CN111893125A - 壳聚糖酶基因、壳聚糖酶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种壳聚糖酶基因、壳聚糖酶及其制备方法和应用。本发明壳聚糖酶基因csn的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其是通过对来源于多枝横梗霉的壳聚糖酶的序列根据毕赤酵母密码子的偏好性进行综合优化得到。本发明壳聚糖酶Csn的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，是一种真菌壳聚糖酶，不仅丰富了壳聚糖酶的种类和来源途径，且其自身具有较高的酶活性，在较宽的温度和pH范围内均表现出良好的稳定性，具有良好的应用前景和产业价值。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及壳聚糖酶基因csn及相应的重组表达载体、重组表达菌株，以及壳聚糖酶Csn及其制备方法和应用。
背景技术
壳寡糖作为一种生物活性物质，其由氨基葡萄糖及N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键随机连接而成。研究表明，壳寡糖具备抗菌、抗肿瘤、提升免疫力等功效，因此其被广泛的应用于农业、畜牧业、食品以及医药等行业。目前壳寡糖的制备主要分为物理法、化学法以及酶法。相对于物理法和化学法，酶法制备壳寡糖具备许多优势如：反应条件温和、产物结构完整、过程易于控制、对环境无污染等优点。
壳聚糖酶作为一种生物酶，能够专一性的水解壳聚糖生产不同分子量的壳寡糖。由于壳聚糖酶在壳寡糖酶法制备过程发挥着重要作用，国内外许多科学家对其展开了研究。迄今，关于壳聚糖酶的研究主要集中在细菌壳聚糖酶，主要分为链霉菌壳聚糖酶和芽孢杆菌壳聚糖酶，关于真菌壳聚糖酶的报道很少。
发明内容
本发明的目的是提供聚糖酶基因csn及相应的重组表达载体、重组表达菌株，以及壳聚糖酶Csn及其制备方法和应用，旨在解决现有研究中存在对真菌壳聚糖酶研究不足的技术问题。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明一方面提供了一种壳聚糖酶基因csn，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明另一方面提供了一种壳聚糖酶Csn，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明再一方面提供了一种重组表达载体，其包括所述的壳聚糖酶基因csn。
本发明又一方面提供了一种重组表达菌株，其包括上述的重组表达载体。
本发明还有一方面提供了一种壳聚糖酶Csn的制备方法，其包括如下步骤：
提供壳聚糖酶基因csn、表达载体和表达菌株；
对所述壳聚糖酶基因csn进行扩增，所得扩增产物与所述表达载体进行连接，得到重组表达载体；
将所述重组表达载体转入表达菌株，得到重组表达菌株；
对所述重组表达菌株进行培养，得到所述壳聚糖酶Csn；
其中，所述壳聚糖酶基因csn的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明最后一方面提供了上述壳聚糖酶Csn或上述壳聚糖酶Csn的制备方法制备得到的壳聚糖酶Csn在水解壳聚糖中的应用。
本发明提供的壳聚糖酶基因csn，是根据毕赤酵母密码子的偏好性，通过对来源于多枝横梗霉的壳聚糖酶的序列(GenBank:CDS07538.1)进行综合优化得到(相比原始基因，壳聚糖酶基因csn的GC含量从43.3％提升至48.7％，表达适应指数从0.56提升至0.83)。该壳聚糖酶基因csn的序列稳定性和密码子适应性都得到显著提高，可在毕赤酵母表达菌株中进行高效表达，降低壳聚糖酶Csn的生产成本。
本发明提供的壳聚糖酶Csn来源于多枝横梗霉，属于一种真菌壳聚糖酶。本发明提供的壳聚糖酶Csn不仅丰富了壳聚糖酶的种类和来源途径，且其自身具有较高的酶活性，在较宽的温度和pH范围内均表现出良好的稳定性，具有良好的应用前景和产业价值。
本发明提供的重组表达载体包括上述的壳聚糖酶基因csn，由于该壳聚糖酶基因csn经过密码子优化，具有较好的稳定性和密码子适应性，相应地，本发明包括该壳聚糖酶基因csn的重组表达载体也具有较好的稳定性，有利于壳聚糖酶基因csn的稳定、高效表达，对降低壳聚糖酶的生产成本起到重要作用。
本发明提供的重组表达菌株包括上述的重组表达载体，因此可用于表达聚糖酶基因csn编码的壳聚糖酶Csn。同时，在壳聚糖酶基因csn的序列具有较好的稳定性和密码子适应性的基础上，所得重组表达菌株可以稳定、高效表达壳聚糖酶Csn。
