CN112430615A - 壳聚糖酶基因csnbaa、壳聚糖酶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种壳聚糖酶基因csnbaa、壳聚糖酶及其制备方法和应用。本发明壳聚糖酶基因csnbaa的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其是通过对来源于萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus壳聚糖酶的序列进行综合优化得到。本发明壳聚糖酶CsnBaa的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，其不仅丰富了壳聚糖酶的种类和来源途径，而且发酵酶活可达4630U/mL，在较宽的温度范围和较宽的pH范围内均表现出良好的稳定性，具有良好的应用前景和产业价值。

Description

壳聚糖酶基因csnbaa、壳聚糖酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及壳聚糖酶基因csnbaa及相应的重组表达载体、重组表达菌株，以及壳聚糖酶CsnBaa及其制备方法和应用。
背景技术
壳寡糖作为一种生物活性物质，其由氨基葡萄糖及N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键随机连接而成。研究表明，壳寡糖具备抗菌、抗肿瘤、提升免疫力等功效，因此其被广泛的应用于农业、畜牧业、食品以及医药等行业。目前壳寡糖的制备主要分为物理法、化学法以及酶法。相对于物理法和化学法，酶法制备壳寡糖具备许多优势，如：反应条件温和、产物结构完整、过程易于控制、对环境无污染等。
壳聚糖酶作为一种生物酶，能够专一性的水解壳聚糖生产不同分子量的壳寡糖。由于壳聚糖酶在壳寡糖酶法制备过程发挥着重要作用，国内外许多科学家对其展开了研究。迄今，关于壳聚糖酶的研究主要集中在细菌壳聚糖酶，主要分为链霉菌壳聚糖酶和芽孢杆菌壳聚糖酶。其中，芽孢杆菌壳聚糖酶能够有效分解壳聚糖并且水解产物具有很好的生物活性。然而，芽孢杆菌壳聚糖酶的研究主要集中在环状芽孢杆菌壳聚糖酶和枯草芽孢杆菌壳聚糖酶，对其它的芽孢杆菌来源的壳聚糖酶研究甚少。
发明内容
本发明的目的是提供壳聚糖酶基因csnbaa及相应的重组表达载体、重组表达菌株，以及壳聚糖酶CsnBaa及其制备方法和应用，旨在提供一种新的芽孢杆菌壳聚糖酶。
为了实现上述发明目的，本发明一方面，提供了一种壳聚糖酶基因csnbaa，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或由所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的核苷酸序列。
本发明提供的壳聚糖酶基因csnbaa是根据毕赤酵母的密码子偏好性，将来源于萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus(GenBank:CP024051.1)壳聚糖酶的序列的GC含量由44.7％提升至48.2％，从而更接近毕赤酵母高效表达的范围；同时减少了稀有密码子，表达适应指数由原来的0.62提升至0.83，进而得到壳聚糖酶基因csnbaa。通过该综合优化，所得壳聚糖酶基因csnbaa的序列稳定性和密码子适应性都得到显著提高，可在毕赤酵母表达系统中实现高效表达。
本发明另一方面，提供了一种壳聚糖酶CsnBaa，其是壳聚糖酶基因csnbaa编码的蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或由所述SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的氨基酸序列。
本发明提供的壳聚糖酶CsnBaa，解决了现有芽孢杆菌来源的壳聚糖酶主要集中在环状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌、来源较少的问题，不仅丰富了壳聚糖酶的种类和来源途径，而且发酵酶活可达4630U/mL，在较宽的温度范围和较宽的pH范围内均表现出良好的稳定性，具有良好的应用前景和产业价值。
本发明再一方面，提供了一种重组表达载体，其包括本发明提供的壳聚糖酶基因csnbaa。
本发明提供的重组表达载体包括本发明提供的壳聚糖酶基因csnbaa，由于该壳聚糖酶基因csnbaa根据毕赤酵母的偏好性进行了密码子优化，具有较好的稳定性和密码子适应性，相应地，本发明提供的包括该壳聚糖酶基因csnbaa的重组表达载体也具有较好的稳定性，有利于实现壳聚糖酶基因csnbaa的稳定、高效表达，对降低壳聚糖酶的生产成本起到重要作用。
本发明又一方面，提供了一种重组表达菌株，其包括本发明提供的重组表达载体以及表达分子伴侣蛋白的载体。
本发明提供的重组表达菌株不仅表达壳聚糖酶CsnBaa，还表达分子伴侣蛋白。通过共表达分子伴侣蛋白，能够有效提升壳聚糖酶CsnBaa的毕赤酵母表达系统中的表达量，使重组表达菌株可以稳定、高效表达壳聚糖酶CsnBaa。
本发明还有一方面，提供了一种壳聚糖酶CsnBaa的制备方法，其包括如下步骤：
提供壳聚糖酶基因csnbaa、表达载体、表达菌株；
对所述壳聚糖酶基因csnbaa进行扩增，所得扩增产物与所述表达载体进行连接，得到重组表达载体；
