg 720

gtgacgacgc cgtttttgca taatgcctcg ctcatcaccg cgtataaact cttttgccgc 780

gagagtgtag cggattttat gctggcgcag cgtaacgtca tccgcgagtt ttcggattta 840

ccgattacgc acaacgacaa cccggcattt aatattcatc atgaacgctc catgcaggcg 900

ctggattttg ccgcctatga tgcctatcca accgctgagc aatggtcgac actggtattt 960

cgttctgacc tgtatcgagc cgctattccc ggccagccat tctggctcat ggaaaccagc 1020

gtggcccaca atggctggtt gggcaatcat cagcccattc acccggcggg gttcttggcc 1080

gcagaggcca gtttgattta tgcccttggt ggagaagggt tttgctactg gttatggcgt 1140

cagcaacgca gcggcgcgga gcttccccat agcgccgtaa aaagtgcctg gaacgcacca 1200

tctatcggct atcacgaagt gaaaaaagtc agtgaagcta aacagcaact tgaaccaaca 1260

ttgctcagtt caacactgat tacccctgaa gtggcggtga cttactcgga tcatgcccgc 1320

gctatgtttg aaaccgaacc tttggataag cgtgccggtt tccctaatcg ttatcgtggc 1380

attgtcgaaa tgtggcataa acagctactg gatgcaggcc tgcatcgcga ggcccgtttt 1440

gagggcgcat ccttagacgg attaaagcta ctgattaccc ctgccatgcc ctatgtgagt 1500

gaggcatttt taattcgtgc tgaggccttt atgcggcgcg gcgggatttg gattgccgga 1560

cctgttaccg gcacgcgcgg caaagaacat acggtgccgg tagaggcggg gcttggctta 1620

ctggagaaaa tggccggtgt gagcacccag tatttactac cacttactgg caccaaagcc 1680

caaggtgaat tgctgggtgt ggaaagtgag ctgagtggtt ggtgcgccgc ggtaaaagcg 1740

aaagcaggca cgagtattgt aggtaccatc accaaaggtc gtgccaaagg actcgccttt 1800

gccaccgagc gcccaatagg caaaggcaag ctggtaatgt taggcgcgca accccatggg 1860

gataacagcg atgcaatgct caaccggctg attgggcatt atgctcagca ggccggggtg 1920

aaaatgcact ttgatgtacc tgagggcata gtcatagtgc cgcgaaaaag ctcgcagggt 1980

aaactgctgt ggatagtgct gaatatgctc aatgagagca aaaccgtttc gctacccgct 2040

ggggctaccg atatgctcag tggtcgaaca ctgggcccct ccacattgct gagcccttac 2100

gcccgattaa ttattaacac caatcaggag gcctga 2136

<210> 2

<211> 711

<212> PRT

<213> β-半乳糖苷酶( β-galactosidase )