本发明提供的壳聚糖酶Csn的制备方法中，通过将壳聚糖酶基因csn进行扩增，得到相应的重组表达载体、重组表达菌株，再经培养得到壳聚糖酶Csn，该方法步骤简单，过程容易控制，可稳定高效生产壳聚糖酶Csn。
本发明上述的壳聚糖酶Csn或上述壳聚糖酶Csn的制备方法制备得到的壳聚糖酶Csn可用于水解壳聚糖领域，由于该壳聚糖酶Csn在较宽的温度和pH范围内均表现出良好的稳定性，因此用于水解壳聚糖时，可使水解反应高效、稳定地进行，有利于提升水解产物壳寡糖的产量。通过实验发现，本发明提供的壳聚糖酶Csn水解壳聚糖，所得水解产物主要为壳二糖和壳三糖，该产物作为壳寡糖的主要活性成分，在多个行业中均具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例5对重组表达菌株进行高密度发酵培养的曲线图；
图2为本发明实施例6所得壳聚糖酶Csn的SDS-PAGE蛋白电泳图；
图3为本发明实施例6所得壳聚糖酶Csn的最适反应温度及热稳定性图；
图4为本发明实施例6所得壳聚糖酶Csn的最适反应pH及pH稳定性图；
图5为本发明实施例6所得壳聚糖酶Csn水解壳聚糖薄层层析的结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
在本发明的描述中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
需要理解的是，本发明实施例中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本发明实施例相关组分的含量按比例放大或缩小均在本发明公开的范围之内。具体地，本发明实施例中所述的重量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
另外，除非上下文另外明确地使用，否则词的单数形式的表达应被理解为包含该词的复数形式。术语“包括”或“具有”旨在指定特征、数量、步骤、操作、元件、部分或者其组合的存在，但不用于排除存在或可能添加一个或多个其它特征、数量、步骤、操作、元件、部分或者其组合。
需要说明的是，本发明实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；相关试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明实施例提供了一种壳聚糖酶基因csn，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
壳聚糖酶基因csn的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)：
ctgccaaagaagagggcttttgacggttgtgttgaagctccatttgctccaactccagacacttgtgctaagttcgagttccaagaccagccaagaggtgtttgtgttgagttggactctggttccactccattcgttgatttggatggtttcccagacatcggttccgttgacgctaaggttactcacgttgcttccatggtcaccaacgttttcgagtacggtactaaggctttctcctacgctgcttgtgccaacattggtgacatgagaggtttcacctgtggttacatcggtttcaccactggaactaacgacgcttcccaggttgttaagacctacaccaaagagaagccaggtaacgagttggctggtttcatttccagattgtccgacttggacactctggacacttgtaacttgggtcagagagcttctacttccggtttggagcaattctgtgacgcttggagaagagaggcttgtttggacgatcacttcgctcagattcaatccaactgggcttacgagcactacgttgttccatccgctagaattgctgcttccgctggtgtttactctccattgggtcagttggttttctacgacgctattatccagcacggttaccagttcactgagtcccacattaacgtcctgagactgttggaattgaccggtccaagacaacaagacgagtccgagcaacagtacttgaccagattcttgaccaccagacgtcagatgcagtgttgttacccagatggtgtttggccagcttccgctactagaactattgacttgcagtccctggttgaccagttcgacttgttgcaaaacttggacaagccactggtcctgaacagattcggtcaagttgttgacccaaacgagccagctatcgctaacactaactcttgttctggtgtttccgcttaa