将所述重组表达载体转入表达菌株，得到重组表达菌株；
对所述重组表达菌株进行培养，得到壳聚糖酶CsnBaa；
其中，所述壳聚糖酶基因csnbaa的核苷酸序列为如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的核苷酸序列；所述壳聚糖酶CsnBaa的氨基酸序列为如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或如SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的氨基酸序列。
本发明提供的壳聚糖酶CsnBaa的制备方法中，采用异源重组的方法，通过将壳聚糖酶基因csnbaa进行扩增，得到相应的重组表达载体、重组表达菌株，再经培养得到壳聚糖酶CsnBaa。本发明提供的制备方法步骤简单，过程容易控制，可稳定、高效、低成本地生产壳聚糖酶CsnBaa，具有良好的工业前景。同时，通过本发明提供的壳聚糖酶CsnBaa的制备方法制备得到的壳聚糖酶CsnBaa还具有酶活性高、酶学特性稳定的优点。
本发明最后一方面，提供了本发明壳聚糖酶CsnBaa或本发明壳聚糖酶CsnBaa的制备方法制备得到的壳聚糖酶CsnBaa在水解壳聚糖中的应用。
本发明提供的壳聚糖酶CsnBaa或本发明提供的壳聚糖酶CsnBaa的制备方法制备得到的壳聚糖酶CsnBaa可用于水解壳聚糖获得壳寡糖。由于该壳聚糖酶CsnBaa的酶活较高，且在较宽的温度范围和较宽的pH范围内均表现出良好的稳定性，因此用于水解壳聚糖时，可使催化反应高效、稳定地进行。
附图说明
图1为本发明实施例6对重组表达菌株进行高密度发酵条件优化的结果示意图；
图2为本发明实施例7所得壳聚糖酶CsnBaa的SDS-PAGE蛋白电泳图；
图3为本发明实施例8所得壳聚糖酶CsnBaa的最适反应温度及热稳定性图；
图4为本发明实施例9所得壳聚糖酶CsnBaa的最适反应pH及pH稳定性图；
图5为本发明实施例10所得壳聚糖酶CsnBaa水解壳聚糖底物的薄层层析结果图；
图6为本发明实施例11所得壳聚糖酶CsnBaa水解产物抑菌特性分析结果示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
在本发明的描述中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
需要理解的是，本发明实施例中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本发明实施例相关组分的含量按比例放大或缩小均在本发明公开的范围之内。具体地，本发明实施例中所述的重量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
另外，除非上下文另外明确地使用，否则词的单数形式的表达应被理解为包含该词的复数形式。术语“包括”或“具有”旨在指定特征、数量、步骤、操作、元件、部分或者其组合的存在，但不用于排除存在或可能添加一个或多个其它特征、数量、步骤、操作、元件、部分或者其组合。
需要说明的是，本发明实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；相关试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明实施例提供了一种壳聚糖酶基因cdaba，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的核苷酸序列。
壳聚糖酶基因csnbaa的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)：
gctggtttgaacaaggaccaaaagagaagggctgagcagttgacttccatcttcgagaacggtatgaccgagatccagtacggttacgttgaacacttgccagacggtagaggttacacttgtggtagagctggtttcactactgctactggtgacgctttggaggttgttgaggtttacactaaggccgtgccaaacaacaagctgaagaagtacttgcccgagctgagaagattggccaaagaagaatctgacgacatctccaacctgaagggtttcgattctgcttggagatcccttggtaaggacaaggatttcagagctgctcaggacactgttaacgacagactgtactaccagccagctatgaagcagtccgacaacatcggtttgaaaaccgctttggctaaggctgtcatgtacgacactattatccaacacggtggtggtgatgatccagactctttgaactccctgatcaagaggaccaacaagaaagctggtggttccccaaagaacggtgttgacgaaaagaagtggctgaacaagttcctggacgtcagatacgacgacttgatgaacccatctgacccagacactagagatgaatggcgtgaatccgttgccagagttgacgtcttgagatccattgctaaggccaacaactacaacctgaacggtccaatcaacgtctactccgaagaatacggtgacttcgtcatcaagtaa