<400> 2

Met Pro Ser Phe Ser Arg Arg Asp Leu Phe Cys Leu Ala Gly Lys Ser

1 5 10 15

Ala Val Leu Gly Ala Phe Met Ala Pro Leu Ser His Asn Ala Leu Ala

20 25 30

Ala Ala Ala Ala Val Ser Arg Pro Tyr Lys Ile Asn Lys Leu Ile His

35 40 45

Gly Val Ala Tyr Tyr Pro Glu Leu Trp Pro Asp Ala Asp Val Asp Ala

50 55 60

Asp Ile Ala Glu Met Gln Ser Leu Gly Ile Asn Leu Val Arg Met Ala

65 70 75 80

Glu Phe Ala Trp Ser Thr Met Glu Thr Thr Pro Gly Asp Tyr Asp Phe

85 90 95

Arg Leu Phe Lys Thr Val Met Asp Lys Met His Ala Ala Gly Ile Asp

100 105 110

Val Leu Leu Cys Thr Pro Thr Ala Thr Pro Pro Ala Trp Leu Thr His

115 120 125

Asn His Pro Glu Arg Cys His Arg Asn Ala Lys Gly Thr Val Met Ser

130 135 140

His Gly Ala Arg Gln His Ala Ser Tyr Glu His Pro Ala Val Arg Glu

145 150 155 160

Ala Cys Phe Ser Ile Ile Arg Arg Met Ser His Glu Leu Gly Arg His

165 170 175

Pro Ala Leu Ile Gly Trp Gln Leu Asp Asn Glu Met Lys Ala His Val

180 185 190

Ala Glu Asp Phe Ser Asp Ala Ala Ile Ala Asn Trp Arg Lys Trp Leu

195 200 205

Gln Gln Arg Phe Gly Thr Ile Glu Ala Leu Asn Glu Ala Trp Gly Thr

210 215 220

His Ile Trp Ser Gln His Tyr Asn Asn Phe Asp Gln Val Pro Ala Pro

225 230 235 240

Val Thr Thr Pro Phe Leu His Asn Ala Ser Leu Ile Thr Ala Tyr Lys

245 250 255

Leu Phe Cys Arg Glu Ser Val Ala Asp Phe Met Leu Ala Gln Arg Asn

260 265 270

Val Ile Arg Glu Phe Ser Asp Leu Pro Ile Thr His Asn Asp Asn Pro

275 280 285

Ala Phe Asn Ile His His Glu Arg Ser Met Gln Ala Leu Asp Phe Ala

290 295 300

Ala Tyr Asp Ala Tyr Pro Thr Ala Glu Gln Trp Ser Thr Leu Val Phe

305 310 315 320

Arg Ser Asp Leu Tyr Arg Ala Ala Ile Pro Gly Gln Pro Phe Trp Leu

325 330 335

Met Glu Thr Ser Val Ala His Asn Gly Trp Leu Gly Asn His Gln Pro

340 345 350

Ile His Pro Ala Gly Phe Leu Ala Ala Glu Ala Ser Leu Ile Tyr Ala

355 360 365

Leu Gly Gly Glu Gly Phe Cys Tyr Trp Leu Trp Arg Gln Gln Arg Ser

370 375 380

Gly Ala Glu Leu Pro His Ser Ala Val Lys Ser Ala Trp Asn Ala Pro

385 390 395 400

Ser Ile Gly Tyr His Glu Val Lys Lys Val Ser Glu Ala Lys Gln Gln

405 410 415

Leu Glu Pro Thr Leu Leu Ser Ser Thr Leu Ile Thr Pro Glu Val Ala

420 425 430

Val Thr Tyr Ser Asp His Ala Arg Ala Met Phe Glu Thr Glu Pro Leu

435 440 445

Asp Lys Arg Ala Gly Phe Pro Asn Arg Tyr Arg Gly Ile Val Glu Met

450 455 460

Trp His Lys Gln Leu Leu Asp Ala Gly Leu His Arg Glu Ala Arg Phe

465 470 475 480

Glu Gly Ala Ser Leu Asp Gly Leu Lys Leu Leu Ile Thr Pro Ala Met

485 490 495

Pro Tyr Val Ser Glu Ala Phe Leu Ile Arg Ala Glu Ala Phe Met Arg

500 505 510

Arg Gly Gly Ile Trp Ile Ala Gly Pro Val Thr Gly Thr Arg Gly Lys

515 520 525

Glu His Thr Val Pro Val Glu Ala Gly Leu Gly Leu Leu Glu Lys Met

530 535 540

Ala Gly Val Ser Thr Gln Tyr Leu Leu Pro Leu Thr Gly Thr Lys Ala

545 550 555 560

Gln Gly Glu Leu Leu Gly Val Glu Ser Glu Leu Ser Gly Trp Cys Ala

565 570 575

Ala Val Lys Ala Lys Ala Gly Thr Ser Ile Val Gly Thr Ile Thr Lys

580 585 590

Gly Arg Ala Lys Gly Leu Ala Phe Ala Thr Glu Arg Pro Ile Gly Lys

595 600 605

Gly Lys Leu Val Met Leu Gly Ala Gln Pro His Gly Asp Asn Ser Asp

610 615 620

Ala Met Leu Asn Arg Leu Ile Gly His Tyr Ala Gln Gln Ala Gly Val

625 630 635 640

Lys Met His Phe Asp Val Pro Glu Gly Ile Val Ile Val Pro Arg Lys

645 650 655

Ser Ser Gln Gly Lys Leu Leu Trp Ile Val Leu Asn Met Leu Asn Glu

660 665 670

Ser Lys Thr Val Ser Leu Pro Ala Gly Ala Thr Asp Met Leu Ser Gly

675 680 685

Arg Thr Leu Gly Pro Ser Thr Leu Leu Ser Pro Tyr Ala Arg Leu Ile

690 695 700

Ile Asn Thr Asn Gln Glu Ala

705 710

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggaattccat atgccttcat tttca 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgctcgagt caggcctcct gattg 25

Claims

1.一种编码β-半乳糖苷酶的核苷酸序列，其特征在于所述核苷酸序列如SEQ IDNo:1所示。

2.一种权利要求1所述核苷酸序列编码的β-半乳糖苷酶，其特征在于所述β-半乳糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。

3.一种重组表达载体，其特征在于它包含了SEQ ID No:1所示核苷酸序列，载体为pET-bga。

4.一种重组表达菌，其特征在于它包含了SEQ ID No:1所示核苷酸序列，菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。

5.利用权利要求1所述β-半乳糖苷酶的核苷酸序列制备重组β-半乳糖苷酶的方法，其特征在于所述方法步骤如下：

6.权利要求5所述方法制备的重组β-半乳糖苷酶在生产低聚半乳糖中的应用。