本发明实施例提供的壳聚糖酶基因csn，是根据毕赤酵母密码子的偏好性，通过对来源于多枝横梗霉的壳聚糖酶的序列(GenBank:CDS07538.1)进行综合优化得到(相比原始基因，壳聚糖酶基因csn的GC含量从43.3％提升至48.7％，表达适应指数从0.56提升至0.83)。该壳聚糖酶基因csn的序列稳定性和密码子适应性都得到显著提高，可在毕赤酵母表达菌株中进行高效表达，降低壳聚糖酶Csn的生产成本。
相应地，本发明实施例还提供了一种壳聚糖酶Csn，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
壳聚糖酶Csn的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：
LPKKRAFDGCVEAPFAPTPDTCAKFEFQDQPRGVCVELDSGSTPFVDLDGFPDIGSVDAKVTHVASMVTNVFEYGTKAFSYAACANIGDMRGFTCGYIGFTTGTNDASQVVKTYTKEKPGNELAGFISRLSDLDTLDTCNLGQRASTSGLEQFCDAWRREACLDDHFAQIQSNWAYEHYVVPSARIAASAGVYSPLGQLVFYDAIIQHGYQFTESHINVLRLLELTGPRQQDESEQQYLTRFLTTRRQMQCCYPDGVWPASATRTIDLQSLVDQFDLLQNLDKPLVLNRFGQVVDPNEPAIANTNSCSGVSA
本发明实施例提供的壳聚糖酶Csn来源于多枝横梗霉，属于一种真菌壳聚糖酶。本发明实施例提供的壳聚糖酶Csn不仅丰富了壳聚糖酶的种类和来源途径，且其自身具有较高的酶活性，在较宽的温度和pH范围内均表现出良好的稳定性，具有良好的应用前景和产业价值。
相应地，本发明实施例还提供了一种重组表达载体，其包括上述的壳聚糖酶基因csn。
本发明实施例提供的重组表达载体包括上述的壳聚糖酶基因csn，由于该壳聚糖酶基因csn经过密码子优化，具有较好的稳定性和密码子适应性，相应地，本发明实施例包括该壳聚糖酶基因csn的重组表达载体也具有较好的稳定性，有利于壳聚糖酶基因csn的稳定、高效表达，对降低壳聚糖酶的生产成本起到重要作用。
相应地，本发明实施例还提供了一种重组表达菌株，其包括上述的重组表达载体。
本发明实施例提供的重组表达菌株包括上述的重组表达载体，因此可用于表达聚糖酶基因csn编码的壳聚糖酶Csn。同时，在壳聚糖酶基因csn的序列具有较好的稳定性和密码子适应性的基础上，所得重组表达菌株可以稳定、高效表达壳聚糖酶Csn。
相应地，本发明实施例还提供了一种壳聚糖酶Csn的制备方法，其包括如下步骤：
S1、提供壳聚糖酶基因csn、表达载体和表达菌株；
S2、对壳聚糖酶基因csn进行扩增，所得扩增产物与表达载体进行连接，得到重组表达载体；
S3、将重组表达载体转入表达菌株，得到重组表达菌株；
S4、对重组表达菌株进行培养，得到壳聚糖酶Csn；
其中，壳聚糖酶基因csn的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明实施例提供的壳聚糖酶Csn的制备方法中，通过将壳聚糖酶基因csn进行扩增，得到相应的重组表达载体、重组表达菌株，再经培养得到壳聚糖酶Csn，该方法步骤简单，过程容易控制，可稳定高效生产壳聚糖酶Csn。
具体地，S1中，根据来源于多枝横梗霉的壳聚糖酶的序列(GenBank:CDS07538.1)，以该序列为基础，根据毕赤酵母密码子的偏好性，合成去除信号肽的壳聚糖酶基因，即为壳聚糖酶基因csn。
表达载体，在本发明实施例中，用于构建表达如SEQ ID NO:1所示的壳聚糖酶基因csn的重组表达载体。在一些实施例中，选择毕赤酵母表达载体。这是因为本发明实施例提供的壳聚糖酶基因csn已根据毕赤酵母密码子的偏好性进行了优化，且毕赤酵母具有表达基因整合稳定性高、培养方便经济、适合扩大工业规模的优点，因此选择毕赤酵母表达载体可以进一步提高壳聚糖酶基因csn的表达稳定性和表达量。具体地，可选择毕赤酵母表达载体pPICZαA用于构建重组表达载体，相应地，将所得重组表达载体命名为pPICZαA-csn。