本发明实施例提供的壳聚糖酶基因csnbaa是根据毕赤酵母的密码子偏好性，将来源于萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus(GenBank:CP024051.1)壳聚糖酶的序列的GC含量由44.7％提升至48.2％，从而更接近毕赤酵母高效表达的范围；同时减少了稀有密码子，表达适应指数由原来的0.62提升至0.83，进而得到壳聚糖酶基因csnbaa。通过该综合优化，所得壳聚糖酶基因csnbaa的序列稳定性和密码子适应性都得到显著提高，可在毕赤酵母表达系统中实现高效表达。
相应地，本发明实施例还提供了一种壳聚糖酶CsnBaa，其是本发明实施例提供的壳聚糖酶基因csnbaa编码的蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的氨基酸序列。
壳聚糖酶CsnBaa的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：
AGLNKDQKRRAEQLTSIFENGMTEIQYGYVEHLPDGRGYTCGRAGFTTATGDALEVVEVYTKAVPNNKLKKYLPELRRLAKEESDDISNLKGFDSAWRSLGKDKDFRAAQDTVNDRLYYQPAMKQSDNIGLKTALAKAVMYDTIIQHGGGDDPDSLNSLIKRTNKKAGGSPKNGVDEKKWLNKFLDVRYDDLMNPSDPDTRDEWRESVARVDVLRSIAKANNYNLNGPINVYSEEYGDFVIK
本发明实施例提供的壳聚糖酶CsnBaa，解决了现有芽孢杆菌来源的壳聚糖酶主要集中在环状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌、来源较少的问题，不仅丰富了壳聚糖酶的种类和来源途径，而且发酵酶活可达4630U/mL，在较宽的温度范围和较宽的pH范围内均表现出良好的稳定性，具有良好的应用前景和产业价值。
相应地，本发明实施例还提供了一种重组表达载体，其包括本发明实施例提供的壳聚糖酶基因csnbaa。
本发明实施例提供的重组表达载体包括本发明实施例提供的壳聚糖酶基因csnbaa，由于该壳聚糖酶基因csnbaa根据毕赤酵母的偏好性进行了密码子优化，具有较好的稳定性和密码子适应性，相应地，本发明实施例提供的包括该壳聚糖酶基因csnbaa的重组表达载体也具有较好的稳定性，有利于实现壳聚糖酶基因csnbaa的稳定、高效表达，对降低壳聚糖酶的生产成本起到重要作用。
相应地，本发明实施例还提供了一种重组表达菌株，其包括本发明实施例提供的重组表达载体以及表达分子伴侣蛋白的载体。
本发明实施例提供的重组表达菌株不仅表达壳聚糖酶CsnBaa，还表达分子伴侣蛋白。通过共表达分子伴侣蛋白，能够有效提升壳聚糖酶CsnBaa的毕赤酵母表达系统中的表达量，使重组表达菌株可以稳定、高效表达壳聚糖酶CsnBaa。
在一些实施例中，表达分子伴侣蛋白的载体具体选择表达HAC1的载体。表达分子伴侣蛋白的载体有很多，但是将表达HAC1的载体转入本发明实施例提供的重组表达载体后，可以显著提高壳聚糖酶CsnBaa的表达量。在一些具体实施例中，表达HAC1的载体为pGAPZ-hac1。毕赤酵母重组工程菌在表达目标蛋白时会给自身带来很大的折叠压力，分子伴侣蛋白HAC1能够降低重组工程菌的压力响应，从而提升重组酵母工程菌分泌目的蛋白的表达能力。
相应地，本发明实施例还提供了一种壳聚糖酶CsnBaa的制备方法，其包括如下步骤：
S1、提供壳聚糖酶基因csnbaa、表达载体和表达菌株；
S2、对壳聚糖酶基因csnbaa进行扩增，所得扩增产物与表达载体进行连接，得到重组表达载体；
S3、将重组表达载体转入表达菌株，得到重组表达菌株；
S4、对重组表达菌株进行培养，得到壳聚糖酶CsnBaa；
其中，壳聚糖酶基因csnbaa的核苷酸序列为如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的核苷酸序列；壳聚糖酶CsnBaa的氨基酸序列为如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的氨基酸序列。
本发明实施例提供的壳聚糖酶CsnBaa的制备方法中，采用异源重组的方法，通过将壳聚糖酶基因csnbaa进行扩增，得到相应的重组表达载体、重组表达菌株，再经培养得到壳聚糖酶CsnBaa。本发明实施例提供的制备方法步骤简单，过程容易控制，可稳定、高效、低成本地生产壳聚糖酶CsnBaa，具有良好的工业前景。同时，通过本发明实施例提供的壳聚糖酶CsnBaa的制备方法制备得到的壳聚糖酶CsnBaa还具有酶活性高、酶学特性稳定的优点。
具体地，S1中，壳聚糖酶基因csnbaa的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该序列是对来源于萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus壳聚糖酶的序列(GenBank:CP024051.1)进行综合优化得到，具体优化方法及优化后基因的优势如前文所述，此处不再赘述。