表达菌株，在本发明实施例中用于构建重组表达菌株。在一些实施例中，选择毕赤酵母表达菌株。这是因为本发明实施例提供的壳聚糖酶基因csn根据毕赤酵母密码子的偏好性进行了优化，且毕赤酵母真核表达系统是目前使用较为广泛的真核表达系统，其具有生物安全性好、遗传元件稳定、可实现高密度发酵、表达水平较高以及易于分离纯化蛋白、适合工业规模化生产等优点。具体地，可选择毕赤酵母X33作为表达菌株。
S2中，通过对壳聚糖酶基因csn进行扩增，所得扩增产物与表达载体进行连接，即可得到重组表达载体。在一些实施例中，用于扩增壳聚糖酶基因csn的引物包括正向引物CSN-F和反向引物CSN-R，且正向引物CSN-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，反向引物CSN-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
CSN-F的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)：
agtcgaattcctgccaaagaagagggctttt
CSN-R的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)：
ttctctagaagcggaaacaccagaaca
S3中，将所得重组表达载体转入表达菌株中，得到重组表达菌株，可表达相应的蛋白。本发明实施例对于重组表达菌株的具体构建方法没有特殊要求，采用本领域常规方法即可。
S4中，通过对重组表达菌株进行培养，壳聚糖酶基因csn的核苷酸序列随着重组表达菌株的繁殖而复制，然后收集重组表达菌株的培养物，经分离、纯化，得到壳聚糖酶Csn。在一些实施例中，重组表达菌株进行培养的方法可以是摇瓶发酵培养，也可以是高密度发酵培养，还可以是先摇瓶发酵培养，再高密度发酵培养。其中，摇瓶发酵培养的方法是：先将重组表达菌株接入BMGY培养基中，在30℃、220rpm条件下进行培养24h，然后再接入含有BMMY的培养基中，在30℃、220rpm条件下进行培养，同时加入甲醇进行诱导，得到发酵液。高密度发酵培养的方法是：将重组表达菌株接入含YPG培养基的250mL三角瓶中，在30℃、200rpm条件下进行过夜培养，然后再接入含YPG培养基的500mL三角瓶中，在30℃、200rpm条件下进行振荡过夜培养，直至OD 600大于10，将二次过夜培养的重组表达菌株接种至含BSM培养基的发酵罐中，在30℃、pH 5.0、500rpm、空气流量为40L/min的条件下进行发酵培养；培养初期以甘油作为碳源，甘油被菌体吸收完后开始用甲醇诱导，得到发酵液。将摇瓶发酵培养或高密度发酵培养所得发酵液进行纯化，得到壳聚糖酶Csn。
相应地，本发明实施例还提供了上述壳聚糖酶Csn或上述壳聚糖酶Csn的制备方法制备得到的壳聚糖酶Csn在水解壳聚糖中的应用。
本发明实施例提供的上述的壳聚糖酶Csn或上述壳聚糖酶Csn的制备方法制备得到的壳聚糖酶Csn可用于水解壳聚糖领域，由于该壳聚糖酶Csn在较宽的温度和pH范围内均表现出良好的稳定性，因此用于水解壳聚糖时，可使水解反应高效、稳定地进行，有利于提升水解产物壳寡糖的产量。通过实验发现，本发明实施例提供的壳聚糖酶Csn水解壳聚糖，所得水解产物主要为壳二糖和壳三糖，该产物作为壳寡糖的主要活性成分，在多个行业中均具有良好的应用前景。
在一些实施例中，本发明实施例提供的壳聚糖酶Csn在水解壳聚糖的反应中，其反应温度为40℃-60℃，最适反应温度为50℃。
在一些实施例中，本发明实施例提供的壳聚糖酶Csn在水解壳聚糖的反应中，其反应pH为4.0-6.0，最适反应pH为5.0。
为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明实施例壳聚糖酶基因、壳聚糖酶及其制备方法和应用的进步性能显著的体现，以下通过实施例来举例说明上述技术方案。
以下实施例中涉及到的实验材料和试剂：
菌株与载体：大肠杆菌菌株Top10、毕赤酵母X33、表达载体pPICZαA均从商业途径购买获得。
Q5高保真Taq酶MIX购自NEB公司；质粒提取、胶纯化试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；限制性内切酶购自宝日医生物技术(北京)有限公司；Zeocin购自Invitrogen公司。
培养基：大肠杆菌培养基为LB(1％(w/v)蛋白胨，0.5％(w/v)酵母提取物，1％(w/v)NaCl，pH7.0)。LBZ为LB培养基加25μg/mL Zeocin(博莱霉素)；
酵母培养基为YPD(1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)蛋白胨，2％(w/v)葡萄糖)。酵母筛选培养基为YPDZ(YPD+100mg/L zeocin)；
酵母诱导培养基BMGY(1％(w/v)酵母提取物、2％(w/v)蛋白胨、1.34％(w/v)YNB、0.00004％(w/v)Biotin、1％甘油(V/V))和BMMY培养基(除以0.5％(v/v)甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同)；
注：YNB为酵母氮源基础(Yeast Nitrogen Base)；Biotin为生物素。
壳聚糖酶活性测定所用试剂：乙酸乙酸钠(0.2mol/L pH5.0)；壳聚糖底物：(1％(w/v)壳聚糖溶于pH5.5，0.2mol/L乙酸乙酸钠溶液)；DNS试剂(6.3‰(w/v)3,5-二硝基水杨酸；18.2％(w/v)四水酒石酸钾钠；5‰(w/v)苯酚；5‰(w/v)无水亚硫酸钠)。
实施例1
本实施例提供了壳聚糖酶CsnLr基因序列分析及密码子优化过程，包括如下步骤：
通过查阅糖苷水解酶生物信息学数据库(http://www.cazy.org/)，发现壳聚糖酶GH46家族的序列及相关信息最多，目前GH46家族记录的壳聚糖酶总共有852种，其中6种来源于古细菌，784种来源于细菌，60种来源于病毒，2种来源于真菌。根据查阅文献的结果，目前重组表达以及特性分析的GH46家族壳聚糖酶均是细菌来源，真菌来源的壳聚糖酶还未有报道。鉴于以上分析，本发明实施例以期通过重组表达真菌来源的壳聚糖酶，为挖掘GH46家族真菌来源的壳聚糖酶奠定基础。
通过分析糖苷水解酶生物信息数据库GH46家族真菌壳聚糖酶，发现已经报道的两种壳聚糖酶均来源于多枝横梗霉，这两种壳聚糖酶的NCBI登录号分别为GenBank:CDS12419.1和GenBank:CDS07538.1。在本发明实施例中选取GenBank:CDS07538.1作为实验对象，将该壳聚糖酶命名为CsnLr。通过信号肽预测软件SignalP-5.0Server预测分析发现CsnLr前18个氨基酸为其信号肽。以CsnLr氨基酸序列为基础，根据毕赤酵母密码子偏好性，合成去除信号肽的壳聚糖酶基因csn，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的壳聚糖酶Csn的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
实施例2
本实施例提供了一种含壳聚糖酶基因csn的重组表达载体的构建过程，具体如下：
(1)根据壳聚糖酶基因csn的序列设计一对引物CSN-F和CSN-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3-4所示，用于扩增壳聚糖酶基因csn；
(2)通过PCR扩增获得壳聚糖酶基因csn，用限制性内切酶EcoRI和XbaI分别过夜酶切表达载体pPICZαA和壳聚糖酶基因csn，将过夜酶切的表达载体pPICZαA和壳聚糖酶基因csn进行纯化回收后进行连接反应；
(3)采用热激法将连接反应产物转入大肠杆菌Top10，采用菌液PCR验证重组转化子；
(4)将验证成功的转化子接入LBZ液体培养基，提取质粒，进行测序验证，最终获得重组表达载体pPICZαA-csn。
实施例3
本实施例提供了一种含实施例2所得重组表达载体的酶活优势菌株的构建及筛选过程，具体如下：
用限制性内切酶SacI线性化重组表达载体pPICZαA-csn后，采用电转化法转入毕赤酵母X33，从而获得不同的阳性转化子。重组毕赤酵母的筛选采用24孔板法，具体步骤如下：将YPDZ平板上的重组转化子用牙签逐个挑至每孔含有1.8mL BMGY培养基的24孔板，30℃，200rpm过夜培养24小时后，4000rpm离心去掉上清，加入1.6mL的BMMY培养基，30℃，200rpm培养24小时，测定重组转化子壳聚糖酶活性。
壳聚糖酶活性的测定方法如下：首先将壳聚糖底物和酶液在50℃进行预热；将预热好的50μL酶液加入1.5mL离心管，然后加入350μL壳聚糖底物，50℃反应10分钟后加入600μL DNS试剂终止反应，于100℃沸水浴5分钟进行显色，冷却后离心取上清在540nm下测定吸光值。酶活单位的定义为：每分钟生成1μmol还原糖所用酶的量定义为一个活力单位。通过筛选120个阳性转化子，最终获得2个酶活优势菌株分别命名为C3(13U/mL)和C98(9U/mL)。
实施例4
本实施例提供了实施例3所得酶活优势菌株的摇瓶发酵培养过程，具体如下：