表达载体，在本发明实施例中，用于构建表达如SEQ ID NO:1所示的壳聚糖酶基因csnbaa的重组表达载体。在一些实施例中，选择毕赤酵母表达载体。这是因为本发明实施例提供的壳聚糖酶基因csnbaa已根据毕赤酵母的密码子偏好性进行了优化，因此选择毕赤酵母表达载体可以进一步提高壳聚糖酶基因csnbaa的表达稳定性和表达量。具体地，可选择毕赤酵母表达载体pPICZαA用于构建重组表达载体，相应地，将所得重组表达载体命名为pPICZαA-csnbaa。
表达菌株，在本发明实施例中用于构建重组表达菌株。在一些实施例中，选择毕赤酵母表达菌株。这是因为本发明实施例提供的壳聚糖酶基因csnbaa根据毕赤酵母的密码子偏好性进行了优化，且毕赤酵母表达系统是本领域中较为成熟的表达系统，具有易于进行基因工程遗传操作、可实现高密度发酵、表达水平较高以及易于分离纯化蛋白、适合工业规模化生产等优点，有利于获得酶活性高且生产成本更低的壳聚糖酶CsnBaa。具体地，可选择毕赤酵母X33作为表达菌株。
S2中，通过对壳聚糖酶基因csnbaa进行扩增，所得扩增产物与表达载体进行连接，即可得到重组表达载体。在一些实施例中，用于扩增壳聚糖酶基因csnbaa的引物包括正向引物csnbaa-F和反向引物csnbaa-R，且正向引物csnbaa-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，反向引物csnbaa-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
csnbaa-F的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)：
agtcgaattcgctggtttgaacaaggaccaaa
csnbaa-R的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)：
ttctctagacttgatgacgaagtcaccgtat
S3中，将所得重组表达载体转入表达菌株中，得到重组表达菌株，可表达相应的蛋白。本发明实施例对于重组表达菌株的具体构建方法没有特殊要求，采用本领域常规方法即可。
S4中，通过对重组表达菌株进行培养，壳聚糖酶基因csnbaa的核苷酸序列随着重组表达菌株的繁殖而复制，然后收集重组表达菌株的培养物，经分离、纯化，得到壳聚糖酶CsnBaa。在一些实施例中，为了提高壳聚糖酶CsnBaa在毕赤酵母表达系统中的表达量，将表达分子伴侣蛋白的载体转入重组表达菌株中，使重组表达菌株共表达壳聚糖酶CsnBaa和分子伴侣蛋白。在一些具体实施例中，表达分子伴侣蛋白的载体为pGAPZ-hac1。
在一些实施例中，重组表达菌株进行培养的方法是高密度发酵培养，其方法是：将重组表达菌株接入含YPG培养基的250mL三角瓶中，在30℃、200rpm条件下进行过夜培养，然后再接入含YPG培养基的500mL三角瓶中，在30℃、200rpm条件下进行振荡过夜培养。将二次过夜培养的重组表达菌株接种至含BSM培养基的发酵罐中，在30℃、pH 5.0、搅拌速度500rpm、空气流量为40L/min的条件下进行发酵培养，得到发酵液。将高密度发酵培养所得发酵液进行纯化，得到壳聚糖酶CsnBaa。
进一步地，本发明实施例对高密度发酵培养的条件进行了优化，将高密度发酵培养的温度设置为26℃，pH设置为6.0，以使发酵酶活达到最大。
相应地，本发明实施例还提供了本发明实施例提供的壳聚糖酶CsnBaa或本发明实施例提供的壳聚糖酶CsnBaa的制备方法制备得到的壳聚糖酶CsnBaa在水解壳聚糖中的应用。
本发明实施例提供的壳聚糖酶CsnBaa或本发明实施例提供的壳聚糖酶CsnBaa的制备方法制备得到的壳聚糖酶CsnBaa可用于催化几丁质脱乙酰基。由于该壳聚糖酶CsnBaa的酶活较高，且在较宽的温度范围和较宽的pH范围内均表现出良好的稳定性，因此用于水解壳聚糖时，可使催化反应高效、稳定地进行。
在一些实施例中，本发明实施例提供的壳聚糖酶CsnBaa在水解壳聚糖的反应中，其反应温度为40℃-65℃，最适反应温度为50℃。
在一些实施例中，本发明实施例提供的壳聚糖酶CsnBaa在水解壳聚糖的反应中，其反应pH为5.5-6.5，最适反应pH为6.5。
为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明实施例壳聚糖酶基因、壳聚糖酶及其制备方法和应用的进步性能显著的体现，以下通过实施例来举例说明上述技术方案。
以下实施例中涉及到的实验材料和试剂：
菌株与载体：大肠杆菌菌株Top10、毕赤酵母X33、表达载体pPICZαA均从商业途径购买获得；分子伴侣表达载体pGAPZ-hac1、pGAPZ-pdi以及pGAPZ-ero1均按照常规的分子生物学方法构建得到，该系列表达载体的抗性为潮霉素。
酶与试剂盒：Q5高保真Taq酶MIX购自NEB公司；质粒提取、胶纯化试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；限制性内切酶购自宝日医生物技术(北京)有限公司；博来霉素(Zeocin)购自Invitrogen公司。
培养基：大肠杆菌培养基为LB(1％(w/v)蛋白胨，0.5％(w/v)酵母提取物，1％(w/v)NaCl，pH7.0)。LBA为LB培养基加入25μg/mL博来霉素。