将实施例3所得酶活优势菌株C3和C98进行摇瓶培养，摇瓶培养在500mL三角瓶中进行，首先将相应的酶活优势菌株分别接入含有5mL BMGY培养基的50mL离心管中，30℃，220rpm培养24小时左右，将培养好的重组酵母工程菌种按1％(v/v)的接种量分别接入含有100mL BMMY培养基的500mL三角瓶中。摇瓶培养条件为30℃，220rpm，每隔24小时加入0.75％(v/v)的甲醇进行诱导，同时取样进行壳聚糖酶活性的测定，通过酶活测定发现，诱导培养120小时后，C3和C98的酶活分别为43U/mL和38U/mL。
实施例5
本实施例提供了将实施例4所得发酵培养后的重组酵母工程菌C3进行高密度发酵培养的过程，具体如下：
将单菌落重组酵母工程菌C3接入含有50mL YPG培养基的250mL三角瓶中，30℃，200rpm振荡过夜培养。再将过夜培养的重组酵母工程菌C3按1％(v/v)的接种量接入含有100mL YPG培养基的500mL三角瓶中，30℃，200rpm振荡过夜培养，至OD 600大于10。将二次过夜培养的重组酵母工程菌C3按10％(v/v)的接种量接入含有2L BSM培养基的5L发酵罐。重组酵母工程菌C3在5L发酵罐的培养条件为：温度为30℃、pH值5.0、搅拌速度为500rpm、空气流量为40L/min。培养初期，以甘油作为碳源供菌体生长。当菌体湿重达到一定的量(180g/L左右)，停止流加甘油，待甘油被菌体吸收完后(溶氧迅速上升)开始用甲醇诱导。甲醇的添加量根据溶氧进行调整。培养过程中，每24小时取样测定菌体湿重、酶活和总蛋白浓度，所得高密度发酵培养的曲线图如图1所示。
通过图1可知，随着发酵时间的增加，壳聚糖酶Csn活性也逐渐增加，当诱导培养至144小时，发酵酶活达到最大(1150U/mL)，总蛋白浓度最大为3.12g/L，细胞湿重则是在诱导至168小时后达到最大(450g/L)。
实施例6
本实施例提供了将实施例5所得发酵液进行纯化的过程，具体如下：
(5)将实施例5所得5L发酵罐的发酵液离心取上清进行纯化回收；
(6)用10kDa超滤管将上清酶液进行超滤浓缩；
(7)用Ni-IDA蛋白纯化试剂盒进行纯化。纯化后的重组CsnLr的酶比活为368U/mg。纯化后的SDS-PAGE蛋白电泳结果如图2所示。由图2可知，壳聚糖酶Csn的大小约42kDa。
实验例1
在pH5.0条件下测定实施例6所得壳聚糖酶Csn在30-60℃不同温度下的酶活，以测定酶活最高温度下的酶活为100％，计算其他温度下的相对酶活；在30-60℃不同温度下水浴热处理30分钟后测定剩余酶活，以没有做热处理样品的酶活为100％，计算其他温度下的相对剩余酶活。
实验结果：壳聚糖酶Csn的温度特性如图3所示。由图3可知，壳聚糖酶Csn的最适反应温度为50℃，在30℃和60℃的相对酶活分别为52％和70％；热稳定性方面，壳聚糖酶Csn在30-60℃不同温度下具有良好的稳定性，热处理30分钟后，剩余酶活均大于81％。
实验例2
在50℃条件下测定实施例6所得壳聚糖酶Csn在pH4.0-8.0下的酶活，以测定酶活最高pH下的酶活为100％，计算其他pH下的相对酶活；在pH4.0-8.0条件下，室温保存6小时后测定剩余酶活，以没有做任何处理的样品的酶活为100％，计算其他温度下的相对剩余酶活。
实验结果：壳聚糖酶Csn的pH特性如图4所示。由图4可知，壳聚糖酶Csn的最适反应pH为5.0，在pH4.0-6.0范围内相对酶活均大于65％，当pH增加到7.0或者降到3.0，相对酶活均急剧下降，分别为6％和32％；pH稳定性方面，在pH4.0-8.0条件下，室温保存6小时后剩余酶活均大于80％，表明在该pH范围内壳聚糖酶Csn具有良好的稳定性。
实验例3
实施例6所得壳聚糖酶Csn水解壳聚糖反应如下：
称取1g壳聚糖溶于100ml乙酸乙酸钠缓冲液(pH5.5)，加入400U壳聚糖酶Csn，50℃，120rpm进行水解反应，水解3小时和6小时分别取样进行薄层层析。
薄层层析如下：取1μL水解反应产物和1μL壳寡糖标准混合物，分别点到硅胶板(Silica gel 60，Merck)上；将点好样的硅胶板放置在扩展缸进行扩展，扩展缓冲液为异丙醇、水和氨水混合物(体积比例为15:1:7.5)；将扩展完的硅胶板从扩展缸取出吹干后喷显示剂(显示剂为茴香醛、乙醇、硫酸和乙酸混合物，体积比为5:90:5:1)；吹干后将硅胶板放置在100℃条件下进行高温显色，薄层层析的结果如图5所示。
由图5可知，水解反应进行3小时后，水解产物中主要由壳二糖、壳三糖和壳四糖构成，当水解反应进行到6小时后，水解产物则主要为壳二糖和壳三糖。说明本发明实施例6所得壳聚糖酶Csn水解壳聚糖的主要产物为壳二糖和壳三糖，