酵母培养基为YPD(1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)蛋白胨，2％(w/v)葡萄糖)。酵母筛选培养基为YPDZ(YPD固体培养基含有不同浓度博来霉素)，YPDH培养基(YPD固体培养基含有不同浓度潮霉素)；
酵母诱导培养基为BMGY(1％(w/v)酵母提取物、2％(w/v)蛋白胨、1.34％(w/v)YNB、0.00004％(w/v)生物素、1％甘油(v/v))，其中，YNB为酵母氮源基础(Yeast NitrogenBase)。
BMMY培养基：除了以0.5％(v/v)甲醇代替甘油，其余成分与BMGY相同。
壳聚糖酶活性测定所用试剂：壳聚糖底物：(1％(w/v)壳聚糖溶于pH6.5，0.2mol/L乙酸乙酸钠溶液)；DNS试剂(6.3‰(w/v)3,5-二硝基水杨酸，18.2％(w/v)四水酒石酸钾钠，5‰(w/v)苯酚，5‰(w/v)无水亚硫酸钠)。
实施例1
本实施例提供了壳聚糖酶基因序列分析及密码子优化过程，包括如下步骤：
(11)芽孢杆菌来源壳聚糖酶的研究目前主要集中在环状芽孢杆菌壳聚糖酶和枯草芽孢杆菌壳聚糖酶，其它芽孢杆菌来源的壳聚糖酶则报道较少。为了能够进一步挖掘芽孢来源的壳聚糖酶，需要对不同芽孢杆菌基因组序列进行分析。在本实施例中通过分析Bacillus atrophaeus基因组序列，发现其基因组中存在一个壳聚糖酶基因，该基因在NCBI数据库的登录号为CP024051.1。该基因全长为825bp，编码274个氨基酸，该壳聚糖酶基因属于GH46家族，是一种典型的芽孢杆菌壳聚糖酶基因。通过信号肽预测软件SignalP-5.0Server预测分析发现其前32个氨基酸为信号肽。
(12)选用毕赤酵母作为异源表达系统，由于毕赤酵母和Bacillus atrophaeus之间存在着密码子偏好性，所以需要进行密码子优化。根据毕赤酵母密码子偏好性，优化了去除信号肽的CsnBaa编码基因，优化的基因命名为csnbaa，其序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。相比原始基因，csnbaa的GC含量由原始的44.7％提升至48.2％，更接近毕赤酵母高效表达的范围；减少了稀有密码子(如编码丙氨酸的GCG优化为GCT、编码亮氨酸的CTG优化为TTG等)；表达适应指数从0.62提升至0.83。
实施例2
本实施例提供了一种含实施例1所得壳聚糖酶基因csnbaa的重组表达载体的构建过程，该重组表达载体以pPICZαA作为表达载体。具体如下：
(13)根据合成基因csnbaa的序列设计一对引物csnbaa-F和csnbaa-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3-4所示，用于扩增csnbaa基因；
(14)通过PCR扩增获得基因csnbaa，用限制性内切酶EcoRI和XbaI分别过夜酶切表达载体pPICZαA和基因csnbaa，将过夜酶切的表达载体pPICZαA和csnbaa进行纯化回收后进行连接反应；
(15)采用热激法将连接反应产物转入大肠杆菌Top10，采用菌液PCR验证重组转化子；
(16)将验证成功的转化子接入LBZ液体培养基，提取质粒，进行测序验证，最终获得表达载体pPICZαA-csnbaa。
实施例3
本实施例提供了一种含实施例2所得重组表达载体的重组毕赤酵母工程菌的构建过程，具体如下：
(17)用限制性内切酶SacI线性化表达载体pPICZαA-csnbaa后，采用电转化法转入毕赤酵母X33，从而获得不同的阳性转化子。为了能够构建不同基因拷贝数的转化子，转化的时候表达载体的浓度大于2μg，此外YPDZ固体培养基中的博来霉素浓度分别为100mg/L、200mg/L以及400mg/L。重组毕赤酵母的筛选采用24孔板法，具体步骤是：将YPDZ平板上的重组转化子用牙签逐个挑至每孔含有1.8mL BMGY培养基的24孔板，30℃，200rpm过夜培养24小时后，4000rpm离心去掉上清，加入1.6mL的BMMY培养基，30℃，200rpm培养24小时，测定重组转化子的壳聚糖酶活性。
(18)壳聚糖酶活性的测定方法如下：首先将壳聚糖底物和酶液在50℃进行预热；将预热好的50μL酶液加入1.5mL离心管，然后加入350μL壳聚糖底物，50℃反应10分钟后加入600μL DNS试剂终止反应，于100℃沸水浴5分钟进行显色，冷却后离心取上清在540nm下测定吸光值。酶活单位的定义为：每分钟生成1μmol还原糖所用酶的量定义为一个活力单位。通过筛选获得三个酶活优势菌株(分别命名ba1、ba2以及ba3)，其酶活分别为11.3U/mL、9.5U/mL以及7.2U/mL。
实施例4
本实施例提供了将实施例3所得3个酶活优势菌株分别进行摇瓶发酵培养的过程，具体如下：
(19)首先将相应的重组工程菌种接入含有5mL BMGY培养基的50mL离心管中，30℃，220rpm培养24小时左右，将培养好的重组酵母工程菌种按1％(v/v)的接种量接入含有50mL BMMY培养基的500mL三角瓶中。摇瓶培养条件为30℃，220rpm，每隔24小时加入0.75％(v/v)的甲醇进行诱导，同时取样进行壳聚糖酶活性的测定，通过酶活测定发现，诱导培养120小时后ba1、ba2以及ba3的酶活分别为53U/mL、45U/mL和38U/mL。