综合以上实施例和实验例可以看出，本发明实施例所得壳聚糖酶Csn用于水解壳聚糖时，水解产物主要为壳二糖和壳三糖。壳二糖和壳三糖作为壳寡糖的主要活性成分，在医药、农业、食品等行业具有好的应用效果。因此本发明实施例所得壳聚糖酶Csn在壳聚糖的水解，以及壳寡糖的酶解制备领域具有很大的应用潜力。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳市润康植物营养技术有限公司
<120> 壳聚糖酶基因、壳聚糖酶及其制备方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 939
<212> DNA
<213> 多枝横梗霉(Lichtheimia ramosa)
<400> 1
ctgccaaaga agagggcttt tgacggttgt gttgaagctc catttgctcc aactccagac 60
acttgtgcta agttcgagtt ccaagaccag ccaagaggtg tttgtgttga gttggactct 120
ggttccactc cattcgttga tttggatggt ttcccagaca tcggttccgt tgacgctaag 180
gttactcacg ttgcttccat ggtcaccaac gttttcgagt acggtactaa ggctttctcc 240
tacgctgctt gtgccaacat tggtgacatg agaggtttca cctgtggtta catcggtttc 300
accactggaa ctaacgacgc ttcccaggtt gttaagacct acaccaaaga gaagccaggt 360
aacgagttgg ctggtttcat ttccagattg tccgacttgg acactctgga cacttgtaac 420
ttgggtcaga gagcttctac ttccggtttg gagcaattct gtgacgcttg gagaagagag 480
gcttgtttgg acgatcactt cgctcagatt caatccaact gggcttacga gcactacgtt 540
gttccatccg ctagaattgc tgcttccgct ggtgtttact ctccattggg tcagttggtt 600
ttctacgacg ctattatcca gcacggttac cagttcactg agtcccacat taacgtcctg 660
agactgttgg aattgaccgg tccaagacaa caagacgagt ccgagcaaca gtacttgacc 720
agattcttga ccaccagacg tcagatgcag tgttgttacc cagatggtgt ttggccagct 780
tccgctacta gaactattga cttgcagtcc ctggttgacc agttcgactt gttgcaaaac 840
ttggacaagc cactggtcct gaacagattc ggtcaagttg ttgacccaaa cgagccagct 900
atcgctaaca ctaactcttg ttctggtgtt tccgcttaa 939
<210> 2
<211> 312
<212> PRT
<213> 多枝横梗霉(Lichtheimia ramosa)
<400> 2
Leu Pro Lys Lys Arg Ala Phe Asp Gly Cys Val Glu Ala Pro Phe Ala
1 5 10 15
Pro Thr Pro Asp Thr Cys Ala Lys Phe Glu Phe Gln Asp Gln Pro Arg
20 25 30
Gly Val Cys Val Glu Leu Asp Ser Gly Ser Thr Pro Phe Val Asp Leu
35 40 45
Asp Gly Phe Pro Asp Ile Gly Ser Val Asp Ala Lys Val Thr His Val
50 55 60
Ala Ser Met Val Thr Asn Val Phe Glu Tyr Gly Thr Lys Ala Phe Ser
65 70 75 80
Tyr Ala Ala Cys Ala Asn Ile Gly Asp Met Arg Gly Phe Thr Cys Gly
85 90 95
Tyr Ile Gly Phe Thr Thr Gly Thr Asn Asp Ala Ser Gln Val Val Lys
100 105 110
Thr Tyr Thr Lys Glu Lys Pro Gly Asn Glu Leu Ala Gly Phe Ile Ser
115 120 125
Arg Leu Ser Asp Leu Asp Thr Leu Asp Thr Cys Asn Leu Gly Gln Arg
130 135 140
Ala Ser Thr Ser Gly Leu Glu Gln Phe Cys Asp Ala Trp Arg Arg Glu
145 150 155 160
Ala Cys Leu Asp Asp His Phe Ala Gln Ile Gln Ser Asn Trp Ala Tyr
165 170 175
Glu His Tyr Val Val Pro Ser Ala Arg Ile Ala Ala Ser Ala Gly Val
180 185 190
Tyr Ser Pro Leu Gly Gln Leu Val Phe Tyr Asp Ala Ile Ile Gln His
195 200 205
Gly Tyr Gln Phe Thr Glu Ser His Ile Asn Val Leu Arg Leu Leu Glu
210 215 220
Leu Thr Gly Pro Arg Gln Gln Asp Glu Ser Glu Gln Gln Tyr Leu Thr
225 230 235 240
Arg Phe Leu Thr Thr Arg Arg Gln Met Gln Cys Cys Tyr Pro Asp Gly
245 250 255
Val Trp Pro Ala Ser Ala Thr Arg Thr Ile Asp Leu Gln Ser Leu Val
260 265 270
Asp Gln Phe Asp Leu Leu Gln Asn Leu Asp Lys Pro Leu Val Leu Asn
275 280 285
Arg Phe Gly Gln Val Val Asp Pro Asn Glu Pro Ala Ile Ala Asn Thr
290 295 300
Asn Ser Cys Ser Gly Val Ser Ala
305 310
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 3
agtcgaattc ctgccaaaga agagggcttt t 31
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 4
ttctctagaa gcggaaacac cagaaca 27
Claims (10)
1.一种壳聚糖酶基因csn，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种壳聚糖酶Csn，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于，包括权利要求1所述的壳聚糖酶基因csn。
4.一种重组表达菌株，其特征在于，包括权利要求3所述的重组表达载体。
5.一种壳聚糖酶Csn的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供壳聚糖酶基因csn、表达载体和表达菌株；
对所述壳聚糖酶基因csn进行扩增，所得扩增产物与所述表达载体进行连接，得到重组表达载体；
将所述重组表达载体转入表达菌株，得到重组表达菌株；
对所述重组表达菌株进行培养，得到所述壳聚糖酶Csn；
其中，所述壳聚糖酶基因csn的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
6.根据权利要求5所述壳聚糖酶Csn的制备方法，其特征在于，将所述壳聚糖酶基因csn进行扩增的步骤中，用于扩增的引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
7.根据权利要求5所述壳聚糖酶Csn的制备方法，其特征在于，所述表达载体为毕赤酵母表达载体。
8.根据权利要求5所述壳聚糖酶Csn的制备方法，其特征在于，所述表达菌株为毕赤酵母表达菌株。
9.权利要求2所述壳聚糖酶Csn或权利要求5-8任一项所述壳聚糖酶Csn的制备方法制备得到的壳聚糖酶Csn在水解壳聚糖中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，在所述水解壳聚糖的反应中，所述壳聚糖酶Csn的反应温度为40℃-60℃；和/或
所述壳聚糖酶Csn的反应pH为4.0-6.0。
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