实施例5
本实施例提供了共表达分子伴侣蛋白的过程，具体如下：
(20)选取3个分子伴侣蛋白(分别是HAC1、PDI以及ERO1)。以摇瓶筛选获得的酶活优势菌ba1为宿主，分别将线性化后的表达载体pGAPZ-hac1、pGAPZ-pdi以及pGAPZ-ero1转入ba1，转化子涂布于YPDH培养基。分子伴侣蛋白共表达重组菌初步筛选也是采用24孔板法，筛选过程中以重组菌ba1为对照，通过筛选发现共表达HAC1效果最好，其次为ERO1。此外通过摇瓶培养复筛，发现共表达HAC1效果依然最好，其对应的重组工程菌ba1-h在摇瓶培养条件下有的培养120h后，发酵酶活为71U/mL。
实施例6
将实施例5所得共表达分子伴侣蛋白的重组工程菌进行高密度发酵培养，高密度发酵优化在5L发酵罐进行，主要进行诱导温度和诱导pH的优化(诱导温度分别为26℃、28℃以及30℃；诱导pH分别为4、5、6以及7)具体如下：
(21)将单菌落重组酵母工程菌接入含有50mL YPG培养基的250mL三角瓶中，30℃，200rpm振荡过夜培养。再将过夜培养的重组酵母工程菌按1％(v/v)的接种量接入含有100mL YPG培养基的500mL三角瓶中，30℃，200rpm振荡过夜培养，至OD 600大于10。将二次过夜培养的重组酵母工程菌按10％(v/v)的接种量接入含有2L BSM培养基的5L发酵罐。重组酵母工程菌在5L发酵罐的培养条件为：温度为30℃、pH值5.0、搅拌速度为500rpm、空气流量为40L/min。培养初期，以甘油作为碳源供菌体生长。当菌体湿重达到180g/L左右时，停止流加甘油，待甘油被菌体吸收完后(溶氧迅速上升)开始用甲醇诱导。甲醇的添加量根据溶氧进行调整。培养过程中，每24小时取样测定菌体湿重、酶活和总蛋白浓度。所得高密度发酵培养的曲线图如图1所示。
由图1A可知，当诱导培养温度为26℃时，重组菌壳聚糖酶活性最高、其次为28℃和30℃，三个温度下的酶活分别为3562U/mL、3221U/mL和2801U/mL；在最适培养温度条件下，优化诱导pH，由图1B可知当诱导pH为6时，效果最好，此时发酵酶活达到4630U/mL。
实施例7
本实施例提供了将实施例6所得发酵液进行纯化，得到壳聚糖酶CsnBaa的过程，具体如下：
(22)将5L发酵罐的发酵液离心取上清进行纯化回收；
(23)用10kDa超滤管将上清酶液进行超滤浓缩；
(24)用Ni-IDA蛋白纯化试剂盒进行纯化，得到壳聚糖酶CsnBaa。
通过实验测定，纯化后的壳聚糖酶CsnBaa酶比活为2100U/mg。纯化后的SDS-PAGE蛋白电泳结果如图2所示，由图2可知，纯化后的重组壳聚糖酶CsnBaa大小约30kDa。
实验例1
在pH 605条件下测定实施例7所得壳聚糖酶CsnBaa在30-60℃不同温度下的酶活，以测定酶活最高温度下的酶活为100％，计算其它温度下的相对酶活。检测结果如图3所示。由图3可知，壳聚糖酶CsnBaa在40℃和65℃的相对酶活分别为61％和68％，最适反应温度为50℃。
热稳定性测定如下：将壳聚糖酶CsnBaa在30-60℃不同温度下水浴热处理10分钟后测定剩余酶活，以没有做热处理样品的酶活为100％，计算其它温度下的相对剩余酶活。实验结果如图3所示。由图3可知，在30-50℃范围内热处理10分钟后，剩余酶活均大于82％。
实验例2
在50℃条件下，分别测定实施例7所得壳聚糖酶CsnBaa在pH 3.5-7.0条件下的酶活，以测定酶活最高pH下的酶活为100％，计算其它pH下的相对酶活，检测结果如图4所示。由图4可知，壳聚糖酶CsnBaa最适反应pH为6.5，在pH5.5-6.5范围内相对酶活均大于65％，当pH增加到7.0或降到4.5时，相对酶活均急剧下降，分别为36％和20％。
不同pH对壳聚糖酶CsnBaa稳定性影响测定如下：
将壳聚糖酶CsnBaa在pH 3.0-11.0条件下室温保存4小时测定剩余酶活，以没有做任何处理的样品的酶活为100％，计算其它温度下的相对剩余酶活，检测结果如图4所示。由图4可知，壳聚糖酶CsnBaa在pH 4.0-10.0范围内，室温保存4小时后剩余酶活均大于80％，说明其在该pH范围内具有良好的稳定性。
实验例3
将实施例7所得壳聚糖酶CsnBaa水解壳聚糖，具体如下：
称取10g壳聚糖溶于100ml乙酸乙酸钠缓冲液(pH5.5)，加入2000U壳聚糖酶CsnBaa，50℃，120rpm进行水解反应，水解10分钟、20分钟、40分钟和60分钟分别取样进行薄层层析。
薄层层析步骤如下：取10μL水解反应产物和10μL壳寡糖标准混合物，分别点到硅胶板(Silica gel 60，Merck)上；将点好样的硅胶板放置在扩展缸进行扩展，扩展缓冲液为异丙醇、水和氨水混合物(体积比例为15:1:7.5)；将扩展完的硅胶板从扩展缸取出吹干后喷显示剂(0.5％茚三酮溶液)；吹干后将硅胶板放置在100℃条件下进行高温显色，结果如图5所示。
通过图5可以看出，水解反应进行10分钟、20分钟和40分钟后，水解产物主要由壳二糖、壳三糖和壳四糖构成。经检测，当水解反应进行到60分钟后，壳聚糖的水解率达到97％，水解产物主要为壳二糖和壳三糖，其中壳二糖和壳三糖的含量分别为57.3％和39.2％。壳二糖和壳三糖作为壳寡糖的主要活性成分，在医药、农业、食品等行业具有好的应用效果。本发明中壳聚糖酶CsnBaa水解壳聚糖的主要产物为壳二糖和壳三糖，表明壳聚糖酶CsnBaa在壳寡糖的酶解制备领域具有很大的应用潜力。
实验例4
采用固体平板抑菌和液体抑菌两种方法评价壳聚糖酶CsnBaa水解产物的抑菌效果，实验使用的指示菌为大肠杆菌(ATCC25922)和金黄色葡萄球菌(ATCC25923)。将实验例3所得水解产物用0.22微米滤膜过滤除菌，获得初始样品。
固体平板抑菌实验过程如下：
(31)抑菌平板制备：实验使用的指示菌为大肠杆菌(ATCC25922)和金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)。所有指示菌在37℃、200rpm培养至对数生长期(OD600≈1)，将培养好的菌液按照1μl/ml加入到无菌培养基中制作平板；
(32)抑菌圈实验：将配置好的指示菌平板，用打孔器打孔后，分别加入稀释好的样品(各100μl)，然后将平板正放于37℃培养箱中培养12～16小时。观察抑菌圈，判断该样品是否有抑菌作用，结果如图6A和图6B所示。
液体抑菌实验过程如下：
(41)样品制备：将初始样品用无菌水稀释至不同倍数；
(42)指示菌制备：将不同的指示菌平板划线，过夜培养；将过夜的菌挑单菌落接入液体培养基，培养至OD值为1.0左右(若大于则调整为1.0)，将培养好的菌稀释1000倍备用，此时菌液的浓度约1.0x106CFU/ml；
(43)抑菌实验：分别取不同浓度的样品1ml加入10ml玻璃试管，然后分别加入1ml稀释好的菌液；
(44)37℃，静置培养16小时左右，进行观察，根据菌液的澄清度判断抑菌效果，结果如图6C和图6D所示。
通过图6A和图6B可以看出，壳聚糖酶CsnBaa水解产物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌效果。通过图6C可以看出，壳聚糖酶CsnBaa水解产物稀释20倍仍然可以有效抑制大肠杆菌的生长；通过图6D可以看出，壳聚糖酶CsnBaa水解产物稀释40倍仍然可以有效抑制大肠杆菌的生长。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳润康生态环境股份有限公司、华南理工大学、深圳诺普信农化股份有限公司
<120> 壳聚糖酶基因csnbaa、壳聚糖酶及其制备方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 728
<212> DNA
<213> 萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)
<400> 1
gctggtttga acaaggacca aaagagaagg gctgagcagt tgacttccat cttcgagaac 60
ggtatgaccg agatccagta cggttacgtt gaacacttgc cagacggtag aggttacact 120
tgtggtagag ctggtttcac tactgctact ggtgacgctt tggaggttgt tgaggtttac 180
actaaggccg tgccaaacaa caagctgaag aagtacttgc ccgagctgag aagattggcc 240
aaagaagaat ctgacgacat ctccaacctg aagggtttcg attctgcttg gagatccctt 300
ggtaaggaca aggatttcag agctgctcag gacactgtta acgacagact gtactaccag 360
ccagctatga agcagtccga caacatcggt ttgaaaaccg ctttggctaa ggctgtcatg 420
tacgacacta ttatccaaca cggtggtggt gatgatccag actctttgaa ctccctgatc 480
aagaggacca acaagaaagc tggtggttcc ccaaagaacg gtgttgacga aaagaagtgg 540
ctgaacaagt tcctggacgt cagatacgac gacttgatga acccatctga cccagacact 600
agagatgaat ggcgtgaatc cgttgccaga gttgacgtct tgagatccat tgctaaggcc 660
aacaactaca acctgaacgg tccaatcaac gtctactccg aagaatacgg tgacttcgtc 720
atcaagta 728
<210> 2
<211> 242
<212> PRT
<213> 萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)
<400> 2
Ala Gly Leu Asn Lys Asp Gln Lys Arg Arg Ala Glu Gln Leu Thr Ser
1 5 10 15
Ile Phe Glu Asn Gly Met Thr Glu Ile Gln Tyr Gly Tyr Val Glu His
20 25 30
Leu Pro Asp Gly Arg Gly Tyr Thr Cys Gly Arg Ala Gly Phe Thr Thr
35 40 45
Ala Thr Gly Asp Ala Leu Glu Val Val Glu Val Tyr Thr Lys Ala Val
50 55 60
Pro Asn Asn Lys Leu Lys Lys Tyr Leu Pro Glu Leu Arg Arg Leu Ala
65 70 75 80
Lys Glu Glu Ser Asp Asp Ile Ser Asn Leu Lys Gly Phe Asp Ser Ala
85 90 95
Trp Arg Ser Leu Gly Lys Asp Lys Asp Phe Arg Ala Ala Gln Asp Thr
100 105 110
Val Asn Asp Arg Leu Tyr Tyr Gln Pro Ala Met Lys Gln Ser Asp Asn
115 120 125
Ile Gly Leu Lys Thr Ala Leu Ala Lys Ala Val Met Tyr Asp Thr Ile
130 135 140
Ile Gln His Gly Gly Gly Asp Asp Pro Asp Ser Leu Asn Ser Leu Ile
145 150 155 160
Lys Arg Thr Asn Lys Lys Ala Gly Gly Ser Pro Lys Asn Gly Val Asp
165 170 175
Glu Lys Lys Trp Leu Asn Lys Phe Leu Asp Val Arg Tyr Asp Asp Leu
180 185 190
Met Asn Pro Ser Asp Pro Asp Thr Arg Asp Glu Trp Arg Glu Ser Val
195 200 205
Ala Arg Val Asp Val Leu Arg Ser Ile Ala Lys Ala Asn Asn Tyr Asn
210 215 220
Leu Asn Gly Pro Ile Asn Val Tyr Ser Glu Glu Tyr Gly Asp Phe Val
225 230 235 240
Ile Lys
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agtcgaattc gctggtttga acaaggacca aa 32
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttctctagac ttgatgacga agtcaccgta t 31

Claims (10)

1.一种壳聚糖酶基因csnbaa，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或由所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的核苷酸序列。
2.一种壳聚糖酶CsnBaa，其特征在于，所述壳聚糖酶CsnBaa是权利要求1所述壳聚糖酶基因csnbaa编码的蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或由所述SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的氨基酸序列。
3.一种重组表达载体，其特征在于，包括权利要求1所述的壳聚糖酶基因csnbaa。
4.一种重组表达菌株，其特征在于，包括权利要求3所述的重组表达载体，以及表达分子伴侣蛋白的载体。
5.根据权利要求4所述的重组表达菌株，其特征在于，所述表达分子伴侣蛋白的载体为表达HAC1的载体。
6.一种壳聚糖酶CsnBaa的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供壳聚糖酶基因csnbaa、表达载体、表达菌株；
对所述壳聚糖酶基因csnbaa进行扩增，所得扩增产物与所述表达载体进行连接，得到重组表达载体；
将所述重组表达载体转入表达菌株，得到重组表达菌株；
对所述重组表达菌株进行培养，得到壳聚糖酶CsnBaa；
其中，所述壳聚糖酶基因csnbaa的核苷酸序列为如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的核苷酸序列；所述壳聚糖酶CsnBaa的氨基酸序列为如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述壳聚糖酶CsnBaa的制备方法，其特征在于，将所述壳聚糖酶基因csnbaa进行扩增的步骤中，用于扩增的引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
8.根据权利要求6所述壳聚糖酶CsnBaa的制备方法，其特征在于，所述表达载体为毕赤酵母表达载体；和/或
所述表达菌株为毕赤酵母表达菌株。
9.权利要求2所述壳聚糖酶CsnBaa或权利要求6-8任一项所述壳聚糖酶CsnBaa的制备方法制备得到的壳聚糖酶CsnBaa在水解壳聚糖中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，在所述水解壳聚糖的反应中，所述反应的温度为40℃-65℃；和/或
所述反应的pH为5.5-6.5。
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